KR100863326B1

KR100863326B1 - 살선충 활성을 나타내는 신균주 마이크로모노스포라 속.ａｗ０５００２７

Info

Publication number: KR100863326B1
Application number: KR1020070039974A
Authority: KR
Inventors: 김창진; 박동진; 김판경; 윤봉식; 이재찬; 윤황근
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-04-24
Filing date: 2007-04-24
Publication date: 2008-10-15

Abstract

본 발명은 살선충 활성을 나타내는 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 스트렙토마이세스 아베미틸리스 ATCC31271(Streptomyces avermitilis ATCC31271)에 비해 살선충 활성이 현저히 우수한 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027(Micromonospora sp. AW050027)[ KCTC 11118BP] 및 이의 용도에 관한 것이다.

소나무재선충, 살선충 활성, 마이크로모노스포라 속. AW050027

Description

살선충 활성을 나타내는 신균주 마이크로모노스포라 속. ＡＷ０５００２７{Micromonospora sp. AW050027 with nematocidal activity against pine wilt nematodes}

도 1은 마이크로모노스포라 속. AW050027의 전자현미경사진을 나타낸 것이다.

도 2는 선발된 살선충 활성 균주의 계통분류학적 위치를 나타낸 그림이다.

도 3은 소나무재선충이 있는 시료에 마이크로모노스포라 속. AW050027의 배양액(× 40 희석)을 처리하기 전(A)과 후(B)의 현미경 사진을 나타낸 것이다.

본 발명은 살선충 활성을 나타내는 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 스트렙토마이세스 아베미틸리스 ATCC31271(Streptomyces avermitilis ATCC31271)에 비해 살선충 활성이 현저히 우수한 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027(Micromonospora sp. AW050027)[KCTC 11118BP] 및 이의 용도에 관한 것이다.

현재 국내외적으로 소나무에 심각한 피해를 일으키고 있는 소나무시들음병(소나무재선충병)의 주요 원인은 매개충인 솔수염하늘소를 통한 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)이 기주식물에 감염되어 병을 일으킨다고 알려져 있다[소나무AIDS 소나무재선충병. 산림청 국립산림과학원 산림과학속보. 2004, 04-06]. 즉, 이 선충이 기주 식물체 내에 침투한 후에 사상균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 먹이로 하여 급속도로 증식한 후 가도관을 막아 수분의 상승을 차단함과 동시에 셀룰라아제(cellulase)를 분비하여 조직을 파괴함으로서 기주식물을 고사시키는 것으로 알려져 있다[Kishi, Y. 1995. The pune wood nematode and the Japanese pine sawyer. Thomas Company Limitied, Tokyo, Japan]. 최근에는 이 선충 표면에 부착된 여러 세균들과 이들 세균이 생산하는 페닐아세트산(phenylacetic acid)도 소나무시들병의 원인으로 밝혀지고 있다[Kawazu, K., Zhang, H., Tamashita, H., and Kanzaki, H. (1996) Relationship between the pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, and phanylacetic acid production, Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:1430-1415].

현재 소나무재선충병 방제제로는 메타이 브로마이드(methyi bromide), 메탐 소디움(metam sodium)과 같은 훈증제, 페니트로티온(fenitrothion), 포시아제이트(foshiazate)와 같은 유기인계 합성농약을 주로 사용하고 있고, 일부 아바멕틴(avamectin) 계열의 항생제를 사용하고 있으나, 독성이 강하여 극히 제한적으로 사용되고 있는 형편이다. 이 중 방선균인 스트렙토마이세스 아베미틸리스 ATCC31271(Streptomyces avermitilis ATCC31271)이 직접 생산 또는 반합성제제인 아바메악틴(Abameactin)과 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin benzoate)제제 등도 예방 효과는 다른 방제제와 비교하여 방제효과가 높은 편이나 이 화합물은 비수용성으로서 임상 적용에 어려움이 많다. 그러나, 본 발명에서 선발된 Micromonospora sp. AW050027균주는 수용성의 살선충 물질을 생산함으로써 현장 적용에 유리한 장점을 보유하고 있다고 하겠다.

그 외에 선충방제 방법으로 메탐소디움 액제 및 양고추냉이 오일 등을 활용한 훈증처리 방법이 있으나 이 방법은 이미 재선충에 감염되어 고사된 목재에 직접처리하는 방법으로 근본적인 소나무재선충 방제적용에는 어려움이 많이 있다.

한편, 일본의 경우는 레바미스(Levamis), 메설펜포스(Mesulfenfos), 모란텔 타르트레이트(Morantel tartrate)의 화학 합성농약 3 종류가 소나무재선충 치료약제로 시판되고 있으나, 고가로 인하여 관상수 등에 제한적으로 사용되고 있는 실정이다.

이와 같이, 소나무시들음병에 주 병원체인 재선충 방제를 위한 방법들이 개발 보고되었으나, 아직도 소나무재선충 감염이 전국적, 전 세계적으로 확산되는 현실로 실효적인 방제 어려움과 함께 산림보호에 위기가 가중되고 있다.

이에, 본 발명자들은 소나무시들음병의 주원인인 소나무재선충 등과 같은 선충에 대한 친환경적인 생물학적 방제를 위해 다양한 자연환경으로부터 다양한 미생 물들을 분리한 결과, 살선충 활성이 우수한 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027[KCTC 11118BP]를 분리함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 살선충 활성을 나타내는 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027[KCTC 11118BP]을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 살선충제를 제공하는데 있다.

본 발명은 살선충 활성을 나타내는 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027(Micromonospora sp. AW050027)[KCTC 11118BP]을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 살선충제를 포함한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 기존의 스트렙토마이세스 아베미틸리스 ATCC31271(Streptomyces avermitilis ATCC31271)에 비해 소나무재선충에 대한 살선충 활성이 현저히 우수한 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027(Micromonospora sp. AW050027)[KCTC 11118BP] 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 소나무시들음병의 주원인인 소나무재선충 등의 선충에 대한 친환경적인 생물학적 방제를 위해 다양한 자연환경으로부터 다양한 미생물들을 분리하였다. 이들 선발 균주들의 농도에 따른 살선충 활성과 소나무에 처리실험, 필드 적용실험을 통하여 생물학적 살충제(예를 들어, 소나무시들음병 방제제 포함) 개발에 응용하고자 함이다.

본 발명은 소나무시들음병의 주 병원체인 소나무재선충의 생물학적 방제를 위하여 다양한 지역에서 토양시료를 채취하여 다양한 미생물을 분리에 사용하였다. 채취한 토양시료를 순차적 희석 처리하여 미생물 분리원 배지에 골고루 도말하고 30 ℃에서 24 ~ 48 시간 배양한 후 세균 3,000종, 방선균 15,000종, 곰팡이 7,000종 등 다양한 미생물을 분리하였다. 살선충활성 미생물을 선발하기 위하여 소나무재선충이 각 웰당 100마리 농도로 준비된 96 웰 플레이트에 각각 분리 배양된 미생물의 배양액을 10배 희석 처리하여 약 100여 균주를 1차 선발하였다. 선발된 미생물 균주들을 대상으로 희석배율을 다양하게 하여 같은 방법으로 살선충활성 시험을 수행하여 가장 강력한 살선충 활성을 지닌 AW050027 균주를 선발하였다.

선발된 AW050027균주를 버어지스 매뉴얼(Bergy's Manual of Determinative Bacteriology)과 16s rRNA의 부분적 염기서열 분석에 따라 본 발명의 균주의 형태학적, 생리학적, 생화학적 및 유전학적 특성을 조사하여 균주 동정을 실시하였다.

그 결과, Micromonospora sp. NAR02 균주와 높은 상동성을 가지는 것을 확인하여 본 발명 균주를 마이크로모노스포라 속. AW050027이라 명명하였고, 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2007년 04월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 11118BP를 부여받았다.

또한, 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027은 배양액이 40배 희석된 시 험에서 100%로 강력한 살선충 활성을 나타내었다.

본 발명에서는 현재 문제시되고 있는 소나무재선충병으로 한정하여 실험을 실시하였으나, 이외의 다른 농지에 문제되는 선충에 대해서도 살선충 효과가 있을 것으로 충분히 예측 가능하다.

한편, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액은 살선충제 등의 생물농약을 포함할 수 있다.

다시 말하면, 상기 신균주를 이용한 생물농약으로서 마이크로모노스포라 속. AW050027 및 이의 배양액을 다양한 담체를 함께 사용하여 제조할 수 있다. 담체로는 통상적으로 사용되는 생물농약, 친환경농자재, 그리고 비료제형으로 허용 가능한 담체면 모두 사용할 수 있으나, 특히 질석, 미강, 제오라이트 등을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 유효성분은 전체 미생물제제 조성물에 대하여 0.001 ~ 90%를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 본 발명에 따른 균주 배양액을 20 ~ 40배 희석하여 수화제로 제제화시킨다. 이렇게 제조된 생물농약을 소나무시들음병을 억제하기 위하여, 소나무재선충 감염 전과 초기부터 1 ~ 10일 간격으로 1 ~ 10회 토양과 나무에 분무처리하거나 나무주사 처리하는 것이 바람직하다.

이러한 미생물제제는 살선충제, 소나무시들음병 방제제, 미생물영양제, 토양개량제 등의 다양한 형태로 만들어서 전반적인 생물농약, 미생물농약제, 친환경농자재 그리고 비료로 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 미생물 분리

본 연구팀이 그 동안 과학기술부 지원의 G7사업(1992년 ~ 2001년), 프런티어사업(2002년 ~ 현재) 등을 통해 획득한 미생물 탐색기술과 세계 각지에서 수집한 토양시료(2,000여점), 분리균주(세균 3,000종, 방선균 15,000종, 곰팡이 7,000종), 배양액(20,000여점), 활성 데이터, 데이터베이스(http://www.mrdb.or.kr)를 기반으로 활용하였다.

방선균의 분리는 여러 종류의 비타민(ρ-aminobenzoic acid 0.5 mg, biotin 0.25 mg, Ca-pantothenate 0.5 mg, inositol 0.5 mg, thiamin-HCl 0.5 mg)과 항생제(Cyclohexmide 50 mg, nalidixic acid 20 mg)가 포함된 humic acid-vitamin agar배지[Hayakawa, M. and H. Nonomura, 1987. Humic acid-vitamin agar, a new medium for the selective isolation of soil actinomycetes. J. Ferment. Technol. 65:501-509](humic acid 1 g, NaHPO₄ 0.5 g, KCl 1.7 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.05 g FeSO₄ㆍ7H₂O 0.01 g, CaCO₃ 0.02 g, agar 20 g, pH 7.2, 증류수 1L)를 사용하였으며 균주 보존은 Bennett's agar 배지[Atlas, R. M. 1993. Handbook of Microbiology Media, pp 126-127. 1^st ed. CRC, Florida](glucose 10 g, yeast extract 1 g, bacto-peptone 2 g, beef extract 1 g, agar 20 g, pH 7.2 증류수 1L)를 사용하였다. 실온에서 풍건한 토양시료 1 g을 멸균생리식염수 10 ml에 현탁한 다음 10^-4배까지 희석한 후 각각의 현탁액 0.1 ml을 부식산-비타민 아가(humic acid-vitamin agar) 배지에 도말하였다. 이를 28 ℃에서 2주간 배양하면서 배지 상에서 출현하는 방선균 집락을 Bennett's agar 배지 상에서 옮겨 28 ℃에서 1주일 배양한 후 형태적 특징을 상호 비교하여 서로 다른 방선균주들을 순수 분리하였다.

실시예 2 : 미생물의 동정

선발된 방선균의 속 동정은 Bergey's manual[Holt, J.G., N.R. Kriege, P.H.A. Snea, J.T. Staley and S.T.Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 605-703. 9^th ed Williams & Wilkins, Baltimore]과 ISP방법[Shirling, E.B. and D.Gottlieb. 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacterial. 16:313-340]에 따라 순수 분리된 각 균주의 형태 및 화학적 특성을 조사하여 행하였다. 즉, 기균사의 색상, 배면색상, 수용성 색소의 생성 여부와 전자현미경(scanning electron microscop)을 이용한 포자 쇄 등의 형태학적 특징[도 1 참조], 그리고 균주 세포벽의 성분인 DAP(diaminipimelic acid)의 특성을 조사하였다. DAP의 분석은 Lechevalier의 방법[Lechevalier, M.P. and H. Lechevalier. 1970. Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes. In. Syst. Bacteriol.20:435-443]에 따라 충분히 생육된 일정량의 균체를 6N HCl로 가수분해한 후 TLC(cellulose TLC; Merck 5715, 전개용매 메탄올: 물:6N HCl:피리딘=80:26:4:10) 상에서 전개시켜 LL-DAP 혹은 meso-DAP를 구분하였다.

소나무재선충에 대한 살선충 활성이 있는 AW050027 균주의 ISP 배지에서의 배양적 특성과 생리적 특성은 다음의 표 1, 2와 같다.

또한, 선발된 균주 AW050027의 세포벽 성분의 하나인 DAP는 meso 형태로 나타났으며, 계통분류학적 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열을 분석(Lane 1991)하였다[서열번호 1]. 16S rDNA염기서열을 분석 결과를 GENBANK의 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 활용하여 다른 균주와 상동성을 비교, 분석한 결과, 다음 표 3과 같이 나타났다.

균주	근연균	상동성
AW050027	Micromonospora sp. NARO2	1136/1146 (99%)

상기와 같은 결과로서, 본 발명 균주를 마이크로모노스포라 속. AW050027로 명명하고 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2007년 04월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 11118BP를 부여받았다.

실시예 3: 분리 균주의 소나무재선충에 대한 살선충 활성 검정

자연으로부터 순수 분리하여 보유한 다양한 방선균, 곰팡이, 세균 배양액으로부터 살선충 활성이 있는 균주 선발을 위해 소나무 재선충을 96 웰 플레이트 각각의 웰에 100마리 농도로 준비하였다. 처리된 96 웰 플레이트를 상온에서 24시간 방치 후에 살선충 활성을 광학 현미경 상에서 관찰하고 방법으로 1차 스크리닝을 통하여 활성이 우수한 균주 100여 균주를 선발하였다. 이 1차 선발 균주를 대상으로 재선충활성을 같은 방법으로 희석배율을 다양화 하여 2차 시험을 통하여 가장 살선충 활성이 우수한 균주로서 마이크로모노스포라 속. AW050027을 선발하였다.

상기에서 분리된 균주 마이크로모노스포라 속. AW050027과 공시균주인 스트렙토마이세스 아베미틸리스 ATCC31271(Streptomyces avermitilis ATCC31271)과 함께 소나무재선충이 들어있는 각각의 웰에 미생물 배양과 멸균 증류수로 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 희석비율로 처리하여 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 시험하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 마이크로모노스포라 속. AW050027 균주는 배양액이 40배 희석된 시험에서도 100%로 탁월한 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 나타내었다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 신균주인 마이크로모노스포라 속. AW050027[KCTC 11118BP]는 탁월한 살선충 활성을 나타내어 상기 신균주 또는 이의 배양액은 친환경적으로 살선충제로서 매우 유용하리라 기대된다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Micromonospora sp. AW050027 with nematocidal activity against pine wilt nematodes <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> Micromonospora sp. AW050027 <400> 1 garaccggct ttttgggatt cgctccacct cacggtatcg cagcccattg taccggccat 60 tgtagcatgc gtgaagccct ggacataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccacctt 120 cctccgagtt gaccccggca gtcttcgatg agtccccgcc ataacgcgct ggcaacatcg 180 aacgagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 240 gccatgcacc acctgtgacc gcccccgaag gacctcacat ctctgcgagt tttgcggcca 300 tgtcaaaccc aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta atccgcatgc tccgccgctt 360 gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg 420 cgcttaatgc gttagctgcg gcacagggaa ccggagaggc cccccacacc tagcgcccaa 480 cgtttacagc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct 540 cagcgtcagt atcggcccag agacctgcct tcgccatcgg tgttcctcct gatatctgcg 600 catttcaccg ctacaccagg aattccagtc tcccctaccg aactctagcc tgcccgtatc 660 gactgcaggc ccgcagttga gctgcgggtt ttcacagtcg acgcgacaag ccgcctacga 720 gctctttacg cccaataatc cggacaacgc tcgcacccta cgtcttaccg cggctgctgg 780 cacgtagttg gccggtgctt cttctgcagg taccgtcact tacgcttcgt ccctgctgaa 840 agaggtttac aacccgaagg ccgtcatccc tcacgcggcg tcgctgcatc aggcttccgc 900 ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc 960 agtgtggccg gtcgccctct caggccggct acccgtcgtc gccttggtag gccatcaccc 1020 caccaacaag ctgataggcc gcgagcccat cccaagccga aaaactttcc acccagcccc 1080 atgcgaggcc aggtcctatt cggtattagc cccggnaaac cn 1122

Claims

재선충에 대한 살선충 활성을 나타내는 신균주 마이크로모노스포라 속. AW050027 (Micromonospora sp. AW050027 [KCTC 11118BP]).
청구항 1의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 재선충에 대한 살선충제.