KR101282394B1 - 콜라겐에 대한 소수성 물질의 공유 그래프팅법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소수성 그래프트된 콜라겐, 그의 제조 방법, 및 특히 치료 요법에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 소수성 물질 또는 분자는 공유 결합에 의하여 콜라겐 분자의 반응성 아미노산 잔기에 그래프트된다. 화학 결합은 콜라겐 및/또는 그의 유도체의 이화학적 및 생물학적 성질을 개질시킨다. 특히, 소수성 잔기들을 도입하면 콜라겐의 친수성 성질을 개질시키고 세포 유착과 성장에 관련된 화학주성(化學走性) 특성을 개질시킬 수 있게 된다.
소수성, 콜라겐, 그래프트
Description
본 발명은 소수성 그래프트된 콜라겐, 그의 제조 방법, 및 특히 치료 요법에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 소수성 물질 또는 분자는 공유 결합에 의하여 콜라겐 분자의 반응성 아미노산 잔기에 그래프트된다. 이 화학 결합은 콜라겐 및/또는 그의 유도체의 이화학적 및 생물학적 성질을 개질시킨다. 특히, 소수성 잔기들을 도입하면 콜라겐의 친수성을 조절하여 세포 유착과 증식에 관련된 화학주성(化學走性) 특성을 개질시킬 수 있게 된다.
종래 기술에 있어서, 세포 유착을 증가시키기 위하여 콜라겐에 유착 펩티드를 그래프트시키는 것 이외에, 콜라겐에 그래프트시키는 것은 거의 없거나 전무하다. 이 경우 그래프팅법은 특별한 화학 공정을 사용하여 이루어진다 [1]. 또한, 어떤 이는 생성물 및 응용에 매우 특정한 공정을 사용하여 폴리우레탄과 같은 불활성 물질에의 콜라겐 그래프팅법을 개시한다 [2]. 또한, 콜라겐과 지방산의 혼합물은 존재하지만, 콜라겐에의 지방산의, 특히 공유 결합에 의한 그래프팅법은 문헌상에 보고된 바 없다.
콜라겐 분자는 그 구조에 있어서 1개 이상의 삼중 나선 도메인을 가지는, 세포외 기질 내에 위치하는 동물성 단백질이다. 이 삼중 나선은 각각이 1050개의 아미노산으로 구성된 알파 사슬 3개에 의하여 만들어진다. 사슬의 끝부분에서, 40개 아미노산 주위의 비나선형 부분은 콜라겐 섬유들이 서로 결합되도록 할 수 있다. 이들이 텔로펩티드이다. 이들 단백질은 글리신 함량 (33%)이 높고, 대략 30% 프롤린 및 히드록시프롤린이 존재하는데 특징이 있다.
생체 적합 물질을 가공, 생산하기 위하여, 공지된 방법으로 몇가지 타입의 다른 구조적 레벨의 콜라겐을 공급원 조직으로부터 추출한다:
● 콜라겐은 그 조직 (삼중 나선 및 텔로펩티드) 내에서 나타나는 전 구조가 추출시 보존될 때 천연이라고 말하여진다.
● 콜라겐은 텔로펩티드에서 효소적으로 또는 화학적으로 분해될 수 있고: 그때 콜라겐은 아텔로콜라겐으로 불리운다.
● 삼중 나선의 알파 사슬 3개가 개질에 의하여 (예컨대, 가열에 의하여) 분리될 때, 콜라겐은 변성된다고 말하여진다.
● 젤라틴에 관하여, 이것은 콜라겐의 변성 및 알파 사슬의 펩티드 단편으로의 가수분해 (화학적 또는 열적)에 특징이 있다.
콜라겐의 다른 타입은 명시되어 왔고, 일부는 분리되어 산업적으로 생산되어 왔다 (필수적으로 타입 I 및 타입 IV).
콜라겐은 다양한 이화학적 및 생물학적 성질을 가지고 있어서 생체 적합 물질 생산을 위한 선택 물질이 된다. 예컨대, 그것은 특정한 유동학적 성질, 낮은 항원성을 가지고, 세포 증식 및 분화에서 역할을 담당하며, 강한 지혈 성질을 가진다. 다양한 의학의 분야, 특히 수술에 있어서, 생체 적합 물질은 매우 자주 사용된다. 일반적으로, 세포 유착 및 통합을 달성하는데 좋다. 그러나, 근래에는 세포 유착을 감소시키는 물질의 개발이 강조되어 왔다. 수술 후 본래 결과인 유착에 더하여 생체 적합 물질에의 수술 후 유착 현상이 일어날 수 있다. 유착 현상을 감소시키거나 제거시킬 수 있도록 하는 시스템을 개발시키기 위하여 수많은 연구가 진행 중이다.
종래 기술에 있어서, 생체 적합 물질에의 세포 유착은 이들 물질의 표면 성질을 개질시킴으로써 감소될 수 있다. 표면 전하, 거칠기, 어떤 화학 구조의 노출 및 소수성은 세포 유착을 조절하는데 중요한 요인이다. 음으로 대전된 표면은 역시 음으로 대전된 세포의 반발을 유도하고 [3,4], 세포 유착을 감소시키는 결과는 낳는다. 물질 (substrate)의 거칠기는 또한 중요한 역할을 하는데, 이는 부드러운 표면이 유착을 예방하기 때문이다 [5,6]. 세포 유착은 또한 물질과 세포의 상호 작용 중에 일어나는 분자 수준의 사건에 직접적인 영향을 미치는 화학적 또는 생화학 구조의 그래프팅에 의하여 제어될 수 있다.
그러므로, 세포 유착은, 콜라겐 [7], 히드록시아파타이트 [5], 폴리라이신 [4], 히드록실화된 중합체 또는 유착 표면 펩티드 [8]과 같이 그들의 유착 증진 성질로 알려진 물질의 불활성 표면에의 그래프팅에 의하여 증가될 수 있다.
간단하게, 세포 유착을 감소시키는데는 3개의 주요한 전략이 있다:
● 세포 유착에 필요한 세포 재조직화에 직접적으로 영향을 미치는 헤파린 또는 탑시가르긴 (thapsigargin)과 같이 유착 방지 성질을 가진 생활성 분자의 불활성 중합체에의 그래프팅 [9,10],
● 테프론 [11], 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리아크릴아마이드 [12]과 같은 소수성 물질의, 가장 일반적으로는 PMMA에의 그래프팅,
● 어떠한 수단을 사용하여 표면 소수성의 개질, 이는 소수성을 증가시키는 합성 중합체가 세포 유착의 감소를 유도하는 것을 보여주기 때문이다 [3,6,13,14].
콜라겐은 그 유착 증진 성질로 인하여 알려지고 사용되지만, 본 발명의 주요한 물질은 유착 방지 성질을 가지고, 출발 콜라겐 만큼 생체 친화성이 있고 세포 유착 및 증식에 관한 그 영향을 제외한 콜라겐의 다른 생물학적 및 유동학적 성질의 필수 부분을 포함하는 소수성 콜라겐을 함유하는 신규한 생성물이다. 그래프트된 소수성 물질은 좋기로는 포화 또는 불포화 지방산이다. 이러한 그래프팅에 사용되는 지방산의 선택에 의하여, 본 발명의 그래프트된 콜라겐은 병리 반응 없이 인간 신체에 의하여 완전히 인식되는 물질로 분해된다.
그러므로, 본 발명은 공유 결합에 의하여 콜라겐에 그래프트된 지방산을 포함하는 그래프트된 소수성 콜라겐에 관한 것이다. 좋기로는, 지방산은 콜라겐 알파 사슬의 유리 아민 잔기, 특히 콜라겐 알파 사슬의 라이실 잔기의 유리 아민에 그래프트된다.
콜라겐 알파 사슬의 유리 아민 잔기에 대하여 상대적인 지방산의 백분율은, 1 내지 100 %이고, 좋기로는 10 % 전후 보다 높고 85 % 전후 보다 낮다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시 상태에 따르면, 지방산의 백분율은 15 내지 50 %이고, 더욱 좋기로는 20 내지 30 %이다.
본 발명의 그래프트된 콜라겐은 어떤 기원의 콜라겐, 특히 천연 콜라겐, 천연 또는 변성 아텔로콜라겐, 또는 젤라틴이다. 바람직하게는, 그래프트된 콜라겐은 포유 동물 기원의, 좋기로는 돼지 기원의 콜라겐이고, 이는 적절한 예방 치료를 유리하게 받아 병원체를 파괴시킨 것이다.
본 발명은 또한 위에서 및 아래에서 정의되는 바와 같이, 그래프트된 소수성 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이고, 여기서 적당량의 활성화 지방산은 적절한 반응 매질 내에서 콜라겐과의 반응을 일으킨다.
그래프팅 방법에 있어서, 지방산의 카르복실 작용기의 활성화는 좋기로는 활성화 에스테르 결합 및 이미다졸리드를 형성함으로서 얻어진다. 활성화 지방산은 콜라겐 알파 사슬의 라이신 엡실론 잔기의 탈프로톤화 아민과 반응한다. 활성화 지방산은 결정화되거나 일시적으로 용해된 상태로 제조될 수 있다.
활성화 지방산은 디메틸포름아마이드 (DMF) 또는 디메틸술폭사이드 (DMSO) 내의 지방산에 카르보닐디이미다졸 (CDI)의 화학량적 반응에 의하여 얻어질 수 있다. 만약 활성화 반응이 DMF 내에서 일어나면, 활성화 생성물은 결정화 및 분리되고 그런 후에 콜라겐 용액에 고체 형태로 가하여져서 그래프트된다. 만약 활성화 지방산이 DMSO 내에서 제조되면, 액상으로 콜라겐에 가하여진다. DMF 내의 활성화 지방산의 제조는 C12 내지 C22의 모든 지방산을 합성하는데 사용될 수 있다. 후자에 관한 것 뿐만 아니라 모든 다른 것에 관하여도, 활성화는 DMSO 내에서 가능하다. 활성화 반응의 수득률은 95 % 보다 크고, 활성화 지방산은 4 ℃에서 18 개월간 저장한 후에도 측정할 수 있을 정도의 활성화 손실을 보이지 않는다. 활성화 지방산 (이미다졸리드)의 화학식은 다음 화학식 I로 나타낼 수 있다:
여기서 R은 지방산의 탄화수소 사슬을 나타낸다.
지방산의 활성화는 또한 디시클로헥실카르보디이미드 또는 디이소프로필카르보디이미드와 같은 카르보디이미드와의 활성화에 의하여 선행되는 지방산에 대한 N-히드록시숙신이미드의 반응에 의하여 달성될 수 있다. 그렇게 분리된 활성화 지방산은 전에 콜라겐에 행하여진 것과 같은 방식으로 그래프트될 수 있다. 활성화 지방산 (숙신이미딜)의 화학식은 다음 화학식 II로 나타낼 수 있다:
여기서 R은 지방산의 탄화수소 사슬을 나타낸다.
본 발명의 방법에 있어서, 일단 활성화된 지방산은 그래프팅 반응을 시키기 전에 반응 매질로부터 분리시키거나 분리시키지 않을 수 있다.
모든 지방산은 상기한 방법을 사용하여 활성화될 수 있고, 본 발명의 소수성 그래프트된 콜라겐 및 그 제조 방법에 사용될 수 있다.
지방산은 당해 발명의 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 지방산은 다양한 길이의 탄화수소 사슬 및 카르복실기 (-COOH)를 포함하는 지방족 카르복실산이다. 탄화수소 사슬은 6개 이상의 탄소 원자, 일반적으로는 6 내지 25개의 탄소 원자, 더욱 좋기로는 10 내지 22개의 탄소 원자를 포함한다. 지방산은 포화 또는 1개 이상의 불포화를 포함하는 불포화 지방산일 수 있다. 그들은 직선형이거나 분지형일 수 있다. 또한, 그들은 1개 이상의 작용기, 특히 1개 이상의 산소, 황 또는 질소 원자를 포함하는 작용기에 의하여, 또는 1개 이상의 할로겐 원자에 의하여 치환될 수 있다. 주요한 직선형 지방산 중에서, 특히 라우르산 (C12), 미리스트산 (C14), 팔미트산 (C16), 스테아르산 (C18), 올레산 (C18, 불포화) 및 리놀레산 (C18, 폴리불포화) 또는 리놀렌산이 언급될 수 있다. 라우르산은 코코유 (45 - 50 %) 및 야자유 (45 - 55 %)의 주요한 성분이다. 너트맥 버터는 그 지방산 함량이 60 - 75 %에 달하는 미리스트산을 고함량으로 함유한다. 팔미트산은 식물성 지방 뿐만 아니라 대부분의 동물성 지방의 20 - 30 %를 형성한다. 스테아르산은 동물성 또는 식물성 지방으로부터 유래된 장사슬 천연 지방산에 매우 일반적이다. 마지막으로 올레산은 매우 풍부한, 천연 불포화 지방산이다.
상기한 지방산은, 본 발명에 따라, 콜라겐에 단독으로 또는 혼합물로서 그래프트될 수 있다.
유리하게도, 지방산은 스테아르산, 팔미트산 및 미리스트산 및 임의의 비율의 이들의 혼합물 중으로부터 선택된다.
지방산의 다양한, 조절가능한 양을 활성화 지방산의 반응에 의하여 단백질의 라이신 잔기에 가한다. 콜라겐 사슬은 이론적으로 30개의 라이신 잔기를 포함한다. 그러므로, 콜라겐 알파 사슬 당 0 내지 30개 분자의 지방산, 즉 0 내지 100 %의 그래프트율로 그래프트시킬 수 있다.
그래프팅은 콜라겐의 어떠한 타입에 대하여도 그 구조에 상관 없이 (천연 콜라겐, 천연 또는 변성 아텔로콜라겐, 또는 젤라틴) 행하여질 수 있다. 그러나, 최대 그래프트율은 고려 하에서 콜라겐의 라이신 함량에 관하여 그리고 특히 비변성 콜라겐에 관하여는, 시약에 대한 라이신 잔기의 접근가능성에 관하여 변할 수 있다. 그래프트된 콜라겐의 구조적 레벨에 관하여, 다른 용매로는 메탄올, 디옥산, DMSO 또는 다른 비율의 용매 혼합물과 같은 것이 사용된다.
비변성 콜라겐에의 그래프팅시, 그래프트율 및 그래프트된 지방산과는 상관 없이, 그래프팅은 좋기로는 메탄올 용액 내 또는 디메틸포름아마이드 (DMF) 현탁액 내의 콜라겐에 이루어진다. 위에서 설명한 바와 같이 전에 활성화되고, 유리하게 결정화된 지방산을 적절한 용매 내 예컨대, a DMF/트리에틸아민 혼합물 내 콜라겐이 있는 용액에 가한다. 반응 후, 그래프트된 콜라겐이 침전되면, 얻어진 침전물을 적절한 용매, 특히 무수 아세톤으로 세척시키며, 통상의 방법 예컨대, 감압 하에서 건조시킨다.
변성 콜라겐에의 그래프팅시, 그래프트율 및 그래프트된 지방산과는 상관 없이, 콜라겐을 감압 하에 밤새도록 건조시키고, 용해시키며, 70 ℃ 디메틸술폭사이드 (DMSO) 내에서 변성시킨다. 바람직한 그래프트율에 관하여, 활성화 지방산을 약염기, 좋기로는 트리에틸아민 또는 이미다졸의 존재하 화학량적 조건 하에서 콜라겐 용액에 가하여 대략 1.2 mEq H+/g 콜라겐을 중화시키고 라이신 잔기의 NH2 작용기을 탈프로톤화시킨다. 용액을 결정화된 활성화 지방산이 용해될 때까지 60 ℃로 가열시킨다. 그래프팅 반응은 실온에서 16 시간 동안 일어난다. 그런 후에 그래프트된 콜라겐 용액을 산 물 pH 2-3에 대하여 투석시켜 DMSO 및 염기를 제거한다. 얻어진 그래프트된 콜라겐 겔을 3 부피 건조 아세톤에서 분쇄시킨 후, 감압 하에 건조시키고; 또는 60 ℃에서 녹이고, 실온에서 건조시키며, 에틸 아세테이트로 세척하여 반응하지 않고 남은 잔여 지방산을 제거시킨다.
각 콜라겐에 관하여, 그래프트율은 출발 콜라겐 내의 유리 아민의 백분율과 그래프트된 콜라겐 내의 유리 아민의 백분율의 차이에 의하여 계산된다. 시험 방법은 Kakade 등 [15]에 의하여 보고된 문헌으로부터 유래된다. 유리 아민의 양은 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산의 반응에 의하여 결정된다.
그래프트된 콜라겐의 가용화는 물 또는 물/에탄올 혼합물 (다른 비율로) 내 또는 아세트산 내에서 이루어진다. 사용된 용매는 지방산 타입 및 그래프트율에 의존한다. 만약 용액 내의 이 콜라겐이 가교되는 것이 바람직하면, 가교제를 수용액에 가하여 그래프트된 콜라겐 용액을 만든다.
본 발명의 그래프트된 콜라겐은 특히 살아있는 세포에 관한 유착 방지 성질을 가진 물질을 제조하기 위하여 가교되거나 가교되지 않을 수 있다. 이러한 가교시 통상의 가교제 (포름알데하이드, 글루타르알데하이드...) 특히 모노-, 바이- 또는 폴리기능성 시약 및 특히 산화된, 분지 다당류 (실시예의 산화 글리코겐 및/또는 산화 아밀로펙틴)를 사용할 수 있다.
산화 다당류로 가교시, 그래프트된 콜라겐의 가교는 산화 글리코겐 또는 산화 아밀로펙틴의 알데하이드 기와 콜라겐에의 그래프트 후 남은 라이신 잔기의 아민의 반응에 의하여 얻어진다. 다당류 CHO/콜라겐 NH2의 비율을 0.1 내지 6으로 개질시킴으로써, 여러 가교율이 얻어질 수 있다. 가교는 pH 9에서 그래프트된 콜라겐과 산화 다당류를 혼합한 후 얻은 물질을 배양한 후, 환원제 (실시예의 소듐 보로하이드라이드 또는 소듐 시아노보로하이드라이드)를 사용하여 남아 있는 알데하이드기 및 형성된 이민 결합을 환원시킴으로써 일어난다.
본 발명의 방법에 있어서, 유착 방지 성질을 가진 소수성 물질을 용이하게 얻을 수 있으며, 이것은 의도된 용도에 따라 적절한 형태로 용이하게 주어질 수 있다. 또한, 사용되는 지방산 및 그 비율의 선택은 이 생성물의 유착 성질을 조절할 수 있도록 한다. 증식에 관한 유리 지방산의 활성화의 억제는 미리스트산 및 팔미트산 [16, 17]보다는 스테아르산 [18 - 20]이 더 크다는 예가 문헌 상에 보고된 바 있다.
그래프트된 콜라겐의 간접적인 독성이 없음을 증명한 후, 세포 유착 및 증식에 관한 그들의 활성화에 대한 연구는 섬유아세포의 MRC5 연속 세포 라인에 대하여 행하여졌다. 지방산 단체에 관하여 확인된 증식에 관한 동일한 억제 활성화는, 지방산이 유리되지 아니한 그래프트된 콜라겐 내에서 발견되었다. 이러한 활성화는 또한 팔미트산 및 미리스트산 (65 % 억제)에 관한 것보다는 스테아르산 (85 % 억제)에 관하여 더 특징적이다. 이러한 세포 성장에 관한 억제 활성화는, 지방산과는 상관 없이, 그래프트율이 1 %에 도달하자마자 표현된다. 유착 억제에 관하여, 억제 활성화는 또한, 지방산과는 상관없이, 1 %의 그래프트율에서 및 그 후에서 관찰되고, 비율이 20 내지 30 % 내에서 변할 때 최대에 도달하였다.
본 발명은 또한 위에서 및 아래에서 정의되는 바와 같은 본 발명에 따른 그래프트된 소수성 콜라겐을 함유하는 의약 또는 화장품 조성물, 특히 유착 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 그래프트된 콜라겐은, 지방산 및 그래프트율과는 상관없이, 형성되어 분말, 용액, 가교이건 아니건 간에 겔, 스폰지, 그래뉼, 필름, 실을 생산하기 위하여 형성될 수 있다.
본 발명은 또한 위에서 및 아래에서 정의되는 바와 같은 본 발명에 따른 그래프트된 소수성 콜라겐을 함유하는 유착 방지 재료에 관한 것이다.
이러한 조성물, 형태 또는 물질의 조성은 0.1 내지 100 % 그래프트된 콜라겐으로 다양하게 변할 수 있다. 그래프트된 콜라겐과 기타 바이오중합체의 혼합물은 다양한 이화학적 및 생물학적 성질을 가진 생성물을 얻도록, 예컨대, 콜라겐, 아텔로콜라겐, 젤라틴, 글리코사미노글리칸, 동일한 지방산으로 다양한 그래프트율로 그래프트된 콜라겐, 다른 지방산으로 그래프트된 콜라겐을 가지고 제조될 수 있다.
그래프트된 콜라겐으로부터, 가교이건 아니건, 물질을 제조시 가소제를 건조 물질 함량의 10 %까지 가할 수 있다. 가소제는 좋기로는 글리콜이지만, 락트산과 같은 다른 물질도 사용될 수 있다.
단독으로 또는 혼합물로 사용되는, 본 발명의 그래프트된 콜라겐은 특히 다 음에 사용될 수 있다:
- 지방산의 공유 그래프팅에 의하여 개질된 콜라겐 전부 또는 일부분을 포한하는 물질의 생산;
- 글루타르알데하이드 및 포름알데하이드와 같은 통상의 가교제를 사용하여 가교시킨 그래프트된 콜라겐의 물질, 스폰지, 겔, 실, 그래뉼 또는 투명 필름의 생산;
- 산화 다당류로 가교시킨 그래프트된 콜라겐의 물질, 스폰지, 겔, 실, 그래뉼 또는 투명 필름의 생산;
- 20 내지 200 μm의 두께를 가지는 필름의 생산;
- 1개 층은 그 비개질, 가교된 구조적 레벨과 상관없이 콜라겐으로 이루어지고, 다른 층은 그래프트된 콜라겐 또는 그래프트된 콜라겐과 비그래프트된 콜라겐의 혼합물로 이루어지는, 가교 이중층 필름의 생산. 그래프트된 콜라겐은 또한 가교될 수 있다;
- 한면은 그래프트된 또는 비그래프트된 콜라겐 스폰지로 이루어지고, 한면은 그래프트된 콜라겐 또는 그래프트된 콜라겐과 비그래프트된 콜라겐의 혼합물의 필름으로 형성되는 조성 물질의 생산;
- 세포 유착을 감소시키는 비세포독성 생체 적합성 물질의 생산;
- 그래프트된 콜라겐 또는 그래프트된 콜라겐과 비그래프트된 콜라겐의 혼합물의 다공성 층 또는 비다공성 층과 함께 함침된 불활성 중합체 (예컨대, 폴리에스테르, 폴리우레탄)의 격자로 이루어지는 조성 물질의 생산.
지방산에 의한 그래프팅으로 개질된 상기 콜라겐은 감소된 세포 유착이 바람직한 어떠한 생체 적합 물질을 생산하는데, 특히 예컨대 유착 방지 물질을 함유하는 혈관 인공 삽입물 또는 인공 수정체의 생산에 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 특히 수술 후 유착을 예방하기 위한 물질을 생산하기 위하여, 그래프트된 콜라겐 또는 그래프트된 콜라겐과 비그래프트된 콜라겐의 혼합물을 사용하는 것에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명의 그래프트된 콜라겐은 단독으로 사용되거나 또는 기타 콜라겐, 특히 그래프트된 콜라겐과의 혼합물로서 사용되어, 단일층 또는 이중층 필름을 생산할 수 있다. 그것은 또한 복벽의 강화를 위하여, 예컨대 중합체 격자와 같이 이미 존재하는 물질과, 그래프트된 콜라겐 또는 그래프트된 콜라겐과 비그래프트된 콜라겐의 혼합물의 조합에 관한 것이다. 본 발명의 콜라겐은 또한 단독으로 사용되거나 혼합물로서 사용되어 그러한 물질을 함침시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 콜라겐과의 격자를 함침시켜 얻은 단일층 또는 이중층 필름에 관한 것이다.
그러므로 본 발명은 또한 위 또는 아래에서 정의되는 것과 같은 유착 방지 재료를 함유하는, 외과용 인공 삽입물, 특히 혈관 인공 삽입물에 관한 것이다. 그것은 또한 본 발명의 상기 유착 방지 재료를 함유하는 인공 수정체에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 위 및 아래에서 정의되는 바와 같은 소수성 콜라겐의 치료적 용도에 관한 것이다.
아래에서 주어지는 구체적 실시 상태의 실시예는 본 발명을 설명한다. 그러 하지 아니하다고 특정되지 아니하는 한, 아래에 주어지는 실시예 수행의 정보, 특히 본 발명에 따라 그래프트된 콜라겐을 제조하는 방법의 수행에 관한 정보는 모든 상기의 정의된 그래프트된 콜라겐에 확장될 수 있다.
그래프팅 반응에 사용되는 변성 콜라겐을 전에 설명한 방법 [21]을 사용하여 추출하고, 좋기로는 돼지 조직으로부터 추출한다. 정제 동안, 콜라겐을 1 시간 동안 20 ℃에서 1M의 소듐 하이드록사이드 용액으로 처리할 수 있는데, 이때 그 화학적 구조 및 생물학적 성질에 있어서의 탐지할 수 있는 개질은 없다. 이 처리는 통상적인 및 비통상적인 병원성 제제를 파괴하는데 추천된다 [22].
가교제, 특히 산화 글리코겐 또는 산화 아밀로펙틴은 Rousseau 등 [21]에 의하여 개질되는 것과 같이 Abdel-Akher 등 [23]에 따라 수용성 매질 내에서 다당류의 과산화에 의하여 얻어진다. 산화 정도의 결정은 Zhao 등 [24]으로부터 시사된 방법을 사용하여 수행된다.
실시예 1: 결정화된 스테아로일 이미다졸리드를 제조
대략 2.4 g의 스테아로일 이미다졸리드를 제조하기 위하여, 열을 가하면서 (40 ℃) 스테아르산 2 g을 무수 디메틸포름아마이드 12 ml에 용해시킨다. 화학량적으로 반응이 일어나도록, 대응 카르보닐디이미다졸 양을 5 % 과량으로, 여기서는 1.34 g을 가한다. 실제에 있어서, CDI 양의 처음 반을 용액에 가한다. 스테아로일 이미다졸리드 결정이 침전된다. 이들은 가열시 (40 ℃) 가용성이다. 재용해 후, CDI 나머지를 가한다. 실온에서 2 시간 후, 반응 매질을 3 시간 동안 0 ℃에서 유 지시킴으로써 스테아로일 이미다졸리드 결정의 침전을 얻는다. 침전을 여과시킨 후 모으고, 그런 후에 차가운 DMF 24 ml 및 에탄올 12 ml로 세척하고, 건조시킨다. 얻어진 분자의 분자량은 334.5 g/mol이다. 그 화학식은 다음과 같다:
[화학식]
실시예 2: N-히드록시숙신이미드로 지방산을 활성화
20 ℃에서 디옥산 내의 10 - 20 % 지방산을 용해, 그런 후 N-히드록시숙신이미드 (1.3 eq/eq 지방산)을 용해시키고 시클로헥실카르보디이미드 (0.98 eq/eq 지방산)을 첨가한다. 20 ℃에서 2 내지 3 시간 동안 반응시킨 후, 반응으로 형성된 우레아를 여과시켜 제거하고, 여과물을 증발시키고 DMF 내에서 재결정화시킨 활성화 에스테르를 얻는다.
실시예 3: 변성 콜라겐에 활성화 지방산을 그래프팅: 변성 아텔로콜라겐에 결정 미리스토일이미다졸리드을 그래프팅한 예, 이론적 그래프트율 20%.
라이신 잔기 1.6 mmol을 함유하는 무수 아텔로콜라겐 5 g을 60 ℃에서 무수 DMSO 50 ml에 용해시킨다. 반응 중인 콜라겐 라이신 20 %에 대응되는 미리스토일이미다졸리드 (분자량 306.5 g/mol) 0.322 mmol (99 mg)을 콜라겐 용액에 가하고, 활성화 지방산 결정이 용해될 때까지 혼합물을 60 ℃로 가열한다. 라이신 엡실론-아민 작용기를 탈프로톤화시키기 위하여 트리에틸아민 6 mmol을 가하고, 매질을 16 시간 동안 20 ℃에서 교반시키면서 둔다. 반응이 완결되면, 트리에틸아민 및 DMSO가 완전히 제거될 때까지 반응 매질을 물에 대하여 투석시킨다. 투석 중에 형성된 겔을 60 ℃에서 녹이고, 얻어진 용액을 건조 공기를 흘려주는 조건 하에서 탈수소화시켜 필름을 만든다. 이것들을 에틸 아세테이트로 세척하고, 반응하지 않은 지방산을 활성화이건 아니건 지방산을 추출한다. 수득률은 90 내지 99 %이다. 그래프트율은 남은 라이신 엡실론-아민 작용기를 분석하여 결정한다.
투석 중에 형성된 겔은 건조 아세톤의 3배 부피가 될 수 있고; 그런 후에 그래프트된 콜라겐을 분말 형태로 얻는다.
실시예 4: 변성 콜라겐에 활성화 지방산을 그래프팅: 이미다졸리드 분리 없이, 변성 아텔로콜라겐에 팔미토일이미다졸리드을 그래프팅한 예; 이론적 그래프트율 40 %.
라이신 잔기 3.2 mmol을 함유하는 아텔로콜라겐 10 g을 60 ℃에서 무수 DMSO 100 ml에 용해시킨다. 팔미트산 450 mg을 60 ℃에서 1.7 % 무수 DMSO에 용해시킨다. CDI 1.4 mmol을 지방산 용액에 가한다. 활성화 반응은 2 시간에 걸쳐 일어난다. 팔미토일이미다졸리드 결정 (320.5 g/mol)은 60 ℃에서 용해되고 팔미토일이미다졸리드 1.28 mmol에 대응하는 부피를 콜라겐 용액에 가한다. 활성화 지방산의 결정이 용해될 때까지 용액을 60 ℃로 가열시킨다. 트리에틸아민 12 mmol을 가하여 라이신 엡실론-아민 작용기을 탈프로톤화시키고, 매질을 16 시간 동안 20 ℃에서 교반시키면서 둔다. 반응이 완결되면, 트리에틸아민 및 DMSO가 완전히 제거될 때까지 반응 매질을 물에 대하여 투석시킨다. 투석 중에 형성된 겔을 60 ℃에서 녹이고, 얻어진 용액을 건조 공기를 흘려주는 조건 하에서 탈수소화시켜 필름을 만든다. 이것들을 에틸 아세테이트로 세척하고, 반응하지 않은 지방산을 활성화이건 아니건 추출한다. 수득률은 90 내지 99 %이다. 그래프트율은 남은 라이신 엡실론-아민 작용기를 분석하여 결정한다.
투석 중에 형성된 겔은 건조 아세톤의 3배 부피가 될 수 있고; 그런 후에 그래프트된 콜라겐을 분말 형태로 얻는다.
실시예 5: 다양한 레벨의 스테아르산, 미리스트산 및 팔미트산으로 그래프트된 콜라겐을 용해
스테아르산, 팔미트산 및 미리스트산으로 그래프트된 모든 변성 콜라겐 (그래프트율이 98 %보다 높은 것은 제외)은 물/에탄올 혼합물 (75:25)에서 열 가용성 (60 ℃)이다. 1 내지 2 % 용액을 제조하기 위하여, 콜라겐을 물/에탄올 혼합물 (50:50)에 최종 부피의 50 %로 용해시킨다. 혼합물을 60 ℃로 가열한다. 일단 콜라겐이 용해되면, 매질을 물로 1/2로 희석시킨다.
98% 지방산 그래프트율을 보이는 변성 콜라겐에 있어서, 용해는 순수한 아세트산에서만 가능하다.
반면, 그래프트율이 30 % 이하인 경우에는 변성 콜라겐은 수용성이다.
실시예 6: 지방산으로 그래프트된 변성 아텔로콜라겐을 함유하는 물질을 제조. 산화 글리코겐으로 아텔로콜라겐을 가교시킨 예.
a) 유착 시험을 위한 배양 접시에서 필름을 제조하는 예:
물/에탄올 혼합물 (25:75) 내에 1 내지 2 % 농도의 그래프트된 콜라겐 용액을 단당류 1 mol 당 CHO가 0.8 mol인 산화글리코겐을 혼합시켜 용액을 제조함으로써 2 CHO 산화 글리코겐/ 1 NH2 비율의 콜라겐 [21)을 얻는다. 그래프트된 콜라겐이 용해될 때까지 60 ℃로 가열시켜 콜라겐 용액을 얻는다. 냉각 후, 산화 글리코겐 용액을 가하고 그런 후에 건조 물질에 대하여 상대적으로 10 %의 비율로 글리코겐을 가한다. 얻어진 최종 용액 1.5 ml을 6 정(well) 배양 접시의 정의 바닥에 붓는다. 용액을 필름 생산에 통상적으로 잘 알려진 방법에 따라 조절된 공기 흐름 하에서 증발시킨다. 가교는 0.1M 소듐 카르보네이트 pH 9의 완충 용액 배스에 필름을 침지시켜 얻는다. 필름을 증류수로 세척하고, 400 mg/L의 소듐 보로하이드라이드 환원 용액에 침지시키며, 증류수로 세척하고, PBS에 침지시킨 후에 조절된 공기 흐름 하에서 건조시킨다.
b) 스테아르산으로 20 % 그래프트되고 0.4 mol CHO/ NH2 mol의 비율로 산화 글리코겐으로 가교된 콜라겐 필름을 제조하는 예:
12 cm x 12 cm 및 45 μm 두께의 필름을 얻기 위하여, 스테아르산으로 20 % 그래프트된 콜라겐의 1.75 % 수용액을 준비한다. 냉각시킨 후, 산화 글리코겐을 용액 내에 0.4 CHO/NH2의 비율로 가한다. 그런 후에 글리세롤을 가한다. 최종 용액을 144 cm3 폴리스티렌 배양 접시에 붓는다. 겔화시킨 후, 용액을 조절된 공기 흐름 하에서 증발시킨다. 건조되면, 필름을 45 분간 O.1M 카르보네이트 완충 용액 pH 9에 침지시키고, 증류수로 세척하며, 400 mg/l의 소듐 보로하이드라이드로 환원시키고, 증류수로 세척하며, PBS에 침지시킨 후 조절된 공기 흐름 하에서 건조시킨다. 이들 필름을 베타 또는 감마 방사선으로 멸균 소독시킬 수 있다.
실시예 7: 스테아르산으로 30 % 그래프트되고 글루타르알데하이드로 가교된 콜라겐 필름을 제조하는 예.
12 cm x 12 cm 및 45 μm 두께의 필름을 얻기 위하여, 스테아르산으로 30 % 그래프트된 콜라겐의 1.75 % 수용액을 준비한다. 글리세롤을 콜라겐 건조물에 10 %의 비율로 가한다. 마지막 용액을 144 cm3 폴리스티렌 접시에 붓는다. 겔화시킨 후, 용액을 조절된 공기 흐름 하에서 증발시킨다. 그런 후에 건조 필름을 18 시간 동안 pH 7의 0.5 % 글루타르알데하이드 용액에, 이후 트리스 용액에 침지시킨다. 이 필름을 베타 또는 감마 방사선으로 멸균 소독시킬 수 있다.
실시예 8: 팔미트산으로 13 % 그래프트된 콜라겐의 동결 건조 스폰지를 제조.
물 중의 1 내지 2 %의 농도로, 8 % 팔미트산으로 그래프트된 콜라겐 수용액을 1 시간 동안 60 ℃로 가열시켜 얻는다. 그런 후에, 용액을 금속 튜브에 붓고 - 70 ℃로 동결시킨다. 48 시간의 동결 건조 후, 스폰지를 얻는다. 평균 다공도는 콜라겐 농도 및 동결 온도에 따른다.
실시예 9: 이식가능한 생체 적합 물질의 제조에 그래트프된 콜라겐을 응용.
a)
시험관 내
세포 독성 연구
가교 스테아르산, 팔미트산 및 미리스트산과 같은 지방산으로 그래프트된 콜라겐 필름 시료의 섬유아세포에 대한 세포 독성을 시험한다.
다른 지방산의 그래프트율과는 상관 없이, 간접적인 세포 독성이 관찰되지 않았다.
b) 세포 성장에 관한
시험관 내
연구
가교 스테아르산, 팔미트산 및 미리스트산과 같은 지방산으로 그래프트된 콜라겐 필름 시료를 접촉시켰을 때의 섬유아세포 성장에 관하여 시험한다. 필름과 접촉시킨 5일간의 세포 성장 후, 트립신을 사용하여 세포를 분리시키고, MTT와 반응시켜 세포 생육성을 측정한다.
팔미트산 및 미리스트산으로 그래프트된 콜라겐으로부터 제조된 필름에 있어서, 그래프트율과는 상관 없이, 세포 성장이 평균 대략 65 % 감소되었다.
스테아르산으로 그래프트된 콜라겐으로부터 제조된 필름에 있어서, 그래프트율과는 상관 없이, 세포 성장이 평균 대략 85 % 감소되었다.
c) 세포 유착에 관한
시험관 내
연구
가교 스테아르산, 팔미트산 및 미리스트산과 같은 지방산으로 그래프트된 콜라겐 필름 시료를 접촉시켰을 때의 섬유아세포 유착에 관하여 시험한다. 트립신과의 동적 분리 (separation kinetics)을 수행시켰다. 각각의 추출에 있어서, MTT와 반응시켜 세포 생육성을 측정하였다.
그래프트율 및 그래프트된 지방산과는 상관 없이, 세포 유착이 감소되었다. 세포 유착의 최대 감소는 그래프트율이 25 내지 30 % 범위인 때에 관찰된다.
d) 생물 분해에 관한
생체 내
연구:
가교 스테아르산, 팔미트산 및 미리스트산과 같은 지방산으로 그래프트된 콜라겐 필름 시료를 쥐의 피하에 이식시킨다.
가교율과 관련하여 물질의 생물 분해를 조사한다. 조직학 연구는 숙주 반응을 특징지우는데 사용된다.
가교 및 그래프트율과는 상관 없이, 어떠한 병리 반응도 관찰되지 않았다. 면역계 세포의 동원은 정상이다. 어떠한 섬유질 쉘도 이식 주위에서 관찰되지 않았다.
e) 면역원성에 관한
생체 내
연구
스테아르산으로 26 % 그래프트된, 분쇄 콜라겐을 사용하여 토끼에 관한 면역화 프로토콜을 결정하였다.
90 일간의 면역화 후, 그래프트된 콜라겐에 대한 항체가 생산되지 않음을 확인하였다.
실시예
10:
비변성
아텔로콜라겐에
스테아르산을
그래프팅
.
a) 메탄올에서
무수 메탄올 30 ml 중의 아텔로콜라겐 500 mg (0.16 mmol 라이신)의 균질한 용액에, 트리에틸아민 150 μl (1.1 mol)를 함유하는 디옥산 5 ml 중의 스테아로일이미다졸 용액 (100 mg, 0.3 mmol)을 가한다. 얻어진 겔을 미세하게 분산시키고, 24 시간 동안 20 °에서 교반시켜 현탁액을 얻는다. 침전물을 흡인 건조시키고 아세톤으로 세척한 후 감압하에 건조시킨다.
b) DMF에서
DMF 20 ml 중의 미세 분말인 콜라겐 1 g (0.32 mmol 라이신)의 현탁액에, 스 테아로일이미다졸 200 mg (0.6 mmol)을 함유하는 디옥산 20 ml 및 트리에틸아민 300 μl (2.2 mmol)를 가한다. 30 °에서 48 시간의 반응 시간 후, 콜라겐을 여과시킨 후 모으고, 무수 아세톤으로 세척하며, 감압 하에 건조시킨다.
Claims (17)
- 공유 결합에 의하여 콜라겐에 그래프트된 지방산을 함유하는 소수성 그래프트된 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 유착 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서, 지방산은 콜라겐 알파 사슬의 유리 아민 잔기에 그래프트되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 콜라겐 알파 사슬의 유리 아민 잔기 개수에 대한 지방산 개수의 백분율은 1 내지 100%인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 지방산 개수의 백분율은 15 내지 50%인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지방산은 스테아르산, 팔미트산, 미리스트산 및 이들의 임의의 비율의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 콜라겐은 천연 콜라겐, 천연 아텔로콜라겐, 변성 콜라겐 또는 아텔로콜라겐, 또는 젤라틴 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 그래프트된 콜라겐은 가교된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 그래프트된 콜라겐은 특히 산화 글리코겐 및 산화 아밀로펙틴 중에서 선택되는 분지형의 산화 다당류에 의하여 가교되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 세포 유착 방지를 위하여 공유 결합에 의하여 콜라겐에 그래프트된 지방산을 함유하는 소수성 그래프트된 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 유착 방지 재료.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 수술 후 세포 유착을 예방하기 위한 것인 조성물.
- 제10항에 따른 유착 방지 재료를 함유하는, 외과용 인공 삽입물.
- 제10항에 따른 유착 방지 재료를 함유하는 인공 수정체.
- 제10항에 따른 유착 방지 재료를 함유하는 단일층 또는 이중층 필름.
- 제10항에 따른 유착 방지 재료와 함께 함침되는 것을 특징으로 하는 복벽 강화용 격자.
- 적당량의 활성화 지방산을 적절한 반응 매질 내에서 콜라겐과 반응시키는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물의 제조 방법.
- 제16항에 있어서, 지방산을 이미다졸리드 또는 숙신이미드의 형태로 활성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
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