KR100470232B1 - 미생물 전달매체 및 그를 포함하는 미생물농약의 제조방법 - Google Patents

미생물 전달매체 및 그를 포함하는 미생물농약의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 전달매체와 미생물농약의 제조방법에 관한 것으로 분말상 미생물농약의 제조방법은 분말상의 전달매체에 액체 배양하여 생산한 미생물을 균일하게 혼합하여 동결 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 입상 미생물 농약의 제조방법은 입상 미생물 전달매체에 미생물을 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 단계; 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅하는 단계 및 상기 배지가 코팅된 입상 미생물 전달매체에 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 또는 입상 미생물 전달매체에 분말상 미생물농약을 코팅 또는 접종 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 입상 미생물 농약의 제조방법에 따르면, 미생물의 농도가 높고, 미생물의 생존성을 높은 수준으로 유지할 수 있으며, 미생물 균주의 고유한 활성을 안정하게 유지시킬 수 있는 입상 미생물 농약을 효과적으로 제조할 수 있다.

Description

미생물 전달매체 및 그를 포함하는 미생물농약의 제조방법{Delivery medium for a microorganism and process for producing a biopesticide containing the same}
본 발명은 분말상 미생물 전달매체 및 분말상 미생물 농약의 제조방법, 입상 미생물 전달매체 및 입상 미생물 농약의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 분말상 미생물 전달매체에 미생물 배양액을 현탁하고 동결 건조하는 단계를 포함하는 분말상 미생물 농약의 제조방법 및 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지 또는 표면 처리 물질을 코팅하는 단계를 포함하는 입상 미생물 농약의 제조방법에 관한 것이다.
독성 화학 합성농약을 반복적으로 사용하는 경우, 잔류독성과 환경오염문제를 야기할 뿐만아니라, 인체에 유해하여 수확기에는 병이 발생하여도 사용할 수 없는 등 사용제한을 받는다. 또한, 토양 침투가 어려워 토양에 잠복하는 병원균과 선충, 해충을 효과적으로 제어하지 못한다. 한편, 미생물 농약은 환경친화적이고 인체에 해가 없어 독성이 강한 화학농약의 대체제로 개발과 연구가 활발히 진행되고 있다. 그렇지만, 화학합성 농약과는 달리 미생물 농약은 활성을 갖는 유효성분이살아있는 미생물이기 때문에 미생물의 효과적인 대량생산과 생존 및 활성을 안정하게 유지하는 것이 절대적으로 필요하다.
농작물과 원예작물, 과수 등의 병해충을 환경친화적이고 효과적으로 제어하기 위한 미생물 농약의 개발에 있어 미생물의 고농도 생산과 생존 및 활성을 안정하게 유지하는 전달매체의 개발과 이를 이용한 미생물 농약의 제조기술이 필요하다.
이와 관련한 종래 기술로서, 미국특허 제4,595,589호에는 토탄(peat)을 주성분으로 하는 현탁액 상태의 미생물 전달매체 조성물이 개시되어 있으며, 미국특허 제5,403,584호에는 초탄(peat moss), 모래와 옥수수를 주성분으로 하는 미생물 전달매체가 개시되어 있다. 본 발명자가 개발한 한국특허 제153138호에는 톱밥, 키틴, 키토산, 라미나린, 카르복시메틸셀룰로오스, 질산암모늄 또는 황산암모늄을 포함하는 분말상 미생물 전달매체 조성물이 개시되어 있으며, 미국특허 제6,280,719호와 한국특허 제189507호에는 밀기울, 키토산, 톱밥, 키틴 및 목화씨에서 유도된 단백질 배지를 포함하는 분말상 미생물 전달매체 조성물이 개시되어 있다.
그러나, 이들 전달매체는 모두 액체형 또는 분말형 전달매체에 관한 것으로 입상 전달매체에 관한 언급은 없다.
한편, 펠릿형 미생물 전달매체의 제조방법이 한국특허 제189507호에 개시되어 있다. 구체적으로는, 미생물 균주의 생존성을 유지할 수 있는 미생물 전달매체의 제조방법에 있어서, 밀기울 40∼65중량%, 키토산 1∼5중량%, 톱밥 1∼3중량% 및 목화씨에서 유도된 단백질 배지 1∼3중량%를 균일하게 혼합하여 얻은 분말 조성물을 펠릿형으로 성형하여 제조되는 미생물 전달매체의 제조방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기 펠릿형 미생물 전달매체의 제조방법은 다음과 같은 문제점이 있었다.
(1) 분말상 전달매체를 압출 성형하는 과정을 거침으로, 펠릿 내부로의 통기가 되지 않아 미생물이 자라지 못하는 전달매체 내부 용적 율이 크게 상승한다. 따라서, 전달매체 단위 g당 유효 미생물 함량이 감소하게 되어 미생물 전달매체로서의 효율성이 크게 떨어진다.
(2) 분말상 전달매체에서 제조된 펠릿을 미생물 전달매체로 사용하는 경우, 펠릿에 미생물을 균일하게 접종하기 위해 혼합하거나 섞는 과정에서 펠릿이 붕괴하여 펠릿의 입상 전달매체 유지가 어렵다.
(3) 펠릿에 미생물을 접종 후 배양하는 과정에서 통기를 위한 교반이나 혼합으로 펠릿이 붕괴되어 펠릿의 입상 유지가 어렵다.
(4) 펠릿형 전달매체는 미생물의 접종, 미생물의 배양과정, 건조 과정과 유통과정에서 펠릿의 붕괴가 발생하여 입상 전달매체로서의 품질이 크게 손상되는 특성을 지니고 있다.
(5) 펠릿형 전달매체에 미생물을 접종하고 배양한 후 다시 분쇄하여 분상 미생물제제를 제조 시에도 분쇄과정에서 미생물에 물리적인 손상을 입혀 미생물 활성을 감소시킨다.
(6) 분말상 전달매체에 미생물을 혼합한 다음, 펠릿 등의 입상 미생물제제를 제조 시에는 입상을 만드는 공정상 성형 압출 과정에서 발생하는 열과 물리적인 손상을 가하여 미생물이 죽거나 활성이 크게 떨어진다.
(7) 압축과정에서 펠릿 내부의 미생물은 생균 활성을 유지하는 데 적합하지 않은 조건에 존재하므로, 펠릿의 표면에 존재하는 미생물에 비해 활성이 크게 감소한다. 기능성 활성 미생물이 식물 병원균, 해충 등의 생장과 번식을 억제하거나 죽이는 특성을 이용하는 미생물농약의 특성상 병원균이나 해충에 작용하는 미생물의 활성을 적정하게 유지하는 것이 필요하다.
본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구하던 중, 밀, 보리, 쌀 등을 입상 전달매체로 사용할 수 있으며, 특히 상기 입상에 미생물 배지나 표면 처리물질을 코팅함으로써, 펠릿형 미생물 전달매체를 이용하지 않고도 효과적인 입상 미생물 전달매체를 제조할 수 있는 방법을 개발하게 되었다.
본 발명의 목적은, 미생물 균주의 고농도 생산과 활성 및 생존성을 유지할 수 있는 분말상 전달매체를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한, 미생물 균주의 고농도 생산과 활성 및 생존성을 유지할 수 있는 분말상 미생물 농약의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 미생물 균주의 고농도 생산과 활성 및 생존성을 유지할 수 있는 입상 전달매체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 펠릿 제조과정을 거치지 않고, 입상 미생물 전달매체를 이용하여 미생물의 농도가 높고, 미생물의 생존성이 높으며, 미생물의 고유한 활성을 안정하게 유지할 수 있는 입상 미생물 농약을 제조하는 방법을 제공하는것이다.
본 발명의 분말상 전달매체는, 옥수수 가루, 카오린, 규조토, 질석 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 미생물 균주의 고농도 생산과 활성 및 생존성을 유지할 수 있는 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 분말상 미생물 농약의 제조방법은, 분말상 전달매체를 멸균하는 단계; 및 미생물 배양액을 멸균한 절달매체에 현탁하고 동결 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 입상 절달매체는, 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 콩, 모래 및 작은 모래(1∼3mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 미생물 균주의 고농도 생산과 활성 및 생존성을 유지할 수 있는 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 입상 미생물 농약의 제조방법은, 입상 전달매체를 멸균하는 단계; 및 미생물을 접종하여 배양하고 건조하는 단계를 포함하는, 미생물 균주의 고농도 생산과 활성 및 생존성을 유지할 수 있는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 입상 미생물 농약의 제조방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅하는 단계; 및
상기 배지가 코팅된 입상 미생물 전달매체에 미생물을 접종하여 배양하는 단계.
상기한 본 발명의 입상 미생물 농약의 제조방법들에 있어서, 상기 입상 전달매체는 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 콩, 모래 및 작은 모래(1∼3mm)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 배지는 미생물이 성장할 수 있는 영양분을 함유하고 있는 것으로서, 예를 들면, 상기 미생물 배지는, CMA(corn meal agar)(옥수수가루[추출물] 50중량부, 한천 15중량부, pH 6.0±0.2, difco)배지, 영양한천배지(소고기 추출물 3g, 펩톤 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 6.8), 트립틱 쏘이 한천배지(Tryptic soy agar, TSA)(트립톤 15중량부, 쏘이톤 5중량부, NaCl 5중량부, 한천 15중량부, pH 7.3±0.2), TSA+1%포도당, 트립틱 쏘이 효모 추출물 배지(트립틱 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 3g, 한천 15g, 증류수 1리터 pH 7.0-7.2), 펩톤·콘 한천배지(콘 스팁 리쿼 5g, 펩톤 5g, 수용성 전분 10g, NaCl 5g, CaCl2·2H2O 0.5g, 한천 16g, 증류수 1리터, pH 7.2), 효모 추출물 최소배지(Na2HPO4·12H2O 3.5g, K2HPO41g, MgSO4·7H2O 0.03g, NH4Cl 0.5g, 효모 추출물 4g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.0-7.2), 트립티케이스·전분 한천배지(트립티케이스 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 2g, 수용성 전분 1g, 한천 15g, 증류수 1리터), PYG 한천배지(펩톤 10g, 효모추출물 5g, 포도당 5g, NaCl 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), 방선균 배지(포도당 4g, 효모 추출물 4g, 말트 추출물 10g, CaCO32g, 한천 12g, 증류수 1리터, pH 7.2), 감자 추출물·영양 한천배지(영양한천배지 23g, 감자 추출물 20㎖, 증류수 1리터), 감자·포도당 한천배지(Potato dextrose agar, PDA)(감자(추출물) 200g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1리터), 감자·포도당·효모 한천배지(Potato dextrose yeast agar, PDY)(PDA+ 0.5% 효모추출물), 포자생성배지(효모추출물 1g, 소고기 추출물 1g, 트립토스 2g, FeSO4·7H2O 미량, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), PDA·효모 추출물 배지(PDA 19.5g, 한천 13g, 효모추출물 1.5g, KH2PO42g, MgSO40.5g, 증류수 1리터), 효모·말트 추출물 한천 배지(효모추출물 4g, 말트 추출물 10g, 포도당 4g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.3), 효모·전분 한천배지(효모 추출물 2g, 수용성 전분 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.3), 포도당·효모추출물·펩톤 한천배지(포도당 5g, 펩톤 5g, 효모추출물 3g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 6.8), TYG 한천배지(트립톤 3g, 효모 추출물 3g, 포도당 3g, K2PO41g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.4) 및 효모 추출물·포도당 한천배지(효모추출물 10g, 포도당 10g, 한천 15g , 증류수 1리터)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 코팅은 상기 입상 전달매체 1kg 당 미생물 배지를 200∼500ml를 첨가하여 균일하게 혼합 코팅하는 단계에 의하여 이루어질 수 있으나, 여기에 한정되지 않고 스프레이 코팅 등 여러 공지의 방법이 사용될 수 있다.
또한, 상기 미생물은 미생물 농약으로 사용될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함될 수 있으며, 예를 들면, 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속 및 모나크로스포리엄 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물일 수 있다. 이들 미생물의 접종 및 배양은 상기 미생물 균주의 고체 배양을 위하여 사용되는 통상적인 접종 및 배양 방법을 응용하여 사용할 수 있다.
위와 같이, 입상 미생물 전달매체에 미생물을 접종하고 배양한 다음, 통상적인 건조과정을 더 거칠 수 있다. 또한, 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅하고, 여기에 미생물 접종하고 배양한 다음, 통상적인 건조 과정을 더 거칠 수 있다. 이러한 건조 과정은 자연 또는 인공 건조과정을 일 수 있으며, 미생물의 활성에 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 입상 미생물 농약의 제조방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅하는 단계; 및
상기 배지가 코팅된 입상 미생물 전달매체에 분말상 미생물 농약의 형태로 미생물을 접종하는 단계.
또한, 본 발명의 입상 미생물 농약의 제조방법은 분말상 미생물 농약의 형태로 미생물이 접종된 입상 미생물 전달 매체를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 입상 전달매체는 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 콩, 모래 및 작은 모래(1∼3mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 배지는 미생물이 성장할 수 있는 영양분을 함유하고 있는 것으로서, 예를 들면, 상기 미생물 배지는, CMA(corn meal agar)(옥수수가루[추출물] 50중량부, 한천 15중량부, pH 6.0±0.2, difco)배지, 영양한천배지(소고기 추출물 3g, 펩톤 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 6.8), 트립틱 쏘이 한천배지(Tryptic soy agar, TSA)(트립톤 15중량부, 쏘이톤 5중량부, NaCl 5중량부, 한천 15중량부, pH 7.3±0.2),TSA+1%포도당, 트립틱 쏘이 효모 추출물 배지(트립틱 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 3g, 한천 15g, 증류수 1리터 pH 7.0∼7.2), 펩톤·콘 한천배지(콘 스팁 리쿼 5g, 펩톤 5g, 수용성 전분 10g, NaCl 5g, CaCl2·2H2O 0.5g, 한천 16g, 증류수 1리터, pH 7.2), 효모 추출물 최소배지(Na2HPO4·12H2O 3.5g, K2HPO41g, MgSO4·7H2O 0.03g, NH4Cl 0.5g, 효모 추출물 4g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.0∼7.2), 트립티케이스·전분 한천배지(트립티케이스 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 2g, 수용성 전분 1g, 한천 15g, 증류수 1리터), PYG 한천배지(펩톤 10g, 효모추출물 5g, 포도당 5g, NaCl 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), 방선균 배지(포도당 4g, 효모 추출물 4g, 말트 추출물 10g, CaCO32g, 한천 12g, 증류수 1리터, pH 7.2), 감자 추출물·영양 한천배지(영양한천배지 23g, 감자 추출물 20㎖, 증류수 1리터), 감자·포도당 한천배지(Potato dextrose agar, PDA)(감자(추출물) 200g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1리터), 감자·포도당·효모 한천배지(Potato dextrose yeast agar, PDY)(PDA+ 0.5% 효모 추출물), 포자생성배지(효모추출물 1g, 소고기 추출물 1g, 트립토스 2g, FeSO4·7H2O 미량, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), PDA·효모 추출물 배지(PDA 19.5g, 한천 13g, 효모추출물 1.5g, KH2PO42g, MgSO40.5g, 증류수 1리터), 효모·말트 추출물 한천 배지(효모추출물 4g, 말트 추출물 10g, 포도당 4g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.3), 효모·전분 한천배지(효모 추출물 2g, 수용성 전분 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.3), 포도당·효모추출물·펩톤 한천배지(포도당 5g, 펩톤 5g, 효모추출물 3g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 6.8), TYG 한천배지(트립톤 3g, 효모 추출물 3g, 포도당 3g, K2PO41g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.4) 및 효모 추출물·포도당 한천배지(효모추출물 10g, 포도당 10g, 한천 15g , 증류수 1리터)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 코팅은 상기 입상 전달매체 1kg 당 미생물 배지를 200∼500ml를 첨가하여 균일하게 혼합 코팅하는 단계에 의하여 이루어질 수 있으나, 여기에 한정되지 않고 스프레이 코팅 등 여러 공지의 방법이 사용될 수 있다. 여기에서, 상기 분말상 미생물 농약은 분말상의 미생물 농약으로서, 예를 들면, 밀기울, 전분, 키토산, 톱밥, 키틴, 옥수수가루, 카오린, 규조토, 질석 또는 상기 성분 중 둘 이상의 혼합물의 전달매체를 사용하고, 여기에 미생물 균주의 세포배양액을 현탁한 후, 동결 건조하여 제조되는 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 미생물 농약으로 사용될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함될 수 있으며, 예를 들면, 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속 및 모나크로스포리엄 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물일 수 있다. 이들 미생물의 접종 및 배양은 상기 미생물 균주의 고체 배양을 위하여 사용되는 통상적인 접종 및 배양 방법을 응용하여 사용할 수 있다.
위와 같이, 입상 미생물 전달매체에 미생물을 접종한 다음, 통상적인 건조과정을 더 거칠 수 있다. 또한, 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅하고, 여기에 미생물을 접종하고 배양한 다음, 통상적인 건조 과정을 더 거칠 수 있다. 이러한 건조 과정은 자연 또는 인공 건조과정을 일 수 있으며, 미생물의 활성에 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 입상 미생물 농약의 제조방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
입상 미생물 전달매체에 젤라틴(0.2∼3.0 w/v), 리그닌설페이트(2∼30 w/v), 한천(0.2∼2.0 w/v), 잔탄검(1∼20% w/v), 전분(0.5∼30% w/v), 글리세롤(6∼30% v/v), 트윈20(0.5∼99% v/v), 트윈80(0.5∼99% v/v), 펙틴(10∼30% w/v), 알긴산(3∼25% w/v), 및 이들 중의 적어도 둘 이상을 포함하는 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표면 처리 물질을 코팅하는 단계; 및
상기 표면처리 물질로 코팅된 입상 미생물 전달매체에 분말상 미생물 농약을 코팅하는 단계.
상기 미생물 전달매체는 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 콩, 모래 및 작은 모래(1∼3mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 예를 들면, 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속 및 모나크로스포리엄 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물일 수 있다. 또한, 상기 분말상 미생물 농약은 분말상의 미생물 농약으로서, 예를 들면, 밀기울, 전분, 키토산, 톱밥, 키틴, 옥수수가루, 카오린, 규조토, 질석 또는 상기 성분 중 둘 이상의 혼합물의 전달매체를 사용하고, 여기에 미생물 균주의 세포배양액을 현탁한 후, 동결 건조하여 제조되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 입상 미생물 농약의 제조방법은 상기 분말상 미생물 농약이 코팅된 입상 미생물 전달매체를 미생물 생육에 적당한 조건에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 발명의 전달매체 및 그의 제조방법에 관한 하기의 실시예에 사용된 미생물 균주 및 그 항균활성에 대한 실험결과는 다음과 같다.
(1) 미생물 균주, 균주 배양과 균주 배양액의 준비
하기 실시예에서는 본 발명의 미생물 전달매체가 지니고 있는 미생물 균주의 고농도 생산, 균주 생존성 유지능력과 생존세포의 재 생장촉진 능력을 평가하기 위하여, 본 발명자에 의해 분리된 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속, 모나크로스포리엄 속 균주를 이용하였다(표1).
본 실시예에 사용된 균주
균주속명 균주명
바실러스 바실러스 써브틸리스 IBT 1022 (Bacillus subtilisIBT 1022)바실러스 써린지엔씨스 IBT 2020(Bacillus thuringiensisIBT 2020)바실러스 균주 IBT 1235(Bacillus sp. IBT 1235)
슈도모나스 슈도모나스 퓨티다 IBT 1021(Pseudomonas putidaIBT 1021)슈도모나스 플루오레슨스 IBT 1121(Pseudomonas fluorescensIBT 1121)슈도모나스 균주 IBT 431(Pseudomonas sp.IBT 431)
부르크홀데리아 부르크홀데리아 세파시아 IBT 1121(Burkholderia cepaciaIBT 1121)
스트렙토마이세스 스트렙토마이세스 속 CYD 10(KCTC 0223 BP)*스트렙토마이세스 속 WYE 20(KCTC 0341 BP)*스트렙토마이세스 속 WYE 324(KCTC 0342 BP)*
마이크로모노스포라 마이크로모노스포라 균주 IBT 120(Micromonospora sp.IBT 120)
악티노플랜 악티노플랜 균주 IBT 1324(Actinoplane sp.IBT 563)
트리코더마 트리코더마 비리데 IBT 3010(Trichoderma virideIBT 3010)트리코더마 하지아넘 IBT 4010(Trichoderma harzianumIBT 4010)트리코더마 균주 IBT 563(Trichodermasp. IBT 563)
글리오클라디엄 글리오클라디엄 비렌스 IBT 234(Glioclaidium virensIBT 234)
부베리아 부베리아 바씨아나 IBT 2000(Beuveria bassianaIBT 2000)
아쓰로보트리스 아쓰로보트리스 균주 A2003(Arthrobotryssp. A2003)(KCTC 10095 BP)*아쓰로보트리스 균주 A2008(Arthrobotryssp. A2008)(KCTC 10096 BP)*아쓰로보트리스 균주 A2010(Arthrobotryssp. A2010)(KCTC 10097 BP)*아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010(Arthrobotrys oligosporaIBT 5010)
모나크로스포리엄 모나크로스포리엄 균주 M3015(Monacrosporiumsp. M3015)(KCTC 10116 BP)*모나크로스포리엄 엘립소스포럼 IBT 13015(Monacrosporium ellipsosporumIBT 13015)
*대전광역시 소재의 생명공학연구소 내 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 기탁됨.
일부 균주는 각각 영양한천(Nutrient agar, difco) 배지 상에서 배양시킨 후, 멸균한 액체 영양배지(Nutrient broth, difco)가 든 1,000㎖ 삼각플라스크에접종한 후 28℃, pH 7.0, 120 rpm으로 1∼3일간 진탕 배양하여 얻은 세포배양액을 상기 각각의 미생물 균주에 대한 시료로 사용하였다(바실러스 써브틸리스 IBT 1022, 바실러스 써린지엔씨스 IBT 2020, 바실러스 균주 IBT 1235, 슈도모나스 퓨티다 IBT 1021, 슈도모나스 플루오레슨스 IBT 1121, 슈도모나스 균주 IBT 431, 부르크홀데리아 세파시아 IBT 1121 균주). 또한, 또 다른 균주들은 CYD 한천 배지(1리터의 증류수에 카사미노산 0.5g, 이스트 추출물 0.8g, 포도당 0.4g, K2HPO42.0g과 한천 18g을 용해한 후 pH를 7.2 내지 7.4로 조절함) 상에서 배양시킨 후, 형성된 포자를 취하여 변형된 벤넷 액체배지(1리터의 증류수에 2g의 이스트 추출물, 2g의 비프 추출물, 2g의 펩톤, 10g의 포도당과 니스타틴 5㎍/ml로 구성하였으며, pH는 6.5∼7.5 로 조정)가 들어 있는 500ml 삼각플라스크에 접종한 후 25℃∼30℃, pH 6.5∼7.5, 130∼300rpm으로 1∼4일간 진탕 배양하여 얻은 세포배양액을 상기 각각의 미생물 균주에 대한 시료로 사용하였다(스트렙토마이세스 균주 CYD 10, 스트렙토마이세스 균주 WYE 20, 스트렙토마이세스 균주 WYE 324, 마이크로모노스포라 균주 IBT 120, 악티노플랜 균주 IBT 1324). 또 다른 일부의 균주는 각각 감자포도당한천배지(Potato dextrose agar, PDA, difco)에서 배양한 후, 멸균한 PDB(potato dextrose broth, difco) 액체 배지가 든 1,000㎖ 삼각플라스크에 접종한 후 28℃, pH 7.0, 120 rpm으로 1∼3일간 진탕 배양하여 얻은 세포배양액을 상기 각각의 미생물 균주에 대한 시료로 사용하였다(트리코더마 비리데 IBT 3010, 트리코더마 하지아넘 IBT 4010, 트리코더마 균주 IBT 563, 글리오클라디엄 비렌스 IBT 234, 부베리아 바씨아나 IBT 2000, 아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010, 아쓰로보트리스 균주 A2003, 아쓰로보트리스 균주 A2008, 아쓰로보트리스 균주 A2010, 모나크로스포리엄 균주 M3015, 모나크로스포리엄 엘립소스포럼 IBT 13015 균주). 미생물 세포수는 멸균수를 이용한 연속희석 및 도말법으로 영양한천배지 또는 옥수수가루 한천배지(CMA, difco)를 이용하여 25∼30℃에서 배양한 후, 단위 g 또는 ㎖당 콜로니 형성 단위 cfu(colony forming unit)로 나타내었다.
상기 균주의 보관은 영양한천배지(difco)(바실러스 써브틸리스 IBT 1022, 바실러스 써린지엔씨스 IBT 2020, 바실러스 균주 IBT 1235, 슈도모나스 퓨티다 IBT 1021, 슈도모나스 플루오레슨스 IBT 1121, 슈도모나스 균주 IBT 431, 부르크홀데리아 세파시아 IBT 1121), CYD 한천배지(스트렙토마이세스 균주 CYD 10, 스트렙토마이세스 균주 WYE 20, 스트렙토마이세스 균주 WYE 324, 마이크로모노스포라 균주 IBT 120, 악티노플랜 균주 IBT 1324), PDA(difco) 배지(트리코더마 비리데 IBT 3010, 트리코더마 하지아넘 IBT 4010, 트리코더마 균주 IBT 563, 글리오클라디엄 비렌스 IBT 234, 부베리아 바씨아나 IBT 2000, 아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010, 아쓰로보트리스 균주 A2003, 아쓰로보트리스 균주 A2008, 아쓰로보트리스 균주 A2010, 모나크로스포리엄 균주 M3015, 모나크로스포리엄 엘립소스포럼 IBT 13015)를 이용하여 25∼28℃ 에서 배양한 후, 4℃에서 보관하였고, 4주마다 주기적으로 계대 배양하였다. 장기보관방법으로는 121℃에서 15분간 멸균한 15∼30% 글리세롤에 포자 현탁액을 만들어 -70℃에서 초저온 저장 보관하였다.
(2) 항균활성 조사
스트렙토마이세스 균주 WYE 20과 WYE 324의 항균활성은 대치 배양을 통해 곰팡이 병원균의 생장저해 활성을 조사하였다. 균주 WYE 20과 WYE 324를 옥수수가루 한천배지(CMA, difco)에 접종한 후 28℃ 에서 7일간 배양하였다. 시험균과 대치하는 위치에 잘 자란 곰팡이 병원균 균사를 접종하고 배양한 후 항균활성을 조사하였으며, 그 결과를 표2에 나타내었다.
미 생 물 항균활성
스트렙토마이세스균주 WYE 20(KCTC 0341 BP) 스트렙토마이세스균주 WYE 324(KCTC 0342 BP)
라이족토니아 솔라니 + +
싸나테포러스 쿠쿠메리스 + +
라이족토니아 솔라니 AG-1 + +
라이족토니아 솔라니 AG-1-1c + +
라이족토니아 솔라니 AG-2-1 + +
라이족토니아 솔라니 AG-2-2(IIIB) + +
라이족토니아 솔라니 AG-3 + +
라이족토니아 씨릴리스 + +
라이족토니아 지애 + +
보트리티스 씨네리아 + +
파이토프쏘라 캡사이시 + +
파이토프쏘라 파라씨티카 + +
파이토프쏘라 메가스퍼마 + +
파이토프쏘라 캑토럼 + +
피씨움 얼티멈 + +
피씨움 이어레귤레 + +
피씨움 아파니더메이텀 + +
피씨움 그라미니콜라 + +
푸사리움 솔라니 + +
푸사리움 삼벅씨넘 + +
푸사리움 옥시스포룸 + +
콜레토트리컴 아큐타텀 + +
콜레토트리컴 그라미니콜라 + +
마그나포쎄 그리씨아(피귤레리아 오리재) + +
스클레로티니아 스클레로티오룸 + +
스클레로티니아 호메오카파 + +
스클레로티움 세피보룸 + +
버티씰리움 아흘리애 + +
+: 항균활성을 나타냄
상기 표2에 나타낸바와 같이, 균주 WYE 20과 WYE 324는 라이족토니아 솔라니, 싸나테포러스 쿠쿠메리스, 라이족토니아 솔라니 AG1, 라이족토니아 솔라니 AG-1-1c, 라이족토니아 솔라니 AG-2-1, 라이족토니아 솔라니 2-2(IIIB), 라이족토니아 솔라니 AG-3, 라이족토니아 씨릴리스, 라이족토니아 지애, 보트리티스 씨네리아, 피토프쏘라 캡사이시, 피토프쏘라 파라시티카, 피토프쏘라 메가스퍼마, 피토프쏘라 캑토럼, 피씨움 얼티멈, 피씨움 이어레귤레, 피씨움 아파니더메이텀, 피씨움 그라미니콜라, 푸사리움 솔라니, 푸사리움 삼벅씨넘, 푸사리움 옥시스포룸, 콜레토트리컴 아큐타텀, 콜레토트리컴 그라미니콜라, 마그나포쎄 그리씨아(피귤레리아 오리재), 스클레로티니아 스클레로티오룸, 스클레로티니아 호메오카파, 스클레로티움 세피보룸, 버티씰리움 아흘리애 등에 대해 항균활성을 나타내었다.
(3) 효소활성 및 항균활성 조사
키티나제(chitinase)와 β-1,3-글루카나제(β-1,3-glucanase)가 곰팡이 병원균 균사를 공격하여 죽이는데 중요한 역할을 하는 효소로 알려져 있으며, 콜로이드 키틴을 유일한 탄소원으로 포함하는 키틴 한천 배지에 균주를 접종한 후 25℃에서 7일간 배양하여 콜로니 생장여부로 효소활성을 확인하였다. β-1,3-글루카나제 활성조사는 라미나린을 유일한 탄소원으로 하는 라미나린 한천배지에 균주를 접종한 후 25℃에서 7일간 배양하여 콜로니 생장여부로 효소활성을 확인하였다.
항균활성은 상기 "(2) 항균활성 조사"에서와 같이, 대치 배양을 통해 곰팡이 병원균의 생장저해 조사로 확인하였다. 균주 IBT 563과 IBT 4010를 PDA(difco) 배지에 접종하고 곰팡이 병원균을 대치 접종한 후 25℃에서 배양하였다. 균주 IBT 563과 IBT 4010의 효소활성과 항균활성 결과는 표3에 나타내었다.
미 생 물 효소활성 항균활성
Chitinase β-(1,3)-glucanase Botrytis cinerea Rhizoctonia solani
트리코더마 균주 IBT 563 + + + +
트리코더마 하지아넘 IBT 4010 + + + +
+: 효소 활성을 나타냄 +: 항균활성을 나타냄
표3에 나타낸바와 같이, IBT 563과 IBT 4010은 키티나제와 β-1,3-글루카나제 활성을 나타내었으며, 곰팡이 병원균인 보트리스 씨네리아와 라이족토니아 솔라니에 대해 항균활성을 나타내었다.
실시예1. 고체배양을 통한 입상 미생물 농약의 제조
(1) 입상 전달매체를 이용한 고체배양에 의한 입상 미생물 농약의 제조
입상 미생물 전달매체로서 물로 깨끗이 씻은 밀, 보리 또는 쌀 각 1kg을 플라스크에 넣고 121℃에서 30분 동안 멸균하였다.
각각의 상기 멸균 전달매체가 든 플라스크에 상기 "(1) 미생물 균주, 균주 배양과 균주 배양액의 준비"에서 기술한 방법으로 생산한 각각의 종균 100ml 씩을 접종한 후, 25℃에서 4∼7일 동안 정치배양하고, 건조하여 입상 미생물 농약을 생산하였다(표4, 표5).
표4에 나타낸 바와 같이, 접종된 각 균주는 밀, 보리 또는 쌀로 구성되는 고체배양 전달매체에서 세포생장, 포자생성, 재 생장 활성이 특정 균주를 제외하고 양호하여 이들 입상 전달매체를 이용하여 각각의 균주를 접종하고, 고체배양을 통해 입상 미생물 농약을 생산할 수 있음을 나타내었다(표4, 표5).
(2) 입상 전달매체에 미생물 배지 코팅과 고체배양을 통한 입상 미생물 농약의 제조
입상 미생물 전달매체로서 물로 깨끗이 씻은 밀, 보리 또는 쌀 각 1kg 당 각각의 준비한 배지 200∼500ml를 첨가하고, 균일하게 혼합하여 잘 코팅되도록 하였다. 그 후 121℃에서 30분간 멸균하였다.
각각의 배지가 코팅된 전달매체가 든 플라스크에 상기 "(1) 미생물 균주, 균주 배양과 균주 배양액의 준비"에서 기술한 방법으로 생산한 각각의 종균 100㎖ 씩을 접종한 후, 25℃에서 4∼7일간 정치 배양하고 건조하여 고농도의 입상 미생물 농약을 생산하였다(표5).
표5에 나타낸 바와 같이, 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅한 후 고체배양을 통해 균주에 따라 106∼1011cfu/g의 고농도 입상 미생물 농약을 효과적으로 생산하였다.
미 생 물 세포생장 포자생성 재 생장 활성
밀 보리 쌀 밀 보리 쌀 밀 보리 쌀
바실러스 써브틸리스 IBT 1022 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
바실러스 써린지엔씨스 IBT 2020 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
바실러스 균주 IBT 1235 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
슈도모나스 퓨티다 IBT 1021 ++ ++ ++ - - - ++ ++ ++
슈도모나스 플루오레슨스 IBT 1121 ++ ++ ++ - - - ++ ++ ++
슈도모나스 균주 IBT 431 ++ ++ ++ - - - ++ ++ ++
부르크홀데리아 세파시아 IBT 1121 ++ ++ ++ - - - ++ ++ ++
스트렙토마이세스 균주 CYD 10(KCTC 0223BP) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
스트렙토마이세스 균주 WYE 20(KCTC 0341BP) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
스트렙토마이세스 균주 WYE 324(KCTC 0342BP) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
마이크로모노스포라 균주 IBT 120 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
악티노플랜 균주 IBT 1324 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
트리코더마 비리데 IBT 3010 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
트리코더마 하지아넘 IBT 4010 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
트리코더마 균주 IBT 563 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
글리오클라디엄 비렌스 IBT 234 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
부베리아 바씨아나 IBT 2000 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
아쓰로보트리스 균주 A2003(KCTC 10095 BP) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
아쓰로보트리스 균주 A2008(KCTC 10096 BP) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
아쓰로보트리스 균주 A2010(KCTC 10097 BP) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
모나크로스포리엄 균주 M3015(KCTC 10116 BP) + + + + + + + + +
모나크로스포리엄 엘립소스포럼 IBT 13015 ++ ++ ++ + + + ++ ++ ++
+: 보통, ++: 양호, +++: 매우 양호. -: 조사되지 않음
실시예2. 입상 미생물 농약의 유효 미생물의 경시변화
멸균된 입상 미생물 전달매체에 배지를 코팅한 다음, 전술한 방법으로 액체 배양하여 얻은 미생물 균주 시료를 균일하게 접종하였다(105∼107cfu/ml). 이를 25℃∼30℃에서 배양하면서 미생물의 생장 정도에 따라 5∼14일간 배양한 다음, 수확하고 건조하여 입상 미생물 농약을 생산하였다. 생산한 입상 미생물 농약의 안정성을 조사하기 위하여 미생물 농약의 미생물 균주 생존 활성과 생존 미생물의 재 생장 활성을 측정하고, 그 결과를 표6에 나타내었다. 생존성 시험의 경우, 상기 최종적으로 얻은 시료에 대해 각각 1g을 취하여 멸균된 증류수 9ml에 넣고 보텍싱(vortexing)한 후, 연속 희석 및 도말법으로 콜로니 형성단위(cfu)로 측정하였다.
표6a, b 및 c에 나타낸 바와 같이, 각각의 시험 미생물 균주는 활성이 우수하게 유지되었다. 또한, 재배실험에서 상기의 전달매체와 균주를 이용한 미생물 농약의 병해충 제어활성 조사에서도 각각의 미생물이 갖는 고유의 항균활성과 살충활성을 그대로 유지하였다. 이는 본 발명의 미생물 전달매체가 미생물의 생존을 적정 수준으로 유지시키고 생존세포의 재 생장도 적절하게 유도할 뿐만아니라 미생물 균주의 기능성을 그대로 유지 및 증진시킴을 보여주는 것이다.
미 생 물 초기세포수(cfu/g) 3개월 후세포수(cfu/g) 생존세포의 재 생장활성
a밀 a밀 a밀
바실러스 써브틸리스 IBT 1022 2.1x109 4.7x108 +++
바실러스 써린지엔씨스 IBT 2020 1.7x109 3.6x108 +++
바실러스 균주 IBT 1235 1.3x109 2.3x108 +++
스트렙토마이세스 균주 WYE 20(KCTC 0341 BP) 1.4x109 5.9x108 +++
스트렙토마이세스 균주 WYE 324(KCTC 0342 BP) 1.0x109 3.4x108 +++
트리코더마 비리데 IBT 3010 1.5x109 7.5x108 +++
트리코더마 하지아넘 IBT 4010 2.1x109 6.9x108 +++
트리코더마 균주 IBT 563 1.3x109 7.2x108 +++
글리오클라디엄 비렌스 IBT 234 1.5x108 6.7x107 +++
부베리아 바씨아나 IBT 2000 2.2x108 8.5x107 +++
아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010 1.5x107 5.8x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2003(KCTC 10095 BP) 2.2x107 6.2x106 +++
아c쓰로보트리스 균주 A2008(KCTC 10096 BP) 1.6x107 5.3x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2010(KCTC 10097 BP) 1.1x107 4.9x106 +++
모나크로스포리엄 균주 M3015(KCTC 10116 BP) 2.8x106 3.2x105 +++
모나크로스포리엄 엘립소스포럼 IBT 13015 1.9x106 2.3x105 +++
a: CMA 배지로 코팅처리한 다음, 미생물 접종 및 배양하여 제조된 입상 미생물 농약
+ : 보통, ++ : 양호, +++ : 매우 양호, - : 조사되지 않음.
미 생 물 초기세포수(cfu/g) 3개월 후세포수(cfu/g) 생존세포의 재 생장활성
a보리 a보리 a보리
바실러스 써브틸리스 IBT 1022 1.2x109 5.4x108 +++
바실러스 써린지엔씨스 IBT 2020 1.9x109 4.3x108 +++
바실러스 균주 IBT 1235 2.1x109 6.5x108 +++
스트렙토마이세스 균주 WYE 20(KCTC 0341 BP) 2.3x109 7.4x108 +++
스트렙토마이세스 균주 WYE 324(KCTC 0342 BP) 2.1x109 5.6x108 +++
트리코더마 비리데 IBT 3010 1.3x109 6.4x108 +++
트리코더마 하지아넘 IBT 4010 1.9x109 5.6x108 +++
트리코더마 균주 IBT 563 2.4x109 4.1x108 +++
글리오클라디엄 비렌스 IBT 234 3.2x108 5.4x107 +++
부베리아 바씨아나 IBT 2000 3.5x108 5.4x107 +++
아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010 2.3x107 4.9x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2003(KCTC 10095 BP) 1.7x107 3.1x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2008(KCTC 10096 BP) 1.9x107 2.7x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2010(KCTC 10097 BP) 2.6x107 3.5x106 +++
모나크로스포리엄 균주 M3015(KCTC 10116 BP) 2.3x106 4.3x105 +++
모나크로스포리엄 엘립소스포럼 IBT 13015 2.8x106 3.2x105 +++
a: CMA 배지로 코팅처리한 다음, 미생물 접종 및 배양하여 제조된 입상 미생물 농약
+ : 보통, ++ : 양호, +++ : 매우 양호, - : 조사되지 않음.
미 생 물 초기세포수 (cfu/g) 3개월 후세포수 (cfu/g) 생존세포의 재 생장활성
a쌀 a쌀 a쌀
바실러스 써브틸리스 IBT 1022 3.2x109 4.3x108 +++
바실러스 써린지엔씨스 IBT 2020 2.1x109 2.4x108 +++
바실러스 균주 IBT 1235 1.9x109 3.1x108 +++
스트렙토마이세스 균주 WYE 20(KCTC 0341 BP) 1.7x109 2.8x108 +++
스트렙토마이세스 균주 WYE 324(KCTC 0342 BP) 1.4x109 2.3x108 +++
트리코더마 비리데 IBT 3010 1.6x109 3.5x108 +++
트리코더마 하지아넘 IBT 4010 1.2x109 2.3x108 +++
트리코더마 균주 IBT 563 1.8x109 3.4x108 +++
글리오클라디엄 비렌스 IBT 234 2.8x108 3.9x107 +++
부베리아 바씨아나 IBT 2000 2.1x108 4.2x107 +++
아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010 1.6x107 3.2x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2003(KCTC 10095 BP) 2.4x107 2.7x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2008(KCTC 10096 BP) 1.3x107 2.4x106 +++
아쓰로보트리스 균주 A2010(KCTC 10097 BP) 2.3x107 3.1x106 +++
모나크로스포리엄 균주 M3015(KCTC 10116 BP) 2.1x106 3.7x105 +++
모나크로스포리엄 엘립소스포럼 IBT 13015 1.6x106 2.1x105 +++
a: CMA 배지로 코팅처리한 다음, 미생물 접종 및 배양하여 제조된 입상 미생물 농약
+ : 보통, ++ : 양호, +++ : 매우 양호, - : 조사되지 않음.
실시예3. 입상 미생물 농약의 오이 라이족토니아 솔라니 모잘록병 제어 활성 분석
오이 작물 포트 재배를 통하여 각각의 균주에 대한 입상 미생물 농약의 라이족토니아 솔라니 모잘록병 제어 활성을 조사하였다.
상기 실시예1에서 기술한 방법으로 고체배양을 통해 제조된 각 균주의 입상 미생물 농약을 포트 배합물에 섞어 처리하였다. 대조군(무처리)에는 미생물이 함유되지 않은 전달매체를 처리하였다.
배합물로는 호투스(Hortus, 영국)를 121℃에서 60분간 멸균 후 상온에서 12시간 방치한 후, 다시 121℃에서 60분간 멸균하는 방법으로 3회 멸균한 후 처리군과 대조군(무처리)의 오이 종자 파종에 이용하였다.
병원균인 라이족토니아 솔라니는 PDB(Difco)에서 10∼14일간 25℃에서 배양한 후 회수하여, 무처리 대조군의 발병율이 약 70%가 되도록 멸균한 상토에 혼합하여 이병토양을 만든 후, 위에서 기술한 방법으로 준비한 처리군과 무처리 대조군에 오이 종자를 파종하여 각각의 입상 미생물 농약 활성을 측정하였다.
파종 포트는 지름 9cm의 일회용 종이컵을 이용하였고, 포트 당 3개의 오이 종자를 파종하였으며, 처리군 별로 7개의 포트를 사용하였다. 파종을 마친 폿트를 랜덤블락배열 방식으로 온실에 배열하고, 습도는 40∼60 %가 유지되도록 조절하였으며, 필요에 따라 주기적으로 물을 공급하였다. 또한, 온도는 25∼30℃로 유지되도록 하였으며, 빛은 자연광을 이용하였다. 주기적으로 종자의 발아와 모잘록병의 발병을 관찰하고, 그 결과를 표7에 나타내었다.
표7과 같이, 본 발명의 입상 미생물 농약으로 처리한 오이 종자의 경우, 라이족토니아 솔라니에 의한 오이 모잘록병의 발병을 86∼100% 억제하였다. 이는, 본 발명의 입상 미생물 농약이 곰팡이 병원균 라이족토니아 솔라니 제어에 매우 효과적임을 나타내는 것이다.
미 생 물 파종한 오이 종자수 세포수(cfu/g밀) 발아한 오이 종자수 건전한 오이 식물체수
7일 14일
무발병 대조군 21 - 21a 21a
라이족토니아 솔라니 + 무처리 대조군 21 - 6b 6b
라이족토니아 솔라니 + 바실러스 균주 IBT 1235 21 1.7x109 18a 17a
라이족토니아 솔라니 + 슈도모나스 퓨티다 IBT 1021 21 1.3x109 19a 19a
라이족토니아 솔라니 + 슈도모나스 플루오레슨스 IBT 1121 21 1.1x1010 19a 18a
라이족토니아 솔라니 + 슈도모나스 균주 IBT 431 21 1.6x1010 21a 20a
라이족토니아 솔라니 + 부르크홀데리아 세파시아 IBT 1121 21 2.1x109 20a 19a
라이족토니아 솔라니 + 스트렙토마이세스 균주 WYE 20 21 1.4x109 20a 20a
라이족토니아 솔라니 + 스트렙토마이세스 균주 WYE 324 21 1.0x109 21a 21a
라이족토니아 솔라니 + 트리코더마 균주 IBT 563 21 1.3x109 18a 18a
x동일 칼럼의 무처리 대조군과 처리 실험군의 결과치를 비교할 때 통계적으로 p = 0.05 범위에서 차이가 나는 경우 서로 다른 알파벳(a, b)으로 나타냄.
실시예4. 입상 미생물 농약의 참외 뿌리혹선충에 대한 방제 효과 시험
상기 실시예1의 (2)에서 기술한 방법으로 제조한 각각의 입상 살선충 미생물 농약의 뿌리혹선충에 대한 살선충 활성을 검증하기 위하여 참외(금싸라기) 포장 재배시험을 수행하였다. 포장 재배시험은 난괴법 3반복으로 시험구를 배치하고, 처리구 당 30주의 참외를 재배하였다. 약제 처리는 참외 정식 2주전 300평당 6kg을 토양혼화 처리하였다. 대조구로 약제를 처리하지 않은 시험구를 두었다. 약제 처리전 포장의 선충밀도는 토양 300g당 300∼400마리를 나타내었으며, 약제 처리 40일 후 뿌리혹선충의 생충율을 조사하고, 그 결과를 표8에 나타내었다.
미 생 물 처리전선충밀도(마리/주) 세포수(cfu/g쌀) 생충율(%) 세포수(cfu/g밀) 생충율(%) 세포수(cfu/g보리) 생충율(%)
평균 평균 평균
무처리 대조군 359 77.7a 77.7a 77.7a
아쓰로보트리스 올리고스포라 IBT 5010 372 1.7x105 26.9b 2.1x106 22.6b 1.2x107 18.8b
아쓰로보트리스 균주 A2003 400 2.9x105 25.0b 3.2x106 21.3b 2.5x107 17.3b
아쓰로보트리스 균주 A2008 384 3.4x105 22.4b 3.9x106 19.8b 2.4x107 15.4b
아쓰로보트리스 균주 A2010 391 5.1x105 24.0b 4.1x106 22.3b 3.5x107 19.9b
모나크로스포리엄 균주 M3015 370 4.6x104 21.4b 3.4x105 19.5b 2.8x106 18.9b
모나크로스포리엄 엘립소스포럼IBT 13015 350 1.9x104 26.3b 2.5x105 22.3b 1.5x106 19.7b
x동일 칼럼의 무처리 대조군과 처리 실험군의 결과치를 비교할 때 통계적으로 p = 0.05 범위에서 차이가 나는 경우 서로 다른 알파벳(a, b)으로 나타냄.
표8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 입상 미생물 농약으로 처리한 경우(104∼107cfu/g), 참외 뿌리혹 선충의 생충율(%)이 15.4∼26.9%로 무처리 77.7%에 비교해 65∼80% 차이로 생충율이 크게 감소하였다. 이는, 본 발명의 입상 미생물 농약이 실제 포장시험 환경에서 매우 효과적으로 살선충 활성을 나타냄을 보여주는 것이다.
실시예5: 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지의 코팅 또는 표면 처리 물질 코팅 및 분상 미생물 농약의 접종을 통한 입상 미생물 농약의 제조
본 실시예에서는 상기 실시예1의 (2)와 같이, 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅한 다음, 미생물을 직접 접종하지 않고 분상 미생물 농약을 접종하고, 이를 건조하여 입상 미생물 농약을 제조하는 방법에 관한 것이다.
(1) 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지의 코팅
입상 미생물 전달매체로서 물로 깨끗이 씻은 밀, 보리 및 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 콩, 모래 또는 작은 모래(1∼3mm) 각 1kg 당 CMA 배지(17g/l) 200∼500ml를 첨가하고, 균일하게 혼합하여 잘 코팅되도록 하였다. 그 후 121℃에서 30분간 멸균하였다.
(2) 분말상 미생물 농약의 제조
밀기울, 전분, 키토산, 톱밥, 키틴, 옥수수가루, 카오린, 규조토, 질석 또는 상기 성분 중 둘 이상의 혼합물의 전달매체를 사용하였다. 분말상 전달매체는 사용전 통상의 방법으로 건열 멸균이나 습열 멸균하여 사용하였다. 각각의 멸균한 전달매체 1kg에 상기 "(1) 미생물 균주, 균주 배양과 균주 배양액의 준비"에서 기술한 방법으로 생산한 각각의 균주 세포배양액을 현탁한 후, 동결 건조하여 고농도 분상미생물 농약을 제조하였다. 아래 표9a에 동결 건조하여 생산한 각각의 분상 미생물 농약의 세포수를 평균값으로 나타내었다.
표9a에서 볼 수 있는 바와 같이, 동결건조를 통해 사용균주에 따라 104∼1010cfu/g의 고농도 분상 미생물 농약을 효과적으로 제조하였다.
(3) 입상 미생물 농약의 제조
얻어진 고농도 분말상 미생물 농약을 상기 (1)에서 얻어진 CMA가 코팅된 미생물 전달매체에 코팅하였다. 이렇게 하여 사용균주에 따라 104∼1010cfu/g의 입상 미생물 농약을 제조하였다(표9b).
1키틴 분상 미생물농약 코팅처리,2옥수수가루 분상 미생물농약 코팅처리,
3카오린 분상 미생물농약 코팅처리.
(4) 입상 미생물 전달매체에 표면처리 물질의 코팅
입상 미생물 전달매체로서 물로 깨끗이 씻은 밀, 보리 및 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 콩, 모래 또는 작은 모래(1∼3mm) 각 1kg 당 젤라틴(0.2∼3.0w/v), 리그닌설페이트(2∼30 w/v), 한천(0.2∼2.0 w/v), 잔탄검(1∼20% w/v), 전분(0.5∼30% w/v), 글리세롤(6∼30% v/v), 트윈20(0.5∼99% v/v), 트윈80(0.5∼99% v/v), 펙틴(10∼30% w/v), 알긴산(3∼25% w/v) 및 이들 중의 적어도 둘 이상을 포함하는 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표면 처리 물질 200∼500ml을 첨가하고, 균일하게 혼합하여 잘 코팅되도록 하였다. 그 후 121℃에서 30분간 멸균하였다.
(5) 입상 미생물 농약의 제조
상기 (4)에서 얻어진 글리세롤(15% v/v)로 코팅된 미생물 전달매체에 상기(2)에서 얻어진 고농도 분말상 미생물농약을 코팅하였다. 이렇게 하여 사용 균주에 따라 104∼1010cfu/g의 입상 미생물 농약을 제조하였다(표9c).
1키토산 분상 미생물농약 코팅처리,2톱밥 분상 미생물농약 코팅처리,
3규조토 분상 미생물농약 코팅처리.
본 발명의 입상 미생물 농약 제조방법에 따르면, 미생물의 농도가 높은 분말상 또는 입상 미생물 농약을 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 입상 미생물의 제조방법에 따르면, 미생물의 농도가 높은 입상 미생물 농약을 제조할 수 있다.
또한, 미생물의 생존성을 높은 수준으로 유지할 수 있는 입상 미생물 농약을제조할 수 있다.
또한, 미생물 균주의 고유한 활성을 안정하게 유지시킬 수 있는 입상 미생물 농약을 제조할 수 있다.

Claims (19)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 입상 전달매체를 멸균하는 단계; 및
    미생물을 접종하여 배양하고 건조하는 단계를 포함하는, 미생물 균주의 고농도 생산과 활성 및 생존성을 유지할 수 있는 입상 미생물 농약의 제조방법으로서,
    상기 입상 전달매체는 입상의 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 모래 및 작은 모래 (1∼3 mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고,
    상기 미생물은, CMA(옥수수가루[추출물] 50중량부, 한천 15중량부, pH 6.0±0.2, difco)배지, 영양한천배지(소고기 추출물 3g, 펩톤 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 6.8), 트립틱 쏘이 한천배지(Tryptic soy agar, TSA)(트립톤 15중량부, 쏘이톤 5중량부, NaCl 5중량부, 한천 15중량부, pH 7.3±0.2), TSA+1%포도당, 트립틱 쏘이 효모 추출물 배지(트립틱 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 3g, 한천 15g, 증류수 1리터 pH 7.0∼7.2), 펩톤·콘 한천배지(콘 스팁 리쿼 5g, 펩톤 5g, 수용성 전분 10g, NaCl 5g, CaCl2·2H2O 0.5g, 한천 16g, 증류수 1리터, pH 7.2), 효모 추출물 최소배지(Na2HPO4·12H2O 3.5g, K2HPO41g, MgSO4·7H2O 0.03g, NH4Cl 0.5g, 효모 추출물 4g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.0∼7.2), 트립티케이스·전분 한천배지(트립티케이스 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 2g, 수용성 전분 1g, 한천 15g, 증류수 1리터), PYG 한천배지(펩톤 10g, 효모추출물 5g, 포도당 5g, NaCl 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), 방선균 배지(포도당 4g, 효모 추출물 4g, 말트 추출물 10g, CaCO32g, 한천 12g, 증류수 1리터, pH 7.2), 감자 추출물·영양 한천배지(영양한천배지 23g, 감자 추출물 20㎖, 증류수 1리터), 감자·포도당 한천배지(Potato dextrose agar, PDA)(감자(추출물) 200g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1리터), 감자·포도당·효모 한천배지(Potato dextrose yeast agar, PDY)(PDA+ 0.5% 효모 추출물), 포자생성배지(효모추출물 1g, 소고기 추출물 1g, 트립토스 2g, FeSO4·7H2O 미량, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), PDA·효모 추출물 배지(PDA 19.5g, 한천 13g, 효모추출물 1.5g, KH2PO42g, MgSO40.5g, 증류수 1리터), 효모·말트 추출물 한천 배지(효모추출물 4g, 말트 추출물 10g, 포도당 4g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.3), 효모·전분 한천배지(효모 추출물 2g, 수용성 전분 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.3), 포도당·효모추출물·펩톤 한천배지(포도당 5g, 펩톤 5g, 효모추출물 3g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 6.8), TYG 한천배지(트립톤 3g, 효모 추출물 3g, 포도당 3g, K2PO41g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.4) 및 효모 추출물·포도당 한천배지(효모추출물 10g, 포도당 10g, 한천 15g , 증류수 1리터)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 배지에서 성장된 것인 입상 미생물 농약의 제조방법.
  5. 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅하는 단계; 및
    상기 배지가 코팅된 입상 미생물 전달매체에 미생물을 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 입상 미생물 농약의 제조방법으로서,
    상기 입상 전달매체는 입상의 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 모래 및 작은 모래 (1∼3 mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고,
    상기 미생물 배지는 CMA(옥수수가루[추출물] 50중량부, 한천 15중량부, pH 6.0±0.2, difco)배지, 영양한천배지(소고기 추출물 3g, 펩톤 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 6.8), 트립틱 쏘이 한천배지(Tryptic soy agar, TSA)(트립톤 15중량부, 쏘이톤 5중량부, NaCl 5중량부, 한천 15중량부, pH 7.3±0.2), TSA+1%포도당, 트립틱 쏘이 효모 추출물 배지(트립틱 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 3g, 한천 15g, 증류수 1리터 pH 7.0∼7.2), 펩톤·콘 한천배지(콘 스팁 리쿼 5g, 펩톤 5g, 수용성 전분 10g, NaCl 5g, CaCl2·2H2O 0.5g, 한천 16g, 증류수 1리터, pH 7.2), 효모 추출물 최소배지(Na2HPO4·12H2O 3.5g, K2HPO41g, MgSO4·7H2O 0.03g, NH4Cl 0.5g, 효모 추출물 4g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.0∼7.2), 트립티케이스·전분 한천배지(트립티케이스 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 2g, 수용성 전분 1g, 한천 15g, 증류수 1리터), PYG 한천배지(펩톤 10g, 효모추출물 5g, 포도당 5g, NaCl 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), 방선균 배지(포도당 4g, 효모 추출물 4g, 말트 추출물 10g, CaCO32g, 한천 12g, 증류수 1리터, pH 7.2), 감자 추출물·영양 한천배지(영양한천배지 23g, 감자 추출물 20㎖, 증류수 1리터), 감자·포도당 한천배지(Potato dextrose agar, PDA)(감자(추출물) 200g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1리터), 감자·포도당·효모 한천배지(Potato dextrose yeast agar, PDY)(PDA+ 0.5% 효모 추출물), 포자생성배지(효모추출물 1g, 소고기 추출물 1g, 트립토스 2g, FeSO4·7H2O 미량, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), PDA·효모 추출물 배지(PDA 19.5g, 한천 13g, 효모추출물 1.5g, KH2PO42g, MgSO40.5g, 증류수 1리터), 효모·말트 추출물 한천 배지(효모추출물 4g, 말트 추출물 10g, 포도당 4g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.3), 효모·전분 한천배지(효모 추출물 2g, 수용성 전분 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.3), 포도당·효모추출물·펩톤 한천배지(포도당 5g, 펩톤 5g, 효모추출물 3g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 6.8), TYG 한천배지(트립톤 3g, 효모 추출물 3g, 포도당 3g, K2PO41g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.4) 및 효모 추출물·포도당 한천배지(효모추출물 10g, 포도당 10g, 한천 15g , 증류수 1리터)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 입상 미생물 농약의 제조방법.
  6. 입상 미생물 전달매체에 미생물 배지를 코팅하는 단계; 및
    상기 배지가 코팅된 입상 미생물 전달매체에 분말상 미생물 농약의 형태로 미생물을 접종하는 단계를 포함하는 입상 미생물 농약의 제조방법으로서,
    상기 입상 전달매체는 입상의 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 모래 및 작은 모래 (1∼3 mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고,
    상기 미생물 배지는 CMA(옥수수가루[추출물] 50중량부, 한천 15중량부, pH 6.0±0.2, difco)배지, 영양한천배지(소고기 추출물 3g, 펩톤 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 6.8), 트립틱 쏘이 한천배지(Tryptic soy agar, TSA)(트립톤 15중량부, 쏘이톤 5중량부, NaCl 5중량부, 한천 15중량부, pH 7.3±0.2), TSA+1%포도당, 트립틱 쏘이 효모 추출물 배지(트립틱 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 3g, 한천 15g, 증류수 1리터 pH 7.0∼7.2), 펩톤·콘 한천배지(콘 스팁 리쿼 5g, 펩톤 5g, 수용성 전분 10g, NaCl 5g, CaCl2·2H2O 0.5g, 한천 16g, 증류수 1리터, pH 7.2), 효모 추출물 최소배지(Na2HPO4·12H2O 3.5g, K2HPO41g, MgSO4·7H2O 0.03g, NH4Cl 0.5g, 효모 추출물 4g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.0∼7.2), 트립티케이스·전분 한천배지(트립티케이스 쏘이 브로쓰 30g, 효모 추출물 2g, 수용성 전분 1g, 한천 15g, 증류수 1리터), PYG 한천배지(펩톤 10g, 효모추출물 5g, 포도당 5g, NaCl 5g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), 방선균 배지(포도당 4g, 효모 추출물 4g, 말트 추출물 10g, CaCO32g, 한천 12g, 증류수 1리터, pH 7.2), 감자 추출물·영양 한천배지(영양한천배지 23g, 감자 추출물 20㎖, 증류수 1리터), 감자·포도당 한천배지(Potato dextrose agar, PDA)(감자(추출물) 200g, 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1리터), 감자·포도당·효모 한천배지(Potato dextrose yeast agar, PDY)(PDA+ 0.5% 효모 추출물), 포자생성배지(효모추출물 1g, 소고기 추출물 1g, 트립토스 2g, FeSO4·7H2O 미량, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.2), PDA·효모 추출물 배지(PDA 19.5g, 한천 13g, 효모추출물 1.5g, KH2PO42g, MgSO40.5g, 증류수 1리터), 효모·말트 추출물 한천 배지(효모추출물 4g, 말트 추출물 10g, 포도당 4g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.3), 효모·전분 한천배지(효모 추출물 2g, 수용성 전분 10g, 한천 15g, 증류수 1리터, pH 7.3), 포도당·효모추출물·펩톤 한천배지(포도당 5g, 펩톤 5g, 효모추출물 3g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 6.8), TYG 한천배지(트립톤 3g, 효모 추출물 3g, 포도당 3g, K2PO41g, 한천 20g, 증류수 1리터, pH 7.4) 및 효모 추출물·포도당 한천배지(효모추출물 10g, 포도당 10g, 한천 15g , 증류수 1리터)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 입상 미생물 농약의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 분말상 미생물 농약의 형태로 미생물이 접종된 입상 미생물 전달 매체를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 입상 미생물 농약의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅은 상기 입상 전달매체 1kg 당 미생물 배지를 200∼500ml를 첨가하여 균일하게 혼합 코팅하는 단계에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 입상 미생물 농약의 제조방법.
  12. 입상 미생물 전달매체에 젤라틴(0.2∼3.0w/v), 리그닌설페이트(2∼30 w/v), 한천(0.2∼2.0 w/v), 잔탄검(1∼20% w/v), 전분(0.5∼30% w/v), 글리세롤(6∼30% v/v), 트윈20(0.5∼99% v/v), 트윈80(0.5∼99% v/v), 펙틴(10∼30% w/v), 알긴산(3∼25% w/v), 및 이들 중의 적어도 둘 이상을 포함하는 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표면 처리 물질을 코팅하는 단계; 및
    상기 표면처리 물질로 코팅된 입상 미생물 전달매체에 분말상 미생물 농약을 코팅하는 단계를 포함하는 입상 미생물 농약의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 분말상 미생물 농약이 코팅된 입상 미생물 전달매체를 미생물 생육에 적당한 조건에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 입상 미생물 농약의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 입상 전달매체는 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 콩, 모래 및 작은 모래(1∼3mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 입상 미생물 농약의 제조방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속 및 모나크로스포리엄 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 입상 미생물 농약의 제조방법.
  16. 분말상의 옥수수 가루, 카오린, 규조토, 질석 또는 이들의 혼합물을 미생물의 전달매체로서 사용하는 방법으로서,
    상기 미생물은 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속 및 모나크로스포리엄 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물인 방법.
  17. 분말상의 옥수수 가루, 카오린, 규조토, 질석 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 분말상 전달매체를 멸균하는 단계; 및
    미생물 배양액을 멸균한 절달매체에 현탁하고 동결 건조하는 단계를 포함하는 분말상 미생물 농약의 제조방법으로서,
    상기 미생물은 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속 및 모나크로스포리엄 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물인 방법.
  18. 입상의 밀, 보리, 쌀, 녹두, 팥, 수수, 옥수수, 모래 및 작은 모래 (1∼3 mm)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 매체를 미생물의 전달매체로서 사용하는 방법으로서,
    상기 미생물은 바실러스 속, 슈도모나스 속, 부르크홀데리아(슈도모나스) 속, 스트렙토마이세스 속, 마이크로모노스포라 속, 악티노플랜 속, 트리코더마 속, 글리오클라디엄 속, 부베리아 속, 아쓰로보트리스 속 및 모나크로스포리엄 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물인 방법.
  19. 제4항 내지 제7항 및 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 제조된 입상 미생물 농약.
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