DE3888943T2

DE3888943T2 - Verfahren zur Verkapselung.

Info

Publication number: DE3888943T2
Application number: DE3888943T
Authority: DE
Inventors: Carol Ann Baker; Albert Arthur Brooks; Robert Ziolkowski Greenley; Jay Myls Stuart Henis
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1988-12-08
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2008-12-09
Also published as: JPH01304883A; AU605946B2; ATE103976T1; ES2010155T3; ES2010155A4; EP0320483B1; DK686188D0; BR8806519A; AU2673688A; CA1336765C; DE3888943D1; EP0320483A3; DK686188A; EP0320483A2; JP2642715B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Einkapselung von biologischem Material. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einkapselung von biologischem Material, wie Mikroben (Bakterien sowie Fungi), Proteinen und Peptiden, in einer Polymermatrix zur Unterstützung der Verwendung des Materials als landwirtschaftliche Agentien (z. B. Herbizide, Insektizide, etc.) oder für einen anderen Zweck, wie als immobilisierter Katalysator.
Die Verwendung von Mikroben als landwirtschaftliche Produkte wurde durch den Mangel an einem effizienten Abgabesystem für die Mikroben verhindert. Eine Mikrobe im Fermenter ist nicht "bereit für die Landwirtschaft". Es muß ein System zur Aufrechterhaltung der Mikrobenaktivität vom Fermenter zum Landwirt geben, und das Produkt muß in einer Form vorliegen, die für den Landwirt annehmbar und verwendbar ist. Dies kann die Verwendung im Boden oder die Haftung an Blattflächen sogar während Regenperioden erfordern.
Die fünf Hauptvorteile des vorliegenden Verfahrens zur Einkapselung von Mikroben oder anderem biologischen Material sind: (1) sehr hohe Rückgewinnung lebensfähiger aktiver Mikroben nach dem Einkapselungsverfahren (2) das fertige Produkt läßt die Mikrobe in einem Ruhezustand zurück, der zur Lagerung geeignet ist; (3) die eingekapselte Mikrobenformulierung ist ein rieselfähiges Material, das unter Verwendung von Standard-Ausrüstung eingesetzt werden kann; (4) eingekapselte Mikroben können dazu gebracht werden, an Blattflächen zu haften; und (5) das vorliegende Verfahren sieht ein Mittel zur Abgabe von biologischem Material vor, das einem Photoabbau ausgesetzt und/oder enzymatisch instabil ist.
Im Gegensatz zu bekannten Verfahren, wie dem Alginatkügelchen-Verfahren von Boshan ("Aliginate Beads as Synthetic Inoculant Carriers for Slow Kelease of Bacteria that Affect Plant Growth", Applied & Environmental Microbiology, Bd. 51, Nr. 5, S. 1089-1098, (1986)), ist kein erneuter wachstumsschritt erforderlich, da üblicherweise weniger als 1,5 log Zellen während des Einkapselungsverfahrens verlorengehen. Da kein erneuter Wachstumsschritt notwendig ist, wird die Struktur der Kügelchen durch das Polymer und das Verfahren zur Herstellung der Kügelchen reguliert und nicht durch die Wirkungen der wachsenden Mikrobe. Dies führt zu einer gleichmäßigeren und vorhersehbarren Struktur sowie Freisetzungsprofilen, die durch die Polymerzusammensetzung und Mikrostruktur der Kügelchen bestimmt werden können.
Im Alginatkügelchen-Verfahren von Boshan fiel die Lebendbakterienzahl 3 bis 4 log, wenn die Kügelchen gefriergetrocknet wurden, wobei höchstens 10&sup7; Zellen/g Kügelchen zurückblieben. Gemäß dem vorliegenden Verfahren wurden Ausbeuten von 10&sup8; bis 10&sup9; erzielt, ohne jedoch bereits die Beladungskapazitätsgrenze zu erreichen. Mikrobenbeladungen von 1012 Lebendzellen pro g Kügelchen sollten möglich sein.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine Schnittdarstellung einer bei der Herstellung von Kügelchen verwendbaren Düse.
Fig. 2 zeigt ein typisches PVOH-Kügelchen im ganzen und im Schnitt.
Fig. 3 zeigt ein typisches PVP-Kügelchen.
Fig. 4 zeigt ein typisches HPC-Kügelchen.
Fig. 5 zeigt an einer Blattfläche nach Regen haftende PVOH-Kügelchen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Einkapselung von biologischem Material vor, bei welchem das biologische Material mit einer wässerigen nicht-ionischen Polymer-Lösung, in der das Polymer in einer Konzentration von zumindest 3% M/V vorliegt, gemischt wird. Durch das tropfenweise Zusetzen der obigen Mischung in ein mit Wasser nicht mischbares Nicht-Lösungsmittel für das Polymer, wobei das Nicht-Lösungsmittel bei einer Temperatur gehalten wird, die ausreicht, um das Kügelchen zu gefrieren, jedoch nicht so niedrig ist, um einen Gefrierbruch des Polymerkügelchens zu bewirken, werden Kügelchen gebildet. Dann werden die das biologische Material enthaltenden Polymerkügelchen zur Entfernung im wesentlichen des gesamten ungebundenen Wassers in den Kügelchen getrocknet.
In einem Aspekt ermöglicht es die Erfindung, daß Mikroben verwendbare landwirtschaftliche Agentien werden. Die Polymerkügelchen der vorliegenden Erfindung bringen die Mikroben in einem Ruhezustand auf den Markt. Es können Kügelchen hergestellt werden, die für eine Abgabe an den Boden oder Pflanzenblätter geeignet sind. Außerdem sind die verwendeten Polymermaterialien bioabbaubar, und die Kügelchen können entweder trocken über eine Pflanzungs- oder Insektizidpackung oder naß über eine Sprühdüse aufgebracht werden.
Es können wasserlösliche nicht-ionische Polymere verwendet werden, die eine Löslichkeit von zumindest 3% M/V aufweisen und für die einzukapselnde Mikrobe nicht schädlich sind. Nicht-ionisches Polymer bedeutet ein neutrales Polymer, das im wesentlichen keine Nettoladung zeigt. Polymerkonzentrationen zwischen 5% und 15% werden bevorzugt. Geeignete Polymere schließen ein: Poly-(vinylalkohol) (PVOH), vorzugsweise in einem MG-Bereich von etwa 10 000 bis 125 000 und zu 85 bis 100% hydrolysiert; Polyvinylpyrrolidon (PVP), vorzugsweise in einem MG-Bereich von etwa 10 000 bis 360 000; Dextan, vorzugsweise in einem MG-Bereich von etwa 10 000 bis 249 000; und verschiedene derivatisierte Cellulose-Polymere, wie Hydroxypropylcellulose (HPC), vorzugsweise in einem MG-Bereich von etwa 60 000 bis 1 000 000.
Trockener PVOH ist in kaltem Wasser nicht leicht löslich, somit lösen sich PVOH-Kügelchen nicht, obwohl eine Quellung und Fragmentierung auftreten können. Das Quell- und Fragmentierungsausmaß kann durch die Molmasse des verwendeten PVOH-Polymers reguliert werden. Die Quellung und Fragmentierung von PVOH-Kügelchen werden mit steigender PVOH-Molmasse reduziert. Trockener PVOH wird durch das Erhitzen der wässerigen PVOH-Mischung auf eine Temperatur von mehr als 80ºC, vorzugsweise auf den Siedepunkt, solubilisiert. Mit PVOH hergestellte Kügelchen sind bei Temperaturen von weniger als 40ºC in Wasser im wesentlichen unlöslich. Die Integrität der PVOH-Kügelchen (Lösungsrate) kann durch das Mischen anderer, in kaltem Wasser löslicher Polymere, wie Polyethylenglykol (PEG), mit dem PVOH verringert werden. Aus PVP, derivatisierter Cellulose und Dextran hergestellte Kügelchen lösen sich, wenn sie in kaltes Wasser oder Wasser bei Raumtemperatur gegeben werden.
Fig. 2 zeigt ein typisches PVOH-Kügelchen im ganzen und im Schnitt, wobei die schwammige, poröse Struktur gezeigt ist. Fig. 3 zeigt ein typisches (10% M/V) PVP-Kügelchen. Fig. 4 zeigt ein typisches (10% M/V, MG 60 000) HPC-Kügelchen.
Die Molmasse des Polymers beeinflußt die mechanische Festigkeit des Kügelchens. Im allgemeinen steigt die Festigkeit des Kügelchens mit zunehmender Molmasse. Beispielsweise quellen PVOH-Kügelchen, die aus einer Mischung verschiedener Molmassen bestehen, jedoch eine mittlere Molmasse von 61 000 aufweisen, fragmentieren jedoch sehr wenig, wenn sie Wasser zugesetzt werden. Aus 25 000 MG PVOH hergestellte Kügelchen fragmentieren rasch und lösen sich in Wasser. Molmassen von weniger als etwa 10 000 bewirken, daß die Kügelchen sehr brüchig werden. Im allgemeinen verringert eine Zunahme der Molmasse des verwendeten PVOH die Fragmentierung. Die Strukturintegritätseffekte können zur Änderung der Freisetzung von Mikroben aus der Kügelchenmatrix verwendet werden. Beispielsweise führt die Fragmentierung der Kügelchen zu einer rascheren Freisetzung des darin enthaltenen biologischem Materials.
Einer der einzigartigen Aspekte der vorliegenden Erfindung ist, daß die Kügelchen gefriergetrocknet werden können und ihre Morphologie beibehalten. Dies ist möglich, da die Verwendeten Polymere bei höheren Konzentrationen mit niedrigeren Viskositäten als Materialien, die derzeit zur Zellimmobilisation eingesetzt werden (Agar, Alginate, etc.), wasserlöslich sind. Daher können Kügelchen mit ausreichend Polymer (> 3% M/V) hergestellt werden, so daß das Kügelchen bei der Entfernung von Wasser eine verwendbare Festigkeit aufweist. Beispielsweise liegen bei Konzentrationen von etwa 5% M/V PVOH oder PVP die Viskositäten unter 1000 mPa·s (1000 Centipoise (cps)). In Abhängigkeit vom Polymer und seiner Molmasse kann die Polymer-Konzentration bis zu ihrer Löslichkeitsgrenze erhöht werden. In den meisten Fällen kommt es jedoch zu keiner Verwendbaren Erhöhung der Festigkeit des Kügelchens über 15% M/V, und einige der Polymere mit höherer Molmasse sind über dieser Konzentration zu viskos für die leichte Bildung von Kügelchen.
Daher sieht die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Verwendbare Zusammensetzungen vor, die ein nicht-ionisches Wasserlösliches Polymer und biologisches Material umfassen, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen frei von ungebundenem Wasser ist und eine nicht-brüchige, schwammige, poröse Struktur aufweist (siehe Fig. 2 bis 4).
In noch einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine feste Zusammensetzung vor, die ein nicht-ionisches Polymer, das bei Temperaturen von weniger als 80ºC nicht leicht gelöst werden kann, hingegen bei Temperaturen von mehr als 80ºC löslich ist, und biologisches Material umfaßt, welche Zusammensetzung im wesentlichen frei von ungebundenem Wasser und bei Temperaturen von weniger als 40ºC in Wasser im wesentlichen unlöslich ist. In den Fällen, in denen das biologische Material eine lebensfähige Mikrobe ist, kann der Mikrobengehalt im Bereich von 0,01 bis 50 Masse-% der Zusammensetzung liegen.
Polymer-Lösungen können bei 15 psig und 121ºC 30 Minuten lang im Autoklaven behandelt werden. In vielen Fällen ist dies vorteilhaft, so daß eine Verunreinigung durch unerwünschte Mikroben vermieden werden kann. Die Lösungen werden beim Abkühlen gerührt, um eine "Hautbildung" an der Oberfläche zu vermeiden. Die "Haut" beeinträchtigt die Verarbeitung der Lösung zu Kügelchen. Nährstoffe und/oder Verdichtungsmittel können vor der Autoklavenbehandlung zugesetzt werden. Alternativ dazu können Nährstoffe filtersterilisiert und nach der Autoklavenbehandlung aseptisch zugesetzt werden. Die Viskosität wird vorzugsweise in einem Bereich von 20 bis 1000 mPa·s (20 bis 1000 cps) gehalten. Die einzigen Grenzen der Viskosität sind jedoch durch das verwendete Verfahren zur Herstellung der Kügelchen vorgegeben.
Da sich der pH der Polymer-Lösung während der Autoklavenbehandlung ändern kann (z. B. Acetatrückstände, die aus PVOH unter Bildung von Essigsäure in Lösung hydrolysieren), kann es notwendig sein, die Polymer-Lösung zu puffern, um den gewünschten pH üblicherweise zwischen 6 und 7,5 zu halten. Puffer, die verwendet werden können, schließen jeden physiologisch annehmbaren Puffer ein, der die Mikroben nicht nachteilig beeinflußt. Ein bevorzugter Puffer ist 0,05 M Natriumphosphat-Puffer.
Der Zusatz eines Verdichtungsmittels ist in den meisten Fällen zur Verstärkung des spezifischen Gewichts des formulierten Kügelchens vorteilhaft, um ihre Handhabung zu erleichtern. Jedes Verdichtungsmittel, das die Aktivität der Mikrobe nicht nachteilig beeinflußt, kann verwendet werden. Geeignete Verdichtungsmittel schließen Siliziumoxid, Silikagel, Bentonit und Aluminiumoxid ein. Aluminiumoxid wird besonders bevorzugt. Das Aluminiumoxid wird sorgfältig mit Wasser und einem Zucker, wie Dextrose oder Saccharose, gemischt, bevor es der Polymer-Lösung zugesetzt wird. Dies ermöglicht, daß das Aluminiumoxid gut dispergiert wird, und der Zucker bewirkt eine Vorbehandlung des Aluminiumoxids, so daß das Aluminiumoxid mit jeglichen Hydroxylgruppen am Polymer eine geringere Wechselwirkung zeigt. Diese Wechselwirkung des Polymers und Aluminiumoxids kann bewirken, daß die Lösung Fäden zieht.
Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können Gram-positive und Gram-negative Bakterien sowie Fungi eingekapselt werden. Beispiele von Mikroben schließen ein: Bacillus thuringiensis; Mikroben der Gattung Pseudomonas, wie Pseudomonas fluorescens, identifiziert durch Hinterlegungsnr. NRRL B-15132, NRRL B-15133, NRRL B-15134 und NRRL B-15135, geoffenbart in US-4 456 684; Mikroben der Gattung Agrobacterium radiobacter; und Fungusarten, wie Alternaria cassiae. Die Mikroben werden der Polymer-Lösung zugesetzt, nachdem sie auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Der Kulturüberstand kann gegebenenfalls von den Zellen gewaschen werden, obwohl in Kulturmedien und Zellprodukten normalerweise gefundene Komponenten die Herstellung der Kügelchen nicht beeinflussen. In Fällen, in denen die Mikrobe einen schädlichen Metaboliten erzeugen kann, wird die Entfernung durch Waschen vor der Einkapselung bevorzugt. Die Zellen werden in einer geringen Fluidmenge vor dem Mischen mit der Polymer-Lösung resuspendiert, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Das Suspensionsfluid kann einfach das Überstandsfluid (Kulturbrühe) vom anfänglichen Zentrifugieren sein, oder es kann eine spezifisch definierte Formulierung zur Verstärkung des Überlebens einer bestimmten Mikrobe während des Gefrierens und der Gefriertrocknung darstellen. Wenn es Adjuvantien gibt, welche die Verwendung der Mikrobe als Herbizid oder Pestizid verstärken, oder ihre Fähigkeit zur Kolonisierung der Zielpflanze oder des Bodens verstärken, können diese Mittel außerdem zugesetzt werden. In den meisten Fällen wird das Volumen des Suspensionsfluids derart bestimmt, daß es vorzugsweise nicht mehr als 5% des Volumens der Polymer-Lösung beträgt, obwohl es ohne Schwierigkeiten sogar 20% betragen kann.
Mikroben können durch Kühlen, Gefrieren und Gefriertrocknen verletzt werden. Bedauerlicherweise ist es nicht vollständig geklärt, welcher Art die Verletzungen sind, wie diese Verletzungen auftreten und wie derartige Verletzungen verhindert werden können. Obwohl spekuliert wurde, daß Gram-positive Bakterien weniger Schutz benötigen als Gram-negative Bakterien, ist es wahrscheinlicher, daß jede Mikrobe als Spezialfall angesehen werden muß. Eingeschlossen in den zu beachtenden Faktoren sind: Alter der Kultur, Wachstumsrate, Typ des Wachstumsmediums, Größenordnung und Rate des Temperaturabfalls und die Art des Wachstums nach der Kältebeanspruchung. Der Zusatz von Zucker, entrahmter Milch, Glycerin, Dimethylsulfoxid (DMSO) oder anderer Kryoschutzmittel kann die Kulturen stabilisieren. Verschiedene Kryoschutzmittel haben unterschiedliche Wirkungen, und ihre Verwendung wird empirisch bestimmt. Glycerin, Saccharose und DMSO haben verbreitete Anwendung gefunden.
Während die obigen Überlegungen auch für Fungi angestellt werden müssen, sind auch andere Behandlungen vorzunehmen. Während des Einkapselungsverfahrens sind Pilzsporen großen Wassermengen ausgesetzt. Da bei einer Reihe von Fungi die Anwesenheit von Wasser die Keimung stimuliert, wird es bevorzugt, daß die Sporen vorbehandelt werden, um sie gegen das Wasser während des Einkapselungsverfahrens zu schützen. Es wurde gefunden, daß ein vorheriges Eintauchen der Sporen in 6 M Sorbit eine wirksame Behandlung ist. Mit Sorbit auf diese Weise vorbehandelte Sporen netzen nicht so leicht wie unbehandelte Sporen und überleben das Einkapselungsverfahren. Obwohl eine Vorbehandlung mit Sorbit bevorzugt wird, ist auch eine Vorbehandlung von Pilzsporen mit Polyethylenglykol (MG 200) wirksam.
Sobald die obige, das Polymer und die Mikrobe oder andere biologische Material umfassende Mischung vollständig ist, wird die Mischung einem Kühlbad bei etwa -30ºC tropfenweise zugesetzt. Das Kühlbad enthält eine Flüssigkeit, die mit Wasser nicht mischbar ist, und ein Nicht-Lösungsmittel für das Polymer. Es ist wichtig, daß die im Kühlbad verwendete Flüssigkeit beide vorstehend beschriebenen Eigenschaften aufweist. Geeignete Nicht-Lösungsmittel schließen Hexan, Petrolether und Freon 113 ein. Hexan wird als Nicht-Lösungsmittel besonders bevorzugt.
Die Temperatur ist ebenfalls ein wichtiger Parameter. Wenn die Temperatur zu hoch ist (z. B. -15ºC), gefrieren die Kügelchen langsamer, und ist die Kügelchen-Morphologie nicht gleichmäßig. Wenn die Temperatur zu niedrig ist (z. B. -80ºC), brechen die Kügelchen bei der Bildung. Das Nicht-Lösungsmittel wird vorzugsweise während des Verfahrens gerührt, um den Wärmeaustausch zu unterstützen und zu ermöglichen, daß eine große Anzahl von Kügelchen rascher hergestellt wird, ohne aneinander zu haften.
Das Kriterium, daß das Nicht-Lösungsmittel auch nicht mit Wasser mischbar sein darf, verhindert im wesentlichen, daß das Nicht-Lösungsmittel das Kügelchen in Konzentrationen durchdringt, die hoch genug sind, um für die Mikroben toxisch zu sein. Außerdem tritt die Kügelchenbildung mit mit Wasser mischbaren Nicht-Lösungsmitteln nicht leicht auf, da die Polymer- Wasser-Mischung etwas in das mit Wasser mischbare Lösungsmittel dispergiert. Dies tendiert dazu, zur Bildung von brüchigen Fäden aus Kügelchen anstatt einzelnen runden Kügelchen zu führen.
Jedes Verfahren zur Kügelchen-Herstellung, das die Lebensfähigkeit der Mikrobe nicht unzulässig verringert, ist zur Verwendung im vorliegenden Verfahren geeignet. Fig. 1 zeigt eine Düse, die zur Herstellung von Kügelchen ohne Reduktion der Zellenlebensfähigkeit erfolgreich verwendet wurde. Variationen der Größe der Öffnungen, der Länge der Rohrleitungen und des Winkels der Innenseite der Kappe können in Abhängigkeit von den Viskositäten der zu zerstäubenden Polymer/Mikroben-Mischung und der gewünschten Größe der Kügelchen eingesetzt werden. Eine Düse ist mit einem Behälter mit Polymer-Mischung verbunden, der bei konstantem Druck gehalten werden kann. Der verwendete Druck ist auch von der Viskosität der Polymer-Mischung und der gewünschten Größe der Kügelchen abhängig. Ein Spülgas (vorzugsweise befeuchteter Stickstoff) tritt oberhalb der Spitze ein, und die Fließrate wird sorgfältig reguliert. Die Regulierung des Spülgases ist für die Steuerung der Größe der Kügelchen essentiell. Der Sprühstrom wird in einem gekühlten Nicht-Lösungsmittelbad bei -30ºC gesammelt. Die Temperatur des Nicht-Lösungsmittels wird unter Verwendung eines Umlaufbades aufrechterhalten. Da dieses System keinen hohen Druck, keine großen Druckgefälle, keine Wärme oder keinen Ultraschall zur Bildung der Kügelchen erfordert, ist es sehr sanft für die Zellen. Unter Verwendung dieses Verfahrens tritt im wesentlichen keine Zellschädigung auf, und daher ergibt sich im wesentlichen kein Verlust der Lebensfähigkeit.
Die gefrorenen Kügelchen werden aus dem kalten Nicht-Lösungsmittel gesammelt und getrocknet. Obwohl jedes Mittel zur Trocknung der Kügelchen verwendet werden kann, wird die Gefriertrocknung für Fälle bevorzugt, in denen die Retention der Mikrobenlebensfähigkeit wichtig ist. Nach dem Sammeln aus dem Nicht-Lösungsmittel werden die Kügelchen kalt zu einem Gefriertrockner transferiert. Das Trocknen der gefrorenen Kügelchen dauert 8 bis 48 Stunden in Abhängigkeit von der Konfiguration des Gefriertrockners und der Menge an zu trocknenden Kügelchen Eine unvollständige Trocknung führt zu einer Klumpenbildung und einem Verlust der Integrität der Kügelchen. Ein Übertrocknen bewirkt einen Verlust der Lebensfähigkeit. Die Kügelchen werden vorzugsweise gefriergetrocknet, bis im wesentlichen das gesamte ungebundene Wasser entfernt wurde. In den Fällen einer Mikrobeneinkapselung liegen etwa 1 bis 2 Masse-% verbleibendes Wasser im getrockneten Kügelchen vor.
Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Durchführung der vorliegenden Erfindung genauer zu erläutern.

ZUSATZ VON VERDICHTUNGSMITTELN

Kügelchen können mit verschiedenen Verdichtungsmitteln, einschließlich Bentonit, Siliziumoxid, Silikagel und Aluminiumoxid, gebildet werden. Mit 10% M/V PVP plus 10% Bentonit hergestellte Kügelchen nahmen an Dichte geringfügig von 0,09 g/ml (nur 10% M/V PVP) auf 0,14 g/ml zu. Das Zusetzen von mehr als 10% Bentonit bewirkte, daß die Viskosität auf einen Wert stieg, wo die Schwierigkeit der Handhabung der viskoseren Lösung den Vorteil der erhöhten Dichte des Endprodukts überwog. Siliziumoxid kann zumindest bis zu 20% zugesetzt werden, und bei der 20% Konzentration betrug die Dichte des Endprodukts ungefähr 0,25 g/ml. Bei diesen Konzentrationen erhöhte das Siliziumoxid die Viskosität nicht auf ungeeignete Werte und war für die eingekapselten Zellen nicht toxisch. Silikagele werden mit ähnlichen Ergebnissen bei der gleichen Konzentration wie das Siliziumoxid zugesetzt. Die verwendeten Silikagele waren jedoch behandelt, und es wurde gefunden, daß der pH der Mischung von Polymer, Silikagel und Zellen weit niedriger war. pH-Änderungen können eingekapselte Zellen und/oder Proteine nachteilig beeinflussen.
Auf Grund seiner höheren Dichte bewirkt Aluminiumoxid eine größere Zunahme der Dichte der Kügelchen. Der bevorzugte Typ von Aluminiumoxid ist Alundum, das unbehandelt ist und keine große Oberfläche aufweist. Die Verwendung von Aluminiumoxid mit großer Oberfläche verringerte die Lebendzellzahl um mehr als 2 log. Ein Aluminiumoxidgehalt von bis zu 30% kann sowohl in PVP- als auch PVOH-Kügelchen verwendet werden. Mit der 30% Konzentration hergestellte Kügelchen hatten eine Dichte von ungefähr 1,8 g/ml und waren mit guten Fließeigenschaften leicht in der Handhabung. Aluminiumoxid-Teilchengrößen von 10 um oder weniger werden bevorzugt, um gute Handhabungscharakteristika für die Polymer-Mischungen sicherzustellen, wobei ein gutes Fließen durch Öffnungen zur Herstellung von Kügelchen ohne Klumpenbildung vorgesehen wird. In allen Fällen war es notwendig, Hochgeschwindigkeitsmischer oder -mischvorrichtungen zu verwenden, um die Feststoffe in den Polymer-Lösungen zu dispergieren oder die Feststoffe vor dem Zusatz vorzunetzen.

VORBEHANDLUNG VON ALUMINIUMOXID

Das Zusetzen von Aluminiumoxid zu Poly-(vinylalkohol)-Lösungen führt dazu, daß die Lösung etwas faserig wurde. Es wird angenommen, daß dies auf einen Koordinationseffekt zwischen dem Aluminiumoxid, das Elektronen übernehmen kann, und den Hydroxylgruppen am PVOH zurückzuführen ist. Kügelchen wurden durch das Lösen des Polymers in 2/3 der End-Wassermenge hergestellt. 5% Dextrose wurde dann dem verbleibenden Wasser zugesetzt und diese Lösung zum Vornetzen des Aluminiumoxids verwendet. Die Hydroxyle in der Dextrose traten mit dem Aluminiumoxid in Wechselwirkung, was bedeutete, daß das Aluminiumoxid weniger mit dem Polymer in Wechselwirkung trat, wenn es mit dem vorgenetzten Aluminiumoxid kombiniert war. Saccharose wurde auch verwendet und funktionierte gleich gut.

STABILISIERUNG VON MIKROBEN

Die Literatur über die Gefriertrocknung von Bakterien umfaßt zahlreiche Stellen über die Stabilisierung von Bakterien während des Gefrier- und Gefriertrocknungsverfahrens durch Additive, häufig Zucker. Im vorliegenden Verfahren trug der Zusatz von Saccharose und Dextrose zur Polymer-Zellmischung vor der Verarbeitung zur Stabilisierung der Gram-negativen Bakterien bei. Versuche zur Einkapselung von Pseudomonas fluorescens zeigen, daß, wenn unbehandelte Zellen bei einer Konzentration von 10&sup9; pro ml vorliegen, nach der Einkapselung die Lebendzahlen 10&sup6; CFU pro ml betrugen. Das Zusetzen von 1% Glucose oder Saccharose zur Mischung vor der Einkapselung führte jedoch zu Ausbeuten von sogar 108 CFU/ml aus Mischungen, die ursprünglich 10&sup9; CFU/ml enthielten.
Die Einkapselung des Fungus Alternaria cassiae war nicht erfolgreich, bis eine Vorbehandlung für den Fungus gefunden wurde. Ohne Vorbehandlung überlebte keine der Konidien das Gefrierverfahren. Mit der Vorbehandlung überlebten 50% der Fungi oder mehr das gesamte Einkapselungsverfahren. Die Vorbehandlung besteht aus dem Eintauchen der Konidien in einer 6 M Sorbit-Lösung während 1 oder 2 h vor dem Mischen der Konidien mit der Polymer-Lösung. Bei der mikroskopischen Untersuchung schienen Sporen, die vorbehandelt waren, nicht so leicht wie unbehandelte Sporen zu netzen. Es wird angenommen, daß das verzögerte Netzen zu geringeren Schäden für die Konidien führt, wenn das Gefrieren eintritt. Es funktioniert auch eine Vorbehandlung unter Verwendung von Polyethylenglykol 200.

HERSTELLUNG VON KÜGELCHEN

Es wurde eine Polymer-Mischung hergestellt, die aus 5% PVOH (78 K MG), 1,5% PVOH (125 K MG), 3,5% PVOH (10 K MG), 0,1% Proteasepepton #3, 0,05 M Na&sub2;HPO&sub4; und 20% Aluminiumoxid bestand. Die Viskosität dieser Mischung betrug 360 mPa·s (360 cps). Unter Verwendung der in Fig. 1 veranschaulichten Düse wurden Kügelchen hergestellt. Ein die Polymer-Mischung enthaltender Behälter wurde gefüllt und unter einen Druck von 48,3 kPa (7 psig) gesetzt. Drücke von 13,8 bis 103,4 kPa (2 bis 15 psig) wurden in Abhängigkeit vom verwendeten Polymer und der gewünschten Größe der Kügelchen eingesetzt. Ein Ventil wird geöffnet, wodurch ermöglicht wird, daß das Polymer zur Spitze hinunterfließt. Spülgas aus befeuchtetem Stickstoff wird zum Aufbrechen des Polymerstroms und Bildung der Kügelchen verwendet. Der Spülgasstrom betrug 3 Standard-Liter/Minute (slpm). Die Kügelchen wurden in Hexan bei -30 bis -35ºC gesammelt und dann gefriergetrocknet. Die getrockneten Kügelchen wurden gesiebt, und es wurde gefunden, daß sie die folgende Verteilung aufwiesen: zurückgehalten auf 0,85 mm Mesh, 17,2%; auf 0,425 mm Mesh, 63,6%; auf 0,250 mm Mesh, 16,7%; und auf 0,150 mm Mesh, 2,5%.
In einem anderen Versuch wurde eine Polymer-Mischung mit 10% PVOH (25 K MG), 20% Aluminiumoxid, 0,1% Proteasepepton #3 mit einer Viskosität von 48,8 mPa·s (48,8 cps) bei einem Druck von 75,85 kPa (11 psig) am Behälter und 6 slpm Spülgas zerstäubt.
Die Kügelchen von diesem Versuch waren wie folgt verteilt: 1% auf 0,85 mm, 1,8% auf 0,425 mm, 32% auf 0,25 mm, 40% auf 0,125 mm, 18% auf 0,075 mm und 8% auf weniger als 0,075 mm.

DOTIEREN VON PVOH-KÜGELCHEN MIT ANDEREN POLYMEREN

Eine Polymer-Mischung wurde hergestellt, die aus 5% PVOH (78 K MG), 1,5% PVOH (125 K MG), 3,5% PVOH (10 K MG), 0,1% Proteasepepton #3, 0,05 M Na&sub2;HPO&sub4; und 20% Aluminiumoxid bestand.
Diese Polymer-Zusammensetzung wurde in 4 Chargen von 120 g geteilt, denen folgendes zugesetzt wurde: zu Charge 1) 2 g PVP (40 K MG); zu Charge 2) 4 g PVP (40 K MG); zu Charge 3) 6 g PVP (40 K MG); und zu Charge 4) 2 g PEG8000. Aus diesen Mischungen wurden Kügelchen hergestellt und mit Kügelchen, die ohne zugesetzte Polymere erzeugt wurden, hinsichtlich ihrer Stabilität in Wasser verglichen. Die Kügelchen wurden auf eine Glasplatte gegeben, unter einem Stereomikroskop bei 20 · untersucht, dann wurde ein Tropfen Wasser zugesetzt und das gegebenenfalls eintretende Lösen beobachtet. Charge 1 löste sich schneller als die undotierten Kügelchen. Charge 2 und 3 lösten sich etwas rascher als Charge 1, der Unterschied zwischen 2 und 3 war jedoch nicht feststellbar. Charge 4 löste sich sehr schnell.

EINKAPSELUNG ZUR ABGABE AN DEN BODEN UNTER VERWENDUNG EINES SOJABOHNENWURZELN KOLONISIERENDEN BAKTERIUMS

Zellen (ein Stamm von Pseudomonas fluorescens, von dem bekannt ist, daß er Sojabohnenwurzeln kolonisiert) werden 16 h aus einem standardisierten Inoculum (5 · 10&sup7; CFU/ml) gezüchtet. Das Medium der Wahl ist King's B mit zugesetztem Rifampicin bei 50 ug/ml. Die Verwendung eines M9-Minimalmediums führt zu einer drastischen Abnahme der Zellenlebensfähigkeit von 5 log nach der Einkapselung. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet und in einer geringen Menge an Überstandsfluid resuspendiert. In den meisten Fällen wird das Volumen an suspensionsfluid derart bestimmt, daß es vorzugsweise nicht mehr als 5% des Volumens der Polymer-Lösung beträgt, obwohl es ohne Schwierigkeit sogar 20% betragen kann. Die Zellen werden mit einer Lösung gemischt, die 10% (M/V) Poly-(vinylalkohol) (MG 25 000, 98% hydrolysiert), 20% Al&sub2;O&sub3;, 0,1% Proteasepepton #3 (Difco Co.) und 1% Dextrose enthält. Sofort nach dem Mischen wird die Lösung durch Sprühen aus einer Sprühdüse in kaltes Hexan zu Kügelchen geformt. Die so gebildeten Kügelchen werden aus dem Hexan gesammelt und gefriergetrocknet. Die Zellenlebensfähigkeit in der Polymer-Mischung betrug 1,3 · 10¹&sup0; CFU/ml. Nach dem Gefriertrocknen der Kügelchen wurde die Lebensfähigkeit mit 1,3 · 10&sup8; CFU/ml bestimmt. In einem typischen Kolonisierungstest werden Kügelchen zum Beimpfen des Bodens "in Furchen" in einem Topf bei einer Rate von 0,2 g Kügelchen pro Topf verwendet. Kontrollen sind zellenfreie Kügelchen (negative Kontrolle) und flüssiges Inoculum (positive Kontrolle). Pflanzen (Sojabohnen Williams-Varietät 79) werden zwei Wochen wachsen gelassen und dann die Wurzeln geerntet, und die Wurzelebene wird auf die Kolonisierungsbakterien getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß kein Unterschied bei der Kolonisierung der Wurzeln (wie durch Duncan's Multiple Range Test for Variable bestimmt) zwischen frisch gezüchtetem flüssigen Inoculum und eingekapselten Zellen vorlag. Beide kolonisierten bei Werten von ungefähr 2 · 10&sup5; CFU/g Wurzel.

EINKAPSELUNG ZUR ABGABE AN BLÄTTER UNTER VERWENDUNG EINER BLATTKOLONISIERENDEN PSEUDOMONADE

Zellen einer blattkolonisierenden Pseudomonade wurden gezüchtet und geerntet, wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, daß zwei Medien verwendet wurden, King's B (ohne Rifampicin) und Nährstoffbrühe (Difco). In King's B gezüchtete Zellen wurden der Polymer-Mischung (10% (M/V) PVOH, 25 000 MG) bei 9,5 · 10&sup5; CFU/ml zugesetzt und lagen in den fertigen Kügelchen bei einer Konzentration von 2 · 10&sup9; CFU/ml vor. In Nährstoffbrühe gezüchtete Zellen wurden bei 5,5 · 10&sup8; CFU/ml in die Polymer-Mischung gemischt und lagen in den fertigen Kügelchen bei einer Konzentration von 2,5 · 10&sup7; CFU/ml vor. Diese Kügelchen sind zur Abgabe an die Blattfläche auf folgende Weise geeignet. Die Kügelchen werden in einer PVOH-Lösung im Konzentrationsbereich von etwa 0,25 bis 10% (M/V) und vorzugsweise etwa 0,5% bis 2% (M/V) suspendiert. Die Lösung kann anderes Material enthalten, das geeignet ist, die Haftung der Kügelchen an einer bestimmten Blattfläche zu verstärken. Die Lösung kann unter Verwendung herkömmlicher Sprühausrüstung auf die Blattflächen gesprüht werden.

EINKAPSELUNG EINES BACILLUS SP ZUR ABGABE AN DEN BODEN

Ein Bacillus sp mit einer Wirksamkeit gegen den Maiswurzelwurm wurde in einem 1% Trypton-1% Glucose-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von 20 ml einer 24 h alten Subkultur für jeweils 300 ml Medium beimpft. Die Zellen wurden 24 h bei 30ºC bei 200 UpM gezüchtet. Die Kulturen wurden durch Zentrifugieren geerntet, in Wasser resuspendiert und mit einer hergestellten Polymer-Mischung gemischt, wobei Endkonzentrationen in der Polymer-Mischung von 10% PVP, 30% Al&sub2;O&sub3; und 2% Proteasepepton #3 erhalten wurden. Dow Antifoam C (Dow Chemical, Midland, MI) wurde zur Unterdrückung einer Schaumbildung zugesetzt. Die Kügelchen wurden unter Verwendung einer Sprühspitze und durch Sprühen in Hexan bei -30ºC hergestellt. Die Kügelchen wurden aus dem Hexan gesammelt und gefriergetrocknet. Die Kügelchen wurden getestet, und es wurde gefunden, daß sie 5 · 10&sup9; CFU/1,5 g Kügelchen enthielten. Die Kügelchen wurden auf Töpfe verteilt, in denen Mais angepflanzt worden war. Als der Mais eine geeignete Größe aufwies, wurden Maiswurzelwürmer zugegeben, und der Mais wurde wachsen gelassen. Die Schadensanalyse erfolgte durch das Wurzelgewicht (je weniger Gewicht, desto höher der Schaden). Die Kontrolle waren Kügelchen ohne Zellen bei einer Rate von 1,5 g/Topf. Die Kügelchen wurden bei 1,5, 4,5 und 7,5 g/Topf zugesetzt. Die positive Kontrolle war Furadan- Insektizid. 8 Wiederholungen fanden für jede Behandlung statt. Die Ergebnisse zeigten, daß die eingekapselten Zellen ausgesetzten Pflanzen signifikant höhere Wurzelgewichte zeigten als die Furadan-Kontrolle bei einem Zusatz bei der Rate von 4,5 und 7,5 g pro Topf.

EINKAPSELUNG VON BACILLUS THURINGIENSIS VAR. KURSTAKI

Eine 200 ml Kultur von B. t. var. kurstaki wurde zu einer Zellpaste reduziert, die hauptsächlich Sporen und Toxinkristalle enthielt. Diese Paste wurde unter Verwendung von sterilem Wasser auf das ursprüngliche Volumen von 200 ml resuspendiert, und 1 ml dieser Suspension wurde zu 100 ml einer 10% Polyvinylalkohol- Lösung zugesetzt. Kügelchen wurden unter Verwendung der obigen Polymer-Mischung gebildet, wie vorstehend beschrieben. Diese Kügelchen wurden auf die Wirksamkeit gegen die Tomatenschwärmerraupe getestet. 1 g Kügelchen wurde in 10 ml Wasser suspendiert, und 0,05 ml dieser Lösung wurden auf jedes von 6 Tomatenblättern gestrichen. Die Blätter wurden mit einem Stück Filterpapier, das mit entionisiertem Wasser befeuchtet worden war, in eine Petrischale gegeben. 5 Larven wurden in jede Schale gesetzt. Eine positive Kontrolle bestand aus nicht-eingekapseltem B. t., der bei der gleichen Konzentration verwendet wurde, und eine negative Kontrolle aus Kügelchen ohne Sporen oder Toxinkristalle. Der Test wurde nach 4 Tagen ausgewertet. In dem Test, bei dem Kügelchen ohne Zellen verwendet wurden, lebten 27/30 Larven. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Kügelchen selbst nicht toxisch für die Larven waren und ihre Nahrungsaufnahme nicht hemmten. In den Tests mit B. t. (sowohl eingekapselt als auch nicht-eingekapselt) starben alle Larven.

EINKAPSELUNG DES FUNGUS ALTERNARIA CASSIAE

Ausgangsmaterial waren Konidien von Alternaria cassiae in Form eines trockenen Pulvers. Eine 0,13 g Probe wurde in ein Teströhrchen mit einem oberflächenaktiven Mittel in 6 M Sorbit gegeben, gut gemischt, um die Sporen zu dispergieren, und ungefähr 1 h stehengelassen. Dieses vorherige Eintauchen verlangsamt das Netzen der Sporen, wenn sie in die wasserlösliche Polymer- Lösung gegeben werden, und ermöglicht ihnen, dem Gefrierabschnitt des Einkapselungsverfahrens standzuhalten. Ohne diese Vorbehandlung geht jede Lebensfähigkeit verloren. Vorbehandelte Sporen wurden mit 5% Polyvinylalkohol-Lösung gemischt und sofort in Hexan bei -30ºC gesprüht, wobei Kügelchen gebildet werden. Die Kügelchen werden gerade bis zur Trockene gefriergetrocknet. Eine Übertrocknung bewirkt den Verlust der Lebensfähigkeit. Die Lebensfähigkeit der eingekapselten Sporen variiert mit dem Ausmaß des Trocknens und liegt im Bereich von 20 bis 90%. Diese Kügelchen werden mit Wasser oder gewünschten Adjuvantien gemischt und auf die Blattfläche von Kanadischer Gänsekresse gesprüht. Eingekapselte Sporen zeigen eine geringfügig verzögerte Keimung und können einige h länger überleben, wenn sie mit Wasser gemischt werden, was ein Vorteil beim Besprühen von Pflanzen im Feld ist. Poly-(vinylalkohol)-Kügelchen haften fest an der Blattfläche, was sie regenfest macht. Eingekapselte Sporen können Kanadische Gänsekresse-Pflanzen infizieren und abtöten. Mit Bezugnahme auf Fig. 5 sind PVOH-Kügelchen gezeigt, die an der Blattfläche einer Grieswurz haften, sogar nachdem die Blattfläche mit Wasser abgespült wurde.

Claims

1. Verfahren zur Einkapselung von biologischem Material, welches umfaßt:

a) Mischen des biologischen Materials mit einer wässerigen nicht-ionischen Polymer-Lösung, in der das Polymer in einer Konzentration von zumindest 3% M/V vorliegt;

b) Bilden von Polymerkügelchen durch das tropfenweise Zusetzen der Mischung von Teil (a) in ein mit Wasser nicht mischbares Nicht-Lösungsmittel für das Polymer, wobei das Nicht-Lösungsmittel bei einer Temperatur gehalten wird, die ausreicht, um das Kügelchen zu gefrieren, jedoch nicht so niedrig ist, um einen Gefrierbruch zu bewirken; und

c) Trocknen der Kügelchen von Schritt (b) zur Entfernung im wesentlichen des gesamten ungebundenen Wassers in den Kügelchen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Lösung Polymer in einer Konzentration zwischen 5 und 15% (M/V) enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem im wesentlichen das gesamte ungebundene Wasser durch Gefriertrocknen entfernt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, welches weiters das Vorliegen eines Verdichtungsmittels in der Polymer-Lösung umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem das Verdichtungsmittel Aluminiumoxid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das Polymer Poly- (vinylalkohol) ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das Polymer Polyvinylpyrrolidon ist.

8. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das Polymer Dextran ist.

9. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das Polymer derivatisierte Cellulose ist.

10. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das biologische Material eine Mikrobe ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem die Mikrobe ein Bakterium ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem die Mikrobe ein Fungus ist und der Fungus vorbehandelt wird, um ein Netzen während der Einkapselung zu verzögern.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem das Bakterium ein Stamm von Bacillus thuringiensis ist.

14. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem das Bakterium ein Pseudomonas sp. ist.

15. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem der Fungus Alternaria cassiae ist.

16. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das biologische Material ein Protein ist.

17. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem das biologische Material ein Peptid ist.

18. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas fluorescens NRRL B-15132, NRRL B-15133, NRRL B-15134 und NRRL B-15135 ausgewählt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem das Bakterium Agrobacterium radiobacter ist.

20. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem das Bakterium Pseudomonas fluorescens ist.

21. Zusammensetzung, welche ein wasserlösliches nicht-ionisches Polymer und biologisches Material umfaßt, welche Zusammensetzung im wesentlichen frei von ungebundenem Wasser ist und eine nichtbrüchige, schwammige, poröse Struktur aufweist.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin das biologische Material eine lebensfähige Mikrobe ist.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin das biologische Material aus der Gruppe bestehend aus Proteinen und Peptiden ausgewählt ist.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 21, welche weiters ein Verdichtungsmittel umfaßt.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin das Polymer aus der Gruppe bestehend aus Poly-(vinylalkohol), Polyvinylpyrrolidon, Dextran und derivatisierter Cellulose ausgewählt ist.

26. Feste Zusammensetzung, welche ein nicht-ionisches Polymer, das bei Temperaturen von weniger als 80ºC nicht leicht gelöst werden kann, jedoch bei Temperaturen von mehr als 80ºC löslich ist, und eine lebensfähige Mikrobe umfaßt, welche Zusammensetzung im wesentlichen frei von ungebundenem Wasser und in Wasser bei Temperaturen von weniger als 40ºC im wesentlichen unlöslich ist.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, worin das Polymer Poly- (vinylalkohol) ist.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 26, mit einem Mikrobengehalt zwischen etwa 0,01 und 50% Masse der Zusammensetzung.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 26, welche weiters ein Verdichtungsmittel umfaßt.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, worin das Verdichtungsmittel Aluminiumoxid ist.

31. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das Aluminiumoxid eine relativ kleine Oberfläche aufweist und unbehandelt ist.

32. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das Aluminiumoxid eine mittlere Teilchengröße von weniger als 10 um aufweist.

33. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das Aluminiumoxid mit einem Zucker oder anderen Mittel vorbehandelt wird, um die Wechselwirkung des Aluminiumoxids mit Hydroxylgruppen am Polymer zu reduzieren.

34. Zusammensetzung nach Anspruch 30, worin das Aluminiumoxid eine relativ kleine Oberfläche aufweist und unbehandelt ist.

35. Zusammensetzung nach Anspruch 30, worin das Aluminiumoxid eine mittlere Teilchengröße von weniger als 10 um aufweist.

36. Zusammensetzung nach Anspruch 30, worin das Aluminiumoxid mit einem Zucker oder anderen Mittel vorbehandelt wird, um die Wechselwirkung des Aluminiumoxids mit Hydroxylgruppen am Polymer zu reduzieren.

37. Verfahren zum Aufbringen von biologischem Material auf die Blattfläche von Pflanzen, welches das Besprühen der Blattflächen mit einer Mischung, die die Zusammensetzung nach Anspruch 26 suspendiert in einer wässerigen Lösung von Poly-(vinylalkohol) enthält, umfaßt.

38. Verfahren nach Anspruch 37, bei welchem die Poly-(vinylalkohol)-Lösung eine Konzentration zwischen etwa 0,25 und 10% (M/V) aufweist.

39. Verfahren nach Anspruch 37, bei welchem die Poly-(vinylalkohol)-Lösung eine Konzentration zwischen etwa 0,5 und 2% (M/V) aufweist.

40. Verfahren zum Aufbringen von biologischem Material auf die Blattfläche von Pflanzen, welches das Besprühen der Blattflächen mit einer Mischung, die die Zusammensetzung nach Anspruch 27 suspendiert in einer wässerigen Lösung von Poly-(vinylalkohol) enthält, umfaßt.

41. Verfahren nach Anspruch 40, bei welchem die Poly-(vinylalkohol)-Lösung eine Konzentration zwischen etwa 0,25 und 10% (M/V) aufweist.

42. Verfahren nach Anspruch 40, bei welchem die Poly-(vinylalkohol)-Lösung eine Konzentration zwischen etwa 0,5 und 2% (M/V) aufweist.

43. Zusammensetzung, welche die Zusammensetzung nach Anspruch 26 suspendiert in einer wässerigen Poly-(vinylalkohol)-Lösung umfaßt.

44. Zusammensetzung nach Anspruch 43, worin die Poly-(vinylalkohol)-Lösung eine Konzentration von 0,25 bis 10% (M/V) aufweist.

45. Zusammensetzung nach Anspruch 43, worin die Poly-(vinylalkohol)-Lösung eine Konzentration von 0,5 bis 2% (M/V) aufweist.