CN101418264B - 一株淡紫拟青霉菌与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780及其菌剂与应用。该菌剂是以高分子材料海藻酸钠为基本骨架，以淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的菌丝体、孢子混合物为活性成分，以硅藻土为载体，根据海藻酸钠与多价阳离子形成凝胶的特性，采用海藻酸钠—氯化钙反应的方法，制备而成的具有缓施作用的杀线虫生物菌剂。实验证明，该菌剂具有较好的杀线虫功效，防治率可达50-60％，且较为稳定，无有毒的化学残留物(无毒、无残留)，不污染农产品和环境(不与环境中的其它物质反应)，性价比高和施用方便的特点。本发明将在植物根结线虫病害的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一株淡紫拟青霉菌与应用，特别是涉及一株淡紫拟青霉菌及其菌剂与该菌剂在防治植物根结线虫病害中的应用。
背景技术
在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元，其中根结线虫(Meloidogyne spp.)是危害最大的一类植物寄生线虫，每年仅对世界上重要的经济作物造成的经济损失就高达数百亿美元。在根结线虫属(Meloidogyne)内，以南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla)四个种的根结线虫病害发生最为普遍，对农作物的危害也最大。根结线虫的繁殖力极强，通常每个雌虫可产卵1000枚以上。根结线虫通常没有明显的寄主专化性，能够侵染的植物超过3000种，分属114科，包括单子叶植物，双子叶植物，草本植物和木本植物，对大多数的粮食作物、油料作物、纤维作物、烟草、茶叶、果树、蔬菜、药材和花卉等均可造成严重损失。受其危害后，作物品质下降，大幅度减产，甚至绝产，同时线虫病的发生又加剧了枯萎病、黄萎病和立枯病等土传病害的危害，造成植物抵抗能力下降，极易受其它病原物侵染。
在控制该类病害的方法中，由于根结线虫通常存活于土壤中和植物根内，所以一般化学农药难以控制其危害，因此该类病害成为大量剧毒农药频繁使用的对象，对农产品生产的安全性构成严重威胁。同时，由于化学杀线剂只能在短期内控制线虫数量，同时还存在成本高、持效短和抗药性等问题。此外，一些传统的防治方法，如轮作、种植抗病品种等虽可起到一定的防治作用，但在实际生产中能够轮作的作物并不多，对根结线虫具有抗性的作物品种十分有限。因此，传统控制方法并不能解决该类病害。综上所述，由于目前缺乏实用、高效、可持续的治理技术，根结线虫病发生区域不断扩大，危害作物种类持续增加，致使农业生产面临严峻挑战，杀线虫生物农药具有非常广阔的应用价值和市场前景。
安全、有效的防治根结线虫类病害是目前农业生产上亟待解决的紧迫问题，而现有的化学防治等措施并不能满足这一要求，因此利用线虫生防资源对其进行调控是今后发展的必然趋势。当前，随着人们环境保护意识的提高和对″无公害产品″需求的不断增加，生防真菌在植物线虫病害生物防治中显示出越来越重要的作用。但是必须指出，尽管自然界中有众多的菌物与线虫密切相关，但仅有很少一部分菌株用于研发生防制剂，并且这些菌剂在生产上真正起到防治作用的很少。此外，目前线虫生防制剂仍然存在一定的缺点，大大限制了其应用，主要体现在：
1.现有防治植物线虫病害的生防制剂多为孢子制剂，对上游活性成分生产要求较高，往往需要两步发酵(液体发酵结合固体发酵)才能获得活性成分—真菌孢子，制备工艺十分繁琐。
2.剂型化水平低，目前线虫防治用生防制剂多为粉剂、悬浮剂等，工艺粗放，土壤适用性差，不利于土壤环境施用，且往往难以克服土壤中抑菌萌发的不利环境因素，不易形成群体，且这些制剂多以种衣剂或拌种剂的形式出现，携带菌量十分有限。因而缺乏市场竞争力，使其应用受到了限制。
3.稳定性差，菌剂活力丧失十分迅速，导致生防制剂货架期短，难以商业化生产。为了保证制剂具有较长时间的货架期，往往要求严格的保存条件，直接限制了真菌类生物农药的大规模应用。
综上所述，尽管土壤中植物线虫病害生物防治型农药具有非常广阔的市场空间，长期以来通过对植物寄生线虫的生物防治研究获得了一些具有一定生防潜力的菌株，但是其产业化应用却进展缓慢，在实际生产中能够满足线虫生防需要的制剂非常缺乏。因此现有生防资源一旦在剂型技术上有所突破，必将会极大的促进植物寄生线虫病害的生物防治工作跃上一个新的台阶。
发明内容
本发明的目的是提供一株对植物根结线虫病害具有防治作用的淡紫拟青霉菌。
本发明所提供的是淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)FZ07-9F-5，该菌株已于2008年12月01日保藏于位于中国北京市朝阳区大屯路中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2780。
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌株具有以下特征：菌落毡状，表面初为白色，产孢时变为葡萄酒红色，并且产孢量越多，颜色越深，背面呈白色或酒红色。该菌株在麦芽汁培养基(MEA)上生长较快，在PDA培养基上也可生长。培养1周后开始产孢，其分生孢子梗直立，孢梗上轮生排列2-4个瓶梗，顶端串生分生孢子。分生孢子呈椭球或纺锤形，外壁光滑，大小为(2.0-3.0)×(1.5-2.2)μm。该菌株生长的温度范围为8-38℃，最佳为25-30℃。该菌株在pH2-11之间均可以生长，适宜pH值为5-9。
本发明的第二个目的是提供一种上述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的培养方法。
本发明所提供的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的培养方法，是将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780接种到淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780专用液体培养基中，在23-25℃下培养，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780得到扩大培养；所述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780专用液体培养基的按照如下方法配制：麦芽糖(C源)20-40g(优选为30g)，酵母(N源)5-7g(优选为6.12g)，K2HPO4 0.5-2g(优选为1g)，MgSO4 0.1-1g(优选为0.5g)，KCl 0.1-1g(优选为0.5g)，FeSO4 0.001-0.05g(优选为0.01g)，ZnSO4·7H2O 5-20mg(优选为10mg)，用水定容至1L，pH 6-7。
为提高菌体的生长速率，可对该菌进行振荡培养，振速优选为120-180rpm。
所述培养时间一般为120-180h。
为获得更高的生长速率，所述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCCNo.2780的培养方法还包括在接种前对菌种进行试管活化培养的步骤，方法可为：将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780接种在马铃薯琼脂培养基上，在25-27℃下培养，得到经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCCNo.2780；所述马铃薯琼脂培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L，pH 6-7左右。
所述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的试管活化培养时间可为72—96h。
本发明的第三个目的是提供一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCCNo.2780菌剂。
本发明所提供的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌剂，其活性成分为淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780。
为获得更好的稳定性，所述菌剂可采用微球剂型，其原料可包含以下组分(每100g)：
海藻酸钠 1-4g，
硅藻土 8-15g，
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780 1-10g(109-1010CFU)，
水 加水至100g。
为了使菌剂的性能更加完备，上述菌剂中还可以包括1-3g的氯化钙
较优选的微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌剂的原料可以是两种情况，第一种为：
海藻酸钠 1-4g，
硅藻土 10-14g，
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780 5-10g(109-1010CFU)，
水 72—84g，
氯化钙 1-3.3g。
其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780和水的重量相加应该等于100g。
第二种情况是：
海藻酸钠 1-3g，
硅藻土 12-15g，
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780 1-5g(109-1010CFU)，
水 77—86g，
氯化钙 1-2.5g。
其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780和水的重量相加应该等于100g。
上述微球剂型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌剂的原料中的水优选为无菌水或蒸馏水。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌剂的方法。
本发明所提供的制备方法，可包括以下步骤：
1)按下述原料组分取料：海藻酸钠1-4g，硅藻土8-15g，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780 1-10g(109-1010CFU)，水71—90g，氯化钙1-3g；其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780和水的重量相加应该等于100g；
2)微球海藻酸钠凝胶液的配制：将海藻酸钠与无菌水混合，在40-60℃下加热并不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却，备用；
3)将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5和硅藻土加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，混匀；
4)配制CaC12溶液：用水配制摩尔浓度为0.1-0.3M的氯化钙溶液，备用；
5)将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5的混合溶液加入容器内，在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌，然后将海藻酸钙微球滤出，冲洗，干燥，得到微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5菌剂。
在上述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5菌剂的制备方法中，步骤1)中的原料优选为(每100g)：海藻酸钠1-4g，硅藻土10-14g，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 5-10g(109-1010CFU)，加水至100g，再滴注入氯化钙1-2g；或者为：海藻酸钠1-3g，硅藻土12-15g，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 1-5g(109-1010CFU)，加水至100g，再滴注入氯化钙1-2.5g。
步骤2)中最好将海藻酸钠水溶液冷却至30℃以下。
步骤3)中的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5可为其菌丝体及其孢子的混合物。
步骤6)中的淬水搅拌时间可为30-60分钟；可用无菌水对海藻酸钙微球进行清洗；所述干燥方法可为真空干燥或阴干。
上述微球剂型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5菌剂制备方法中所用的水优选为无菌水或蒸馏水。
本发明提供了一株对植物寄生线虫—根结线虫具有较高杀虫活性的根结线虫真菌寄生菌株淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780及其菌剂。该菌剂是以高分子材料海藻酸钠为基本骨架，以淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的菌丝体、孢子混合物为活性成分，以硅藻土为载体，根据海藻酸钠与多价阳离子形成凝胶的特性，采用海藻酸钠—氯化钙反应的方法，制备而成的具有缓施作用的杀线虫生物菌剂。实验证明，该菌剂具有较好的杀线虫功效，防治率高达82％，且较为稳定，其药效作用期至少4个月，无有毒的化学残留物(无毒、无残留)，不污染农产品和环境(不与环境中的其它物质反应)，性价比高和施用方便的特点。本发明将在植物根结线虫病害的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为以淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780为活性成分的微球型生防菌剂的形态图
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。
实施例1、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的分离及保藏
采集云南峨山塔甸烟草根结线虫病根，用自来水冲洗病根3—5分钟以除去土壤，然后将病根放在解剖镜下，用小镊子挑出卵囊，用1％次氯酸钠处理卵囊1分钟以对卵囊表面消毒和释放线虫卵，将次氯酸钠卵悬液分别过200μm和30μm网筛，用灭菌蒸馏水冲洗3遍以除去次氯酸钠，大约每100个卵涂布在PDA平板上，每天观察菌落出现情况。最终自烟草根结线虫卵上分离得到一株杀线虫真菌菌株，命名为FZ07-9F-5，已于2008年12月01日保藏于位于中国北京朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2780。经鉴定，该菌株为淡紫拟青霉菌，具有以下特征：菌落毡状，表面初为白色，产孢时变为葡萄酒红色，并且产孢量越多，颜色越深，背面呈白色或酒红色。该菌株在麦芽汁培养基(MEA)上生长较快，在PDA培养基上也可生长。培养1周后开始产孢，其分生孢子梗直立，孢梗上轮生排列2-4个瓶梗，顶端串生分生孢子。分生孢子呈椭球或纺锤形，外壁光滑，大小为(2.0-3.0)×(1.5-2.2)μm。该菌株生长的温度范围为8-38℃，最佳为25-30℃。该菌株在pH 2-11之间均可以生长，适宜pH值为5-9。
实施例2、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养及其菌剂的制备
一、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养
1、试管种培养
马铃薯琼脂培养基的配制：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L，pH 6-7。
将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种在试管中的马铃薯琼脂培养基上，在25℃下培养72-96h，得到经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780。
2、扩大培养
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780专用液体培养基的配制：麦芽糖(C源)30g，酵母(N源)6.12g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO40.01g，ZnSO4·7H2O 10mg，用水定容至1L，pH 6-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种到上述专用液体培养基中，在25℃、150rpm下培养120h，得到淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物。
二、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780微球型菌剂的制备
用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCCNo.2780菌剂，具体制备方法包括以下步骤：
1)称取原料：海藻酸钠20kg，硅藻土100kg，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780(菌丝体及其孢子的混合物)10kg(10136-1014CFU)，无菌水870kg，氯化钙22kg；
2)微球海藻酸钠凝胶液的配制：将海藻酸钠与无菌水混合，在40℃下加热并不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30℃，备用；
3)将步骤一得到的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物匀浆打碎，离心收集沉淀和硅藻土共同加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀，备用；
4)配制CaCl2溶液：用无菌水配制摩尔浓度为0.2M的氯化钙溶液，备用；
5)将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCCNo.2780的混合溶液加入密闭耐压容器内加压滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌60分钟后，滤出微球，用无菌水冲洗3次，将微球在真空条件下干燥，得到微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780菌剂。形态如图1所示，单粒微球重0.022-0.024克，直径4.8±0.2mm，经检测，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780含量为107-108CFU/g。
实施例3、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养及其菌剂的制备
一、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养
1、试管种培养
马铃薯琼脂培养基的配制：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L，pH 6-7。
将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种到试管中的马铃薯琼脂培养基上，在25℃下培养72h，得到经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780。
2、扩大培养
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780专用液体培养基的配制：麦芽糖20g，酵母5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.1g，KCl 0.1g，FeSO4 0.001g，ZnSO4·7H2O5mg，用水定容至1L，pH6-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种到上述专用液体培养基中，在26℃、180rpm下培养150h，得到淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物。
二、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780微球型菌剂的制备
用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCCNo.2780，具体制备方法包括以下步骤：
1)称取原料：海藻酸钠10kg，硅藻土150kg，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780(菌丝体及其孢子的混合物)20kg(1013-1014CFU)，氯化钙11kg，无菌水820kg；
2)微球海藻酸钠凝胶液的配制：将海藻酸钠与无菌水混合，在50℃下加热并不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30℃，备用；
3)将步骤一得到的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物进行匀浆打碎，离心收集沉淀和硅藻土共同加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀，备用；
4)配制CaCl2溶液：用无菌水配制摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液，备用；
5)将步骤3)获得的海藻酸钠及微球型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的混合溶液加入密闭耐压容器内在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌30分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用无菌水冲洗2次，滤出微球真空干燥，得到微球剂型的微球型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780菌剂。菌剂形态与实施例1制备的菌剂相同，单粒微球重0.032-0.034克，直径4.5±0.3mm，经检测，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780含量为107-108CFU/g。
实施例4、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养及其菌剂的制备
一、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养
1、试管种培养
马铃薯琼脂培养基的配制：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L，pH6-7。
将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种在试管中的马铃薯琼脂培养基上，在28℃下培养72h，得到经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780。
2、扩大培养
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780专用液体培养基的配制：麦芽糖40g，酵母7g，K2HPO4 2g，MgSO4 1g，KCl 1g，FeSO4 0.05g，ZnSO4·7H2O 20mg，用水定容至1L，pH6-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种到上述专用液体培养基中，在23℃、120rpm下培养180h，得到淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物。
二、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780微球型菌剂的制备
用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCCNo.2780菌剂，具体制备方法包括以下步骤：
1)称取原料：海藻酸钠20kg，硅藻土80kg，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780(菌丝体及其孢子的混合物)30kg(1013-1014CFU)，氯化钙33kg，无菌水870kg；
2)微球海藻酸钠凝胶液的配制：将海藻酸钠与无菌水混合，在60℃下加热并不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30℃，备用；
3)将步骤一得到的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物匀浆打碎，离心收集沉淀和硅藻土共同加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀，备用；
4)配制CaCl2溶液：用无菌水配制摩尔浓度为0.3M的氯化钙溶液，备用；
5)将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCCNo.2780的混合溶液加入密闭耐压容器内在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌45分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用无菌水冲洗4次，滤出后阴干，得到微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780菌剂。菌剂形态与实施例1制备的菌剂相同，单粒微球重0.018-0.020克，直径4.7±0.2mm，经检测，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780含量为107-108CFU/g。
实施例5、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养及其菌剂的制备
一、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780的培养
1、试管种培养
马铃薯琼脂培养基的配制：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L，pH6-7。
将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种在试管中的马铃薯琼脂培养基上，在25℃下培养96h，得到经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780。
2、扩大培养
淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780专用液体培养基的配制：麦芽糖25g，酵母6.5g，K2HPO4 1.5g，MgSO4 0.8g，KCl 0.4g，FeSO4 0.03g，ZnSO4·7H2O10mg，用水定容至1L，pH6-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780接种到上述专用液体培养基中，在25℃、150rpm下培养120h，得到淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物。
二、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780微球型菌剂的制备
用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCCNo.2780菌剂，具体制备方法包括以下步骤：
1)称取原料：海藻酸钠25kg，硅藻土120kg，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780(菌丝体及其孢子的混合物)25kg(1013-1014CFU)，氯化钙11kg，无菌水830kg；
2)微球海藻酸钠凝胶液的配制：将海藻酸钠与无菌水混合，在45℃下加热并不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30℃，备用；
3)将步骤一得到的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780液体培养物匀浆打碎，离心收集沉淀和硅藻土共同加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀，备用；
4)配制CaCl2溶液：用无菌水配制摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液，备用；
5)将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCCNo.2780的混合溶液加入密闭耐压容器内在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌50分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用无菌水冲洗4次，过滤后阴干，得到微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5菌剂。菌剂形态与实施例1制备的菌剂相同，单粒微球重0.026-0.028克，直径4.6±0.2mm，经检测，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780含量为107-108CFU/g。
实施例6、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780菌剂的生防效果检测
用下述实验检测实施例2-5制备的微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780菌剂对根结线虫(以黄瓜根结线虫为例)的防治效果，实验方法如下：
选择根结线虫病发病严重的北京市门头沟碧琨种植中心蔬菜温室大棚为大棚，种植作物为黄瓜。实验小区面积为20平方米，每处理三次重复，小区排列为随机排列法。在黄瓜苗移栽时，将供试药剂采用穴施的方法，施于作物根下，实验期间按常规管理，时间为9月中旬-次年1月下旬。供试药剂如下：
处理1：空白对照(不施药)，
处理2：本发明生物杀线虫微球菌剂2kg/亩，
处理3：本发明生物杀线虫微球菌剂4kg/亩，
处理4：本发明生物杀线虫微球菌剂8kg/亩，
在作物收获后，挖出每处理黄瓜根，按照根结线虫分级调查指标进行调查，具体如下：0级＝没有根结，1级1-10％的根上有根结，2级11-20％的根上有根结，3级21-30％的根上有根结，4级31-40％的根上有根结，5级41-50％的根上有根结，6级51-60％的根上有根结，7级61-70％的根上有根结，8级71-80％的根上有根结，9级81-90％的根上有根结，10级91-100％的根上有根结。防治效果计算公式为：防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。其中，实施例2-5的微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780菌剂实验结果如表1-4所示，可以看出，使用本发明的微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5 CGMCC No.2780菌剂后对根结线虫都有不同程度的防效，与空白对照相比能够显著降低根结线虫危害，且防治效果随施用量的增加而不断提高。
表1 实施例2的菌剂对黄瓜根结线虫的防治效果检测结果
表2 实施例3的菌剂对黄瓜根结线虫的防治效果检测结果
表3 实施例4的菌剂对黄瓜根结线虫的防治效果检测结果
表4 实施例5的菌剂对黄瓜根结线虫的防治效果检测结果
Claims (10)
1.淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)FZ07-9F-5，其生物保藏号为CGMCCNo.2780。
2.一种培养权利要求1所述的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的方法，是将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780接种到如下专用液体培养基中，在25-30℃下培养，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780得到扩大培养；所述专用液体培养基按照如下方法配制：麦芽糖20-40g，酵母5-7g，K2HPO40.5-2g，MgSO40.1-1g，KCl0.1-1g，FeSO40.001-0.05g，ZnSO4·7H2O5-20mg，用水定容至1L，pH6-7。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养过程中进行振荡，振速为120-180rpm；培养时间为120-180h；接种前，先对淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌种进行试管活化培养，方法为：将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780接种在马铃薯琼脂培养基上，在25-30℃下培养，得到经活化的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780；所述马铃薯琼脂培养基按照如下方法配制：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L，pH6-7。
4.一种防治根结线虫的菌剂，其活性成分为权利要求1所述的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为微球剂型，其原料包含以下组分：
海藻酸钠 1-4g，
硅藻土 8-15g，
淡紫拟青霉(P. lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780 1-10g，
水 加水至100g；
所述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的CFU数目是109-1010CFU。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中还包括1-4g的氯化钙。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂的原料由以下组分组成：
海藻酸钠 1-4g，
硅藻土 10-14g，
淡紫拟青霉(P. lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780 5-10g，
水 72—84g，
氯化钙 1-3.3g；
其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780和水的重量相加等于100g；所述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的CFU数目是109-1010CFU。
8.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂的原料由以下组分组成：
海藻酸钠 1-3g，
硅藻土 12-15g，
淡紫拟青霉(P. lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780 1-5g，
水 77—86g，
氯化钙 1-2.5g。
其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780和水的重量相加等于100g；所述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的CFU数目是109-1010CFU。
9.一种制备权利要求6所述的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌剂的方法，包括以下步骤：
1)按下述原料组分取料：海藻酸钠1-4g，硅藻土8-15g，淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.27801-10g，水71—90g，氯化钙1-4g；其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780和水的重量相加等于100g；所述淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的CFU数目是109-1010CFU；
2)微球海藻酸钠凝胶液的配制：将海藻酸钠与水混合，在40-60℃下加热使其溶化，得到海藻酸钠水溶液；
3)将淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780和硅藻土加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，混匀；
4)配制CaCl2溶液：用水配制摩尔浓度为0.1-0.3M的氯化钙溶液；
5)将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780的混合溶液加入容器内，在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌，然后将海藻酸钙微球滤出，冲洗，干燥，得到微球剂型的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCC No.2780菌剂。
10.权利要求4—8中任意一项所述的淡紫拟青霉(P.lilacinus)FZ07-9F-5CGMCCNo.2780菌剂在防治植物根结线虫病害中的应用。
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