CN110878257B - 淡紫拟青霉培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淡紫拟青霉培养方法及应用，其中，淡紫拟青霉的培养包括如下步骤：将淡紫拟青霉经液体培养基培养，固体培养基培养、发酵和烘干后磨料制粉。本发明方法中实现了淡紫拟青霉的扩大培养。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉培养方法及应用。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
淡紫拟青霉(Paeci lomyces lilacinus)是一种重要的生防农药，在人类的生活中起着重要的作用。
目前淡紫拟青霉的培养方法对环境的要求较高，生产条件复杂，成本高，不利于大规模的生产。
淡紫拟青霉杀虫效果不错，但是在趋避根结线虫等时，能力较弱。
发明内容
本发明实施例提供了一种淡紫拟青霉培养方法及应用；本发明的方法制备得到的药物制剂集杀菌、驱虫和杀虫功能于一体，有效保证植物生长。
本发明第一方面的实施例提供了一种淡紫拟青霉的培养方法，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉经液体培养基培养，固体培养基培养、发酵和烘干后磨料制粉。
进一步的，所述的培养方法包括如下步骤：
将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；
所述的液体培养基按重量百分比计包括如下组分：芹菜浆：1.5％-2.5％，脲0.2％-0.5％，葡萄糖0.01％-3％，氯化铵0.05％-0.2％，硝酸钾0.01％-2％，酵母粉0.01％-3％，余量为水；
将所述的液体种子接种到固体培养基中进行固态发酵，接种量为 3％-10％，得到发酵产物；
所述的固体培养基由干料和水混合而成，其中，所述的固体培养基中水的质量百分含量为45％-68％；
所述的干料按重量百分比计包括如下组分：纤维微球35％-50％，大米粉10％-15％，魔芋粉2％-25％，玉米芯粉20％-50％，硫酸铵0.01％ -2％；
所述的纤维微球的半径为0.5-1mm，所述的微球具有蜂窝状结构；
所述的固体培养基的制备包括如下步骤：
将所述的硫酸铵加入到水中得到硫酸铵溶液；
将大米、魔芋和玉米芯进行粗粉碎、干燥、粉碎后过800目筛得到混合粉料，将所述的混合粉料混合均匀后加入到纤维微球中，搅拌混匀得到所述的干粉，将干粉加入到硫酸铵溶液中混匀得到所述的固体培养基；
将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。
进一步的，所述的固体培养基中均布有多个温度探针，所述的温度探针与控制器相连，当探测到的温度最大值与温度最小值之差达到设定阈值时，控制器报警。
进一步的，所述的干燥采用过热蒸汽干燥。
本发明第二方面的实施例提供了一种淡紫拟青霉培养方法的应用，所述的培养方法为上述的培养方法，所述的应用为在制备淡紫拟青霉药物制剂中的应用，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉进行培养；
取火山岩颗粒粉碎成粒径为1-2mm的火山岩颗粒，将所述的火山岩颗粒进行蜂窝化处理，将所述的淡紫拟青霉与所述的火山岩颗粒混合，使淡紫拟青霉进入到火山岩颗粒的内部蜂窝结构中；得到预混颗粒；
在所述的预混颗粒表面粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌。
进一步的，在粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌前还包括步骤：将所述的预混颗粒在驱虫糊料中滚球，在所述的预混颗粒表面形成驱虫层，然后在所述的驱虫层上粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌。
进一步的，所述的驱虫糊料由如下方法制备而得：将猪屎豆和茶叶混合粉碎后得到驱虫料，将所述的驱虫料与水按照质量比为1:0.5混合均匀得到所述的驱虫糊料。
进一步的，在将淡紫拟青霉与火山岩颗粒混合之前还包括步骤：将淡紫拟青霉与茶粉按照质量比为10:1的比例混合均匀后再与所述的火山岩颗粒混合。
本发明实施例的有益效果如下：
本发明培养方法采用的固体培养基中采用了纤维微球，纤维微球为蜂窝状，而且，纤维本身蓬松度较高，蜂窝状结构内部及纤维球之间都充满其他粉料的浆液，高蓬松度有助于培养基内外温度一致。
探针的探测可以对固体培养基内部温度进行实时监测，设定温度差值的阈值，一旦差值达到阈值，即报警。对于报警后如何处理，可以采用人工来调整培养基，当然可以是通过调整微球与粉末及水分的比例来实现，还可以是其他的方式，根据需要确定。
本发明通过火山岩颗粒微球的蜂窝结构，将淡紫拟青霉与日本硅酸盐菌、中国台湾诺卡氏放线菌分开，可以兼有二者的功效，在使用后，可以通过日本硅酸盐菌、中国台湾诺卡氏放线菌自身活动及代谢产物和肽蛋白使作物的根部生长环境优化，线虫的根部寄生环境彻底改变，对作物根部线虫幼虫及成虫趋避作用达到95％以上，并通过益生菌在土壤中的持续代谢活动杀死根结线虫，再辅以淡紫拟青霉，可以大大提高根结线虫的防治效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
一种淡紫拟青霉的培养方法，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉经液体培养基培养，固体培养基培养、发酵和烘干后磨料制粉。
在本发明的一些实施例中，所述的培养方法包括如下步骤：
将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；
所述的液体培养基按重量百分比计包括如下组分：芹菜浆：1.5％ -2.5％，脲0.2％-0.5％，葡萄糖0.01％-3％，氯化铵0.05％-0.2％，硝酸钾0.01％-2％，酵母粉0.01％-3％，余量为水；
将所述的液体种子接种到固体培养基中进行固态发酵，接种量为 3％-10％，得到发酵产物；
所述的固体培养基由干料和水混合而成，其中，所述的固体培养基中水的质量百分含量为45％-68％；
所述的干料按重量百分比计包括如下组分：纤维微球35％-50％，大米粉10％-15％，魔芋粉2％-25％，玉米芯粉20％-50％，硫酸铵0.01％ -2％；
所述的纤维微球的半径为0.5-1mm，所述的微球具有蜂窝状结构；
所述的固体培养基的制备包括如下步骤：
将所述的硫酸铵加入到水中得到硫酸铵溶液；
将大米、魔芋和玉米芯进行粗粉碎、干燥、粉碎后过800目筛得到混合粉料，将所述的混合粉料混合均匀后加入到纤维微球中，搅拌混匀得到所述的干粉，将干粉加入到硫酸铵溶液中混匀得到所述的固体培养基；
将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。
在本发明的一些实施例中，所述的固体培养基中均布有多个温度探针，所述的温度探针与控制器相连，当探测到的温度最大值与温度最小值之差达到设定阈值时，控制器报警。
在本发明的一些实施例中，所述的干燥采用过热蒸汽干燥。
在本发明的另一些实施例中，茶粉和魔芋粉，功能在于调节培养基成分，茶粉有驱虫效果，从成本角度考虑，魔芋粉也可换成麸皮，或小麦粉(添加量与魔芋粉相同)。辅料可以添加低聚壳聚糖(添加量 0.1％-0.5％)，能抑制根接线虫的抗逆性。
在本发明的另一些实施例中，芹菜浆可以用青草或收获后的番茄，瓜果藤蔓粉碎后浆汁代替(添加量不变)。
一种淡紫拟青霉药物制剂的制备方法，包括如下步骤：
扩大培养淡紫拟青霉，所述的扩大培养采用上述的培养方法进行培养；
取火山岩颗粒粉碎成粒径为1-2mm的火山岩颗粒，将所述的火山岩颗粒进行蜂窝化处理，将所述的淡紫拟青霉与所述的火山岩颗粒混合，使淡紫拟青霉进入到火山岩颗粒的内部蜂窝结构中；得到预混颗粒；
在所述的预混颗粒表面粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌。
在本发明的一些实施例中，在粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌前还包括步骤：将所述的预混颗粒在驱虫糊料中滚球，在所述的预混颗粒表面形成驱虫层，然后在所述的驱虫层上粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌。
在本发明的一些实施例中，所述的驱虫糊料由如下方法制备而得：将猪屎豆和茶叶混合粉碎后得到驱虫料，将所述的驱虫料与水按照质量比为1:0.5混合均匀得到所述的驱虫糊料。在另一些实施例中，同时驱虫层作为粘附剂，用沸石粉0.5mm孔径颗粒代替吸附硅酸盐细菌和放线菌，成本低廉。添加低聚壳聚糖也可代替驱虫效果。
在本发明的一些实施例中，在将淡紫拟青霉与火山岩颗粒混合之前还包括步骤：将淡紫拟青霉与茶粉按照质量比为10:1的比例混合均匀后再与所述的火山岩颗粒混合。
在本发明的另一些实施例中，火山岩微球中是可以添加阿维链霉菌，其产物阿维菌素对根接结线虫具有防止效果，具体的添加量可以根据需要添加，如添加量为淡紫拟青霉质量的百分之五等。
在本发明的另一些实施例中，吸附淡紫拟青霉微球表面可以采用生物膜包衣及缓释技术，并添加稳定剂，使微生物菌剂持续发挥作用时间大于90天，避免重复性使用菌剂。
实施例1
一种淡紫拟青霉的培养方法，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；
所述的液体培养基按重量百分比计包括如下组分：芹菜浆：1.5％，脲0.5％，葡萄糖3％，氯化铵0.2％，硝酸钾2％，酵母粉3％，余量为水；
将所述的液体种子接种到固体培养基中进行固态发酵，接种量为 10％，得到发酵产物；
所述的固体培养基由干料和水混合而成，其中，所述的固体培养基中水的质量百分含量为68％；
所述的干料按重量百分比计包括如下组分：纤维微球35％-50％，大米粉10％-15％，魔芋粉2％-25％，玉米芯粉20％-50％，硫酸铵 0.01％；
所述的纤维微球的半径为0.5-1mm，所述的微球具有蜂窝状结构；
所述的固体培养基的制备包括如下步骤：
将所述的硫酸铵加入到水中得到硫酸铵溶液；
将大米、魔芋和玉米芯进行粗粉碎、干燥、粉碎后过800目筛得到混合粉料，将所述的混合粉料混合均匀后加入到纤维微球中，搅拌混匀得到所述的干粉，将干粉加入到硫酸铵溶液中混匀得到所述的固体培养基；
将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。
本实施例的培养方法采用的固体培养基中采用了纤维微球，纤维微球为蜂窝状，而且，纤维本身蓬松度较高，蜂窝状结构内部及纤维球之间都充满其他粉料的浆液，高蓬松度有助于培养基内外温度一致。
淡紫拟青霉产孢量按照GB 20287－2006检测方法测定为每克100 亿个活孢子(干重)。该淡紫拟青霉规模化生产工艺孢子产量高，发酵产品孢子损伤小，孢子活性维持时间长，利于工业生产及应用。与现有的技术相比，孢子产量高出至少20％，而且，其室温贮藏24个月后孢子萌发率仍能达到96％左右，而现有的技术中，室温贮藏24个月左右孢子萌发率不足50％。
实施例2
一种淡紫拟青霉的培养方法，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；
所述的液体培养基按重量百分比计包括如下组分：芹菜浆：2.2％，脲0.4％，葡萄糖3％，氯化铵0.1％，硝酸钾1.2％，酵母粉2％，余量为水；
将所述的液体种子接种到固体培养基中进行固态发酵，接种量为 3％-10％，得到发酵产物；
所述的固体培养基由干料和水混合而成，其中，所述的固体培养基中水的质量百分含量为55％；
所述的干料按重量百分比计包括如下组分：纤维微球40％，大米粉14％，魔芋粉14％，玉米芯粉30％，硫酸铵2％；
所述的纤维微球的半径为0.5-1mm，所述的微球具有蜂窝状结构；
所述的固体培养基的制备包括如下步骤：
将所述的硫酸铵加入到水中得到硫酸铵溶液；
将大米、魔芋和玉米芯进行粗粉碎、干燥、粉碎后过800目筛得到混合粉料，将所述的混合粉料混合均匀后加入到纤维微球中，搅拌混匀得到所述的干粉，将干粉加入到硫酸铵溶液中混匀得到所述的固体培养基；
将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。
所述的固体培养基中均布有多个温度探针，所述的温度探针与控制器相连，当探测到的温度最大值与温度最小值之差达到设定阈值时，控制器报警。
本实施例的培养方法采用的固体培养基中采用了纤维微球，纤维微球为蜂窝状，而且，纤维本身蓬松度较高，蜂窝状结构内部及纤维球之间都充满其他粉料的浆液，高蓬松度有助于培养基内外温度一致。
探针的探测可以对固体培养基内部温度进行实时监测，设定温度差值的阈值，一旦差值达到阈值，即报警，阈值可以是0.1度，也可以是0.5摄氏度，阈值过高会导致温度调控效果差，阈值过小可以提高控制精度，会导致经常报警，而且没有必要。对于报警后如何处理，可以采用人工来调整培养基，当然可以是通过调整微球与粉末及水分的比例来实现，还可以是其他的方式，根据需要确定。
实施例3
一种淡紫拟青霉的培养方法，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；
所述的液体培养基按重量百分比计包括如下组分：芹菜浆：2.2％，脲0.4％，葡萄糖3％，氯化铵0.1％，硝酸钾1.2％，酵母粉2％，余量为水；
将所述的液体种子接种到固体培养基中进行固态发酵，接种量为 3％-10％，得到发酵产物；
所述的固体培养基由干料和水混合而成，其中，所述的固体培养基中水的质量百分含量为55％；
所述的干料按重量百分比计包括如下组分：纤维微球40％，大米粉14％，魔芋粉14％，玉米芯粉30％，硫酸铵2％；
所述的纤维微球的半径为0.5-1mm，所述的微球具有蜂窝状结构；
所述的固体培养基的制备包括如下步骤：
将所述的硫酸铵加入到水中得到硫酸铵溶液；
将大米、魔芋和玉米芯进行粗粉碎、干燥、粉碎后过800目筛得到混合粉料，将所述的混合粉料混合均匀后加入到纤维微球中，搅拌混匀得到所述的干粉，将干粉加入到硫酸铵溶液中混匀得到所述的固体培养基；干燥采用过热蒸汽干燥。
将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉。
所述的固体培养基中均布有多个温度探针，所述的温度探针与控制器相连，当探测到的温度最大值与温度最小值之差达到设定阈值时，控制器报警。
本实施例的培养方法采用的固体培养基中采用了纤维微球，纤维微球为蜂窝状，而且，纤维本身蓬松度较高，蜂窝状结构内部及纤维球之间都充满其他粉料的浆液，高蓬松度有助于培养基内外温度一致。
探针的探测可以对固体培养基内部温度进行实时监测，设定温度差值的阈值，一旦差值达到阈值，即报警，阈值可以是0.1度，也可以是0.5摄氏度，阈值过高会导致温度调控效果差，阈值过小可以提高控制精度，会导致经常报警，而且没有必要。对于报警后如何处理，可以采用人工来调整培养基，当然可以是通过调整微球与粉末及水分的比例来实现，还可以是其他的方式，根据需要确定。
大米粉和魔芋粉可以调整培养基的营养结构，而且，低聚壳聚糖还有驱虫的功效。
实施例4
一种淡紫拟青霉药物制剂的制备方法，包括如下步骤：
扩大培养淡紫拟青霉，所述的扩大培养采用上述的培养方法进行培养；
取火山岩颗粒粉碎成粒径为1-2mm的火山岩颗粒，将所述的火山岩颗粒进行蜂窝化处理，将所述的淡紫拟青霉与所述的火山岩颗粒混合，使淡紫拟青霉进入到火山岩颗粒的内部蜂窝结构中；得到预混颗粒；
在所述的预混颗粒表面粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌。
本实施例通过火山岩颗粒微球的蜂窝结构，将淡紫拟青霉与日本硅酸盐菌、中国台湾诺卡氏放线菌分开，可以兼有二者的功效，在使用后，可以通过日本硅酸盐菌、中国台湾诺卡氏放线菌自身活动及代谢产物和肽蛋白使作物的根部生长环境优化，线虫的根部寄生环境彻底改变，对作物根部线虫幼虫及成虫趋避作用达到95％以上，并通过益生菌在土壤中的持续代谢活动杀死根结线虫，再辅以淡紫拟青霉，可以大大提高根结线虫的防治效果。
在本发明的一些实施例中，在粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌前还包括步骤：将所述的预混颗粒在驱虫糊料中滚球，在所述的预混颗粒表面形成驱虫层，然后在所述的驱虫层上粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌。
在本发明的一些实施例中，所述的驱虫糊料由如下方法制备而得：将猪屎豆和茶叶混合粉碎后得到驱虫料，将所述的驱虫料与水按照质量比为1:0.5混合均匀得到所述的驱虫糊料。
在本发明的一些实施例中，在将淡紫拟青霉与火山岩颗粒混合之前还包括步骤：将淡紫拟青霉与茶粉按照质量比为10:1的比例混合均匀后再与所述的火山岩颗粒混合。
将本发明的药物制剂用到作物中，不但可以杀虫，而且还有很好的趋避效果，使得根结线虫的防治效果更好。
在本发明的一些实施例中，在将淡紫拟青霉与火山岩颗粒混合之前还包括步骤：将淡紫拟青霉与茶粉按照质量比为10:1的比例混合均匀后再与所述的火山岩颗粒混合。
火山岩颗粒材质中含有几十种矿物质和微量元素，表现为接近圆颗粒，颜色为红黑褐色，多孔质轻，颗粒粒径可根据不同要求生产，高效挂膜轻质在物理微观结构方面表现为表面粗糙多孔，这些特点特别适合于微生物在其表面生长、繁殖、形成生物膜。添加硅酸盐细菌在微球表面，其产物荚膜更容易在火山岩材料上形成生物膜。
实验地：河北省蔬菜发病严重的地块，按照常规方法播种。
处理：试验共有3组。即，对照组1：拌种采用淡紫拟青霉10kg/ha；对照组2：拌种日本硅酸盐菌、中国台湾诺卡氏放线菌；实施例：拌种本本实施例的淡紫拟青霉药物制剂10kg/ha：喷洒淡紫拟青霉规模化生产菌剂10kg/ha；(ha为面积单位：公顷)。每个试验组做6个小区重复取平均值。
虫口调查方法：每个小区进行随机10个点取样，每点取10株，染色调查根内幼虫数，根据幼虫数计算相对防效。
相对防效计算公式：
相对防效(％)＝(对照组幼虫数一处理组幼虫数)/对照组幼虫数
田间试验结果：
本发明方法制备的淡紫拟青霉在储存较长时间(24个月)后，田间防效仍较好，而且明显高于储存时间相同的现有技术制备的淡紫拟青霉。
通过对比发现，采用本发明的制剂来防治根结线虫可以大大提高根结线虫的防治效果。
对比结果入表1所示
表1
| 杀菌率(％) | |
| 本发明药物制剂 | 98.72 |
| 对照组1 | 83.11 |
| 对照组2 | 95.02 |
可以看出，本发明的药物制剂的防治根结线虫的效果明显高于对照组，原因是，本发明药物制剂结合了淡紫拟青霉和日本硅酸盐菌、中国台湾诺卡氏放线菌的优点，而且，在本发明中采用火山岩颗粒将二者分开，可以避免二者在使用前的接触，这也增强了药物制剂的防虫效果。
本发明中未曾限定的手段均为本领域技术人员可以根据现有技术可以实现的，本领域技术人员可以根据需要选择，在此不再赘述。
Claims (5)
1.一种淡紫拟青霉（ Paecilomyces lilacinus ） 的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉经液体培养基培养，固体培养基培养、发酵和烘干后磨料制粉；所述的培养方法包括如下步骤：
将淡紫拟青霉菌株接种到灭菌后的液体培养基中进行种子培养得到液体种子；
所述的液体培养基按重量百分比计包括如下组分：芹菜浆：1.5％-2.5％，脲0.2％-0.5％，葡萄糖0.01％-3％，氯化铵0.05％-0.2％，硝酸钾0.01％-2％，酵母粉0.01％-3％，余量为水；
将所述的液体种子接种到固体培养基中进行固态发酵，接种量为3％-10％，得到发酵产物；
所述的固体培养基由干料和水混合而成，其中，所述的固体培养基中水的质量百分含量为45％-68％；
所述的干料按重量百分比计包括如下组分：纤维微球35％-70％，茶粉10％-15％，魔芋粉2％-25％，玉米芯粉12％-24％，硫酸铵0.01％-2％；
所述的纤维微球的半径为0.5-1mm，所述的微球具有蜂窝状结构；
所述的固体培养基的制备包括如下步骤：
将所述的硫酸铵加入到水中得到硫酸铵溶液；
将茶叶、魔芋和玉米芯进行粗粉碎、干燥、粉碎后过800目筛得到混合粉料，将所述的混合粉料混合均匀后加入到纤维微球中，搅拌混匀得到所述的干粉，将干粉加入到硫酸铵溶液中混匀得到所述的固体培养基；
将所述的发酵产物采用低温烘干后磨料制粉；
所述的固体培养基中均布有多个温度探针，所述的温度探针与控制器相连，当探测到的温度最大值与温度最小值之差达到设定阈值时，控制器报警。
2.根据权利要求1所述的培养方法，所述的干燥采用过热蒸汽干燥。
3.一种淡紫拟青霉培养方法的应用，其特征在于，所述的培养方法为权利要求1-2任一项所述的培养方法，所述的应用为在制备淡紫拟青霉药物制剂中的应用，包括如下步骤：
将淡紫拟青霉进行培养；
取火山岩颗粒粉碎成粒径为1-2mm的火山岩颗粒，将所述的淡紫拟青霉与所述的火山岩颗粒混合，使淡紫拟青霉进入到火山岩颗粒的内部蜂窝结构中；得到预混颗粒；
将所述的预混颗粒在驱虫糊料中滚球，在所述的预混颗粒表面形成驱虫层，然后在所述的驱虫层上粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌；
在所述的预混颗粒表面粘覆日本硅酸盐菌与中国台湾诺卡氏放线菌；
所述的火山岩颗粒表面采用生物膜包衣及缓释技术，并添加稳定剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的驱虫糊料由如下方法制备而得：将猪屎豆和茶叶混合粉碎后得到驱虫料，将所述的驱虫料与水按照质量比为1:0.5混合均匀得到所述的驱虫糊料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在将淡紫拟青霉与火山岩颗粒混合之前还包括步骤：将淡紫拟青霉与茶粉按照质量比为10:1的比例混合均匀后再与所述的火山岩颗粒混合。
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