JPH01304883A - カプセル封入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的材料のカプセル封入に関する。さら
に詳しくは、本発明は、微生物（細菌ならびにかび）お
よびタンパク質のよ５な生物学的材料金、その材料の農
業用剤（たとえば除草剤、殺虫剤等）としてまたは他の
ある毬の目面たとえば固定化触媒としての利用性ヲ鍋め
るために、カプセル封入する方法に関する。

漬菜用製品としての微生物の使用は、微生物の効率的な
送達システムを欠くために妨げられてきた。ファーメン
タ−内の倣ｇＥ、物をそのまま議場に使用することはで
さない。ファーメンタ−から議場まで倣生慄の活性を維
持するためのシステムがなげればならないし、製品は農
場に、ｆＦ谷さルるもの、有用なものでなければならな
い。そのためには、土蟻中で使用できる必要がるり、ま
た山勘を進じてざえ葉に付層しているものでなければな
らない。

微生換金カプセル封入する本発明の方法には５つの利点
がめる。すなわち、（１）カプセル封入麦の生育可能、
活性微生物のきわめて高い回収率、（２）完成製品では
微生物が珠存に通した休眠状態に置かれている、（３）
カプセル封入された微生物処方は流動性金有し、標準的
装置音用いた利用かり能である、（４）カプセル封入微
生物は葉の表面に付層させることができる、（５）光分
解を受けやすいおよび／または＃累的に不安定な生物学
的材料の送達手段を提供すること、である。

Ｂｏｓｈａｎのフルイン鍍塩ビーズ法（”　Ａｌｇｉｎ
ａｔｅＢｅａｄｓ　ａｓ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｉｎｏ
ｃｕｌａｎｔ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｆｏｒＳｌｏｗ　　
Ｒｅ１ｅａｓｅ　　ｏｆ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ　　ｔｈ
ａｔ　　Ａｆｆｅｃｔ　　ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈ　”
、Ａｐｐｌｉｅｄ　＆−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏｇｙ、　　ＶｏＬ　　５　　ｌ
、ｍ５、　ｐｐ　　Ｉ　　Ｕ　６９〜１０９８．１９８
６）のよ５な従米技俯と異なり、カプセル封入過程の間
に失われる細胞は通常１．５　ｌｏｇ未満であるから、
再生育工程を必要としない。再生育工程を必要としない
から、ビーズの構造はポリマーおよびビーズ製造過程に
よって制御され、生育する仮生物の影響に支配されるこ
とがない。これによってより均一で予期どおりの構造、
ならびにビーズのポリマー組成および微細構造によって
決定される放出像が達成される。

Ｂｏｓｈａｎのアルイン戚塩ビーズ法では、生存細菌数
は６〜４１０ｇはど低下し、ビーズを凍結乾燥したとき
にはビーズ１１めたり高々１０７個の細胞しか残らない
。本発明の方法に従うと１０８〜１０９個の収量が達成
され、しかもまだ負荷能力の限界に堰していない。ビー
ズ１ｙあたり生育可能？Ｉａ胞１０１２個の微生物負荷
も可能である。

第１図は、ビーズの製造に有用なノズルの断面を図解的
に示す図である。

第２図は、典型的なＰｖＯＨビーズの全体図および断面
図である。

第３図は、典型的なＰＶＰビーズを示す。

第４図は、典型的なＨＰＣビーズを示す。

第５図は、雨の後、葉の表面に付層しているＰＶＯＨビ
ーズを示す。

発明の説明 本発明は、生物学的材料のカプセル封入方法を提供する
ものである。本発明の方法によれば、生物学的材料は、
非イオン性ポリマーが少なくとも３　ｖ／ｖ　％の一度
で存在する水性ポリマー溶液と混合する。この混合物を
、水弁混合性でそのポリマーの非溶媒中に、ビーズが急
速に凍結するのに十分な温度であるがポリマービーズの
凍結破裂を生じるほどは低くない温度に維持しながら？
両肌して、ビーズを生成させる。生物学的材料を貧有す
るポリマービーズを次に乾燥し、ビーズによまれる実質
的にすべての非結合水金除去する。

本発明の一態様は、微生物を有用な漬業用剤とすること
を可能にする。本発明のポリマービーズは、微生ｖＥｔ
−休眠状態で市場に送達する。ビーズは、土遺または植
物の葉への送達に適当なように製造できる。ざらに使用
されるポリマー材料は生物分解性であり、ビーズは栽培
もしくは殺虫箱を介して乾燥状態でまたはＩ！Ｊｇノズ
ルを経て湿潤状態で通用できる。

少なくとも６％ｗ／ｖの溶解度忙有し、カプセル封入し
ようとする微生物に対して有害でない水溶性非イオ／ポ
リマーを使用できる。非イオン性ポリマーとは、実質的
に純電荷をもたない中性ポリマーを意味する。ポリマー
の濃度は５〜１５チが好まじり。適当なポリマーには、
ポリ（ビニルアルコール）　（ＰＶＯＨ）　、好ましく
は分子ｔｍ囲約ｉｏ、ａｏｏ　〜１２５，０００．７Ｊ
ＩＩ水分解率８５〜１００チ；ポリビニルピロリドン（
ｆｆＰ　）　、好ましくは分子童範囲約ｉ　ｏ、ｏ　ｏ
　ｏ〜５６０，０００　；デキストラン、好ましくは分
子ｆ範囲約ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ〜２４９．０００　；お
よび各楕セルＱ−ス誘纒体ポリマー、たとえばヒドロキ
シゾロピルセルロース（ＨＰＣ）、好ましくは分子量範
囲約６　［１，０［Ｊ　Ｏ〜１．０００，０００が包Ｓ
される。

乾燥ＰＶＯＨは冷水には容易には溶解しないので、ＰＶ
Ｏ）Ｉビーズは膨潤や破砕が起こっても溶解することは
ない。膨潤や破砕の程夏は使用するＰＶＯＨの分子量に
よって請願でさる。ＰＶＯＨビーズの膨潤および破砕は
ｐｖｏＨの分子量が大さくなるはと低下すル。乾燥ＰＶ
ＯＨは、水性ＰＶＯＨ混合＊ｔ８０゛Ｃ以上、好ましく
は沸点まで加熱することにより可溶化される。ＰＶＯＨ
で製造したビーズは４０″Ｃ以下の温度では実質的に水
に不躊性である。ＰＶＯＨビーズの統合性（溶解率）は
、他の冷水溶解性ポリマー、たとえばポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ　）ｆ　ＰＶＯＨに配置することによっ
て低下させることができる。ｐｖｐ　、セルロース誘尋
体およびデキストランから製造されたビーズは、冷水ま
たは室温の水に入れると溶解する。

第２図は、典型的なＰＶＯＨビーズの全体図、およびス
ポンジ休の多孔性構造を示す断面図である。

第３図は典型的な（１０チｗ／ｖ　）　ｐｖｐビーズで
ある。５ｇ４図は典型的な（１０％町〜、分子量６０、
ＯＵ　Ｏ）　）ＩＰＣビーズである。

ポリマーの分子量はげ一ズの機械的強度に影響する。一
般的に、ビーズの強度は分子量の壇〃口とともに増大す
る。たとえば、′１８棟分子倉のｆｆＯＨの混合物から
製造されるが、平均分子量６１，００００Ｐ’１０Ｈビ
ーズは、水に礪刀口された場合、膨潤するものの、はと
んど破砕されることはない１分子７２５．０００のＰｖ
ＯＨから製造されるビーズは水中で速やかに破砕され、
溶解する。分子量的１ｏ、ｏ　ｏ　ｏ未満ではビーズは
きわめて砕けやすくなる。一般的に、使用するＰｖＯＨ
の分子量が増加すると破砕性は低下する。この構造的読
会幼果は、ビーズマトリックスからの微生物の放出′ｔ
−変化させるのに利用できる。たとえば、ビーズの破砕
は、それに官有された生物学的物質のより速やかな放出
を生じる。

本発明の独符な性質のひとつは、ビーズを凍結ｖ！Ｌ凍
させ、その形態を珠待させることがでさる点である。こ
れは、現在細胞の一足化に用いられている材料（アガー
ル、アルイン威項等）に比べて、使用されるポリマーが
＾ｄ度水に９浴で、粘度が低いために可能となる。した
がって、ビーズは、水を除去したのちにも有用な強度を
示すのに十分なポリマー（〉６％η〜〕で製造すること
ができポリマーおよびその分子量によっては、ポリマー
−度をその溶解＠反まで上昇させることもできる。

しかしながら、多くの場合、Ｃ−ズの強度を約１５％Ｗ
々以上に増大させても無用で、める楕の高分子量ポリマ
ーはこの濃度以上では粘稠すざてビーズの製造が峻しく
なる。

したがって、本発明は他の感体として、水浴性非イオン
性ポリマーと生物学的材料からなり、非結合水を実質的
に富まず、破砕されにくい、スポンジ休の多孔性構造を
有する組成物（第２図〜第４図参照）′ｊｋ提供する。

さらに他の感体として、本発明は、８０”Ｃ未満の温度
では容易に溶解しないが８０　’Ｃを越える温度では溶
解可能な非イオン性ポリマーと生物学的材料からなり、
非結金水ｆｆ：芙買的に′ざまず、４０−Ｃ未満の温度
では夷買的に水に不治性の固体組成物を提供する。生物
学的材料が生１ｆＯＴ能な微生物である場合、微生物の
Ｂ量は、組成物のυ、Ｌｌ　１〜５０ｉＬ童チとするこ
とができる。

ポリマー溶液は、１５　ｐｓｌｇ　、　　１２１−０Ｖ
Ｃ＆’ｔ＞て６０分間オートクレーブ処理することがで
きる。

多くの揚曾、これは、望ましくない倣王吻の夾雑を回遊
できるので有利で必る。冷却時にＭ漱を攪拌すると、表
面の薄膜形成金避けることができる。

４膜は、浴液ｒビーズに〃ロエする猷に妨害となる。

栄養系および／または加嵐剤はオートクレーブ処理の前
に添加することができる。別法として、栄女巣は成因濾
過し、オートクレーブ処理後に無菌的に刃口えることも
できる。粘度は２Ｕ〜１，０００Ｃｐの範囲に維持する
ことが好ましい。しかしながら、粘度に対する１がｊ限
の春は、採用されたビーズのＪＡ造方法によって指示さ
れる。

ポリマー溶液の−はオートクレーブ処理の間に変動する
ことがめるので（たとえばアセテート・残基がＰＶＯＨ
から刃口水分解されて、浴液中Ｖ′ｃ酢ｇ＆を生じるン
、ｆ９Ｔ望の−、通常は６〜７．５を維持するようｒこ
、ポリマー溶液は緩鴬化する必女がある。

使用でさる緩衝剤には微生物に悪影４１与えない任意の
生理的に許容さｎる緩衝剤が包含さルる。

好ましい緩衝剤は０．０５　Ｍ　リン戚ナトリウム緩衝
液である。

加厘剤のｂ５加は、大抵の場合、処方さルたビーズの比
ｊｊＬを増大させ、ビーズの取扱い（ｉ−容易にするの
で有利である。微生物の活！！Ｅ＆Ｃ悪形＃金与えない
任意の加厘剤が使用できる。適当な加嵐剤には、シリカ
、シリカゾル、ベントナイトおよびアルミナが包含され
る。アルミナはとくに好ましい。

アルミナは、ポリマー溶液に添加する前に、水および楯
たとえばデキストロースまたはスクロースと完全に混合
する。これによって、アルミナ金よく分散させ、楯によ
るアルミナの前処理はアルミナとポリマー上のヒドロキ
シル基との相互作用全低下させる０ポリマーとアルミナ
の相互作用で溶液は糸を引くようになる〕混合かめる。

＋：兄明の方法を用いれば、ダラム陽柱耐およびグラム
陰注函、ならびにかびをカプセル封入することができる
。微生物の例としては、バチルス・スＩ）７’ｆ’工ｙ
　シス（８ａｃｉｌｌｕｓ　　仙且ロ旦掃、二且狐）；
シュードモナス（カー些ｃｌｏｍｏｎａｓ橋の微生物た
とえば寄託番号ＮａＲＬＢ１５１５２、ＮＲＲＬ　Ｂ−
１５１３５、ＮＲＲＬ　Ｂ−１ｂ　１６４　＆工びＮＲ
ＲＩ＝　Ｂ−１５１３５、ＡＴＣＣ６９ＢＯ２のシュー
ドモナス・フルオレセンス（−亡」冴傷と狡去り−（Ｙ
駁匡並習）：寄託査号ＡＴＣＣ６９８（Ｊ６のアグロバ
クテリウム・ラゾオバクタ−（ユ捜ハｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ　）　；ならびにオルタ
ナリア・カシェ（，４１ｔｅｒｎａｒｉａ　摩Ｉ旦Ｌ■
−）のようなかびの橿を挙げることができる。１奴王吻
はポリマー溶液を型温に冷却したのちＩＩＪ≦加ざルる
。細胞は培養上清から洗浄してもよいが、培養メジウム
中の通常の成分および細胞の産王物がビーズのＡ表金妨
害することはない。微生物が付置な代謝物金座生する場
合には、カプセル封入前に洗浄によって除去することが
好ましい。細胞は、ポリマー浴液と混合する前に、均一
な懸濁歇を得るために少量の載体中に再Ｍ濁する。悪濁
する献体は単に最初の遠心分離の際の上清（培養肉汁）
であってもよく、また凍結および凍結乾燥時に特定の微
生物の生存率を眉大させる特定の処方とすることもでき
る。さらに微生物の除草剤もしくは有害生吻殺ＴＨ，刑
としての利用または標的植物もしくは土櫃に果洛化する
その能力？高める補助ＭＩＪがあｎば、そ几らｔ添加し
てもよい。大違の場合、憑濁孜体の谷量はポリマー溶液
漱の容量の５チを越えないよ５に決定されるのが好まし
いが、２膜１％程度の高容量としてもとくに問題はない
。

微生物は、冷却、凍結および凍祷乾燥によってｍ害を受
けやすい。この傷害が何であるか、これらの傷害がどう
して起こるか、またこのような傷害をどのよ５にして防
止できるかはｆＡ念ながら完全にはわかっていない。グ
ラム陽性醒はグラム原性函よりも保護金要しな−と考え
られてさたが、保護の要否は微生物毎に異なると考える
方が多分正しいように思われる。考慮されるべき因子と
しては、培養細胞の帽代数、生胃速反、生育メジウムの
種類、温【ＥＦの程度および速度、ならびに４１１？ス
トレス以麦の生背方法がある。糖、スギムミルク、グリ
セロール、ジメチルスルホキシドＣＤＭＳＯ）または慣
の凍結保護剤の礪加で培養物を安定化することができる
。各凍結保護剤の幼果はそれぞれに異なり、それらの使
用は紅綬的に決定される。グリセロール、スクロースお
よ□　ＤＭＳＯは広く適用できることが明らかにされて
いる。

かびについても上述した配属が同様に必要であるか、他
の処理も行う必要かめる。カプセル封入過程で、かびの
胞子は大量の水に曝露されることになる。かびの多くは
、水の存在で発芽が刺激されるので、カプセル封入過程
で胞子を水から保護するために前処理を行うことが好ま
しい。胞子を６Ｍソルビタール中に予め浸漬させること
は有効な処理であることが明らかにされている。このよ
うにソルビトールで前処理した胞子は非処理胞子のよう
に容易には湿潤せず、カプセル封入過程を通じて生存す
る。ソルビトールによる前処理が好まし匹が、かび胞子
のポリエチレングリコール（分子ｔ２００）の前処理も
同様に有効である。

ポリマーと微生物または他の土切学的材料からなる上記
混付物が完成したならば、この混合＊１−冷却浴に約−
６０′０で？＃加する。冷却浴は、水非混和性で、ポリ
マーの非溶媒である液体から構成される。冷却浴に用い
られる成体は上述の両性質をもつことが重要である。適
当な非＃Ｉ媒にに、ヘキサン、石油エーテルおよび７レ
オン１１６が包含される。非溶媒としてはヘキサンがと
くに好ましい。

温度もまたＸ要なパラメーターである。温度が高ずざる
と（ｆことえは−１５０）、ビーズの凍結に時間がかか
つて、ビーズの形態は不均一性を欠くことになる。温度
が低すざると（たとえば−８０°Ｃ）、ビーズは形成時
に破裂する。この過程中、熱交換を助けるため、また多
数のビーズが相互に粘層しないで速やかに製造できるよ
うに、非溶媒を攪拌することが好ましい。

非＃媒が水非混和性でもるるといプ条件は、微生物に毒
性を示すほど高−度の非溶媒がビーズ内に浸透すること
を妨げるのに有効でおる。さらに、水混和性非溶媒では
、その中にある程良、ポリマーと水の混合ｗが分散する
ので、ビーズの形成がすぐには起こらない。その結果、
ばらばらの丸いビーズではなく、糸を引いた細長いビー
ズを形成しやすくなる。

＠５［生物の生存率を著しく低下させることのない任意
のビーズ製造方法が、本発明に使用する方法として適し
ている。第１図には、細胞の生存半金低下させることな
く、ビーズの製造に有効に使用されたノズルを示す。開
口部のサイズ、管部の長さ、およびキャップの内側の角
度は、噴霧されるポリマー／微生物混合物および所望の
ビーズの大速さによって適宜変更して用いられる。ノズ
ルはポリマー混合物の貯蔵部に接続される。貯蔵部は一
定の圧力に保持される。使用される圧力も、ポリマー混
仕物の粘度および所望のビーズの大きさに依存する。掃
射気体（好ましくは含湿窒素）はノズル先端の上部から
流入させ、その流速を注意深く請願する。その流速の調
廊は、ビーズの大きさの―卿に肝要である。噴霧された
液体は一１℃に冷却した非溶媒浴に巣められる。非溶媒
浴の温度は角傭墳浴を用いて維持する。このシステムで
は、ビーズの形成に、高圧、大きな圧力降下、熱または
超音波を用いることがなく、細胞にはきわめて穏やかで
ある。したがって、仁の方法では細胞の損傷は全く起こ
らず、生存率の低下は生じない。

凍結したビーズを冷却非溶媒から集め、乾燥させる。ビ
ーズの乾燥には任意の方法を使用できるが、微生物の生
存率の維持が重要な場合には凍結乾燥が好ましい。非溶
媒から回収したならば、ビーズは冷いまま凍結乾燥器に
移す。凍結乾燥器の構成および乾燥するビーズの量に応
じて、凍結ビーズの乾燥には８〜４８時間を要する。乾
燥が不完全な場合は凝集やビーズの統合性の貴失が起こ
る。乾燥しすぎると生存能が失われる。ビーズは非結合
水の実質的にすべてが除去されるまで凍結乾燥すること
が好ましい。微土切のカプセル封入の場合には、乾燥ビ
ーズ中には約１〜２重ｔチの水分が残留する。

以下の実施例により、本発明の実施態様をさらに詳細に
ａ１２関するが、これらはいかなる；を床においても本
発明の範囲の限定を意図するものではない。

刃口１１沖ｊの　訪≦刀ロ ビーズは、休々な〃０恵剤たとえばベントナイト、シリ
カ、シリカゾルおよびアルミナ金剛いて形成させること
ができる。１０　％　ｖｒ／ｖ　ＰＶＰに１０％のベン
トナイト倉加えて製造したビーズでは、密度はＵ、０９
み勺（１０チη〜ｐｖｐだけの場合）から０．１４　ｆ
！／ｄにわずかに増力口する。１０チ以上のベントナイ
トを添加すると粘度が増加し、最終製品の密度の増加に
よる利点よりも粘度の高い溶液の取扱いの難しさの万が
問題になる。シリカは少なくとも２０％まで添カロでき
、２０％？Ｓ度における最終製品の密度は約０．２５９
Ａでめった。この程度の一度のシリカは、取扱りが難し
いほどまでに粘度を増加させることはなく、またカプセ
ル封入される細胞に毒性を示すこともなかった。シリカ
ゾルｔシリカと同磯度添加しても類似の結果が得られた
。しかしながら、シリカゾルを礒加すると、ポリマー、
シリカゾルおよび細胞の混合物の−は著しく低下した。

−の変化は、カプセル封入する細胞および／またはタン
パク質に悪影＊１与えることがある。

密度が大きいので、アルミナはビーズの密度で著しく上
昇させる。好ましい種類のアルミナは、非処理で表面積
の大きくないアランダムである。

表面積の大きいアルミナを使用すると、生育可能細胞数
が２１ｏｇ以上も低下する。ｐｖｐおよびＰＶＯＨビー
ズのいずれにも６０チまでのアルミナを使用できる。そ
の濃度６０％を用いたビーズは約１．８＆Ａｌの密度を
示し、流動性は良好で取扱いは容易であった。粒子径１
０ミクｃ１７またはそ几以下のアルミナが好ましく、ポ
リマー混合物に良好な処理狩性を確実に付与し、ビーズ
形成開口部とよく通過して詰まりを生じることがない。

この固体をポリマー溶液に分散するため、また園体金添
７Ｊ１１前に予め湿潤させるためには、すべての場合、
尚速ミキサーまたはプレンダーの使用が必要でめった。

アルミナの前処理 アルミナ金ポリ（ビニルアルコール）浴液に脩力口する
と、溶液がめる程匣粘層性になる。これは、電子共荷−
ετもつアルミナとｐｖｏＨ上のヒドロキシル基との間
の配位効果によるものと考えられる。

ビーズの製造に際して、ポリマーは最終孟の水の％に４
解した。残りの水に５％のデキストロースを加え、この
浴ｆｒｉ、金用いてアルミナ金子め湿潤させた。デキス
トロース中のヒドロキシル基がアルミナと相互作用し、
その結果、ポリマーを予め湿潤させたアルミナと合した
とき、アルミナとポリマーの相互作用は低減した。スク
ロースも使用でき、同等の効果が得られた。

微生物の安定化 細菌の凍結乾燥に関する文献には、凍結および凍結乾燥
ｉ４程における添加物、多くの場合循による細菌の安定
化について多くの論及がある。本発明の方法の場合、ポ
リマー細胞混合物に、その処理前、スクロースおよびデ
キストロースを添加することは、ダラム陰性困を安定化
に役立った。シュードモナス・フルオレセンスのカプセ
ル封入実験では、非処理細胞を１０’個肩の一度で存在
させた場合、カプセル封入後の生育町雇細／＠数は１０
’ｃｆｕ７ｆｎｌでめった。しかしながら、カプセル封
入前に混合物に１％グルコースまたはスクロースを添加
すると、最初１Ｑ９ｃｆｕ７（ｎｌを貧有した混合物か
ら１０８ｃｆｕＡ１／の高い収率が達成された。

かび、オルタナリア、カシ二のカプセル封入は、かびの
前処理法が考案されてはじめて成功した。

前処理金しないと、凍結処理後に生存する分生胞子は認
められなかった。前処理を行プと、５０％またはそれ以
上のかびがカプセル封入過程終了後も生存した。前処置
は、分生胞子とポリマー溶液の混合前に１〜２時間、分
生胞子を６モル濃度のソルビトール溶液に浸漬するもの
である。顕仮腕で調べると、前処理した胞子は、非処理
胞子はど容易には湿潤しないことがわかった。湿潤の遅
延が凍結を生じた場合の分生胞子に対する禍害を低減さ
せるものと考えられる。ポリエチレングリコール２００
ｔ−用いた前処理も同僚に有効である。

ビーズの装造 ５％ＰＶＯＨ（分子ｔ７８　Ｋ　）、１．５１ＰＶＯ）
Ｉ　（分子！１２５Ｋ　）、６．５％ｐｖｏａ　（分子
ｍｌ　ＯＫ　）、０．１％プロテアーゼ、ペプトンナ６
．０．Ｌｌ　５　ＭＮａ２ＨＰＯ４および２０％アルミ
ナからなるポリマー振付ｗｌＪｆｔ調製した。この混合
物の粘度は３６　Ｕ　ｃｐでめった。ａｉｇＩ図に例示
したノズルを用いてビーズを製造した。ポリマー混合物
の貯緘部を充填し、７　ｐｓｉｇの圧力をかけた。使用
したポリマーおよび所望のビーズの大きさに応じて、２
〜１５　ｐｓｉｇの圧力全使用した。バルブｔ−開いて
、ポリマーをノズルの先端に下行させる。掃射気体とし
ては含湿窒素を便用、ポリマー流液を離散させ、ビーズ
を形成させる。掃射気体のｍｔは５＠準ｔ／分（ａｌｐ
ｍ　’）とした。ビーズは−６０〜−６５′Ｃのへキチ
ン中に集め、ついで凍結転環した。乾燥ビーズｔ−ポッ
ト中した場合の一上残留率は、Ｌｌ、ｅ１５朋メツシュ
、１７．２＊：０．４２５ｉｎメツシユ、６５．６　％
　；　０．２５０　ｍ）　７　シュ、１６．７％、ｏ、
ｉｓ。

Ｕメツシュ、２．５チの分布を示した。別の実績では、
ＩＱ％ｐｖｏａ（分子ｔ２５Ｋ）、２０％アルミナ、０
．１％プロテアーゼ、ペゾトンφ３のポリマー混合物、
埜度４８．８　ｃｐ’を貯蔵部圧１１　Ｐ８ｉ＆％掃射
気体６ｓｐ１ｍで噴霧した。この実験で得られたビーズ
の帥上残留率は、０．８５ｍメツシュ、１チ；Ｕ、４２
５ｍメツシュ、１．８　Ｔｏ　：　０．２５ｍメツシュ
、６２％；０．１２５ｍメツシュ、４０１％：０．０７
５ｉｕａメツシユ、１８チ；　０．０７５ｉ＋ｍメツシ
ュ未満８％でめった。

他のポリマーを添加したＰＶＯＨピーズ５％ＰＶＯＨ（
分子量７８Ｋ）、’１．５％ＰＶＯＨ（分子［１２，５
Ｋ　）、６．５％ＰＶＯＨ（分子量１０Ｋ）、０．１％
ｆａテアーゼペゾトンナ６．０．０５　ＭＮａ２ＨＰＯ
４および２０チアルミナからなるポリマー混合物ｔ−調
製した。

このポリマー組成ｖＩＪｔ−各１２０１の４バツチに分
け、それぞれに以のポリマー混合物中した。すなわち、
バッチ１）にはｐｖｐ　（分子量４０Ｋ）２Ｊ。

バッチ２）にはｐｖｐ　（分子ｔ４ＵＫ）４，９．バッ
チ６）にｒＣｐｖｐ　（分子量４０Ｋ）（１，バッチ４
）には２ｇのＰＥＧ　８０００ｔ−添加した。これらの
混合物からビーズを製造し、ポリマー添刀１ｌｌｔシな
かった混付物から得られたビーズと水中での安定性を比
較した。ビーズ倉ガラススライド上に置き、２０ｘの立
体ａｔａｇ誂下で−ベながら水を１調添加し、溶解が起
こればそれ１−＊祭した。バッチ１は他のポリマー添〃
口を行わなかったビーズより急速に溶解した。バッチ２
および３はバッチ１よりもわずかに早く溶解したが、２
と３の間の差は検知できなかった。バッチ４はきわめて
速やかに溶解した。

大豆の根に集落化する細菌を用いる土儂施用カシ±！と 細胞（大豆の根に集落化することが知られているシュー
ドモナス・フルオレセンスの休）を標準化ｔｃ　ｔｌｌ
　ｍ　（ｂ　Ｘ　１０’ｃｆｕ７ｍ　）から１６時間ｉ
ｎさせる。とくに好ましいメジウムは５０μ７１，１１
１１す７アンピシン添〃ロキングＢ培地である。Ｍ９最
小培庵の使用では、細胞の生存率は、カプセル封入後５
　ｌｏＨの一程度まで著しく低下する。細胞を遠心分離
によって収穫し、小量の上清液に再懸濁する。

多くの場合、懸濁液の容量はポリマー４欧の善意の好ま
しくは５％を越えないように決定される力〜２０チ楊度
までは間層はない。細胞を、１０％（ｗ、／ｖ）ポリ（
ビニルアルコール）（分子量２５，０００、加水分解率
９８％）、２０　Ｔｏ　ＡｔｇＯｓ、０．１　％プロテ
アーゼペゾトン≠３　（Ｄｉｆｃｏ　Ｃｏ、）および１
９ｂデキストロース含有溶液と混合する。混合後直ちに
、溶酸をスプレーノズルから冷ヘキサン中に噴霧してビ
ーズを形成させる。かくして生成したビーズをへキチン
から集め、凍結乾燥する。ポリマー混合物中での細胞の
生存率は１−３　Ｘ　１０”　ｃｆｕ７１ｆＪでめった
。ビーズを凍結乾燥したのちの生存率はＬ５　Ｘ　１０
８ｃｆｕ／ｆＩｌｌであった。通常Ｏ集落化検定−４ｅ
は、ビーズｔ−ポット中の土壌の必せ溝に、谷ポットわ
たりビーズ０．２１の割合で接種する。対照には細胞を
含まないビーズ（陰性対照）と歇体接櫨（陽性対照）と
を用いる。植物（大豆、クィリアムズ変撞７９）は２週
間生育させたのち根を収穫し、集落化した細閑について
リゾプレーンを検定する。結果は、ν丁だに生育させた
液体接種細胞とカプセル化細胞との闇で、根の集落化に
母全認めなかった（デュンカンの多範囲変ｊｊｋ解析に
よる）。

両者とも集落化のレベルは根１ｙあたり約２Ｘ１０５ｃ
ｆｕでめった。

葉−一化シュードモナド　　いる−施　のｔ−めのカプ
セル 葉集落化シュートモナートの細胞を、キングＢ（す７ア
ンピシンを含まない）および栄養培地（Ｄｉｒｃｏ　）
の２徨を用いたほかは前述したと同様に生育させ、収穫
した。キングＢ中で生育した細胞をポリマー混合物（１
０％ｗ／ｖ　ＰＶＯＨ、分子量２５．０００　）に９．
５　Ｘ　Ｉ　Ｑ’　ｃｆｕ／ｆｎ！添加し、完成ビーズ
中に２　Ｘ　１０９ｃｆｕ７Ｍの一度で存在させた。

栄養培地中に生育させた細胞はポリマー混合物に５．５
　Ｘ　１０８ｃｆｕ７４ｔｌ混会し、完成ビーズ中に２
．５×１０７ｃｆｕ、Ａ／磯度存在させた。これらのビ
ーズは以下の方法で葉の表面に施用するのに適している
。

すなわち、ビーズを濃度範囲約０．２５〜１０％（Ｗ／
Ｖ　）、好ましくは約０．５〜２％（ｖ／’ｖ　）のＰ
ＶＯＨ中に懸濁する。この溶成には、ビーズの特定の葉
表面への付７Ｉｔ性を増大させるのに通用でさる池の材
料をざ有させてもよい。この溶成は慣用のスプレー装置
ｔを用いて葉の弐面に噴霧できる。

ウリハムシ（ｃｏｒｎ　ｒｏｏｔ　ｗｏｒｍ　）に対し
て活性全音するバチルス櫨の細菌全１ラドリプトン−１
チグルコースメゾウム中で生育させた。各３０Ｕゴのメ
ジウムについての２４時時間式培誉液２０ｍ１を用いて
細胞接種を行った。細胞全３０　”Ｃ，２０Ｏｒｐｍに
おいて２４時間生育させた。培養液全遠心分離して収穫
し、水に再懸濁し、これを―襄ポリマー混合物と混合し
、１０　’！ｂ　ＰＶＰ　、　　３０　％　Ａｔ２０３
および２％プロテアーゼペプトン＋５のポリマー混合物
中に、ｔＰ：？Ｉｋ度となるようにした。ダウアンチフ
オームＣ（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　、　Ｍｉｄｌａ
ｎｄ　、　ＭＩ　）？刀日えて発泡を抑制した。ビーズ
は噴霧ノズルを用いて一６０℃のへキサン中に噴きして
製造した。

ビーズｔヘキサンから集め、凍結乾燥した。ビーズを試
戚したところ、５　ｘ　１０９ｃｆｕ／　１．５　ｇビ
ーズの細菌が生存した。トーモロコシ金子め植えておい
たポットにビーズを散布した。トーモロコシが過当な大
きさに生育した時点でウリノ１ムシを添〃口し、トーモ
ロコシの生育全貌けた。傷！？″ｉ、根のＭｔによって
解析した（ｘｔが小さいほど陽害は大きい）。対照には
細胞金言まないビーズをポットあたり１．５ｇとした。

ビーズはポットあたり１．５．　４．５および７．５ｙ
添加した。陽性対照は７ビーズ全添加した場合、カプセ
ル封入１１ｔＩ廁に曝露した植物の方がフラダン対照に
比べて有意に大きい根の＊ｔｉ示した。

−Ｂ、−ｔ、　ｖａｒ　Ｋｕｒｓｔａｋｉの培誉ｇ２０
　［Ｊｍ金濃縮し、主とじて胞子とトキシン結晶をざむ
細掘ペースト金得た。このペーストを滅醒水を用いて最
初の２００ｄ谷撞に再懸濁し、この懸濁放ｉ　ｔｎｌを
１０％、ｔｒ　ＩＪビニルアルコール 上記ポリマー溶液を用い、前述したと同体にしてビーズ
金生成させた。これらのビーズについてトマトイモムシ
に対する活性金試雇した。ビーズ１、Ｆｔｊｋ１０ＩＩ
ｌｌｌｃｆｉ濁し、この溶ｇｕ．０５ｍｌｋ６枚のトマ
トの葉それぞれに塗布した。葉を、脱イオン水で湿潤さ
せたｇ紙片とともにペトリ皿中に置いた。５匹の幼虫を
各ペトリ皿に入れた。陽性対照はカプセル封入しない旦
よりの同蹟度全使用し、陰性対照は胞子およびトキシン
結晶を含まないビーズとした。４８麦に検定を行った。

細／＠／ｌざまないビーズを用いた場合、幼虫の生存数
は２７，１５０でめった。この結果は、ビーズ自身には
幼虫に対する毒性がなく、また摂食を妨害することもな
いことｔ示しでいる。Ｂ，　ｔ．　＜用いた例でｅよ、
カプセルに封入した場合もカプセル封入しなかった嚇合
も、全幼虫が死滅した。

出発材料は、乾燥粉末状のオルタナリア・カシェの分生
胞子とした。サンプル０．１３１　’＊、界面活性剤、
６Ｍンルビトールとともに試威管に取り、よく混合して
胞子を分散させ、約１時間静置した。

このように予め浸漬することによって、水浴性ポリマー
溶液に入れた場合の胞子の湿潤は遅延し、カプセル封入
過程における凍結時に耐性を示すようになる。この前処
置を行わないと、生存率はりになる。前処置した胞子を
５％ポリビニルアルコール溶液と混合し、直ちに一３０
℃のヘキサン中に噴４してビーズを形成させる。ビーズ
が丁度乾燥するまで凍結乾燥する。乾燥しすぎると生存
率が低下する。カプセル封入胞子の生存率は乾燥量によ
って変動し、２０〜９０％の範囲である。これらの♂−
ズを水または所望のアジュバントと混合し、シックレポ
ート（５ｉｃｋｌｅｐｏｄ　）の葉の表面上に噴霧する
。カプセル封入した胞子は、水と混合した場合、発芽は
わずかに遅延し、数時間長く生存し、これは野外のｆＩ
ｉ物に噴霧した場合、有利である。ポリ（ビニルアルコ
ール）のビーズは、葉の表面に粘り強く付層し、雨に対
して抵抗性全示す。カプセル封入した胞子はシックレポ
ート植物に感染し、これ金死滅させることができる。第
５図に示すように、ＰＶＯＨビーズは葉の表面ｆ：４水
したのちでも滑らかな葉の表面に付着している。

【図面の簡単な説明】

本発明の典型的なｐｖｏｕ　ｔ；−ズの全体図および断
；面図である。第３図は、本発明の典型的なｐｖｐビー
ズを示す。第４図は、本発明の典型的なＨＰＣ♂−ズを
示す。第５図は、雨の後も葉の表面に付層しているｐｖ
ｏａビーズを示す。

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）生物学的材料を、非イオン法ポリマーが少
   なくとも３ｗ／ｖ％の濃度で存在する非イオン性ポリマ
   ーの水性浴液と混合し、（ｂ）上記（ａ）の混合物を、
   水非混和性でそのポリマーの非溶媒中に、生成したビー
   ズが急速に凍結するのに十分な温度であるがポリマービ
   ーズの凍結破裂を生じるほどは低くない温度に維持しな
   がら滴加してポリマービーズを生成させ、ついで（ｃ）
   工程（ｂ）で得られたビーズを乾燥して実質的にすべて
   の結合水をビーズから除去することを特徴とする生物学
   的材料のカプセル封入方法。
2. （２）溶液は濃度５〜１５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含
   有する特許請求の範囲第１項の方法。
3. （３）実質的にすべての非結合水を凍結乾燥によつて除
   去する特許請求の範囲第２項の方法。
4. （４）ポリマー溶液中にさらに加重剤を存在させる特許
   請求の範囲第３項の方法。
5. （５）加重剤はアルミナである特許請求の範囲第４項の
   方法。
6. （６）ポリマーはポリ（ビニルアルコール）である特許
   請求の範囲第３項の方法。
7. （７）ポリマーはポリビニルピロリドンである特許請求
   の範囲第３項の方法。
8. （８）ポリマーはデキストランである特許請求の範囲第
   ３項の方法。
9. （９）ポリマーはセルロース誘導体である特許請求の範
   囲第３項の方法。
10. （１０）生物学的材料は微生物である特許請求の範囲第
    ３項の方法。
11. （１１）微生物は細菌である特許請求の範囲第１０項の
    方法。
12. （１２）微生物はかびであり、かびにカプセル封入時、
    湿潤を遅延させる前処理を施す特許請求の範囲第１０項
    の方法。
13. （１３）細菌はバチルス・スリンギエンシス（￥Ｂａｃ
    ｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥）の株である
    特許請求の範囲第１１項の方法。
14. （１４）細菌はシュードモナス属（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
    ｎａｓ￥）の種である特許請求の範囲第１１項の方法。
15. （１５）かびはオルタナリア・カシエ（￥Ａｌｅｒｎａ
    ｒｉａ￥￥ｃａｓｓｉａｅ￥）である特許請求の範囲第
    １１項の方法。
16. （１６）生物学的材料はタンパク質である特許請求の範
    囲第３項の方法。
17. （１７）生物学的材料はペプチドである特許請求の範囲
    第３項の方法。
18. （１８）Ｍ−はシュードモナス・フルオレセンス（￥Ｐ
    ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥￥ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ￥）
    ＮＲＲＬ　Ｂ−１５１３２、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５１３３
    、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５１３４およびＮＲＲＬ　Ｂ−１５
    １３５からなる群より選ばれる特許請求の範囲第１４項
    の方法。
19. （１９）細菌はアグロバクテリウム・ラジオバクター（
    ￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｒａｄｉｏｂａｃｔ
    ｅｒ￥）ＡＴＣＣ３９８０３である特許請求の範囲第１
    １項の方法。
20. （２０）細菌はシュードモナス・フルオレセンス（￥Ｐ
    ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥￥ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ￥）
    ＡＴＣＣ３９８０２である特許請求の範囲第１４項の方
    法。
21. （２１）水溶性非イオン性ポリマーと生物学的材料から
    なり、非結合水を実質的に含まず、破砕されにくい、ス
    ポンジ様の多孔性構造を有する組成物。
22. （２２）生物学的材料は生育可能微生物である特許請求
    の範囲第２１項の組成物。
23. （２３）生物学的材料はタンパク質およびペプチドから
    なる群より選ばれる特許請求の範囲第２１項の組成物。
24. （２４）さらに加重剤を含有する特許請求の範囲第２１
    項の組成物。
25. （２５）ポリマーはポリ（ビニルアルコール）、ポリビ
    ニルピロリドン、デキストランおよびセルロース誘導体
    からなる群より選ばれる特許請求の範囲第２１項の組成
    物。
26. （２６）８０℃未満の温度では容易に溶解しないが８０
    ℃を越える温度では溶解可能な非イオン性ポリマーと生
    育可能な微生物からなり、非結合水を実質的に含まず、
    ４０℃未満の温度では実質的に水に不溶性の固体組成物
    。
27. （２７）ポリマーはポリ（ビニルアルコール）である特
    許請求の範囲第２６項の組成物。
28. （２８）微生物含量は組成物の約０．０１〜５０重量％
    である特許請求の範囲第２６項の組成物。
29. （２９）さらに加重剤を含有する特許請求の範囲第２６
    項の組成物。
30. （３０）加重剤はアルミナである特許請求の範囲第２９
    項の組成物。
31. （３１）アルミナは比較的低表面積で非処理である特許
    請求の範囲第５項の方法。
32. （３２）アルミナの平均粒子サイズは１０ミクロン未満
    である特許請求の範囲第５項の方法。
33. （３３）アルミナは糖または他の試薬で前処理し、アル
    ミナとポリマー上のヒドロキシル基との相互作用を低減
    させる特許請求の範囲第５項の方法。
34. （３４）アルミナは比較的低表面積で非処理である特許
    請求の範囲第３０項の方法。
35. （３５）アルミナの平均粒子サイズは１０ミクロン未満
    である特許請求の範囲第３０項の方法。
36. （３６）アルミナは糖または他の試薬で前処理し、アル
    ミナとポリマー上のヒドロキシル基との相互作用を低減
    させる特許請求の範囲第３０項の方法。
37. （３７）特許請求の範囲第２６項の組成物がポリ（ビニ
    ルアルコール）の水性溶液に懸濁されている混合物を植
    物の葉の表面に噴霧することを特徴とする植物の葉の表
    面に生物学的材料を適用する方法。
38. （３８）ポリ（ビニルアルコール）溶液の濃度は約０．
    ２５〜１０％（ｗ／ｖ）である特許請求の範囲第３７項
    の方法。
39. （３９）ポリ（ビニルアルコール）溶液の濃度は約０．
    ５〜２％（ｗ／ｖ）である特許請求の範囲第３７項の方
    法。
40. （４０）特許請求の範囲第２７項の組成物がポリ（ビニ
    ルアルコール）の水性溶液に懸濁されている混合物を植
    物の葉の表面に噴霧することを特徴とする植物の葉の表
    面に生物学的材料を通用する方法。
41. （４１）ポリ（ビニルアルコール）溶液の濃度は約０．
    ２５〜１０％（ｗ／ｖ）である特許請求の範囲第４０項
    の方法。
42. （４２）ポリ（ビニルアルコール）溶液の濃度は約０．
    ５〜２％（ｗ／ｖ）である特許請求の範囲第４０項の方
    法。
43. （４３）特許請求の範囲第２６項の組成物がポリ（ビニ
    ルアルコール）の水性溶液に懸濁されていることを特徴
    とする組成物。
44. （４４）ポリ（ビニルアルコール）溶液の濃度は約０．
    ２５〜１０％（ｗ／ｖ）である特許請求の範囲第４３項
    の組成物。
45. （４５）ポリ（ビニルアルコール）溶液の濃度は約０．
    ５〜２．０％（ｗ／ｖ）である特許請求の範囲第４３項
    の組成物。