JP2642715B2 - カプセル封入方法 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的材料のカプセル封入に関する。さ
らに詳しくは、本発明は、微生物（細菌ならびにかび）
およびタンパク質のような生物学的材料を、その材料の
農業用剤（たとえば除草剤、殺虫剤等）としてまたは他
のある種の目的たとえば固定化触媒としての利用を高め
るために、カプセル封入する方法に関する。
らに詳しくは、本発明は、微生物（細菌ならびにかび）
およびタンパク質のような生物学的材料を、その材料の
農業用剤（たとえば除草剤、殺虫剤等）としてまたは他
のある種の目的たとえば固定化触媒としての利用を高め
るために、カプセル封入する方法に関する。
農業用製品としての微生物の使用は、微生物の効率的
な送達システムを欠くために妨げられてきた。フアーメ
ンター内の微生物はそのまま農場に使用することはでき
ない。フアーメンターから農場まで微生物の活性を維持
するためのシステムがなければならないし、製品は農場
に許容されるもの、有用なものでなければならない。そ
のためには、土壌中で使用できる必要があり、また雨期
を通じてさえ葉に付着しているものでなければならな
い。
な送達システムを欠くために妨げられてきた。フアーメ
ンター内の微生物はそのまま農場に使用することはでき
ない。フアーメンターから農場まで微生物の活性を維持
するためのシステムがなければならないし、製品は農場
に許容されるもの、有用なものでなければならない。そ
のためには、土壌中で使用できる必要があり、また雨期
を通じてさえ葉に付着しているものでなければならな
い。
微生物をカプセル封入する本発明の方法には５つの利
点がある。すなわち、（１）カプセル封入後の生育可
能、活性微生物のきわめて高い回収率、（２）完成製品
では微生物が保存に適した休眠状態に置かれている、
（３）カプセル封入された微生物処方は流動体を有し、
標準的装置を用いた利用が可能である、（４）カプセル
封入微生物は葉の表面に付着させることができる、
（５）光分解を受けやすいおよび／または酵素的に不安
定な生物学的材料の送達手段を提供すること、である。
点がある。すなわち、（１）カプセル封入後の生育可
能、活性微生物のきわめて高い回収率、（２）完成製品
では微生物が保存に適した休眠状態に置かれている、
（３）カプセル封入された微生物処方は流動体を有し、
標準的装置を用いた利用が可能である、（４）カプセル
封入微生物は葉の表面に付着させることができる、
（５）光分解を受けやすいおよび／または酵素的に不安
定な生物学的材料の送達手段を提供すること、である。
Boshanのアルギン酸塩ビーズ法（“Alginate Beads a
s Sythetic Inoculant Carriers for Slow Release of
Bacteria that Affect Plant Growth",Applied＆Enviro
nmental Microbiology,Vol.51、NO.5、pp1089〜1098、1
986）のような従来技術と異なり、カプセル封入過程の
間に失われる細胞は通常1.5log未満であるから、再生育
工程を必要としない。再生育工程を必要としないから、
ビーズの構造はポリマーおよびビーズ製造過程によつて
制御され、生育する微生物の影響に支配されることがな
い。これによつてより均一で予期どおりの構造、ならび
にビーズのポリマー組成および微細構造によつて決定さ
れる放出像が達成される。
s Sythetic Inoculant Carriers for Slow Release of
Bacteria that Affect Plant Growth",Applied＆Enviro
nmental Microbiology,Vol.51、NO.5、pp1089〜1098、1
986）のような従来技術と異なり、カプセル封入過程の
間に失われる細胞は通常1.5log未満であるから、再生育
工程を必要としない。再生育工程を必要としないから、
ビーズの構造はポリマーおよびビーズ製造過程によつて
制御され、生育する微生物の影響に支配されることがな
い。これによつてより均一で予期どおりの構造、ならび
にビーズのポリマー組成および微細構造によつて決定さ
れる放出像が達成される。
Boshanのアルギン酸塩ビーズ法では、生存細菌数は３
〜4logほど低下し、ビーズを凍結乾燥したときにはビー
ズ1gあたり高々107個の細胞しか残らない。本発明の方
法に従うと108〜109個の収量が達成され、しかもまだ負
荷能力の限界に達していない。ビーズ1gあたり生育可能
細胞1012個の微生物負荷も可能である。
〜4logほど低下し、ビーズを凍結乾燥したときにはビー
ズ1gあたり高々107個の細胞しか残らない。本発明の方
法に従うと108〜109個の収量が達成され、しかもまだ負
荷能力の限界に達していない。ビーズ1gあたり生育可能
細胞1012個の微生物負荷も可能である。
図面の簡単な説明 第１図は、ビーズの製造に有用なノズルの断面を図解
的に示す図である。
的に示す図である。
第２図は、典型的なPVOHビーズの全体図および断面図
である。
である。
第３図は、典型的なPVPビーズを示す。
第４図は、典型的なHPCビーズを示す。
第５図は、雨の後、葉の表面に付着しているPVOHビー
ズを示す。
ズを示す。
発明の説明 本発明は、生物学的材料のカプセル封入方法を提供す
るものである。本発明の方法によれば、生物学的材料
は、非イオン性ポリマーが少なくとも3w/v％の濃度で存
在する水性ポリマーと混合する。この混合物を、水非混
合性でそのポリマーの非溶媒中に、ビーズが急速に凍結
するのに十分な温度であるがポリマービーズの凍結破裂
を生じるほどは低くない温度に維持しながら滴加して、
ビーズを生成させる。生物学的材料を含有するポリマー
ビーズを次に乾燥し、ビーズに含まれる実質的にすべて
の非結合水を除去する。
るものである。本発明の方法によれば、生物学的材料
は、非イオン性ポリマーが少なくとも3w/v％の濃度で存
在する水性ポリマーと混合する。この混合物を、水非混
合性でそのポリマーの非溶媒中に、ビーズが急速に凍結
するのに十分な温度であるがポリマービーズの凍結破裂
を生じるほどは低くない温度に維持しながら滴加して、
ビーズを生成させる。生物学的材料を含有するポリマー
ビーズを次に乾燥し、ビーズに含まれる実質的にすべて
の非結合水を除去する。
本発明の一態様は、微生物を有用な農業用剤とするこ
とを可能にする。本発明のポリマービーズは、微生物を
休眠状態で市場に送達する。ビーズは、土壌または植物
の葉への送達に適当なように製造できる。さらに使用さ
れるポリマー材料は生物分解性であり、ビーズは栽培も
しくは殺虫箱を介して乾燥状態でまたは噴霧ノズルを経
て湿潤状態で適用できる。
とを可能にする。本発明のポリマービーズは、微生物を
休眠状態で市場に送達する。ビーズは、土壌または植物
の葉への送達に適当なように製造できる。さらに使用さ
れるポリマー材料は生物分解性であり、ビーズは栽培も
しくは殺虫箱を介して乾燥状態でまたは噴霧ノズルを経
て湿潤状態で適用できる。
少なくとも３％w/vの溶解度を有し、カプセル封入し
ようとする微生物に対して有害でない水溶性非イオンポ
リマーを使用できる。非イオン性ポリマーとほ、実質的
に純電荷をもたない中性ポリマーを意味する。ポリマー
の濃度は５〜15％が好ましい。適当なポリマーには、ポ
リ（ビニルアルコール）（PVOH）、好ましくは分子範囲
約10,000〜125,000、加水分解率85〜100％；ポリビニル
ピロドリン（PVP）、好ましくは分子量範囲約10,000〜3
60,000;デキストラン、好ましくは分子量範囲約10,000
〜249,000;および各種セルロース誘導体ポリマー、たと
えばヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、好ましく
は分子量範囲約60,000〜1,000,000が包含される。
ようとする微生物に対して有害でない水溶性非イオンポ
リマーを使用できる。非イオン性ポリマーとほ、実質的
に純電荷をもたない中性ポリマーを意味する。ポリマー
の濃度は５〜15％が好ましい。適当なポリマーには、ポ
リ（ビニルアルコール）（PVOH）、好ましくは分子範囲
約10,000〜125,000、加水分解率85〜100％；ポリビニル
ピロドリン（PVP）、好ましくは分子量範囲約10,000〜3
60,000;デキストラン、好ましくは分子量範囲約10,000
〜249,000;および各種セルロース誘導体ポリマー、たと
えばヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、好ましく
は分子量範囲約60,000〜1,000,000が包含される。
乾燥PVOHは冷水には容易には溶解しないので、PVOHビ
ーズは膨潤や破枠が起こつても溶解することはない。膨
潤や破枠の程度は使用するPVOHの分子量によつて調節で
きる。PVOHビーズの膨潤および破枠はPVOHの分子量が大
きくなるほど低下する。乾燥PVOHは、水性PVOH混合物を
80℃以上、好ましくは沸点まで加熱することにより可溶
化される。PVOHで製造したビーズは40℃以下の温度では
実質的に水に不溶性である。PVOHビーズの統合性（溶解
率）は、他の冷水溶解性ポリマー、たとえばポリエチレ
ングリコール（PEG）をPVOHに配合することによつて低
下させることができる。PVP、セルロース誘導体および
デキストランから製造されたビーズは、冷水または室温
の水に入れると溶解する。
ーズは膨潤や破枠が起こつても溶解することはない。膨
潤や破枠の程度は使用するPVOHの分子量によつて調節で
きる。PVOHビーズの膨潤および破枠はPVOHの分子量が大
きくなるほど低下する。乾燥PVOHは、水性PVOH混合物を
80℃以上、好ましくは沸点まで加熱することにより可溶
化される。PVOHで製造したビーズは40℃以下の温度では
実質的に水に不溶性である。PVOHビーズの統合性（溶解
率）は、他の冷水溶解性ポリマー、たとえばポリエチレ
ングリコール（PEG）をPVOHに配合することによつて低
下させることができる。PVP、セルロース誘導体および
デキストランから製造されたビーズは、冷水または室温
の水に入れると溶解する。
第２図は、典型的なPVOHビーズの全体図、およびスポ
ンジ様の多孔性構造を示す断面図である。第３図は典型
的な（10％w/v）PVPビーズである。第４図は典型的な
（10％w/v、分子量60,000）HPCビーズである。
ンジ様の多孔性構造を示す断面図である。第３図は典型
的な（10％w/v）PVPビーズである。第４図は典型的な
（10％w/v、分子量60,000）HPCビーズである。
ポリマーの分子量はビーズの機械的強度に影響する。
一般的に、ビーズの強度は分子量の増加とともに増大す
る。たとえば、各種分子量のPVOHの混合物から製造され
るが、平均分子量61,000のPVOHビーズは、水に添加され
た場合、膨潤するものの、ほとんど破枠されることはな
い。分子量25,000のPVOHから製造されるビーズは水中で
速やかに破枠され、溶解する。分子量約10,000未満では
ビーズはきわめて砕けやすくなる。一般的に、使用する
PVOHの分子量が増加すると破枠性は低下する。この構造
的統合効果は、ビーズマトリツクスからの微生物の放出
を変化させるのに利用できる。たとえば、ビーズの破枠
は、それに含有された生物学的物質のより速やかな放出
を生じる。
一般的に、ビーズの強度は分子量の増加とともに増大す
る。たとえば、各種分子量のPVOHの混合物から製造され
るが、平均分子量61,000のPVOHビーズは、水に添加され
た場合、膨潤するものの、ほとんど破枠されることはな
い。分子量25,000のPVOHから製造されるビーズは水中で
速やかに破枠され、溶解する。分子量約10,000未満では
ビーズはきわめて砕けやすくなる。一般的に、使用する
PVOHの分子量が増加すると破枠性は低下する。この構造
的統合効果は、ビーズマトリツクスからの微生物の放出
を変化させるのに利用できる。たとえば、ビーズの破枠
は、それに含有された生物学的物質のより速やかな放出
を生じる。
本発明の独特な性質のひとつは、ビーズを凍結乾燥さ
せ、その形態を保持させることができる点である。これ
は、現在細胞の固定化に用いられている材料（アガー
ル、アルギン酸塩等）に比べて、使用されるポリマーが
高濃度水に可溶で、粘度が低いために可能となる。した
がつて、ビーズは、水を除去したのちにも有用な強度を
示すのに十分なポリマー（＞３％w/v）で製造すること
ができる。たとえばPVOHまたはPVP約５％w/vの濃度での
粘度は1000センチポイズ（cp）未満である。ポリマーお
よびその分子量によつては、ポリマー濃度をその溶解限
度まで上昇させることもできる。しかしながら、多くの
場合、ビーズの強度を約15％w/v以上に増大させても無
用で、ある種の高分子量ポリマーはこの濃度以上では粘
稠すぎてビーズの製造が難しくなる。
せ、その形態を保持させることができる点である。これ
は、現在細胞の固定化に用いられている材料（アガー
ル、アルギン酸塩等）に比べて、使用されるポリマーが
高濃度水に可溶で、粘度が低いために可能となる。した
がつて、ビーズは、水を除去したのちにも有用な強度を
示すのに十分なポリマー（＞３％w/v）で製造すること
ができる。たとえばPVOHまたはPVP約５％w/vの濃度での
粘度は1000センチポイズ（cp）未満である。ポリマーお
よびその分子量によつては、ポリマー濃度をその溶解限
度まで上昇させることもできる。しかしながら、多くの
場合、ビーズの強度を約15％w/v以上に増大させても無
用で、ある種の高分子量ポリマーはこの濃度以上では粘
稠すぎてビーズの製造が難しくなる。
したがつて、本発明は他の様態として、水溶性非イオ
ン性ポリマーと生物学的材料からなり、非結合水を実質
的に含まず、破枠されにくい、スポンジ様の多孔性構造
を有する組成物（第２図〜第４図参照）を提供する。
ン性ポリマーと生物学的材料からなり、非結合水を実質
的に含まず、破枠されにくい、スポンジ様の多孔性構造
を有する組成物（第２図〜第４図参照）を提供する。
さらに他の態様として、本発明は、80℃未満の温度で
は容易に溶解しないが80℃を越える温度では溶解可能な
非イオン性ポリマーと生物学的材料からなり、非結合水
を実質的に含まず、40℃未満の温度では実質的に水に不
溶性の固体組成物を提供する。生物学的材料が生育可能
な微生物である場合、微生物の含量は、組成物の0.01〜
50重量％とすることができる。
は容易に溶解しないが80℃を越える温度では溶解可能な
非イオン性ポリマーと生物学的材料からなり、非結合水
を実質的に含まず、40℃未満の温度では実質的に水に不
溶性の固体組成物を提供する。生物学的材料が生育可能
な微生物である場合、微生物の含量は、組成物の0.01〜
50重量％とすることができる。
ポリマー溶液は、15psig、121℃において30分間オー
トクレープ処理することができる。多くの場合、これ
は、望ましくない微生物の夾雑を回避できるので有利で
ある。冷却時に溶液を撹拌すると、表面の薄膜形成を避
けることができる。薄膜は、溶液を、ビーズに加工する
際に妨害となる。栄養素および／または加重剤はオート
クレーブ処理の前に添加することができる。別法とし
て、栄養素は滅菌濾過し、オートクレーブ処理後に無菌
的に加えることもできる。粘度は20〜1,000cpの範囲に
維持することが好ましい。しかしながら、粘度に対する
制限のみは、採用されたビーズの製造方法によつて指示
される。
トクレープ処理することができる。多くの場合、これ
は、望ましくない微生物の夾雑を回避できるので有利で
ある。冷却時に溶液を撹拌すると、表面の薄膜形成を避
けることができる。薄膜は、溶液を、ビーズに加工する
際に妨害となる。栄養素および／または加重剤はオート
クレーブ処理の前に添加することができる。別法とし
て、栄養素は滅菌濾過し、オートクレーブ処理後に無菌
的に加えることもできる。粘度は20〜1,000cpの範囲に
維持することが好ましい。しかしながら、粘度に対する
制限のみは、採用されたビーズの製造方法によつて指示
される。
ポリマー溶液のpHはオートクレーブ処理の間に変動す
ることがあるので（たとえばアセテート残基がPVOHから
加水分解されて、溶液中に酢酸を生じる）、所望のpH、
通常は６〜7.5を維持するように、ポリマー溶液は緩衝
化する必要がある。使用できる緩衝剤には微生物に悪影
響を与えない任意の生理的に許容される緩衝剤が包含さ
れる。好ましい緩衝剤は0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液
である。
ることがあるので（たとえばアセテート残基がPVOHから
加水分解されて、溶液中に酢酸を生じる）、所望のpH、
通常は６〜7.5を維持するように、ポリマー溶液は緩衝
化する必要がある。使用できる緩衝剤には微生物に悪影
響を与えない任意の生理的に許容される緩衝剤が包含さ
れる。好ましい緩衝剤は0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液
である。
加重剤の添加は、大抵の場合、処方されたビーズの比
重を増大させ、ビーズの取扱いを容易にするので有利で
ある。微生物の活性に悪影響を与えない任意の加重剤が
使用できる。適当な加重剤には、シリカ、シリカゲル、
ペンナイトおよびアルミナが包含される。アルミナはと
くに好ましい。アルミナは、ポリマー溶液に添加する前
に、水および糖たとえばデキストロースまたはスクロー
スと完全に混合する、これによつて、アルミナをよく分
散させ、糖によるアルミナの前処理はアルミナとポリマ
ー上のヒドロキシル基との相互作用を低下させる。ポリ
マーとアルミナの相互作用で溶液は糸を引くようになる
場合がある。
重を増大させ、ビーズの取扱いを容易にするので有利で
ある。微生物の活性に悪影響を与えない任意の加重剤が
使用できる。適当な加重剤には、シリカ、シリカゲル、
ペンナイトおよびアルミナが包含される。アルミナはと
くに好ましい。アルミナは、ポリマー溶液に添加する前
に、水および糖たとえばデキストロースまたはスクロー
スと完全に混合する、これによつて、アルミナをよく分
散させ、糖によるアルミナの前処理はアルミナとポリマ
ー上のヒドロキシル基との相互作用を低下させる。ポリ
マーとアルミナの相互作用で溶液は糸を引くようになる
場合がある。
本発明の方法を用いれば、グラム陽性菌およびグラム
陰性菌、ならびにかびをカプセル封入することができ
る。微生物の例としては、バチルス・スリンギエンシス
（Bacillus thuringiesis）；シユードモナス（Pseudom
onas属の微生物たとえば寄託番号NRRL B−15132、NRRL
B−15133、NRRL B−15134およびNRRL B−15135、ATCC39
802のシユードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas f
luorescens）；寄託番号ATCC39803のアグロバクテリウ
ム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）；
ならびにオルタナリア・カシエ（Alternaria cassiae）
のようなかびの種を挙げることができる。微生物はポリ
マー溶液を室温に冷却したのち添加される。細胞は培養
上清から洗浄してもよいが、培養メジウム中の通常の成
分および細胞の産生物がビーズの調製を妨害することは
ない。微生物が有害な代謝物を産生する場合には、カプ
セル封入前に洗浄によつて除去することが好ましい。細
胞は、ポリマー溶液と混合する前に、均一な懸濁液を得
るために少量の液体中に再懸濁する。懸濁する液体は単
に最初の遠心分離の際の上清（培養肉汁）であつてもよ
く、また凍結および凍結乾燥時に特定の微生物の生存率
を増大させる特定の処方とすることもできる。さらに微
生物の除草剤もしくは有害生物殺滅剤としての利用また
は標的植物もしくは土壌に集落化するその能力を高める
補助剤あれば、それらを添加してもよい。大抵の場合、
懸濁液体の容量はポリマー溶液の容量の５％を越えない
ように決定されるのが好ましいが、20％程度の高容量と
してもとくに問題はない。
陰性菌、ならびにかびをカプセル封入することができ
る。微生物の例としては、バチルス・スリンギエンシス
（Bacillus thuringiesis）；シユードモナス（Pseudom
onas属の微生物たとえば寄託番号NRRL B−15132、NRRL
B−15133、NRRL B−15134およびNRRL B−15135、ATCC39
802のシユードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas f
luorescens）；寄託番号ATCC39803のアグロバクテリウ
ム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）；
ならびにオルタナリア・カシエ（Alternaria cassiae）
のようなかびの種を挙げることができる。微生物はポリ
マー溶液を室温に冷却したのち添加される。細胞は培養
上清から洗浄してもよいが、培養メジウム中の通常の成
分および細胞の産生物がビーズの調製を妨害することは
ない。微生物が有害な代謝物を産生する場合には、カプ
セル封入前に洗浄によつて除去することが好ましい。細
胞は、ポリマー溶液と混合する前に、均一な懸濁液を得
るために少量の液体中に再懸濁する。懸濁する液体は単
に最初の遠心分離の際の上清（培養肉汁）であつてもよ
く、また凍結および凍結乾燥時に特定の微生物の生存率
を増大させる特定の処方とすることもできる。さらに微
生物の除草剤もしくは有害生物殺滅剤としての利用また
は標的植物もしくは土壌に集落化するその能力を高める
補助剤あれば、それらを添加してもよい。大抵の場合、
懸濁液体の容量はポリマー溶液の容量の５％を越えない
ように決定されるのが好ましいが、20％程度の高容量と
してもとくに問題はない。
微生物は、冷却、凍結および凍結乾燥によつて障害を
受けやすい。この傷害が何であるか、これらの傷害がど
うして起こるか、またこのような傷害をどのようにして
防止できるかは残念ながら完全にはわかつていない。グ
ラム陽性菌はグラム陰性菌よりも保護を要しないと考え
られてきたが、保護の要否は微生物毎に異なると考える
方が多分正しいように思われる。考慮されるべき因子と
しては、培養細胞の継代数、生育速度、生育メジウムの
種類、温度低下の程度および速度、ならびに寒冷ストレ
ス以後の生育方法がある。糖、スキムミルク、グリセル
ロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）または他の凍結
保護剤の添加で培養物を安定化することができる。各凍
結保護剤の効果はそれぞれに異なり、それらの使用は経
験的に決定される。グリセロール、スクロースおよびDM
SOは広く適用できることが明らかにされている。
受けやすい。この傷害が何であるか、これらの傷害がど
うして起こるか、またこのような傷害をどのようにして
防止できるかは残念ながら完全にはわかつていない。グ
ラム陽性菌はグラム陰性菌よりも保護を要しないと考え
られてきたが、保護の要否は微生物毎に異なると考える
方が多分正しいように思われる。考慮されるべき因子と
しては、培養細胞の継代数、生育速度、生育メジウムの
種類、温度低下の程度および速度、ならびに寒冷ストレ
ス以後の生育方法がある。糖、スキムミルク、グリセル
ロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）または他の凍結
保護剤の添加で培養物を安定化することができる。各凍
結保護剤の効果はそれぞれに異なり、それらの使用は経
験的に決定される。グリセロール、スクロースおよびDM
SOは広く適用できることが明らかにされている。
かびについても上述した配慮が同様に必要であるが、
他の処理も行う必要がある。カプセル封入過程で、かび
の胞子は大量の水に曝露されることになる。かびの多く
は、水の存在で発芽が刺激されるので、カプセル封入過
程で胞子を水から保護するために前処理を行うことが好
ましい。胞子を6Mソルビタール中に予め浸漬されること
は有効な処理があることが明らかにされている。このよ
うにソルビトールで前処理した胞子は非処理胞子のよう
に容易には湿潤せず、カプセル封入過程を通じて生存す
る。ソルビトールによる前処理が好ましいが、かび胞子
のポリエチレングリコール（分子量200）の前処理も同
様に有効である。
他の処理も行う必要がある。カプセル封入過程で、かび
の胞子は大量の水に曝露されることになる。かびの多く
は、水の存在で発芽が刺激されるので、カプセル封入過
程で胞子を水から保護するために前処理を行うことが好
ましい。胞子を6Mソルビタール中に予め浸漬されること
は有効な処理があることが明らかにされている。このよ
うにソルビトールで前処理した胞子は非処理胞子のよう
に容易には湿潤せず、カプセル封入過程を通じて生存す
る。ソルビトールによる前処理が好ましいが、かび胞子
のポリエチレングリコール（分子量200）の前処理も同
様に有効である。
ポリマーと微生物または他の生物学的材料からなる上
記混合物が完成したならば、この混合物を冷却浴に約−
30℃で滴状に添加する。冷却浴は、水非混和性で、ポリ
マーの非溶媒である液体から構成される。冷却浴に用い
られる液体は上述の両性質をもつことが重要である。適
当な非溶媒には、ヘキサン、石油エーテルおよびフレオ
ン113が包含される。非溶媒としてはヘキサンがとくに
好ましい。
記混合物が完成したならば、この混合物を冷却浴に約−
30℃で滴状に添加する。冷却浴は、水非混和性で、ポリ
マーの非溶媒である液体から構成される。冷却浴に用い
られる液体は上述の両性質をもつことが重要である。適
当な非溶媒には、ヘキサン、石油エーテルおよびフレオ
ン113が包含される。非溶媒としてはヘキサンがとくに
好ましい。
温度もまた重要なパラメーターである。温度が高すぎ
ると（たとえば−15℃）、ビーズの凍結に時間がかかつ
て、ビーズの形態は不均一性を欠くことになる。温度が
低すぎると（たとえば−80℃）、ビーズは形成時に破裂
する。この過程中、熱交換を助けるため、また多数のビ
ーズが相互に粘着しないで速やかに製造できるように、
非溶媒を撹拌することが好ましい。
ると（たとえば−15℃）、ビーズの凍結に時間がかかつ
て、ビーズの形態は不均一性を欠くことになる。温度が
低すぎると（たとえば−80℃）、ビーズは形成時に破裂
する。この過程中、熱交換を助けるため、また多数のビ
ーズが相互に粘着しないで速やかに製造できるように、
非溶媒を撹拌することが好ましい。
非溶媒が水非混和性でもあるという条件は、微生物に
毒性を示すほど高濃度の非溶媒がビーズ内に浸透するこ
とが妨げるのに有効である。さらに、水混和性非溶媒で
は、その中にある程度、ポリマーと水の混合物が分散す
るので、ビーズの形成がすぐには起こらない。その結
果、ばらばらの丸いビーズではなく、糸を引いた細長い
ビーズを形成しやすくなる。
毒性を示すほど高濃度の非溶媒がビーズ内に浸透するこ
とが妨げるのに有効である。さらに、水混和性非溶媒で
は、その中にある程度、ポリマーと水の混合物が分散す
るので、ビーズの形成がすぐには起こらない。その結
果、ばらばらの丸いビーズではなく、糸を引いた細長い
ビーズを形成しやすくなる。
微生物の生存率を著しく低下させることのない任意の
ビーズ製造方法が、本発明に使用する方法として適して
いる。第１図には、細胞の生存率を低下させることな
く、ビーズの製造に有効に使用されたノズルを示す。開
口部のサイズ、管部の長さ、およびキヤップの内側の角
度は、噴霧されるポリマー／微生物混合物および所望の
ビーズの大きさによつて適宜変更して用いられる。ノズ
ルはポリマー混合物の貯蔵部に接続される。貯蔵部は一
定の圧力に保持される。使用される圧力も、ポリマー混
合物の粘度および所望のビーズの大きさに依存する。帰
射気体（好ましくは含湿窒素）はノズル先端の上部から
流入させ、その流速を注意深く調節する。その流速の調
節は、ビーズの大きさの制御に肝要である。噴射された
液体は−30℃に冷却した非溶媒浴に集められる。非溶媒
浴の温度は角循環浴を用いて維持する。このシステムで
は、ビーズの形成に、高圧、大きな圧力降下、熱または
超音波を用いることがなく、細胞にはきわめて穏やかで
ある。したがつて、この方法では細胞の損傷は全く起こ
らず、生存率の低下は生じない。
ビーズ製造方法が、本発明に使用する方法として適して
いる。第１図には、細胞の生存率を低下させることな
く、ビーズの製造に有効に使用されたノズルを示す。開
口部のサイズ、管部の長さ、およびキヤップの内側の角
度は、噴霧されるポリマー／微生物混合物および所望の
ビーズの大きさによつて適宜変更して用いられる。ノズ
ルはポリマー混合物の貯蔵部に接続される。貯蔵部は一
定の圧力に保持される。使用される圧力も、ポリマー混
合物の粘度および所望のビーズの大きさに依存する。帰
射気体（好ましくは含湿窒素）はノズル先端の上部から
流入させ、その流速を注意深く調節する。その流速の調
節は、ビーズの大きさの制御に肝要である。噴射された
液体は−30℃に冷却した非溶媒浴に集められる。非溶媒
浴の温度は角循環浴を用いて維持する。このシステムで
は、ビーズの形成に、高圧、大きな圧力降下、熱または
超音波を用いることがなく、細胞にはきわめて穏やかで
ある。したがつて、この方法では細胞の損傷は全く起こ
らず、生存率の低下は生じない。
凍結したビーズを冷却非溶媒から集め、乾燥させる。
ビーズの乾燥には任意の方法を使用できるが、微生物の
生存率の維持が重要な場合には凍結乾燥が好ましい。非
溶媒から回収したならば、ビーズは冷いまま凍結乾燥器
に移す。凍結乾燥器の構成および乾燥するビーズの量に
応じて、凍結ビーズの乾燥には８〜48時間を要する。乾
燥が不完全な場合は凝集やビーズの統合性の喪失が起こ
る。乾燥しすぎると生存能が失われる。ビーズは非結合
水の実質的にすべてが除去されるまで凍結乾燥すること
が好ましい。微生物のカプセル封入の場合には、乾燥ビ
ーズ中には約１〜２重量％の水分が残留する。
ビーズの乾燥には任意の方法を使用できるが、微生物の
生存率の維持が重要な場合には凍結乾燥が好ましい。非
溶媒から回収したならば、ビーズは冷いまま凍結乾燥器
に移す。凍結乾燥器の構成および乾燥するビーズの量に
応じて、凍結ビーズの乾燥には８〜48時間を要する。乾
燥が不完全な場合は凝集やビーズの統合性の喪失が起こ
る。乾燥しすぎると生存能が失われる。ビーズは非結合
水の実質的にすべてが除去されるまで凍結乾燥すること
が好ましい。微生物のカプセル封入の場合には、乾燥ビ
ーズ中には約１〜２重量％の水分が残留する。
以下の実施例により、本発明の実施例態様をさらに詳
細に説明するが、これらはいかなる意味においても本発
明の範囲の限定を意図するものではない。
細に説明するが、これらはいかなる意味においても本発
明の範囲の限定を意図するものではない。
加重剤の添加 ビーズは、様々な加重剤たとえばベントナイト、シリ
カ、シリカゲルおよびアルミナを用いて形成させること
ができる。10％w/vPVPに10％のベントナイトを加えて製
造したビーズでは、密度は0.09g/ml（10％w/vPVPだけの
場合）から0.14g/mlにわずか増加する。10％以上のベン
トナイトを添加すると粘度が増加し、最終製品の密度の
増加による利点よりも粘度の高い溶液の取扱いの難しさ
の方が問題になる。シリカは少なくとも20％まで添加で
き、20％濃度における最終製品の密度は約0.25g/mlであ
つた。この程度の濃度のシリカは、取扱いが難しいほど
までに粘度を増加させることはなく、またカプセル封入
される細胞に毒性を示すこともなかつた。シリカゲルを
シリカと同濃度添加しても類似の結果が得られた。しか
しながら、シリカゲルを添加すると、ポリマー、シリカ
ゲルおよび細胞の混合物のpHは著しく低下した。pHの変
化は、カプセル封入する細胞および／またはタンパク質
に悪影響を与えることがある。
カ、シリカゲルおよびアルミナを用いて形成させること
ができる。10％w/vPVPに10％のベントナイトを加えて製
造したビーズでは、密度は0.09g/ml（10％w/vPVPだけの
場合）から0.14g/mlにわずか増加する。10％以上のベン
トナイトを添加すると粘度が増加し、最終製品の密度の
増加による利点よりも粘度の高い溶液の取扱いの難しさ
の方が問題になる。シリカは少なくとも20％まで添加で
き、20％濃度における最終製品の密度は約0.25g/mlであ
つた。この程度の濃度のシリカは、取扱いが難しいほど
までに粘度を増加させることはなく、またカプセル封入
される細胞に毒性を示すこともなかつた。シリカゲルを
シリカと同濃度添加しても類似の結果が得られた。しか
しながら、シリカゲルを添加すると、ポリマー、シリカ
ゲルおよび細胞の混合物のpHは著しく低下した。pHの変
化は、カプセル封入する細胞および／またはタンパク質
に悪影響を与えることがある。
密度が大きいので、アルミナはビーズの密度を著しく
上昇させる。好ましい種類のアルミナは、非処理面で表
面積の大きくないアランダムである。表面積の大きいア
ルミナを使用すると、生育可能細胞数が21og以上も低下
する。PVPおよびPVOHビーズのいずれにも30％までのア
ルミナを使用できる。その濃度30％を用いたビーズは約
1.8g/mlの密度を示し、流動性は良好で取扱いは容易で
あつた。粒子径10ミクロンまたはそれ以下のアルミナが
好ましく、ポリマー混合物に良好な処理特性を確実に付
与し、ビーズ形成開口部をよく通過して詰まりを生じる
ことがない。この固体をポリマー溶液に分散するため、
また固体を添加前に予め湿潤させるためには、すべての
場合、高速ミキサーまたはブレンダーの使用が必要であ
つた。
上昇させる。好ましい種類のアルミナは、非処理面で表
面積の大きくないアランダムである。表面積の大きいア
ルミナを使用すると、生育可能細胞数が21og以上も低下
する。PVPおよびPVOHビーズのいずれにも30％までのア
ルミナを使用できる。その濃度30％を用いたビーズは約
1.8g/mlの密度を示し、流動性は良好で取扱いは容易で
あつた。粒子径10ミクロンまたはそれ以下のアルミナが
好ましく、ポリマー混合物に良好な処理特性を確実に付
与し、ビーズ形成開口部をよく通過して詰まりを生じる
ことがない。この固体をポリマー溶液に分散するため、
また固体を添加前に予め湿潤させるためには、すべての
場合、高速ミキサーまたはブレンダーの使用が必要であ
つた。
アルミナの前処理 アルミナをポリ（ビニルアルコール）溶液に添加する
と、溶液がある程度粘着性になる。これは、電子共有能
をもつアルミナとPVOH上のヒドロキシル基との間の配位
効果によるものと考えられる。ビーズの製造に際して、
ポリマーは最終量の水の2/3に溶解した。残りの水に５
％のデキストロースを加え、この溶液を用いてアルミナ
を予め湿潤させた。デキストロース中のヒドロキシル基
がアルミナと相互作用し、その結果、ポリマーを予め湿
潤させたアルミナと合したとき、アルミナとポリマーの
相互作用は低減した。スクロースも使用でき、同等の効
果が得られた。
と、溶液がある程度粘着性になる。これは、電子共有能
をもつアルミナとPVOH上のヒドロキシル基との間の配位
効果によるものと考えられる。ビーズの製造に際して、
ポリマーは最終量の水の2/3に溶解した。残りの水に５
％のデキストロースを加え、この溶液を用いてアルミナ
を予め湿潤させた。デキストロース中のヒドロキシル基
がアルミナと相互作用し、その結果、ポリマーを予め湿
潤させたアルミナと合したとき、アルミナとポリマーの
相互作用は低減した。スクロースも使用でき、同等の効
果が得られた。
微生物の安定化 細菌の凍結乾燥に関する文献には、凍結および凍結乾
燥過程における添加物、多くの場合糖による細菌の安定
化について多くの論及がある。本発明の方法の場合、ポ
リマー細胞混合物に、その処理前、スクロースおよびデ
キストロースを添加することは、グラム陰性菌を安定化
に役立つた。シユードモナス・フルオレセンスのカプセ
ル封入実験では、非処理細胞を109個/mlの濃度で存在さ
せた場合、カプセル封入後の生育可能細胞数は106cfu/m
lであつた。しかしながら、カプセル封入前に混合物に
１％グルコースまたはスクロースを添加すると、最初10
9cfu/mlを含有した混合物から108cfu/mlの高い収率が達
成された。
燥過程における添加物、多くの場合糖による細菌の安定
化について多くの論及がある。本発明の方法の場合、ポ
リマー細胞混合物に、その処理前、スクロースおよびデ
キストロースを添加することは、グラム陰性菌を安定化
に役立つた。シユードモナス・フルオレセンスのカプセ
ル封入実験では、非処理細胞を109個/mlの濃度で存在さ
せた場合、カプセル封入後の生育可能細胞数は106cfu/m
lであつた。しかしながら、カプセル封入前に混合物に
１％グルコースまたはスクロースを添加すると、最初10
9cfu/mlを含有した混合物から108cfu/mlの高い収率が達
成された。
かび、オルタナリア、カシエのカプセル封入は、かび
の前処理法が考案されてはじめて成功した。前処理をし
ないと、凍結処理後に生存する分生胞子は認められなか
つた。前処理を行うと、50％またはそれ以上のかびをカ
プセル封入過程終了後も生存した。前処置は、分生胞子
とポリマー溶液の混合前に１〜２時間、分生胞子を６モ
ル濃度のソルビトール溶液に浸漬するものである。顕微
鏡で調べると、前処理した胞子は、前処理胞子ほど容易
には湿潤しないことがわかつた。湿潤の遅延が凍結を生
じた場合の分生胞子に対する傷害を低減させるものと考
えられる。ポリエチレングリコール200を用いた前処理
も同様に有効である。
の前処理法が考案されてはじめて成功した。前処理をし
ないと、凍結処理後に生存する分生胞子は認められなか
つた。前処理を行うと、50％またはそれ以上のかびをカ
プセル封入過程終了後も生存した。前処置は、分生胞子
とポリマー溶液の混合前に１〜２時間、分生胞子を６モ
ル濃度のソルビトール溶液に浸漬するものである。顕微
鏡で調べると、前処理した胞子は、前処理胞子ほど容易
には湿潤しないことがわかつた。湿潤の遅延が凍結を生
じた場合の分生胞子に対する傷害を低減させるものと考
えられる。ポリエチレングリコール200を用いた前処理
も同様に有効である。
ビーズの製造 ５％PVOH（分子量78K）、1.5％PVOH（分子量125K）、
3.5％PVOH（分子量10K）、0.1％プロテアーゼ、ペプト
ン＃３、0.05MNa2HPO4および20％アルミナからなるポリ
マー混合物を調製した。この混合物の粘度は360cpであ
つた。第１図に例示したノズルを用いてビーズを製造し
た。ポリマー混合物の貯蔵部を充填し、7psigの圧力を
かけた。使用したポリマーおよび所望のビーズの大きさ
に応じて、２〜15psigの圧力を使用した。バルブを開い
て、ポリマーをノズルの先端に加工させる。掃射気体し
ては含湿窒素を使用、ポリマー流液を離散させ、ビーズ
を形成させる。掃射気体の流量は３標準l/分（slhm）と
した。ビーズは−30〜−35℃のヘキサン中に集め、つい
で凍結乾燥した。乾燥ビーズを順次篩過した場合の篩上
残留率は、0.85mmメツシユ、17.2％;0.425mmメツシユ、
63.6％;0.250mmメツシユ、1.67％、0.150mmメツシユ、
2.5％の分布を示した。別の実験では、10％PVOH（分子
量25K）、20％アルミナ、0.1％プロテアーゼ、ペプトン
＃３のポリマー混合物、粘度48.8cpを貯蔵部圧11psig、
掃射気体6splmで噴霧した。この実験で得られたビーズ
の篩上残留率は、0.85mmメツシユ、１％;0.425mmメツシ
ユ、1.8％;0.25mmメツシユ、32％;0.125mmメツシユ、40
％;0,075mmメツシユ、18％;0.075mmメツシユ未満８％で
あつた。
3.5％PVOH（分子量10K）、0.1％プロテアーゼ、ペプト
ン＃３、0.05MNa2HPO4および20％アルミナからなるポリ
マー混合物を調製した。この混合物の粘度は360cpであ
つた。第１図に例示したノズルを用いてビーズを製造し
た。ポリマー混合物の貯蔵部を充填し、7psigの圧力を
かけた。使用したポリマーおよび所望のビーズの大きさ
に応じて、２〜15psigの圧力を使用した。バルブを開い
て、ポリマーをノズルの先端に加工させる。掃射気体し
ては含湿窒素を使用、ポリマー流液を離散させ、ビーズ
を形成させる。掃射気体の流量は３標準l/分（slhm）と
した。ビーズは−30〜−35℃のヘキサン中に集め、つい
で凍結乾燥した。乾燥ビーズを順次篩過した場合の篩上
残留率は、0.85mmメツシユ、17.2％;0.425mmメツシユ、
63.6％;0.250mmメツシユ、1.67％、0.150mmメツシユ、
2.5％の分布を示した。別の実験では、10％PVOH（分子
量25K）、20％アルミナ、0.1％プロテアーゼ、ペプトン
＃３のポリマー混合物、粘度48.8cpを貯蔵部圧11psig、
掃射気体6splmで噴霧した。この実験で得られたビーズ
の篩上残留率は、0.85mmメツシユ、１％;0.425mmメツシ
ユ、1.8％;0.25mmメツシユ、32％;0.125mmメツシユ、40
％;0,075mmメツシユ、18％;0.075mmメツシユ未満８％で
あつた。
他のポリマーを添加したPVOHビーズ ５％PVOH（分子量78K）、1.5％PVOH（分子量125K、3.
5％PVOH（分子量10K）、0.1％プロテアーゼペプトン＃
３、0.05MNa2HPO4および20％アルミナからなるポリマー
混合物を調製した。
5％PVOH（分子量10K）、0.1％プロテアーゼペプトン＃
３、0.05MNa2HPO4および20％アルミナからなるポリマー
混合物を調製した。
このポリマー組成物を各120gの４バツチに分け、それ
ぞれに以のポリマーを添加した。すなわち、バツチ１）
にはPVP（分子量40K）2g、バツチ２には）PVP（分子量4
0K）4g、バツチ３）にはPVP（分子量40K）6g、バツチ
４）には2gのPEG8000を添加した。これらの混合物から
ビーズ製造し、ポリマー添加をしなかつた混合物から得
られたビーズと水中での安定性を比較した。ビーズをガ
ラススライド上に置き、20×の立体顕微鏡で調べながら
水を１滴添加し、溶解が起こればそれを観察した。バツ
チ１は他のポリマー添加を行わなかつたビーズより急速
に溶解した。バツチ２および３はバツチ１よりもわずか
に早く溶解したが、２と３の間の差は検知できなかつ
た。バツチ４はきわめて速やかに溶解した。
ぞれに以のポリマーを添加した。すなわち、バツチ１）
にはPVP（分子量40K）2g、バツチ２には）PVP（分子量4
0K）4g、バツチ３）にはPVP（分子量40K）6g、バツチ
４）には2gのPEG8000を添加した。これらの混合物から
ビーズ製造し、ポリマー添加をしなかつた混合物から得
られたビーズと水中での安定性を比較した。ビーズをガ
ラススライド上に置き、20×の立体顕微鏡で調べながら
水を１滴添加し、溶解が起こればそれを観察した。バツ
チ１は他のポリマー添加を行わなかつたビーズより急速
に溶解した。バツチ２および３はバツチ１よりもわずか
に早く溶解したが、２と３の間の差は検知できなかつ
た。バツチ４はきわめて速やかに溶解した。
大豆の根に集落化する細菌を用いる土壌施用カプセル 細胞（大豆の根に集落化することが知られているシユ
ードモナス・フルオレセンスの株）を標準化接種菌（５
×107cfu/ml）から16時間生育させる。とくに好ましい
メジウムは50μg/mlリフアンピシン添加キングＢ培地で
ある。M9最小培地の使用では、細胞の生存率は、カプセ
ル封入後5logの程度まで著しく低下する。細胞を遠心分
離によつて収穫し、小量の上清液に再懸濁する。多くの
場合、懸濁液の容量はポリマー溶液の容量の好ましくは
５％を越えないように決定されるが、20％程度までは問
題はない。細胞を、10％（w/v）ポリ（ビニルアルコー
ル）（分子量25,000、加水分解率98％）、20％Al2O3,0.
1％プロテアーゼペプトン＃３（Difco Co.）および１％
デキストロース含有溶液と混合する。混合後直ちに、溶
液をスプレーノズルから冷ヘキサン中に噴霧してビーズ
を形成させる。かくして生成したビーズをヘキサンから
集め、凍結乾燥する。ポリマー混合物中での細胞の生存
率は1.3×1010cfu/mlであつた。ビーズを凍結乾燥した
のちの生存率は1.3×108cfu/mlであつた。通常の集落化
検定では、ビーズをポツト中の土壌のあぜ溝に、各ポツ
トあたりビーズ0.2gの割合で接種する。対照には細胞を
含まないビーズ（陰性対照）と液体接種（陽性対照）と
を用いる。植物（大豆、ウイリアムズ変種79）は２週間
生育させたのち根を収穫し、集落化した細菌についてリ
ゾプレーンを検定する。結果は、新たに生育させた液体
接種細胞とカプセル化細胞との間で、根の集落化に差を
認めなかつた（デユンカンの多範囲変量解析による）。
両者とも集落化のレベルは根1gあたり約２×105cfuであ
つた。
ードモナス・フルオレセンスの株）を標準化接種菌（５
×107cfu/ml）から16時間生育させる。とくに好ましい
メジウムは50μg/mlリフアンピシン添加キングＢ培地で
ある。M9最小培地の使用では、細胞の生存率は、カプセ
ル封入後5logの程度まで著しく低下する。細胞を遠心分
離によつて収穫し、小量の上清液に再懸濁する。多くの
場合、懸濁液の容量はポリマー溶液の容量の好ましくは
５％を越えないように決定されるが、20％程度までは問
題はない。細胞を、10％（w/v）ポリ（ビニルアルコー
ル）（分子量25,000、加水分解率98％）、20％Al2O3,0.
1％プロテアーゼペプトン＃３（Difco Co.）および１％
デキストロース含有溶液と混合する。混合後直ちに、溶
液をスプレーノズルから冷ヘキサン中に噴霧してビーズ
を形成させる。かくして生成したビーズをヘキサンから
集め、凍結乾燥する。ポリマー混合物中での細胞の生存
率は1.3×1010cfu/mlであつた。ビーズを凍結乾燥した
のちの生存率は1.3×108cfu/mlであつた。通常の集落化
検定では、ビーズをポツト中の土壌のあぜ溝に、各ポツ
トあたりビーズ0.2gの割合で接種する。対照には細胞を
含まないビーズ（陰性対照）と液体接種（陽性対照）と
を用いる。植物（大豆、ウイリアムズ変種79）は２週間
生育させたのち根を収穫し、集落化した細菌についてリ
ゾプレーンを検定する。結果は、新たに生育させた液体
接種細胞とカプセル化細胞との間で、根の集落化に差を
認めなかつた（デユンカンの多範囲変量解析による）。
両者とも集落化のレベルは根1gあたり約２×105cfuであ
つた。
葉集落化シユードモナドを用いる葉施用のためのカプセ
ル 葉集落化シユードモナードの細胞を、キングＢ（リフ
アンピシンを含まない）および栄養培地（Difco）の２
種を用いたほかは前述したと同様に生育させ、収穫し
た。キングＢ中で生育した細胞をポリマー混合物（10％
w/vPVOH、分子量25,000）に9.5×109cfu/ml添加し、完
成ビーズ中に２×109cfu/mlの濃度で存在させた。栄養
培地中に生育させた細胞はポリマー混合物に5.5×108cf
u/ml混合し、完成ビーズ中に2.5×107cfu/ml濃度存在さ
せた。これらのビーズは以下の方法で葉の表面に施用す
るのに適している。すなわち、ビーズを濃度範囲約0.25
〜10％（w/v）、好ましくは約0.5〜２％（w/v）のPVOH
中に懸濁する。この溶液には、ビーズの特定の葉表面へ
の付着性を増大させるのに適用できる他の材料を含有さ
せてもよい。この溶液は慣用のスプレー装置を用いて葉
の表面に噴霧できる。
ル 葉集落化シユードモナードの細胞を、キングＢ（リフ
アンピシンを含まない）および栄養培地（Difco）の２
種を用いたほかは前述したと同様に生育させ、収穫し
た。キングＢ中で生育した細胞をポリマー混合物（10％
w/vPVOH、分子量25,000）に9.5×109cfu/ml添加し、完
成ビーズ中に２×109cfu/mlの濃度で存在させた。栄養
培地中に生育させた細胞はポリマー混合物に5.5×108cf
u/ml混合し、完成ビーズ中に2.5×107cfu/ml濃度存在さ
せた。これらのビーズは以下の方法で葉の表面に施用す
るのに適している。すなわち、ビーズを濃度範囲約0.25
〜10％（w/v）、好ましくは約0.5〜２％（w/v）のPVOH
中に懸濁する。この溶液には、ビーズの特定の葉表面へ
の付着性を増大させるのに適用できる他の材料を含有さ
せてもよい。この溶液は慣用のスプレー装置を用いて葉
の表面に噴霧できる。
土壌施用のためのバチルス種（Bacillus sp.）のカプセ
ル封入 ウリハムシ（corn root worm）に対して活性を有する
バチルス種の細菌を１％トリプトン−１％グルコースメ
ジウム中で生育させた。各300mlのメジウムについての2
4時間継代培養液20mlを用いて細胞接種を行つた。細胞
を30℃、200rpmにおいて24時間生育させた。培養液を遠
心分離して収穫し、水に再懸濁し、これを調製ポリマー
混合物と混合し、10％PVP、30％Al2O3および２％プロテ
アーゼペプトン＃３のポリマー混合物中に最終濃度とな
るようにした。ダウアンチフオームＣ（Dow Chemical,M
idland,MI）を加えて発泡を抑制した。ビーズは噴霧ノ
ズルを用いて−30℃のヘキサン中に噴霧して製造した。
ビーズをヘキサンから集め、凍結乾燥した。ビーズを試
験したところ、５×109cfu/1.5gビーズの細菌が生存し
た。トーモロコシを予め植えておいたポットにビーズを
散布した。トーモロコシが適当な大きさに生育した時点
でウリハムシを添加し、トーモロコシの生育を続けた。
傷害は根の重量によつて解析した（重量が小さいほど傷
害は大きい）。対照には細胞を含まないビーズをポツト
あたり1.5gとした。ビーズはポツトあたり1.5,4.5およ
び7.5g添加した。陽性対照はフラダン殺虫剤とした。各
処置毎に８回の試験を反復した。結果は、ポツトあたり
4.5および7.5gのビーズを添加した場合、カプセル封入
細胞に曝露した植物の方がフラダン対照に比べて有意に
大きい根の重量を示した。
ル封入 ウリハムシ（corn root worm）に対して活性を有する
バチルス種の細菌を１％トリプトン−１％グルコースメ
ジウム中で生育させた。各300mlのメジウムについての2
4時間継代培養液20mlを用いて細胞接種を行つた。細胞
を30℃、200rpmにおいて24時間生育させた。培養液を遠
心分離して収穫し、水に再懸濁し、これを調製ポリマー
混合物と混合し、10％PVP、30％Al2O3および２％プロテ
アーゼペプトン＃３のポリマー混合物中に最終濃度とな
るようにした。ダウアンチフオームＣ（Dow Chemical,M
idland,MI）を加えて発泡を抑制した。ビーズは噴霧ノ
ズルを用いて−30℃のヘキサン中に噴霧して製造した。
ビーズをヘキサンから集め、凍結乾燥した。ビーズを試
験したところ、５×109cfu/1.5gビーズの細菌が生存し
た。トーモロコシを予め植えておいたポットにビーズを
散布した。トーモロコシが適当な大きさに生育した時点
でウリハムシを添加し、トーモロコシの生育を続けた。
傷害は根の重量によつて解析した（重量が小さいほど傷
害は大きい）。対照には細胞を含まないビーズをポツト
あたり1.5gとした。ビーズはポツトあたり1.5,4.5およ
び7.5g添加した。陽性対照はフラダン殺虫剤とした。各
処置毎に８回の試験を反復した。結果は、ポツトあたり
4.5および7.5gのビーズを添加した場合、カプセル封入
細胞に曝露した植物の方がフラダン対照に比べて有意に
大きい根の重量を示した。
バチルス・サリンギエンシス・クルスタキ株 （Bacillus thuringiensis var.kurstaki）のカプセル
封入 B.t.var Kurstakiの培養液200mlを濃縮し、主として
胞子とトキシン結晶を含む細胞ペーストを得た。このペ
ーストを滅菌水を用いて最初の200ml容量に再懸濁し、
この懸濁液1mlを10％ポリビニルアルコール溶液100mlに
添加した。上記ポリマー溶液を用い、前述したと同様に
してビーズを生成させた。これらのビーズについてトマ
トイモムシに対する活性を試験した。ビーズ1gを水10ml
に懸濁し、この溶液0.05mlを６枚のトマトの葉それぞれ
に塗布した。葉を、脱イオン水で湿潤させた濾紙片とと
もにペトリ皿中に置いた。５匹の幼虫を各ペトリ皿に入
れた。陽性対照はカプセル封入しないB.t.の同濃度を使
用し、陰性対照は胞子およびトキシン結晶を含まないビ
ーズとした。４日後に検定を行つた。細胞を含まないビ
ーズを用いた場合、幼虫の生存数は27/30であつた。こ
の結果は、ビーズ自身には幼虫に対する毒性がなく、ま
た摂食を妨害することもないことを示している。B.t.を
用いた例では、カプセルに封入した場合もカプセル封入
しなかつた場合も、全幼虫が死滅した。
封入 B.t.var Kurstakiの培養液200mlを濃縮し、主として
胞子とトキシン結晶を含む細胞ペーストを得た。このペ
ーストを滅菌水を用いて最初の200ml容量に再懸濁し、
この懸濁液1mlを10％ポリビニルアルコール溶液100mlに
添加した。上記ポリマー溶液を用い、前述したと同様に
してビーズを生成させた。これらのビーズについてトマ
トイモムシに対する活性を試験した。ビーズ1gを水10ml
に懸濁し、この溶液0.05mlを６枚のトマトの葉それぞれ
に塗布した。葉を、脱イオン水で湿潤させた濾紙片とと
もにペトリ皿中に置いた。５匹の幼虫を各ペトリ皿に入
れた。陽性対照はカプセル封入しないB.t.の同濃度を使
用し、陰性対照は胞子およびトキシン結晶を含まないビ
ーズとした。４日後に検定を行つた。細胞を含まないビ
ーズを用いた場合、幼虫の生存数は27/30であつた。こ
の結果は、ビーズ自身には幼虫に対する毒性がなく、ま
た摂食を妨害することもないことを示している。B.t.を
用いた例では、カプセルに封入した場合もカプセル封入
しなかつた場合も、全幼虫が死滅した。
かび、オルタナリア・カシエ（Alternaria cassiae）の
カプセル封入 出発材料は、乾燥粉末状のオルタナリア・カシエの分
生胞子とした。サンプル0.13gを、界面活性剤、6Mソル
ビトールとともに試験管に取り、よく混合して胞子を分
散させ、約１時間静置した。このように予め浸漬するこ
とによつて、水溶性ポリマー溶液に入れた場合の胞子の
湿潤は遅延し、カプセル封入過程における凍結時に耐性
を示すようになる。この前処置を行わないと、生存率は
０になる。前処置した胞子を５％ポリビニルアルコール
溶液と混合し、直ちに−30℃のヘキサン中に噴霧してビ
ーズを形成させる。ビーズが丁度乾燥するまで凍結乾燥
する。乾燥しすぎると生存率が低下する。カプセル封入
胞子の生存率は乾燥量によつて変動し、20〜90％の範囲
である。これらのビーズを水または所望のアジユバント
と混合し、シツクレポード（sicklepod）の葉の表面上
に噴霧する。カプセル封入した胞子は、水と混合した場
合、発芽はわずかに遅延し、数時間長く生存し、これは
野外の植物に噴霧した場合、有利である。ポリ（ビニル
アルコール）のビーズは、葉の表面に粘り強く付着し、
雨に対して抵抗性を示す。カプセル封入した胞子はシツ
クレポード植物に感染し、これを死滅させることができ
る。第５図に示すように、PVOHビーズは葉の表面を潅水
したのちでも滑らかな葉の表面に付着している。
カプセル封入 出発材料は、乾燥粉末状のオルタナリア・カシエの分
生胞子とした。サンプル0.13gを、界面活性剤、6Mソル
ビトールとともに試験管に取り、よく混合して胞子を分
散させ、約１時間静置した。このように予め浸漬するこ
とによつて、水溶性ポリマー溶液に入れた場合の胞子の
湿潤は遅延し、カプセル封入過程における凍結時に耐性
を示すようになる。この前処置を行わないと、生存率は
０になる。前処置した胞子を５％ポリビニルアルコール
溶液と混合し、直ちに−30℃のヘキサン中に噴霧してビ
ーズを形成させる。ビーズが丁度乾燥するまで凍結乾燥
する。乾燥しすぎると生存率が低下する。カプセル封入
胞子の生存率は乾燥量によつて変動し、20〜90％の範囲
である。これらのビーズを水または所望のアジユバント
と混合し、シツクレポード（sicklepod）の葉の表面上
に噴霧する。カプセル封入した胞子は、水と混合した場
合、発芽はわずかに遅延し、数時間長く生存し、これは
野外の植物に噴霧した場合、有利である。ポリ（ビニル
アルコール）のビーズは、葉の表面に粘り強く付着し、
雨に対して抵抗性を示す。カプセル封入した胞子はシツ
クレポード植物に感染し、これを死滅させることができ
る。第５図に示すように、PVOHビーズは葉の表面を潅水
したのちでも滑らかな葉の表面に付着している。
第１図は、本発明のビーズの製造に有用なノズルの断面
図を図解的に示した図である。第２図〜第５図は粒子構
造を示す写真であり、第２図は、本発明の典型的なPVOH
ビーズの全体図および断面図である。第３図は、本発明
の典型的なPVPビーズを示す。第４図は、本発明の典型
的なHPCビーズを示す。第５図は、雨の後も葉の表面に
付着しているPVOHビーズを示す。
図を図解的に示した図である。第２図〜第５図は粒子構
造を示す写真であり、第２図は、本発明の典型的なPVOH
ビーズの全体図および断面図である。第３図は、本発明
の典型的なPVPビーズを示す。第４図は、本発明の典型
的なHPCビーズを示す。第５図は、雨の後も葉の表面に
付着しているPVOHビーズを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート ジオルコウスキー グリーン リィ アメリカ合衆国 ミズリー州 フロンテ ナツク，オウク バレー ドライブ 544 (72)発明者 ジェイ マイルス スチュアート ヘニ ス アメリカ合衆国 ミズリー州 クレーブ クール，マーフォード ドライブ 501
Claims (23)
- 【請求項１】（ａ）生物学的材料を、少なくとも3w/v％
の濃度の非イオン性ポリマーを含有する水性溶液と混合
し、（ｂ）上記（ａ）の混合物を、水非混和性でそのポ
リマーの非溶媒中に、生成したビーズが凍結するのに十
分な温度であるがポリマービーズの凍結破裂を生じるほ
どは低くない温度に維持しながら滴状に添加してポリマ
ービーズを生成させ、ついで（ｃ）工程（ｂ）で得られ
たビーズを乾燥して実質的にすべての非結合水をビーズ
から除去することを特徴とする生物学的材料のカプセル
封入方法。 - 【請求項２】溶液は濃度５〜15w/v％のポリマーを含有
する特許請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項３】実質的にすべての非結合水を凍結乾燥によ
って除去する特許請求の範囲第２項の方法。 - 【請求項４】ポリマー溶液中にさらに加重剤を存在させ
る特許請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項５】加重剤はアルミナである特許請求の範囲第
４項の方法。 - 【請求項６】ポリマーはポリ（ビニルアルコール）であ
る特許請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項７】ポリマーはポリビニルピロリドンである特
許請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項８】ポリマーはデキストランである特許請求の
範囲第３項の方法。 - 【請求項９】ポリマーはセルロース誘導体である特許請
求の範囲第３項の方法。 - 【請求項１０】生物学的材料は微生物である特許請求の
範囲第３項の方法。 - 【請求項１１】微生物は細菌である特許請求の範囲第10
項の方法。 - 【請求項１２】微生物はかびであり、かびにカプセル封
入時、湿潤を遅延させる前処理を施す特許請求の範囲第
10項の方法。 - 【請求項１３】細菌はバチルス・スリンギエンシス（Ba
cillus thuringiensis）の株である特許請求の範囲第11
項の方法。 - 【請求項１４】細菌はシュードモナス属（Pseudomona
s）の種である特許請求の範囲第11項の方法。 - 【請求項１５】かびはオルタナリア・カシエ（Alternar
ia cassiae）である特許請求の範囲第11項の方法。 - 【請求項１６】生物学的材料はタンパク質である特許請
求の範囲第３項の方法。 - 【請求項１７】生物学的材料はペプチドである特許請求
の範囲第３項の方法。 - 【請求項１８】細菌はシュードモナス・フルオレセンス
（Pseudomonas fluorescens）NRRL B−15132、NRRL B−
15133、NRRL B−15134およびNRRL B−15135からなる群
より選ばれる特許請求の範囲第14項の方法。 - 【請求項１９】細菌はアグロバクテリウム・ラジオバク
ター（Agrobacterium radiobacter）ATCC 39803である
特許請求の範囲第11項の方法。 - 【請求項２０】細菌はシュードモナス・フルオレセンス
（Pseudomonas fluorescens）ATCC 39802である特許請
求の範囲第14項の方法。 - 【請求項２１】アルミナは比較的低表面積で非処理であ
る特許請求の範囲第５項の方法。 - 【請求項２２】アルミナの平均粒子サイズは10ミクロン
未満である特許請求の範囲第５項の方法。 - 【請求項２３】アルミナは糖または他の試薬で前処理
し、アルミナとポリマー上のヒドロキシル基との相互作
用を低減させる特許請求の範囲第５項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13196587A | 1987-12-11 | 1987-12-11 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01304883A JPH01304883A (ja) | 1989-12-08 |
| JP2642715B2 true JP2642715B2 (ja) | 1997-08-20 |
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| CA (1) | CA1336765C (ja) |
| DE (1) | DE3888943T2 (ja) |
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| DE4027220A1 (de) * | 1990-08-24 | 1992-02-27 | Preussag Noell Wassertech | Verfahren und anlage zum biologischen abbau von schwefelwasserstoff |
| DE4027221A1 (de) * | 1990-08-24 | 1992-02-27 | Preussag Noell Wassertech | Verfahren und vorrichtung zum entfernen von ammonium, nitrit und/oder nitrat aus wasser |
| DE4027222A1 (de) * | 1990-08-24 | 1992-02-27 | Preussag Noell Wassertech | Verfahren zur eliminierung von phosphat aus wasser |
| DE4127757A1 (de) * | 1991-02-06 | 1992-08-13 | Hoechst Ag | Neue pflanzenschutzmittel-formulierungen |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0202409A3 (en) * | 1985-03-25 | 1989-02-01 | Miles Inc. | A process for the production of viable and stable dry microorganisms for food and agricultural purposes |
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- 1988-12-08 DE DE3888943T patent/DE3888943T2/de not_active Expired - Fee Related
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