KR970007083B1 - 바이오캡슐화(bioencapsulation)를 이용한 미생물살충제의 제조방법 - Google Patents

바이오캡슐화(bioencapsulation)를 이용한 미생물살충제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용없음

Description

바이오캡슐화(bioencapsulation)를 이용한 미생물살충제의 제조방법
본 발명은 바이오캡슐화(bioencapsulation)를 이용한 미생물 살충제의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 다양한 생물 방제인자의 바이오캡슐화를 위한 간단하고 경제적인 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 생분해 가능한, 환경적으로 안전한 B.T.제 농약에 관한 것이다.
농약용 독성 화학물질에 대한 각국 정부의 규제 및 상기 독성 화학물질의 사용에 의한 환경오염에 대한 관심으로 인해 최근 수년동안 농화학 산업계에서는 생물 농약의 필요성이 고조되어 왔다.
생물농약은 그들의 환경적 안정성, 방제할 목적 병원균 또는 해충에 대한 특이성으로 인해 기존 유기합성 농약에 대한 대체물 또는 보충물로서 흥미를 끈다.
생물 농약의 제조에 일반적으로 사용되는 생물학적 방제인자로는 세균, 효모, 진균류, 바이러스 및 바실러스 터링지엔시스(Bacillus thuringiensis)에 의해 생산된 B.T. 독소와 같은 독소들이 포함된다. 이들을 이용하여 저렴하고 안전한 생물살충제, 생물살균제, 생물제초제 및 식물 성장 조절제를 공급할 수 있다.
생물 농약의 주요 문제점은 높은 생산 경비 및 경작지에 적용시 햇빛, 건조, 열, 자외선, 우식(rain wash)과 같은 다양한 환경조건에 대해 불안정하거나 또는 민감하다는 것이다.
대부분의 생물 농약의 불안정성 또는 짧은 저장수명 및 그들의 높은 생산 경비로 인해 실제적인 유용성이 심하게 제한받는다. 예를들어, 바실러스 터링지엔시스에 의해 생산된 B.T. 독소는 햇빛하의 들판에서 며칠내에 그의 살충 활성을 잃는다. 비록 B.T. 독소가 커다란 시장성을 갖는 매우 유용한 생물 살충제이긴 하지만, 들판 적용 상태하에서의 불안정성으로 인해 그의 시장성 성장이 심하게 제한 받는다.
최근에, 캡슐화 기술은 환경에 의한 손상으로부터의 보호 및 활성성분의 서방성을 제공함으로써 유기합성 농약 분야에 있어 중대한 역할을 해 왔다. 그렇지만 유기합성 농약에 사용된 대부분의 캡슐화 기술은 생물 농약에 대해서는 유용하지 않은데, 그 이유는 생물농약이 매우 민감한 미생물 또는 생물활성인자를 포함하기 때문이다.
일반적으로 바이오캡슐화 기술이 실질적으로 효용성을 갖기 위해서는 하기의 필요조건을 충족시켜야 한다.
첫째, 캡슐화에 사용될 고분자 물질은 환경적으로 안전한 생물농약을 만들기 위해 화학합성 고분자 대신 저렴하고 값싼 천연 고분자이어야 한다.
둘째, 생물학적 방제인자의 캡슐화에 사용된 천연 고분자 겔매트릭스는 캡슐화된 생물학적 인자에 보호층을 공급하고 그들의 생존을 위한 높은 수분 보유 능력을 유지함으로써 햇빛, 열, 자외선, 건조와 같은 다수의 환경적 손상으로부터 캡슐화된 생물학적 인자를 보호할 수 있어야 한다.
세째, 생물학적 방제 인자의 바이오캡슐화에 사용된 천연 고분자 매트릭스는 들판에서 농작물에 적용시 점착성을 나타내고 수분을 흡수하여야 한다. 이러한 특성은 생물 농약의 고른 분포, 식물 병원체, 해충 및 잡초와 같은 표적에 대한 생물 농약의 효과적인 전달 뿐만 아니라 생물 농약의 우식 방지를 가능하게 한다.
네째, 바이오캡슐화 매트릭스 층 내부의 생물학적 방제인자의 활성을 위한 최적의 물리적 및 생물학적 상태를 유지하는 것이 매우 중요하게 고려되어야 한다.
최상의 결과를 위해서, 천연매트릭스 층 내부의 미생물은 바이오캡슐화된 생성물이 표적에 적용될 때 효과적으로 발아하고, 성장하고, 증식함으로써, 생물제초제, 생물살충제, 생물살진균제, 살선충제, 살균제, 연체동물 박멸제, 살비제, 살조제, 식물 성장 조절제, 생물 비료 또는 추수후 저장시 과일 및 채소 보존제로서 작용할 수 있는 항생제, 효소, 독소 또는 다른 생물활성 화합물을 생산하여야 한다.
상기 필요조건은 만약 캡슐화된 미생물이 자연 생태계에서 표적 식물에 달라 붙어서, 증식하여 그 장소에서 생물 농약을 효과적으로 생산할 수 있다면, 상기 생물 농약으로 농업에 사용되는 많은 독성 화학물질을 대체할 수 있기 때문에 극히 중요하다.
다섯째, 가장 중요한 필요조건은 많은 기존의 지렴한 유기합성 농약과 경쟁하기 위한 매우 간단하고 값싼 바이오캡슐화기술의 개발일 것이다.
화학 합성고분자 매트릭스내로 효소 및 유기합성 농약을 캡슐화하는 것은 광범위하게 연구되어 웠다. 그렇지만, 그 기술들은 생물 농약에 대한 상기의 필요조건을 충족시킬 수 없기 때문에 생물 농약에 거의 사용될 수 없다.
구체적으로 예를 들면, 유럽 특허 제0,320,483호에서 베이커(Baker)등은 바실러스 터링지엔시스, 알터나리아 카씨애(Alternaria cassiae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)와 같은 미생물을 캡슐화 하기 위한 폴리비닐알콜 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 화학 합성 고분자의 용도를 개시하고 있는데, 상기 기술은 화학 합성 고분자에 의한 환경 오염문제 및 높은 생산비로 인해 실용적이지 못하다.
이에 반해, 바이오캡슐화 기술은 생물학적 방제 인자를 캡슐화하기 위해 천연 고분자 매트릭스를 사용하는 것으로, 이 분야에서의 연구 활동은 바로 최근에야 늘어나기 시작했다.
미합중국 특허 제4,647,537호에서 시게미쯔(H. Shigemitsu)는 카라지난(carrageenan) 고분자 매트릭스내에 식물병 억제 미생물을 바이오캡슐화하는 시도를 개시하고 있으나, 이 기술은 고분자 물질의 비싼 가격으로 인해 실용적이지 못하다.
미합중국 특허 제4,724,147호에서 모리스(J.J.Morris) 및 미합중국 특허 제4,668,512호에서 루이스(J.A. Lewis)는 진균제초제로서 사용될 진균을 캡슐화하기 위한 일긴산염 펠릿의 사용을 개시하고 있다. 이 기술은 생물제초제의 들판 적용에 있어서 약간의 효용을 가지나 실용화하기엔 너무 비용이 많이 들 뿐만 아니라 수분 보유능이 낮으며 엽상 사용에 적용하기에는 점착성이 그리 크지 않은 단점이 있다.
유사한 기술로, 알긴산 칼슘이 선충류를 캡슐화하기 위해 약간의 전망을 가지고 사용되었으나 효용은 그리 크지 않았다(H.K. Kaya et al., Environ. Entomol. 14, 572-574(1985)).
프랑스 특허 제2,501,229호에서 정(Jung) 등은 생존가능한 저장을 위해 균근(mycorrhizas)을 천연 고분자내에 포함시키는 것을 개시하고 있다. 천연 고분자 겔은 크산토모나스(Xanthomonas)에 의한 탄수화물의 발효에 의해 생산된 고분자량의 헤테로 다당류로 만들어진다. 그렇지만, 상기 기술은 사용된 천연 고분자의 높은 생산비로 인해 널리 사용되기에는 너무 비용이 든다.
유럽 특허 제0,192,319호에서 반즈(A.C. Barnes)와 커밍스(S.G. Cummings)는 매우 정교한 새로운 바이오캡슐화 기술을 개시하고 있는데, 즉 B.T. 독소 생산 슈도모나스(Pseudomonas)의 전세포를 화학시약으로 처리하여 세포를 죽이고 죽은 세포 내부에 B.T. 독소 분자를 고정화하였다. 이 생성물은 셀-캡(Cell-Cap)으로 불리우며, 햇빛하의 자외선 손상의 방지로 인해 들판에서 더 큰 안정성을 나타낸다. 그렇지만, 상기의 신규한 기술 역시 널리 사용되기에는 꽤 비용이 든다.
지금까지 개시된 것중 가장 흥미롭고 또한 지렴한 바이오캡슐화 기술은 곤충 병원체의 전분 캡슐화 방법이다(B.S. Shasha 및 R.L. Dunkle, 미합중국 특허 제4,859,377).
상기 방법의 경우에는 겔을 형성하기 위해 미리 젤라틴화된 옥수수 전분분말, 옥수수 기름, 냉수 및 바실러스 터링지엔시스 포자 및 B.T. 독소를 상온에서 5∼60 초내에 혼합함으로써 천연겔(biogel)을 제조한다. 미리 젤라틴화된 전분중 아밀로즈 성분의 재화합으로 실질적으로 균일한 크기의 전분 매트릭스가 생겨나고 생물학적 인자들은 연속적인 전분 매트릭스 전체에 고르게 분산되어 갇힌다. 겔로 만든 전분-생물학적 인자 혼합물을 상온에서 약 30분동안 트레이에 둔다. 그 다음 생성된 비점착성 매트릭스를 적당한 수단으로 갈아서 비응집성입자로 만들고 상기 겔 입자를 무수 진주빛 옥수수 전분 분말로 피복한후 상온에서 공기 건조시킨 다음 입자를 다양한 메쉬(mesh) 크기로 체질하여 최종 생성물을 얻는다.
상기 바이오캡슐화 기술은 비교적 싼 재료의 천연 고분자를 사용하며 공정도 꽤 간단하지만, 다음과 같은 측면에서 경제적인 바이오캡슐화 기술이 되기 위한 모든 필요조건을 충족시키지 못한다.
첫째, 유일한 캡슐화 물질로서 미리 젤라틴화된 전분 분말만을 사용하며,
둘째, 겔 물질 및 수득된 최종 생성물은 생물 농약을 표적에 효과적으로 전달하기 위해 필요한 점착성이 부족하며,
세째, 겔 매트릭스내에 탄소원만을 포함하므로 캡슐화된 미생물이 경작지에서 자라고, 증식하고, 생물활성 화합물을 효과적으로 생산하기에 적합하지 않으며,
네째, 가공된 미리 젤라틴화된 전분을 캡슐화 물질로서 사용하는 것은 여전히 비용이 많이 들며,
다섯째, 캡슐화중에 멸균되지 않은 물질을 사용하므로 최종 생성물이 원치않는 미생물로 오염될 수 있다.
따라서, 생물 농약을 방제 대상 또는 표적에 고도의 능률로 전달할 수 있는 간단하고, 저렴한 실제적인 바이오캡슐화 방법의 개발이 계속 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 예의 연구한 결과, 적은 비용으로 생물 농약의 생산에 대한 대부분의 필요조건을 달성하는 간단한 바이오캡슐화 기술을 발견하게 되었으며 이를 대한민국 특허청에 특허출원한 바 있다(1991년 5월 23일자 특허출원 제91-8328호).
그러나 바실러스 터링지엔시스를 연구하는 과정에서 본 발명자들은 상기 미생물이 특히 콩류의 바이오겔속에서 더욱 빠르게 증식하고 B.T. 독소를 효율적으로 생산함을 발견하여 본 발명을 크게 개선시키는데 성공하였다.
상기 발견에 따라, 본 발명의 목적은 콩류의 천연겔 매트릭스내의 바실러스 터링지엔시스가 살충제 생물 농약으로서 작용하도록 들판 조건하에 살포되었을 때 겔 매트릭스속에서 성장·증식하고, 그 장소에서 생물 활성 B.T. 독소를 생산하기 위한 조건을 최적화하고, 햇빛 또는 자외선에 의한 환경적 손상으로부터 천연겔 매트릭스내의 B.T. 독소생산 인자를 보호하여 해충에 독소를 효과적으로 전달시킬 수 있는, 바실러스 터링지엔시스 세포의 바이오캡슐화를 위한 간단하고 저렴한 방법을 제공하는 것이
본 발명의 또다른 목적은 생분해가능하고, 환경적으로 안전한 바이오캡슐화 미생물 살충제 농약을 제공하는 것이다.
본 발명에서는, 단백질 및 지방이 풍부한 콩류를 5∼40% 농도로 물과 섞어 100℃ 이상, 바림직하게는 100∼121℃의 온도에서 끓인 후 분쇄시키거나 부드럽게 하여 균일한 겔 상태로 만든다. 겔화를 용이하게 하기 위하여, 고온에서 젤라틴 또는 한천을 상기 혼합물에 가할 수 있다.
상기 방법에서, 단백질 및 지방이 풍부한 콩류를 비롯한 단백질이 풍부한 고분자가 사용될 수 있으며, 단백질이 풍부한 고분자는 콩류, 견과류, 땅콩류, 지방종자, 이들의 분말 또는 부산물, 면실박 또는 그의 혼합물을 포함한다.
상기의 콩류 천연겔을 121℃에서 가압 멸균시킨 후 상혼∼50℃로 냉각시키고, 목적 미생물 세포 또는 포자와 균일하게 혼합한다.
콩류의 단백질 또는 지방 성분들은 가열에 의해 변성되어 냉각 후 연속적인 균일한 천연겔 매트릭스를 형성하여 다양한 생물 방제 인자들(바실러스 터링지엔시스 세포, 포자, 혹은 B.T. 독소)을 상기 천연겔 매트릭스내에 매트릭스 1g 당 104∼1014세포가 되게 가둔다. 천연겔 매트릭스-생물학적 방제 인자 복합체를 다양한 수단에 의해 분말, 입자 또는 펠릿으로 건조시켜 다양한 타입의 바이오캡슐화된 미생물 살충제 농약을 제조한다. 이때 상기 복합체의 건조 온도는 바람직하게는 20
본 발명에서는 사용된 "바이오캡슐화"라는 용어는 생물학적 활성인자를 콩류의 천연 고분자 물질을 사용하여 제조된 천연겔 매트릭스 내에 가두는 것을 의미한다.
이하 실시예로서 본 발명을 예시하고자 하지만, 이로써 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
(실시예 1) : 바이러스 터링지엔시스의 배양
바실러스 커링지엔시스 FM H1 (KCTC 0059BP)를 8ℓ의 발효 배지가 들어 있는 15ℓ 발효조에서 통기 (1v.v.m) 및 진탕 (40rpm)하면서 30℃로 증성 pH에서 2일 동안 배양시켰다. 배양 배지의 조성은 배니 1ℓ당 박토쏘이톤 20g, 효모 추출물 2g, 가용성 전분 5g, 글루코오즈 10g, MgSO4·7H2O 500㎎, FeSO4·7H2O 200㎎, MnCl2·4H2O 20㎎, ZnSO4·7H2O 20㎎이었다. 미생물 세포 또는 포자는 원심분리에 의해 발효 배지로부터 분리하여 100㎖의 10% 멸균 탈지 우유 용액에 분산시켜 1㎖당 1012세포 또는 포자를 만들었다.
(실시예 2) : 단백질이 풍부한 바이오캡슐화 B.T 제의 제조
단백질이 풍부한 천연겔 매트릭스를 제조하기 위해 녹두 500g과 콩나물콩 500g을 물 200㎖에 넣고 60분 동안 끓인 후 블렌더에 넣어 겔 상태로 만들었다. 생성된 천연겔 매트릭스를 121℃에서 30분동안 가압 멸균한 다음 상온으로 냉각시켰다.
실시예 1에서와 같이 배양된 바실러스 터링지엔시스 FM H1(KCTC 0059BP)의 세포 또는 포자가 들어 있는 10% 멸균 탈지 우유 현탁액을 상기에서 제조된 콩류를 이용한 천연겔 매트릭스와 혼합하여 천연겔 매트릭스 1g 당 약 109세포 또는 포자를 갖는 단백질 천연겔 매트릭스-매생물 세포/포자 복합체를 만들었다. 상기 복합체를 22℃에서 건조시키고 이를 각각 200 메쉬 크기의 분말 형태로 더 가공하여 바이오캡슐화된 B.T 제 생물 농약을 얻었다.
(비교예) : 탄수화물이 풍부한 바이오캡슐화 B.T 제 생물 농약의 제조
단백질이 풍부한 천연겔과의 효능을 비교하기 위해 탄수화물이 풍부한 천연겔 매트릭스를 다음과 같이 제조하였다. 쌀가루 1000g을 2500㎖의 물에 혼합하고 혼합물을 교반하면서 100℃에서 끓여 균일한 겔 매트릭스를 얻었다. 생성된 천연겔 매트릭스를 121℃에서 30분동안 가압 멸균한 다음 상온으로 냉각시켰다. 그 다음, 상기에서 제조한 탄수화물이 풍부한 천연겔을 사용하여 실시예 2와 동일하게 실시하여 바실러스 터링지엔시스가 쌀을 이용한 탄수화물 바이오 겔속에 캡슐화된 생물 농약을 얻었다.
(실시예 3) : 바이오캡슐화된 바실러스 터링지엔시스의 성장
실시예 2 및 비교예에서 얻은 각각의 바실러스 터링지엔시스 FM H1(KCTC 0059BP)이 캡슐화된 생물농약에서 미생물이 이들 입자의 생체고분자막 속에서 어떻게 증식하는가를 검정하였다. 시료를 무균페트리-접시에 넣고, 30℃의 온도 및 95% 이상의 습도를 유지하면서 0, 24 및 48시간동안 배양한 후 PDA 평판 배지(조성 : 감자추출물 200g, 글로코스 20g, 한천 15g)상에서 자라는 균총수에 의해 시료속의 미생물 총수를 결정하여 표 1에 나타내었다.
[표 1]
표 1에 표시한 바와 같이 단백질 천연겔 속에 바이오 캡슐화된 바실러스 터링지엔시스 세포는 탄수화물 천연겔속에 바이오 캡슐화된 세포보다 50배 이상 더 증식하였다. 이로부터 콩류를 이용한 단백질 천연겔이 B.T. 세포를 바이오 캡슐화하여 생물 농약을 제조하는데 있어서 탄수화물 천연겔보다 유리함을 알 수 있다.
(실시예 4) : 바이오캡슐화된 바실러스 터링지엔시스의 성장 및 B.T. 독소 생산
실시예 2 및 비교예에서 수득한 각각의 바이오캡슐화된 생성물의 건조 분말을 30℃에서 무균 플레이트에 깔린 축축한 여과지상에 두어 3일 동안 배양하였다. 배양기간 동안 총세포수 및 B.T. 독소 결정 형성을 현미경으로 관찰하였다(표 2). 현미경하에서 포자형성 및 B.T. 독소 결정체가 보이는 세포수는 전체 세포수의 75%에 달했다. 특히, 단백질 바이오겔속에 캡슐화된 바실러스 터링지엔시스 세포가 24시간내에 100배까지 성장할 수 있다는 것이 주목할 만하며, 이는 바실러스 터링지엔시스의 경우 콩류의 단백질 고분자속에 바이오캡슐화하는 것이 효율을 높일 수 있음을 뜻한다.
[표 2]
상기에서는 보는 바와 같이 바실러스 터링지엔시스 세포를 포함하는 B.T.제의 제조시 단백질 겔에 캡슐화하는 경우가 탄수화물 겔에 캡슐화하는 경우에 비해 바실러스 터링지엔시스의 증식이 훨씬 잘 되며 B.T. 독소 또한 많이 생성됨을 알 수 있다.

Claims (7)

  1. 가) 단백질 함량이 50 중량% 이상이 단백질이 풍부한 콩류의 천연 고분자를 물과 혼합하고 100℃이상으로 가열하여 분쇄하거나 부드럽게하여 균일한 겔 매트릭스를 만듬으로써 단백질이 풍부한 천연겔 매트릭스를 제조하고 ; 나) 상기 천연겔 매트릭스를 121℃에서 가압 멸균시키고 ; 다) 상기 멸균된 천연겔 매트릭스를 상온으로 냉각시키고 ; 라) 바실러스 터링지엔시스 세포, 포자 혹은 B.T. 독소 등이나 이들의 복합체를 포함하는 생물학적 방제 인자를 상기 냉각된 천연겔 매트릭스와 균일하게 혼합하고 ; 마) 수득된 천연겔 매트릭스-생물학적 방제 인자 복합체를 건조 또는 동결건조시킨 후 분쇄하여 분말, 입자 또는 펠릿을 제조하는 단계들을 포함하는 생물학적 방제 인자가 바이오캡슐화된 미생물살충제를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 풍부한 고분자가 콩류, 견과류, 땅콩류, 지방 종자, 이들의 분말 또는 부산물, 면실박 또는 그의 혼합물을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 가)의 천연겔중의 고형분 함량이 5∼40%인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 가)단계에서 상기 천연 고분자를 100℃∼121℃로 가열하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 라)단계에서 생물학적 방제 인자를 천연겔 매트릭스 1g 당 104∼1014세포 또는 포자의 농도로 가하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 마)단계에서 천연겔-생물학적 방제 인자 복합제를 20∼25℃로 건조시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 캡슐화된 미생물살충제.
KR1019930022037A 1993-10-22 1993-10-22 바이오캡슐화(bioencapsulation)를 이용한 미생물살충제의 제조방법 KR970007083B1 (ko)

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