ES2351047T3

ES2351047T3 - Injerto covalente de sustancias hidrófobas sobre el colágeno.

Info

Publication number: ES2351047T3
Application number: ES05792279T
Authority: ES
Inventors: Christian Gagnieu
Original assignee: BiomUp France SAS
Current assignee: BiomUp France SAS
Priority date: 2004-10-04
Filing date: 2005-10-03
Publication date: 2011-01-31
Anticipated expiration: 2025-10-03
Also published as: US20070260299A1; FR2877669B1; FR2877669A1; CA2582306A1; ATE479709T1; EP1797124A1; WO2006037770A1; AU2005291306A1; DE602005023326D1; CA2582306C; EP1797124B1; AU2005291306B2

Abstract

Colágeno hidrófobo injertado que comprende unos ácidos grasos injertados sobre el colágeno mediante enlace covalente, para su utilización en terapia.

Description

La presente invención se refiere a un colágeno injertado hidrófobo, a su procedimiento de preparación y a su utilización, en particular en terapia. En la presente invención, unas sustancias o moléculas de carácter hidrófobo son injertadas mediante unos enlaces covalentes sobre unos residuos aminoácidos reactivos de moléculas colagénicas. Los acoplamientos químicos tienen como objetivo modificar las propiedades físico-químicas y biológicas del colágeno y/o de sus derivados. En particular, la introducción de residuos hidrófobos permite modular el carácter hidrófilo del colágeno y modificar sus propiedades quimiotácticas implicadas en la adhesión y el crecimiento celulares.

Se conoce poco o nada del injerto sobre el colágeno en el estado de la técnica aparte de los injertos de péptido de adhesión sobre el colágeno con aumento de la adhesión celular. El injerto se realiza mediante un procedimiento químico particular [1]. Algunos autores describen asimismo unos injertos de colágeno sobre unas sustancias inertes tales como el poliuretano mediante unos procedimientos muy específicos para el producto y para la aplicación [2]. Por otra parte, existen unas mezclas de colágeno y de ácidos grasos pero no se ha informado en la bibliografía de ningún injerto de ácidos grasos sobre colágeno, en particular mediante enlace covalente.

Las moléculas de colágeno son unas proteínas animales situadas en la matriz extracelular que poseen en su estructura uno o varios dominios en triple hélice. La triple hélice se obtiene mediante la asociación de tres cadenas alfa compuestas cada una por

1.050 aminoácidos. En el extremo de las cadenas, unas zonas no helicoidales de una cuarentena de aminoácidos permiten la asociación de las fibras de colágeno entre sí. Son los telopéptidos. Estas proteínas se caracterizan por su riqueza en glicina (33%) y por la presencia de aproximadamente 30% de prolina y de hidroxiprolina.

Para la realización y la confección de biomateriales, los colágenos de varios tipos y de diferentes niveles de estructuración son extraídos de los tejidos fuentes mediante unos procedimientos bien conocidos.

↓: El colágeno se denomina nativo cuando el conjunto de la estructura que adopta en los tejidos (triple hélice y telopéptidos) se conserva en la extracción.

↓: El colágeno puede ser escindido de manera enzimática o química a nivel de los telopéptidos: el colágeno se denomina entonces atelocolágeno.

↓: Cuando las tres cadenas alfa de la triple hélice son separadas mediante desnaturalización (calentamiento por ejemplo), el colágeno se denomina desnaturalizado.

↓: En cuanto a la gelatina, ésta se caracteriza por una desnaturalización y una hidrólisis (química o térmica) de las cadenas alfa en fragmentos peptídicos.

Diferentes tipos de colágeno han sido puestos en evidencia y algunos han sido aislados y producidos industrialmente (esencialmente el tipo I y el tipo IV).

El colágeno presenta unas propiedades físico-químicas y biológicas variadas que hacen del mismo una materia prima de calidad para la confección de biomateriales. Así, presenta unas propiedades reológicas específicas, una baja antigenicidad, un papel en el crecimiento y en la diferenciación celulares, y tiene asimismo un fuerte poder hemostático. En los diferentes campos de la medicina y más particularmente de la cirugía, se utilizan muy habitualmente los biomateriales. En general, se busca la adhesión y la integración celular. Sin embargo, desde hace algunos años, se ha puesto énfasis en la puesta a punto de materiales que reducen la adhesión celular. Unos fenómenos de adherencias posquirúrgicas a unos biomateriales pueden aparecer además de las adherencias consecuencias intrínsecas de la cirugía. Numerosos estudios están en curso para realizar unos sistemas que permitan reducir o eliminar los fenómenos de adherencias.

Según el estado de la técnica, la disminución de la adhesión celular sobre los biomateriales se puede obtener mediante la modificación de sus propiedades de superficie. La carga de la superficie, la rugosidad, la exposición de algunas estructuras químicas y la hidrofobicidad son unos factores claves de la regulación de la adhesión celular. En efecto, unas superficies cargadas negativamente inducen una repulsión de las células cargadas también negativamente [3, 4] y provocan una reducción de la adhesión celular. La rugosidad del sustrato desempeña asimismo un papel clave puesto que unas superficies lisas son anti-adherentes [5, 6]. El control de la adhesión celular se puede obtener asimismo injertando unas estructuras químicas o bioquímicas que tienen una influencia directa sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la interacción de las células con los materiales.

Así, la adhesión celular puede ser aumentada mediante el injerto sobre unas superficies inertes de los materiales conocidos por sus propiedades que favorecen la adhesión tales como colágeno [7], hidroxiapatita [5], polilisinas [4], polímeros hidroxilados

o péptidos de superficie adherentes [8].

De manera similar, se utilizan tres estrategias principales para disminuir la adhesión celular:

-el injerto sobre unos polímeros inertes de moléculas bioactivas con un poder antiadherente tales como la heparina o la tapsigargina que afectan directamente a la reorganización celular requerida para la adhesión celular [9, 10],

-el injerto de sustancias hidrófobas tales como el Téflon [11], la polivinilpirrolidona o la poliacrilamida [12] generalmente sobre PMMA,

-la modificación de la hidrofobia de superficie mediante cualquier medio puesto que se ha demostrado que unos polímeros sintéticos cada vez más hidrófobos inducen una disminución de la adhesión celular [3, 6, 13, 14].

Unas gelatinas injertadas por unos ácidos grasos que alcanzan hasta 16 átomos de carbono están descritas por Toledano et al. (J. of Colloid and Interface Science, 193, 172-177 (1997) y 200, 235-240 (1998)), por Kamyshny et al. (Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 13 (1999) 187-194) y Magdassi et al. (J. Dispersion Science and Technology, 22(4), 313-322 (2001) para el estudio de sus propiedades interfaciales.

Aunque el colágeno es conocido y se utiliza por sus propiedades que favorecen la adhesión, el objeto de la presente invención consiste en un nuevo producto que presenta unas propiedades anti-adhesivas, que comprende unos colágenos hidrófobos tan compatibles como el colágeno de partida y que presenta lo esencial de las demás propiedades biológicas y reológicas del colágeno salvo su acción sobre la adhesión y el crecimiento celulares. Las sustancias hidrófobas injertadas son preferentemente unos ácidos grasos saturados o no. En función de la selección de los ácidos grasos utilizados para este injerto, el colágeno injertado según la invención está degradado en sustancias perfectamente reconocidas por el organismo humano sin ninguna reacción patológica.

La presente invención se refiere por lo tanto a un colágeno hidrófobo injertado que comprende unos ácidos grasos injertados sobre el colágeno mediante un enlace covalente, para su utilización en terapia. De manera preferida, los ácidos grasos son injertados sobre los residuos de aminas libres de la cadena alfa del colágeno, en particular sobre las aminas libres de los residuos lisilos de la cadena alfa del colágeno.

El porcentaje de ácidos grasos con respecto a los residuos aminas libres de la cadena alfa del colágeno está comprendido entre 1 y 100%, preferentemente es superior a aproximadamente 10% e inferior a aproximadamente 85%. Según un modo más preferido de realización de la invención, el porcentaje de ácidos grasos está comprendido entre 15 y 50%, más preferentemente comprendido entre 20 y 30%.

El colágeno injertado según la invención es un colágeno de cualquier origen, en particular nativo, atelocolágeno nativo o desnaturalizado, o gelatina. De manera ventajosa, el colágeno injertado es un colágeno de origen mamífero, preferentemente de origen porcino, que habrá sufrido ventajosamente un tratamiento profiláctico apropiado para destruir los agentes patógenos.

El presente documento se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de un colágeno hidrófobo injertado tal como se ha definido anteriormente, en el que se hace reaccionar una cantidad apropiada de un ácido graso activado con el colágeno en un medio de reacción apropiado.

En el procedimiento de injerto, la activación de la función carboxílica del ácido graso se obtiene preferentemente mediante la formación de un enlace éster activado o de una imidazolida. El ácido graso así activado reacciona con las aminas desprotonadas de los residuos épsilon lisinas de las cadenas alfa del colágeno. El ácido graso activado puede estar o bien cristalizado, o bien preparado extemporáneamente en disolución.

El ácido graso activado puede ser obtenido mediante reacción estequiométrica del carbonildiimidazol (CDI) sobre el ácido graso en dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO). Cuando la reacción de activación se lleva a cabo en DMF, el producto activado se cristaliza, se aísla y se añade en forma sólida a la disolución de colágeno a injertar. Cuando el ácido graso activado se prepara en DMSO, se añade en disolución al colágeno. La preparación del ácido graso activado en la DMF se puede utilizar para sintetizar el conjunto de los ácidos grasos comprendidos entre C12 y C22. Para todos los demás, pero también para éstos, la activación es posible en DMSO. El rendimiento de la reacción de activación es superior a 95%, y el ácido graso activado no presenta ninguna pérdida de actividad medible después de 18 meses de almacenamiento a 4ºC. La fórmula química del ácido graso activado (imidazolida) puede ser representada por la fórmula I siguiente:

imagen1

5 en la que R representa la cadena hidrocarbonada del ácido graso.

La activación del ácido graso puede ser llevada a cabo asimismo mediante la reacción de la N-hidroxisuccinimida sobre el ácido graso precedida de una activación con

10 una carbodiimida tal como la diciclohexilcarbodiimida o la diisopropilcarbodiimida. El ácido graso activado así aislado puede ser injertado de la misma manera que anteriormente sobre el colágeno. La fórmula química del ácido graso (succinimidilo) activado puede ser representada por la fórmula II siguiente:

imagen1

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en la que R representa la cadena hidrocarbonada del ácido graso.

Para el procedimiento, el ácido graso, una vez activado, puede ser aislado o no del 20 medio de reacción antes de efectuar la reacción de injerto.

Todos los ácidos grasos son susceptibles de ser activados por los medios

anteriores y susceptibles de ser utilizados en el colágeno injertado hidrófobo según la

invención y su procedimiento de preparación.

25 Los ácidos grasos son bien conocidos por el experto en la materia. Los ácidos grasos son unos ácidos carboxílicos alifáticos que comprenden una cadena hidrocarbonada de longitud variable y un grupo carboxilo (-COOH). La cadena hidrocarbonada comprende más de 6 átomos de carbono, generalmente entre 6 y 25

30 átomos de carbono, más preferentemente entre 10 y 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados, incluyendo una o varias insaturaciones. Pueden ser lineales o ramificados. Pueden asimismo ser sustituidos por uno o varios grupos funcionales, en particular unos grupos funcionales que comprenden uno o varios átomos de oxígeno, de azufre o de nitrógeno, o también por uno o varios átomos de

35 halógeno. Entre los principales ácidos grasos lineales se citarán en particular los ácidos láurico (C12), mirístico (C14), palmítico (C16), esteárico (C18), oleico (C18, insaturado) y linoleico (C18, poliinsaturado), o linolénico. El ácido láurico es el principal componente del aceite de coco (45 -50%) de aceite de palma (45 -55%). La manteca de nutmeg es rica en ácido mirístico que constituye 60-75% de su contenido en ácidos grasos. El ácido

40 palmítico constituye entre 20 y 30% de la mayoría de las grasas animales, pero también de grasas vegetales. El ácido esteárico es el más común de los ácidos grasos naturales de larga cadena, derivado de grasas animales o vegetales. Por último, el ácido oleico es el más abundante de los ácidos grasos insaturados naturales.

Los ácidos grasos anteriores pueden ser injertados solos o en mezcla sobre el colágeno según la invención.

De manera ventajosa, los ácidos grasos se seleccionan de entre los ácidos esteárico, palmítico y mirístico, y sus mezclas en cualquier proporción.

Unas cantidades variables y controlables de ácidos grasos son introducidas por reacción del ácido graso activado sobre los residuos lisinas de la proteína. Una cadena de colágeno contiene en teoría 30 residuos lisinas. Por lo tanto, es posible injertar de 0 a 30 moléculas de ácidos grasos por cadena alfa del colágeno, es decir, unos índices de injerto de 0 a 100%.

El injerto se puede llevar a cabo sobre cualquier tipo de colágeno y sea cual sea su estructura: colágeno nativo, atelocolágeno nativo o desnaturalizado o gelatina. Sin embargo, los índices de injerto máximo pueden variar en función del contenido en lisina del colágeno considerado y de la accesibilidad de los residuos al reactivo, en particular para los colágenos no desnaturalizados. En función del nivel de estructuración del colágeno a injertar, se utilizan diferentes disolventes tales como el metanol, el dioxano, el DMSO o una mezcla de disolventes en diferentes proporciones.

En caso de injerto sobre colágeno no desnaturalizado, sea cual sea el índice de injerto y el ácido graso injertado, el injerto tiene lugar preferentemente sobre colágeno en disolución en el metanol, o en suspensión en dimetilformamida (DMF). El ácido graso previamente activado y ventajosamente cristalizado tal como se ha explicado anteriormente se añade en disolución al colágeno en un disolvente apropiado, por ejemplo una mezcla DMF trietilamina. Después de la reacción, el colágeno injertado precipita y el precipitado obtenido se lava mediante un disolvente apropiado en particular por acetona anhidra, y se seca según los métodos habituales, por ejemplo a presión reducida.

En caso de injerto sobre colágeno desnaturalizado, sea cual sea el índice de injerto, y el ácido graso injertado, el colágeno se seca una noche a presión reducida, se disuelve y se desnaturaliza en el dimetilsulfóxido (DMSO) a 70ºC. En función del índice de injerto deseado, el ácido graso activado se añade a la disolución de colágeno en condiciones estequiométricas en presencia de una base débil y preferentemente la trietilamina o el imidazol, con el objetivo de neutralizar aproximadamente 1,2 mEq de H+/g de colágeno y desprotonar las funciones NH2 de los residuos lisina. La disolución se calienta a 60ºC hasta la disolución de los ácidos grasos activados cristalizados. La reacción de injerto se realiza durante 16 horas a temperatura ambiente. Las disoluciones de colágenos injertados son entonces dializadas contra agua ácida pH 2-3 para eliminar el DMSO y las bases. El gel de colágeno injertado obtenido se tritura entonces en 3 volúmenes de acetona seca y después se seca a presión reducida; es decir, se funde a 60ºC, se seca a temperatura ambiente y se lava con acetato de etilo para eliminar los ácidos grasos residuales que no han reaccionado.

Para cada colágeno, el índice de injerto se calcula por la diferencia entre el índice de aminas libres en el colágeno de partida y el índice de aminas libres en el colágeno injertado. El método de dosificación se deriva de las investigaciones de Kakade et al. [15]. La cantidad de aminas libres se determina mediante la reacción del ácido 2,4,6trinitrobenceno sulfónico.

La solubilización de los colágenos injertados se lleva a cabo en agua o en una mezcla de agua/etanol (a diferentes proporciones) o en el ácido acético. El disolvente a usar depende de la naturaleza del ácido graso y del índice de injerto. Cuando se desea reticular este colágeno en disolución, el agente reticulante se añade en disolución acuosa a la disolución de colágeno injertado.

El colágeno injertado según la invención puede ser reticulado o no, en particular para la realización de materiales con propiedades anti-adhesivas frente a las células vivas. Esta reticulación puede tener lugar mediante los agentes reticulantes habituales (formaldehído, glutaraldehído, etc.) en particular unos agentes reactivos mono, bi o polifuncionales y particularmente por los polisacáridos ramificados oxidados (glicógeno oxidado y/o amilopectina oxidada por ejemplo).

En el caso de las reticulaciones por los polisacáridos oxidados, la reticulación de los colágenos injertados se obtiene mediante la reacción de los grupos aldehídos del glicógeno oxidado o de amilopectinas oxidadas con las aminas de los residuos lisina que permanecen después del injerto sobre el colágeno. Modificando la relación CHO del polisacárido/NH2 del colágeno de 0,1 a 6, se pueden obtener unos índices de reticulación diferentes. La reticulación tiene lugar mediante incubación del material obtenido por mezcla del colágeno injertado y del polisacárido oxidado a pH 9, y después la reducción de los grupos aldehídos restantes y de los enlaces iminas formados por un reductor (borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio, por ejemplo).

El procedimiento permite obtener de manera fácil un material hidrófobo que presenta unas propiedades anti-adhesivas, y fácilmente moldeable en una forma apropiada según la utilización que se hará de éste. Además, la elección de los ácidos grasos usados y su proporción permitirán modular las propiedades anti-adhesivas de este producto. Así, se ha informado en la bibliografía que la actividad inhibidora de los ácidos grasos libres sobre el crecimiento es más marcada para el ácido esteárico [18-20] que para los ácidos mirísticos y palmíticos [16, 17].

Después de la verificación de la ausencia de toxicidad indirecta de los colágenos injertados, el estudio de su actividad sobre la adhesión y el crecimiento celular se ha realizado en la línea continua fibroblástica MRC5. La actividad inhibidora sobre el crecimiento, descubierta para los ácidos grasos solos se encuentra para los colágenos injertados en los que los ácidos grasos no son libres. Esta actividad es asimismo más marcada para el ácido esteárico (85% de inhibición) que para los ácidos palmíticos y mirísticos (65% de inhibición). Esta acción inhibidora del crecimiento celular se expresa en cuanto el índice de injerto alcanza 1% y sea cual sea el ácido graso. En lo que se refiere a la inhibición de la adhesión, una actividad inhibidora se observa asimismo en cuanto se alcanza un índice de injerto de 1% y sea cual sea el ácido graso, y alcanza un máximo para un índice comprendido entre 20 y 30%.

La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica o cosmética que comprende colágeno hidrófobo injertado según la invención tal como el definido anteriormente y a continuación, en particular una composición anti-adhesiva.

El colágeno injertado según la invención, sea cual sea el ácido graso y el índice de injerto, se puede conformar para proporcionar unos polvos, unas disoluciones, unos geles reticulados o no, unas esponjas, unos gránulos, unas películas, o unos hilos.

La presente invención se refiere asimismo a un material anti-adhesivo que comprende colágeno hidrófobo injertado según la invención tal como el definido anteriormente y a continuación.

La composición de estas composiciones, formas o materiales puede estar comprendida entre 0,1 y 100% en colágeno injertado. Se pueden realizar unas mezclas del colágeno injertado con otros biopolímeros tales como colágeno, atelocolágeno, gelatina, glicosaminoglicanos, colágenos injertados con el mismo ácido graso pero con un índice de injerto diferente, colágenos injertados con unos ácidos grasos diferentes, para proporcionar unos productos que presentan unas propiedades físico-químicas y biológicas variadas.

En el caso de una confección de un material reticulado o no a partir de los colágenos injertados, se puede añadir un plastificante hasta 10% de la materia seca. El plastificante es preferentemente glicerol, pero se pueden utilizar asimismo otros productos tales como el ácido láctico.

El colágeno injertado según la invención, usado solo o en mezcla permitirá en particular:

-confeccionar unos materiales compuestos en su totalidad o en parte por un colágeno modificado mediante injerto covalente de ácido graso;

-confeccionar unos materiales, esponjas, geles, hilos, gránulos o películas transparentes, de colágeno injertado reticulado por unos agentes de reticulación clásicos tales como el glutaraldehído y el formaldehído;

-confeccionar unos materiales, esponjas, geles, hilos, gránulos o películas transparentes, de colágeno injertado reticulado por unos polisacáridos oxidados;

-confeccionar unas películas de un grosor comprendido entre 20 y 200 µm;

-confeccionar unas películas bicapas reticuladas de las que una capa está compuesta por colágeno, sea cual sea su nivel de estructuración no modificado y reticulado y de la que la otra capa está compuesta por colágeno injertado o por una mezcla de colágeno injertado y no injertado, pudiendo estar reticulado asimismo el colágeno injertado;

-confeccionar unos materiales compuestos, compuestos por una cara constituida por una esponja de colágeno injertado o no y por una cara constituida por una película de colágeno injertado o por una mezcla de colágeno injertado y no injertado;

-: confeccionar unos adhesión celular; materiales biocompatibles, no citotóxicos que reducen la

-: confeccionar unos materiales compuestos, constituidos por un entramado de polímeros inertes (poliéster, poliuretano, por ejemplo) impregnados de una capa porosa o no de colágeno injertado o de una mezcla de colágeno injertado o no injertado.

Dicho colágeno modificado mediante injerto de ácido graso se puede utilizar en la

confección de cualquier biomaterial en el que se desea la reducción de la adhesión celular, y muy particularmente en la confección de materiales que previenen las adherencias posquirúrgicas, de prótesis vasculares o de lentes intraoculares por ejemplo.

La presente invención se refiere por lo tanto muy particularmente a la utilización de los colágenos injertados o de una mezcla de colágeno injertado y no injertado para el conformado de un material que previene las adherencias posoperatorias. Se podrá así utilizar el colágeno injertado según la invención solo o en mezcla con otros colágenos y en particular unos colágenos injertados para la fabricación de películas mono o bicapas. Se refiere asimismo a la asociación de colágeno injertado o de una mezcla de colágeno injertado y no injertado con unos materiales existentes tales como unos entramados de polímero por ejemplo para el refuerzo de la pared abdominal. Se podrá utilizar el colágeno según la invención, solo o en mezcla, para la impregnación de dichos materiales.

La presente invención se refiere asimismo a las películas mono o bicapas así obtenidas para la impregnación de los entramados con el colágeno según la invención.

La presente invención se refiere por lo tanto asimismo a una prótesis quirúrgica, en particular una prótesis vascular, que comprende un material anti-adhesivo tal como el definido anteriormente y a continuación. Se refiere asimismo a una lente intraocular que comprende dicho material anti-adhesivo.

El presente documento se refiere por último a la utilización en terapia del colágeno hidrófobo tal como el definido anteriormente y a continuación.

Los ejemplos de realización siguientes permiten ilustrar la invención. Salvo que se especifique lo contrario, las informaciones relativas a la realización de los ejemplos siguientes, en particular las informaciones que se refieren a la realización de los procedimientos de preparación de los colágenos injertados según la invención pueden extenderse al conjunto de los colágenos injertados definidos anteriormente.

El colágeno desnaturalizado puesto en reacción para el injerto se extrae según un procedimiento descrito anteriormente [21] y se extrae preferentemente de un tejido porcino. Durante la purificación, el colágeno puede ser tratado con una disolución de hidróxido de sodio 1M a 20ºC durante 1h sin modificación detectable de su estructura química y de sus propiedades biológicas. Este tratamiento se recomienda para destruir los agentes patógenos convencionales y no convencionales [22].

El agente reticulante y más particularmente el glicógeno oxidado o la amilopectina oxidada se obtiene mediante la oxidación periódica del polisacárido en medio acuoso según Abdel-Akher et al. [23] modificado por Rousseau et al. [21]. La determinación del grado de oxidación se lleva a cabo inspirándose en el método Zhao et al. [24].

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EJEMPLO 1: Preparación de estearoilo imidazolida cristalizado

Para la preparación de aproximadamente 2,4 g de estearoilo imidazolida, se disuelven 2 g de ácido esteárico en 12 ml de dimetilformamida anhidra en caliente (40ºC). 10 Siendo la reacción estequiométrica, se prevé añadir la cantidad de carbonildiimidazol correspondiente con 5% de exceso, en este caso 1,34 g. Prácticamente, la primera mitad de la cantidad de CDI se añade a la disolución. Los cristales de estearoilo imidazolida se precipitan. Son solubles en caliente (40ºC). Después de la redisolución, se añade el resto de CDI. Después de 2 horas a temperatura ambiente, la precipitación de los cristales de

15 estearoilo imidazolida se obtiene manteniendo el medio de reacción a 0ºC durante 3 horas. El precipitado se recoge mediante filtración, y después se lava mediante 24 ml de DMF frío y 12 ml de etanol, y se seca. La molécula obtenida presenta un peso molecular de 334,5 g/mol. Su fórmula química es la siguiente:

imagen1

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EJEMPLO 2: Activación del ácido graso por la N-hidroxisuccinimida

25 Disolución del ácido graso a 10-20% en dioxano a 20ºC, y después disolución de N-hidroxisuccinimida (1,3 eq/eq de ácido graso) y adición de la ciclohexilcarbodiimida (0,98 eq/eq de ácido graso). Después de 2 a 3 horas de reacción a 20ºC, la urea formada por la reacción se elimina mediante filtración y el filtrado se evapora para dar un éster activado que se vuelve a cristalizar en el DMF.

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EJEMPLO 3: Injerto del ácido graso activado sobre el colágeno desnaturalizado: ejemplo del injerto de la miristoilimidazolida cristalina sobre el atelocolágeno desnaturalizado, índice de injerto teórico 20%

35 Se ponen en disolución 5 g de atelocolágeno anhidro que contiene 1,6 mmoles de residuos lisina en 50 ml de DMSO anhidro a 60ºC. Se añaden a la disolución de colágeno 0,322 mmoles (99 mg) de miristoilimidazolida (PM 306,5 g/mol) que corresponden a 20% de las lisinas del colágeno puesto en reacción, y la mezcla se calienta a 60ºC hasta la

40 disolución de los cristales de ácido graso activado. Se añaden 6 mmoles de trietilamina con el fin de desprotonar las funciones épsilon aminas de las lisinas, y el medio se agita a 20ºC durante 16 horas. Al final de la reacción, el medio de reacción se dializa contra agua hasta la eliminación total de la trietilamina y DMSO. El gel formado durante la diálisis se funde a 60ºC y la disolución obtenida se deshidrata bajo flujo de aire seco para

45 proporcionar unas películas. Éstas se pueden lavar mediante acetato de etilo para extraer los ácidos grasos activados o no que no hubieran reaccionado. El rendimiento está comprendido entre 90 y 99%. El índice de injerto se determina mediante la dosificación de las aminas épsilon lisinas restantes.

Los geles formados durante la diálisis pueden ser asimismo triturados en 3 volúmenes de acetona seca: el colágeno injertado se obtiene entonces en forma de polvo.

EJEMPLO 4: Injerto del ácido graso activado sobre el colágeno desnaturalizado: ejemplo del injerto de la palmitoilimidazolida sin aislamiento de la imidazolida sobre el atelocolágeno desnaturalizado, índice de injerto teórico 40%

Se disponen en disolución 10 g de atelocolágeno que contiene 3,2 mmoles de residuos lisinas en 100 ml de DMSO anhidro a 60ºC. Se disuelven 450 mg de ácido palmítico en DMSO anhidro al 1,7% en caliente a 60ºC. Se añaden 1,4 mmoles de CDI a la disolución de ácido graso. La reacción de activación se realiza durante 2 horas. Los cristales de pamitoilimidazolida (320,5 g/mol) se solubilizan a 60ºC y el volumen correspondiente a 1,28 mmoles de palmitoilimidazolida se añade a la disolución de colágeno. La disolución se calienta a 60ºC hasta la disolución de los cristales de ácido graso activados. Se añaden 12 mmoles de trietilamina con el fin de desprotonar las funciones épsilon aminas de las lisinas y el medio se agita a 20ºC durante 16 horas. Al final de la reacción, el medio de reacción se dializa contra agua hasta la eliminación total de la trietilamina y del DMSO. El gel formado durante la diálisis se funde a 60ºC y la disolución obtenida se deshidrata bajo flujo de aire seco para proporcionar unas películas. Éstas se pueden lavar mediante acetato de etilo para extraer los ácidos grasos activados

o no que no hubieran reaccionado. El rendimiento está comprendido entre 90 y 99%. El índice de injerto se determina mediante la dosificación de las aminas épsilon lisinas restantes.

Los geles formados durante la diálisis pueden ser asimismo triturados en 3 volúmenes de acetona seca: el colágeno injertado está entonces en forma de polvo.

EJEMPLO 5: Solubilización de los colágenos injertados con unos índices variables de ácidos esteárico, mirístico y palmítico

Todos los colágenos desnaturalizados injertados con el ácido esteárico, palmítico y mirístico (con la excepción de los índices de injerto superiores a 98%) son solubles en caliente (60ºC) en una mezcla agua/etanol (75:25). Para la preparación de disoluciones de 1 a 2%, el colágeno se disuelve en 50% del volumen final en una mezcla agua/etanol (50:50). La mezcla se calienta a 60ºC. Una vez el colágeno disuelto, el medio se diluye al 1/2 mediante agua.

Para los colágenos desnaturalizados injertados con un índice de 98% de ácidos grasos, la disolución es posible sólo en ácido acético puro.

Por el contrario, para unos injertos inferiores o iguales a 30%, los colágenos desnaturalizados son hidrosolubles.

EJEMPLO 6: Preparación de materiales a base de atelocolágeno desnaturalizado injertado por un ácido graso. Ejemplo de reticulación del atelocolágeno por el glicógeno oxidado

a) Ejemplo de confección de una película en unas placas de cultivo para ensayos de adhesión:

Se prepara una disolución mezclando unas disoluciones de colágeno injertado en una concentración comprendida entre 1 y 2% en una mezcla agua/etanol (25/75) con glicógeno oxidado con 0,8 moles de CHO/mol de sacárido para obtener un ratio de 2 CHO del glicógeno oxidado/1 NH2 del colágeno [21]. La disolución de colágeno se obtiene mediante calentamiento a 60ºC hasta la disolución del colágeno injertado. Después del enfriamiento, se añade la disolución de glicógeno oxidado, y después se añade el glicerol a razón de 10% con respecto a la materia seca. Se vierten 1,5 ml de la disolución final obtenida en el fondo de los pocillos de la placa de cultivo de 6 pocillos. La disolución se evapora bajo flujo de aire controlado según los procedimientos habituales bien conocidos de realización de las películas. La reticulación se obtiene mediante la inmersión de las películas en un baño de tampón carbonato de sodio 0,1M pH 9. Las películas se lavan con agua destilada, se sumergen en una disolución reductora de borohidruro de sodio a 400 mg/l, se lavan con agua destilada, se sumergen en PBS y después se secan bajo flujo de aire controlado.

b) Ejemplo de confección de películas de colágeno injertado al 20% mediante ácido esteárico y reticulado mediante glicógeno oxidado según el ratio 0,4 moles CHO/mol de NH2:

Para obtener películas de 12 cm por 12 cm, de 45 µm de grosor, se realiza una disolución acuosa al 1,75% de colágeno injertado al 20% mediante ácido esteárico. Después del enfriamiento, el glicógeno oxidado se añade a razón de 0,4 CHO/NH2 en disolución. El glicerol se añade después. La disolución final se vierte en cajas de poliestireno de 144 cm2. La disolución, después de la gelificación, se evapora bajo flujo de aire controlado. Una vez secas, las películas se sumergen en tampón carbonato 0,1 M pH 9 durante 45 minutos, se lavan con agua destilada, se reducen mediante una disolución de borohidruro de sodio a 400 mg/l, se lavan con agua destilada, se sumergen en PBS y después se secan bajo un flujo de aire controlado. Estas películas pueden ser esterilizadas mediante radiación beta o gamma.

EJEMPLO 7: Ejemplo de confección de películas de colágeno injertado al 30% mediante ácido esteárico y reticulado mediante glutaraldehído

Para la obtención de películas de 12 cm por 12 cm, de 45 µm de grosor, se realiza una disolución acuosa al 1,75% de colágeno injertado al 30% mediante ácido esteárico. El glicerol se añade a razón de 10% de la materia seca de colágeno. La disolución final se vierte en cajas de poliestireno de 144 cm2. La disolución, después de la gelificación, se evapora bajo flujo de aire controlado. La película seca se sumerge entonces en una disolución de glutaraldehído al 0,5% durante 18 horas a pH 7, después una disolución de Tris, aclarado en PBS y después secado. Esta película puede ser esterilizada mediante radiación beta o gamma.

EJEMPLO 8: Fabricación de una esponja liofilizada de colágeno injertado con ácido palmítico al 13%

Una disolución acuosa de colágeno injertado mediante 8% de ácidos palmíticos en concentración de 1 a 2% en agua se obtiene mediante calentamiento a 60ºC durante 1 hora. La disolución se vierte a continuación en una bandeja metálica y se congela a -70ºC. Después de 48 horas de liofilización, se obtienen unas esponjas. La porosidad media depende de la concentración en colágeno y de la temperatura de congelación.

EJEMPLO 9: Aplicación del colágeno injertado a la confección de biomateriales implantables

a) estudio in vitro de citotoxicidad:

Unas muestras de películas de colágenos injertados mediante unos ácidos grasos tales como el ácido esteárico, palmítico y mirístico reticulados son ensayadas en lo que se refiere a su citotoxicidad frente a unos fibroblastos. No se observa ninguna citotoxicidad indirecta, sea cual sea el índice de injerto de los diferentes ácidos grasos.

b) estudio in vitro de crecimiento celular:

Unas muestras de películas de colágenos injertados por unos ácidos grasos tales como el ácido esteárico, palmítico y mirístico reticulados son ensayadas en lo que se refiere al crecimiento de los fibroblastos a su contacto. Después de 5 días de crecimiento celular, en contacto con las películas, las células se sueltan mediante tripsina, y se mide la viabilidad celular mediante reacción con MTT.

Para las películas realizadas con unos colágenos injertados con ácido palmítico y mirístico, sea cual sea el índice de injerto, el crecimiento celular ha disminuido como media aproximadamente 65%.

Para las películas realizadas con unos colágenos injertados con ácido esteárico, sea cual sea el índice de injerto, el crecimiento celular ha disminuido como media aproximadamente 85%.

c) estudio in vitro de adhesión celular:

Unas muestras de películas de colágenos injertados por unos ácidos grasos tales como el ácido esteárico, palmítico y mirístico reticulados son ensayadas en lo que se refiere a la adhesión de los fibroblastos a su contacto. Se han realizado unas cinéticas de separación con tripsina. En cada extracto, la viabilidad celular se mide mediante reacción con el MTT.

Sea cual sea el índice de injerto y el ácido graso injertado, la adhesión celular ha disminuido. Un máximo de disminución de la adhesión celular se observa alrededor de 25 a 30% de índice de injerto.

d) estudio in vivo de biodegradación:

Unas muestras de películas de colágenos injertados por unos ácidos grasos tales como el ácido esteárico, palmítico y mirístico reticulados son implantadas en posición subcutánea en el ratón.

Se estudia la biodegradación de los materiales en función del índice de reticulación. Unos estudios histológicos permiten caracterizar la reacción del hospedante.

Sea cual sea el índice de reticulación y de injerto, no se observa ninguna reacción patológica. La movilización de las células del sistema inmunitario es normal. No se observa ningún coque fibroso alrededor del implante.

e) estudio in vivo de inmunogenicidad:

Se ha realizado un protocolo de inmunización de conejos con un triturado de colágeno injertado al 26% con ácido esteárico.

Después de 90 días de inmunización, no se ha demostrado ninguna producción de anticuerpos dirigidos contra el colágeno injertado.

EJEMPLO 10: Injerto del ácido esteárico sobre atelocolágeno no desnaturalizado

a) en metanol

A una disolución homogénea de 500 mg de atelocolágeno (0,16 mmoles de lisina) en 30 ml de metanol anhidro, se añade una disolución de estearoilimidazol (100 mg, 0,3 mmoles) en 5 ml de dioxano que contiene 150 µl de trietilamina (1,1 mmoles). El gel obtenido se dispersa finamente y la suspensión se agita durante 24h a 20ºC. El precipitado se centrifuga y se lava mediante acetona y después se seca a presión reducida.

b) en DMF

A una suspensión de 1 g (0,32 mmoles de lisina) de colágeno en polvo fino en 20 ml de DMF se añaden 20 ml de dioxano que contiene 200 mg (0,6 mmoles) de esteroilimidazol y 300 µl de trietilamina (2,2 mmoles). Después de 48h de reacción a 30ºC, el colágeno se recoge mediante filtración, se lava mediante acetona anhidra y se seca a presión reducida.

REFERENCIAS:

1.: Myles, J.L., B.T. Burgess, y R.B. Dickinson, Modification of the adhesive properties of collagen by covalent grafting with RGD peptides. J Biomater Sci Polym Ed, 2000. 11(1): p. 69-86.

2.: Park, J.C., et al., Type I atelocollagen grafting onto ozone-treated polyurethane

films: cell attachment, proliferation, and collagen synthesis. J Biomed Mater Res, 2000. 52(4): p. 669-77.

3.: Lee, J.H., et al., Interaction of cells on chargeable functional group gradient surfaces. Biomaterials, 1997. 18(4): p. 351-8.

4.: Sugimoto, Y., Effect on the adhesion and locomotion of mouse fibroblasts by their interacting with differently charged substrates. A quantitative study by ultrastructural method. Exp Cell Res, 1981. 135(1): p. 39-45.

5.: Marois, Y., M.F. Sigot-Luizard, y R. Guidoin, Endothelial cell behavior on vascular prosthetic grafts: effect of polymer chemistry, surface structure, and surface treatment. Asaio J, 1999. 45(4): p. 272-80.

6.: Lampin, M., et al., Correlation between substratum roughness and wettability, cell adhesion, and cell migration. JBiomed Mater Res, 1997.36(1): p. 99-108.

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8.: Massia, S.P. y J.A. Hubbell, Human endothelial cell interactions with surfacecoupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J Biomed Mater Res, 1991. 25 (2): p. 223-42.

9.: Miyata, T., et al., A biodegradable antiadhesion collagen membrane with slow release heparin. ASAIO Trans, 1988. 34(3): p. 687-91.

10.: Duncan, G., et al., Thapsigargin-coated intraocular lenses inhibit human lens cell growth. Nat Med, 1997. 3(9): p. 1026-8.

11.: Tziampazis, E., J. Kohn, y P.V. Moghe, PEG-variant biomaterials as selectively adhesive protein templates: model surfaces for controlled cell adhesion and migration. Biomaterials, 2000.21(5): p. 511-20.

12.: DeFife, K.M., et al., Effects of photochemically immobilized polymer coatings on protein adsorption, cell adhesion, and the foreign body reaction to silicone rubber. J Biomed Mater Res, 1999. 44(3): p. 298-307.

13.: Werner, L., et al., Evaluation of teflon-coated intraocular lenses in an organ culture method JBiomed Mater Res, 1999. 46(3): p. 347-54.

14.: Altankov, G. y T. Groth, Fibronectin matrix formation by human fibroblasts on surfaces varying in wettability. J Biomater Sci Polym Ed, 1996. 8(4): p. 299-310.

15.: Kakade, M.L. y I.E. Liener, Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem, 1969. 27 (2): p. 273-80.

16.: Legrand, P. y V. Rioux, De l'acide myristique à la myristoylation des protéines. CERIN Cholé-doc, 2000. n°59.

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21.: Rousseau, C.F. y C.H. Gagnieu, In vitro cyto-compatibility of porcine type I atelocollagen crosslinked by oxidized glycogen. Biomaterials, 2002. 23(6): p. 1503

10.

22.: Dormont, D., [Nature and physicochemical and biological properties of non conventional transmissible agents or prions: consequences for public health]. Pathol Biol (Paris), 1995. 43(2): p. 124-36.

23.: Abdel-Akher, M. y F. Smith, Reduction of the products of periodate oxidation of carbohydrates. VII. the constitution of glycogen. Arch Biochem Bio. phys, 1958. 78(2): p. 451-9.

24.: Zhao, H. y N.D. Heindel, Détermination of degree of substitution of formyl groups in polyaldehyde dextran by the hydroxylamine hydrochloride method Pharm Res, 1991. 8(3): p. 400-2.

Claims

Reivindicaciones

1.

Colágeno hidrófobo injertado que comprende unos ácidos grasos injertados sobre el colágeno mediante enlace covalente, para su utilización en terapia.
2.

Colágeno hidrófobo injertado según la reivindicación 1, caracterizado porque los ácidos grasos son injertados sobre los residuos aminas libre de la cadena alfa del colágeno.
3.

Colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el porcentaje de ácidos grasos con respecto a los residuos aminados libres de la cadena alfa del colágeno está comprendido entre 1 y 100%, preferentemente es superior a aproximadamente 10% e inferior a aproximadamente 85%.
4.

Colágeno hidrófobo injertado según la reivindicación 3, caracterizado porque el porcentaje de ácidos grasos está comprendido entre 15 y 50%, más preferentemente comprendido entre 20 y 30%.
5.

Colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los ácidos grasos se seleccionan de entre los ácidos esteárico, palmítico y mirístico, y sus mezclas en cualquier proporción.
6.

Colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el colágeno se selecciona de entre el colágeno nativo, el atelocolágeno nativo, el colágeno o el atelocolágeno desnaturalizado o gelatina.
7.

Colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el colágeno injertado está reticulado.
8.

Colágeno hidrófobo injertado según la reivindicación 7, caracterizado porque el colágeno injertado está reticulado mediante unos polisacáridos ramificados oxidados, seleccionados en particular de entre el glicógeno oxidado y las amilopectinas oxidadas.
9.

Colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización en la reducción de la adhesión celular.
10.

Colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en la prevención de las adherencias posoperatorias.
11.

Utilización de un colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8, para conferir una propiedad anti-adhesiva a un material, comprendiendo dicho material el colágeno hidrófobo injertado solo o en mezcla.
12.

Prótesis quirúrgica, en particular prótesis vascular, que comprende un material anti-adhesivo, comprendiendo dicho material anti-adhesivo un colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8.
13.

Lente intraocular, que comprende un material anti-adhesivo, comprendiendo dicho material anti-adhesivo colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8.
14.

Película mono o bicapa que comprende un material anti-adhesivo, comprendiendo dicho material anti-adhesivo colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8.
15.

Entramado para el refuerzo de las paredes abdominales, caracterizado porque está impregnado por un material anti-adhesivo, comprendiendo dicho material antiadhesivo colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8.
16.

Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende colágeno hidrófobo injertado según una de las reivindicaciones 1 a 8.