CN110201234B - 一种组织工程用前列腺细胞微囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属医学生物工程领域，涉及一种组织工程用前列腺细胞微囊及其制备方法。本发明采用海藻酸钠‑树枝状稳定剂组分‑聚乙二醇的结构，其内层由海藻酸钠对细胞进行包裹，然后用树枝状聚乙烯亚胺和树枝状聚赖氨酸作为稳定剂，其与普通的聚赖氨酸相比，网络结构复杂，交联点较多，提高了微囊的机械性能。微囊的最外层是由单边固定在树枝状稳定剂组分的聚乙二醇链段组成，由于其具有滑动性能，对蛋白质、细胞的粘附起到抑制作用。由于聚乙二醇在人体中是趋于“隐形”的材料，故而本发明所述微囊在一定程度上可以抑制被纤维化，从而延长活性细胞的存活时间。该细胞微囊能够帮助前列腺癌患者克服多种生理功能障碍，提高生活质量。

Description

一种组织工程用前列腺细胞微囊及其制备方法
技术领域
本发明属医学生物工程领域，涉及一种组织工程用前列腺细胞微囊及其制备方法。
背景技术
前列腺是男性生殖器附属腺中较为重要的实质性器官，为不成对的实质性腺体，位于膀胱与尿生殖膈之间，包绕尿道根部，其形状和大小均似稍扁的栗子。前列腺液是前列腺的分泌物。前列腺液的分泌受雄性激素的控制，每日分泌量约为0.5～2毫升。它是精液的重要组成成分，是精液中精浆成分之一，约占射出精液量的1/10～1/3。前列腺液中蛋白质的含量很少，主要含有高浓度的锌离子、酸性磷酸酶、蛋白水解酶、纤维蛋白酶、精胺、脂族多肽等。前列腺液有多种生理功能：（1）促进受精卵的形成：前列腺液中含有蛋白分解酶和纤维蛋白分解酶，因此可帮助精子穿过重重屏障-子宫颈内的黏液屏障和卵细胞的透明带，使得精子和卵细胞能够顺利结合。（2）激发精子的活力：前列腺液中含有一种特殊的成分，能够使精子从精液中获取营养，激发精子的活力。（3）促进精液的液化：前列腺液中的胰液凝乳蛋白酶可促进精液液化。（4）提高精子的成活率：前列腺液略偏碱性，可中和女性阴道中的酸性分泌物，减少酸性物质对精子的侵蚀，提高精子的成活率。（5）维持生殖泌尿系的卫生：前列腺位于膀胱的前方、直肠的下方，环绕着尿道，而且前列腺液中的锌离子具有杀菌的功效，使得前列腺发挥了抵御外界病菌的作用，从而对维护生殖泌尿系统的健康有一定的帮助。（6）提高性生活的质量：前列腺内布满大量的神经网和神经末梢，因此是一个性敏感部位，能够激发性冲动和性兴奋，从而有利于性生活的和谐。
前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中前列腺癌病理类型上包括腺癌（腺泡腺癌）、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。其中前列腺腺癌占95%以上，因此，通常我们所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁。家族遗传型前列腺癌患者发病年龄稍早，年龄≤55岁的患者占43%。
对于早期前列腺癌患者可采用根治性治疗方法，能够治愈早期前列腺癌的方法有放射性粒子植入、根治性前列腺切除术、根治性外放射治疗。对于中期前列腺癌患者应采用综合治疗方法，如手术+放疗、内分泌治疗+放疗等。不管哪种治疗措施，都会严重影响前列腺的功能，使前列腺癌症患者的生活质量大大降低。现在的治疗理念认为，不但需要让患者活着，而且要让患者活的有尊严，所以如何解决前列腺癌患者多种生理功能障碍的问题亟待解决。
细胞或组织移植，是解决前列腺癌患者生理功能障碍的重要途径之一，但是本体细胞或组织来源较少，而异种细胞和人源异体细胞都存在免疫排斥反应严重的问题，限制了细胞移植的开展。应用生物材料制作的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微胶囊，其半通透性的囊膜将细胞包裹，只允许小分子的营养物质和细胞分泌物自由通过，限制了大分子的免疫成分和细胞进入，从而达到延长移植物存活的免疫隔离作用。APA 微囊化人工细胞的异种移植已在治疗帕金森病、疼痛、糖尿病等疾病的研究中取得很大的进展。但是利用APA 前列腺细胞微囊，改善前列腺功能恢复的研究，尚未见报道。
目前，利用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）包裹细胞或组织的微囊化细胞工艺，主要包括：细胞与海藻酸钠溶液混合、成球、包覆聚赖氨酸、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠、微囊液化等步骤。首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合均匀，然后用高压静电液滴法或气流切割法将混合液滴至固化溶液中(等渗的CaCl2溶液)形成海藻酸钙微球，然后再将微球先后投入到适当浓度的聚赖氨酸溶液和海藻酸钠溶液中包覆聚赖氨酸和海藻酸钠，最后将微球投入到柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠，液化微球的核心，即可获得APA微囊化的细胞或组织。海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊由于易吸附蛋白和细胞，容易被组织纤维化，并且其机械性能较差。
本发明采用海藻酸钠-树枝状稳定剂组分-聚乙二醇的结构，其内层由生物相容性较好的海藻酸钠对细胞进行包裹，然后用树枝状聚乙烯亚胺和树枝状聚赖氨酸作为稳定剂，其中树枝状聚乙烯亚胺和树枝状聚赖氨酸层相比普通的聚赖氨酸相比，网络结构复杂，交联点较多，提高了微囊的机械性能。微囊的最外层是由单边固定在树枝状稳定剂组分的聚乙二醇链段组成，由于其具有滑动性能，对蛋白质、细胞的粘附起到抑制作用。由于聚乙二醇在人体中是趋于“隐形”的材料，故而本发明所述微囊在一定程度上可以抑制被纤维化，从而延长活性细胞的存活时间。
发明内容
本发明的目的之一是为了解决上述的技术问题而提供一种前列腺细胞微囊。
本发明的目的之二在于提供上述的一种前列腺细胞微囊的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种应用上述的一种前列腺细胞微囊的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种组织工程用前列腺细胞微囊的制备方法，按照如下的操作步骤进行：
（1）将前列腺细胞置于质量百分比浓度为15-25g/L的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1-6×106个细胞；
（2）利用喷雾装置将步骤（1）获得的悬浮液以150-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，两种液体的比例为保证每升混合液含0.5-1×108个细胞，放置5-10分钟，待沉淀完全除去上清液，获得前列腺细胞的海藻酸钙沉淀；
（3）将步骤（2）获得的沉淀物加入到一种浓度为0.3-0.7g/L的树枝状稳定剂溶液中，二者的比例保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
（4）将步骤（3）获得的沉淀物加入到浓度为100-300g/L的活性聚乙二醇溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
（5）将步骤（4）获得的沉淀物加入到一种浓度为45-75mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得前列腺细胞沉淀物；
（6）将步骤（5）获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液中清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养待用。
所述前列腺细胞具有85%以上的纯度。
在步骤（2）中将步骤（1）获得的细胞悬液以200-600μm直径的胶珠分散。
所述树枝状稳定剂溶液为树枝状聚赖氨酸和树枝状聚乙烯亚胺混合溶液，其中树枝状聚赖氨酸：树枝状聚乙烯亚胺的质量比为70：30。
在步骤（4）中所述活性聚乙二醇为聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺己酸酯。
按照上述制备方法获得的组织工程前列腺细胞微囊。
所述的组织工程前列腺细胞微囊应用为：将组织工程用前列腺细胞微囊拦截在人体需要的组织盲腔或腔道内，从而使组织工程用前列腺细胞微囊能够根据机体调节适量分泌前列腺液。
所述前列腺细胞的来源为异体或异种。
与本领域的同类现有技术相比，本发明具有下列有益效果：
1、胰岛细胞微囊利用树枝状聚乙烯亚胺和树枝状聚赖氨酸作为稳定剂，其中树枝状聚乙烯亚胺和树枝状聚赖氨酸层相比普通的聚赖氨酸相比，网络结构复杂，交联点较多，提高了微囊的机械性能，解决了海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）机械性能差的缺点。
2、胰岛细胞微囊的最外层是由单边固定在活性氨基组分的聚乙二醇链段组成，由于其具有滑动性能，对蛋白质、细胞的粘附起到抑制作用。由于聚乙二醇在人体中是趋于“隐形”的材料，故而本发明所述微囊在一定程度上可以抑制被纤维化，相比于传统结构的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊，可以使细胞在微囊内存活时间更长。
附图说明：
图1为前列腺细胞微囊结构示意图。
图2为一种组织工程用前列腺细胞微囊的制备方法
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不受这些具体实施例的限制。
组织工程前列腺细胞微囊的制备
实施例1:将前列腺细胞置于质量百分比浓度为20g/L的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含3×106个细胞；采用Inotech IE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以150-1000μm直径的微滴状态喷入浓度为100 mmol/L的氯化钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应8分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.5g/L的树枝状稳定剂溶液中（树枝状聚乙烯亚胺：树枝状聚赖氨酸的质量比为30:70），二者的比例保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置15分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为150g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将获得的沉淀物加入到一种浓度为100mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得前列腺细胞沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得前列腺细胞。
实施例2：将胰岛细胞置于质量百分比浓度为15g/L的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1×106个细胞；采用Inotech IE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以150-400μm直径的微滴状态喷入浓度为80 mmol/L的氯化钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应5分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.3g/L的树枝状稳定剂溶液中（树枝状聚乙烯亚胺：树枝状聚赖氨酸的质量比为30:70），二者的比例保证每升液体含0.5×108个细胞，混合均匀，放置5分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为100g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5×108个细胞，混合均匀，放置3分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将获得的沉淀物加入到一种浓度为45mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5×108个细胞，混合均匀，放置5分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得前列腺细胞微囊沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得前列腺细胞微囊。
实施例3：将胰岛细胞置于质量百分比浓度为25g/L的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含6×106个细胞；采用Inotech IE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以700-1000μm直径的微滴状态喷入浓度为120mmol/L的乳酸钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应10分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.7g/L的树枝状稳定剂溶液中（树枝状聚乙烯亚胺：树枝状聚赖氨酸的质量比为30:70），二者的比例保证每升液体含1×108个细胞，混合均匀，放置20分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为100g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含1×108个细胞，混合均匀，放置15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将沉淀物加入到一种浓度为60mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含1×108个细胞，混合均匀，放置20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得前列腺细胞微囊沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得前列腺细胞微囊。
比较例1：将胰岛细胞置于质量百分比浓度为10g/L的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含0.5×106个细胞；采用Inotech IE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以50-100μm直径的微滴状态喷入浓度为50 mmol/L的氯化钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应3分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.1g/L的树枝状稳定剂溶液中（树枝状聚乙烯亚胺：树枝状聚赖氨酸的质量比为30:70），二者的比例保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置3分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为50g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置1分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将获得的沉淀物加入到一种浓度为20mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置3分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得前列腺细胞微囊沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得前列腺细胞微囊。
小鼠去前列腺模型的建立与治疗
前列腺细胞微囊的体内移植：摘除小鼠前列腺腺性组织制成去前列腺小鼠模型，一组作为切除前列腺组，一组在切除前列腺后即用实施例1所述前列腺细胞微囊移植入小鼠前列腺囊腔内，作为移植组。一组在切除前列腺后即用比较例1所述前列腺细胞微囊移植入小鼠前列腺囊内，作为比较例组。设正常未切除前列腺的小鼠作为对照。术后90天，处死所有动物，取前列腺分泌物，并观察前列腺囊内前列腺细胞微囊的生长状态。
前列腺分泌物的测定：酸性磷酸酶可帮助判断前列腺功能，故本试验采用南京建成生物工程研究所的前列腺酸性磷酸酶(PACP)测试盒，测定酸性磷酸酶的活性；
前列腺细胞微囊的生长状态：将前列腺细胞微囊破壁再培养，观察细胞的贴壁和生长状态。
小鼠前列腺分泌物中酸性磷酸酶活性检测结果如表1所示。
Figure 88696DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，前列腺细胞微囊在移植入小鼠体内后，可以正常分泌前列腺分泌物，并且其酸性磷酸酶的活性与对照组基本一致，说明前列腺细胞微囊对前列腺切除后的功能恢复起到较为有效的作用。将移植的前列腺细胞微囊取出，破壁再培养，从微囊内释放的前列腺细胞仍能迅速贴壁，生长良好，也表明前列腺细胞在前列腺囊内可以成活，并发挥较好的功能恢复作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的个别实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种组织工程用前列腺细胞微囊的制备方法，其特征在于，按下列步骤进行：
（1）将前列腺细胞置于浓度为15-25g/L的海藻酸钠溶液中混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1-6×106个细胞；
（2）利用喷雾装置将步骤（1）获得的悬浮液以150-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，两种液体的比例为保证每升混合液含0.5-1×108个细胞，放置5-10分钟，待沉淀完全除去上清液，获得前列腺细胞的海藻酸钙沉淀；
（3）将步骤（2）获得的沉淀物加入到一种浓度为0.3-0.7g/L的树枝状稳定剂溶液中，二者的比例保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
（4）将步骤（3）获得的沉淀物加入到浓度为100-300g/L的活性聚乙二醇溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
（5）将步骤（4）获得的沉淀物加入到一种浓度为45-75mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得前列腺细胞沉淀物；
（6）将步骤（5）获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液中清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养待用；
步骤（3）中，所述树枝状稳定剂溶液为树枝状聚赖氨酸和树枝状聚乙烯亚胺的混合溶液，其中树枝状聚赖氨酸:树枝状聚乙烯亚胺的质量比为70:30；
步骤（4）中所述活性聚乙二醇为聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺己酸酯。
2.根据权利要求1所述的组织工程用前列腺细胞微囊的制备方法，其特征在于，所述前列腺细胞具有85%以上的纯度。
3.根据权利要求1所述的组织工程用前列腺细胞微囊的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中将步骤（1）获得的细胞悬液以200-600μm直径的胶珠分散。
4.按照权利要求1-3中任一所述的组织工程用前列腺细胞微囊的制备方法获得的组织工程用前列腺细胞微囊。
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