RU2822238C1 - Трансплантат - тканеинженерная надхрящница для восстановления хряща субъекта - Google Patents
Трансплантат - тканеинженерная надхрящница для восстановления хряща субъекта Download PDFInfo
- Publication number
- RU2822238C1 RU2822238C1 RU2023119296A RU2023119296A RU2822238C1 RU 2822238 C1 RU2822238 C1 RU 2822238C1 RU 2023119296 A RU2023119296 A RU 2023119296A RU 2023119296 A RU2023119296 A RU 2023119296A RU 2822238 C1 RU2822238 C1 RU 2822238C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- perichondrium
- cartilage
- tissue
- cells
- spheroids
- Prior art date
Links
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 16
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000002520 cambial effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 24
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 21
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 31
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 11
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 11
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 11
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 4
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 4
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061762 Chondropathy Diseases 0.000 description 2
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 1
- -1 DMEM with 10% serum Chemical compound 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001963 Synthetic biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000001162 elastic cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- KKNIUBFRGPFELP-UHFFFAOYSA-N secretolin Chemical compound N=1C=CNC=1CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(=O)NC(C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(C)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O)C(C)O)CC1=CC=CC=C1 KKNIUBFRGPFELP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- FISGLHSNQHXMGY-UHFFFAOYSA-N sodium;aminoazanide Chemical group [Na+].[NH-]N FISGLHSNQHXMGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биомедицины и биотехнологии. Предложен трансплантат - тканеинженерная надхрящница для восстановления хряща субъекта, включающий скаффолд и живые клетки, отличающийся тем, что скаффолд представлен пластом донорской децеллюляризованной надхрящницы, на верхней части которого расположены клеточные сфероиды, представленные трехмерными агрегатами в форме сфер, состоящими из контактирующих друг с другом аутологичных предварительно культивированных адгезивных клеток камбиального слоя надхрящницы в количестве 8000 клеток на сфероид, частично слившихся между собой и погруженных в скаффолд, сверху конструкт покрыт слоем геля на основе гиалуроновой кислоты с сураминсодержащими липосомами толщиной 250-500 мкм. Изобретение обеспечивает восстановление структуры и формы хрящей на месте посттравматических дефектов хрящей за счет инициации репаративной регенерации хрящевой ткани. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, ортобиологии, экспериментальной травматологии, пластической и восстановительной хирургии и может быть использовано травматологических, ортопедических, хирургических и других стационарах.
Одной из актуальных проблем медицины является регенерация хрящевой ткани, большой практический интерес представляет восстановление любых дефектов гиалиновых хрящей, так как хрящевая ткань обладает крайне ограниченной способностью к спонтанной регенерации в условиях утраты надхрящницы или же при ее отсутствии в норме, например, у суставных гиалиновых хрящей нет надхрящницы. Значение надхрящницы как для физиологической, так и для репаративной регенерации, а также роста хрящей и хрящевых основ костей является основополагающим. В качестве примера, у детей и подростков надхрящница необходима для правильного формирования и роста хрящевой основы черепа (висцерального отдела), что должно обязательно учитываться при проведении реконструктивных операций в области головы и шеи с необходимостью восстановления целостности надхрящницы при хирургии этой области и лечении травм. Регенеративный потенциал надхрящницы - является перспективой для разработки новых стратегий тканевой инженерии хрящей и хрящевых тканей (Gvaramia D, Kern J, Jakob Y, Zenobi-Wong M, Rotter N. Regenerative Potential of Perichondrium: A Tissue Engineering Perspective. Tissue Eng Part В Rev. 2021 Jun 30. doi: 10.1089/ten.TEB.2021.0054. Epub ahead of print. PMID: 33966486).
Перспективными строительными блоками для разработки новых методов тканевой инженерии скелетных тканей являются клеточные сфероиды, которые представляют собой клеточные агрегаты округлой формы. При 3D культивировании клеток в составе сфероидов, например, некоторые стволовые клетки взрослых и клетки соединительной ткани синтезируют внеклеточный матрикс, воссоздавая в искусственных условиях выращивания новые структуры на тканевом уровне (клеточные агрегаты имеют способность накапливать внутри себя элементы внеклеточного матрикса). Сфероиды из стволовых клеток взрослых могут быть рассмотрены как органоиды, поскольку стволовые клетки повторяют пути дифференцировки, и являются перспективной живой моделью тех или иных тканей или органов вне организма для выявления новых молекулярных мишеней (биомаркеров) для диагностики и разработки новых методов терапии. Сфероиды представляют собой новый развивающийся и перспективный подход к клеточной трансплантации, установлено, что клетки, в составе сфероидов более успешно приживляются и интегрируют с организмом реципиента, сфероиды могут участвовать в регенеративных гистогенезах, что не характерно для клеточных трансплантатов в виде суспензии отдельных разрозненных клеток, для которых более характерно проявление паракринного эффекта на окружающие ткани реципиента в области пересадки - сценарий медицинских сигнальных клеток. Сфероиды могут быть непосредственно пересажены в область посттравматических дефектов, либо в комбинации с различными биоматериалами. Клетки, мигрирующие из сфероидов, могут выходить из сфероида и распространяться на поверхность каркаса, причем сфероиды могут взаимодействовать с каркасами (матрицами, скаффолдами) в разных условиях эксперимента in vitrum, в искусственных лабораторных условиях на тканевых или органных культурах, либо при закреплении каркаса-матрицы на реципиентной поверхности в организме-реципиента на живой модели. Сфероиды крайне важны для развития методов биопечати, являются для биопринтинга строительными блоками, продуктами тканевой инженерии, могут входить в состав биочернил. Образуемые конструкции, в которой сфероид взаимодействует со скаффолдом - каркасом, исследуются, уже доказано, что клетки сфероидов мигрируют в каркас от места прилипания сфероида, а сфероиды, например, из стволовых клеток взрослых вероятно могут быть использованы для оптимизации клеточной колонизации в скаффолдах для инженерии хрящей и костной ткани (Baptista LS, Kronemberger GS, Cortes I, Charelli LE, Matsui RAM, Palhares TN, Sohier J, Rossi AM, Granjeiro JM. Adult Stem Cells Spheroids to Optimize Cell Colonization in Scaffolds for Cartilage and Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 2018 Apr 25; 19(5): 1285. doi: 10.3390/ijms 19051285. PMID: 29693604; PMCID: PMC5983745).
Известен способ выращивания новой гиалиновой хрящевой ткани в искусственных условиях тканевой культуры, который может быть использован в качестве прототипа. В этом способе коллагеновые матрицы заворачивали в слой надхрящницы. Матрица служит носителем для обеспечения миграции клеток из надхрящницы в матрикс матрицы. Условия тканевого (3D) культивирования в питательной среде полученного конструкта стимулировали рост и пролиферацию клеток. Клетки мигрировали в поры матрикса (матрицы), где они выживали и синтезировали компоненты матрикса, включая коллаген 2-го типа. Было показано при гистологическом исследовании, что после 4 недель культивирования происходит увеличение количества клеточных слоев вокруг матрикса, а также количество клеток, мигрировавших в пористый матрикс самой матрицы. Иммуногистохимическое окрашивание этих культивируемых клеток показало экспрессию коллагена типа II, в том числе обнаруженного и внутриклеточно, что является одним из доказательств неохондрогенеза, так как процесс синтеза коллагена II типа является фенотипическими признаками хондроцита (van Lange JW, de Roo K, Middelkoop E, van den Bos T, Everts V, Nolst Trenite GJ. Perichondrium-wrapped collagenous matrices to induce chondroneogenesis: an in vitro study. Arch Facial Plast Surg. 2001 Apr-Jun; 3(2): 122-6. doi: 10.1001/archfaci.3.2.122. PMID: 11368666).
Известен способ неоморфогенеза хряща путем выращивания бычьих хондроцитов в тесной взаимосвязи с биоразлагаемыми полимерами, состоящими из полигликолевой кислоты и поли-L-молочной кислоты. В этом способе полимерные матрицы засевают свежевыделенными бычьими суставными хондроцитами, а затем имплантируют подкожно голым (иммунодефицитным) мышам. Макроскопическое исследование вырезанных образцов через 12 недель после имплантации (ксенотрансплантации клеток на носителе) выявило наличие нового гиалинового хряща примерно тех же размеров, что и исходная конструкция для подкожного введения из биоразлагаемого полимера. Этот хрящ не проявлял признаков резорбции или разрастания в течение 12 недель эксперимента (Kim W.S., Vacanti J.P., Cima L., Mooney D., Upton J., Puelacher W.C., Vacanti C.A. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg. 1994 Aug; 94(2):233-7; discussion 238-40. PMID: 8041813).
На настоящий момент установлено, что спонтанное восстановление хряща на месте его посттравматического дефекта часто отсутствует или является неполным, это обычно медленно текущий процесс. Причины неспособности хрящевой ткани к репаративной регенерации исследуются, считают, что вероятно связаны с особенностями структуры и физиологической природы этой бессосудистой и узкоспециализированной скелетной ткани, содержащей ограниченное количество хондроцитов с медленным их обновлением при физиологической регенерации, как клеточной составляющей. Медленно обновляется и матрикс гиалинового хряща. Продолжаются разработки имплантатов с живыми аутологичными клетками, которые, во-первых, должны быть доступно для практического здравоохранения получаемыми; во-вторых, должны обладать, как минимум, всеми преимуществами аутогенного хряща, например, как при мозаичной хондропластике. Подобные более совершенные, но полученные искусственным путем, тканеинженерные конструкции или живые эквиваленты хрящей активно разрабатываются.
Один из важнейших способов добиться результата в регенеративной медицине скелетных тканей - изучить спонтанную репаративную регенерацию скелета, условия - специальные искусственные условия, при которых она возможна, и попробовать воспроизвести в процессе разработки и осуществления биомедицинской технологии, это, так называемый, биомиметический подход. При этом подходе создаются устройства и способы, в которых достижение технических результатов по восстановлению тканей возможны на основе заимствований идей и основных элементов осуществления механизмов органо-типичной репаративной, либо физиологической регенерации из живой природы.
В гистологии и хирургии давно известно, что реберный хрящ человека способен к полноценной регенерации при определенных условиях. Условием реализации способности гиалинового хряща к полноценному восстановлению на месте посттравматических дефектов с утратой части хрящевой массы этой части ребра является сохранение целостности надхрящницы, покрывающей реберный хрящ в виде чехла, либо наложение швов, восстанавливающих анатомическую форму надхрящницы этот самый покровный чехол, что очень важно для предотвращения врастания регенератов окружающих мягких тканей под надхрящницу. При наличии крупных отверстий в надхрящнице регенераты мягких тканей вместе с новообразованными сосудами быстро заполняют дефект хряща, постепенно превращаясь из рыхлой волокнистой ткани в атипичный соединительнотканный регенерат - рубец, при этом нормальная структура и функции реберного хряща не восстанавливаются, пожизненно остается дефект этого органа. Для регенерации хряща под надхрящницей важно наличие и поддержание свободного пространства для развития полноценного репаративного регенерата. Создание специальных пространств, в которых происходит развитие регенератов, часто осуществляется с помощью ин виво биореакторов.
Регенерация хряща под надхрящницей осуществляется благодаря наличию в ней камбиальных элементов. Содержащиеся в надхрящнице стволовые клетки и прехондробласты активируются, пролиферируют и дифференцируются в хондробласты, которые вырабатывают межклеточное вещество хряща, постепенно заполняющее образовавшийся дефект полноценным регенератом. Очень важно сохранять надхрящницу во время хирургического вмешательства для адекватного послеоперационного заживления и сохранения целостности хряща, как органа. Надо отметить, что клеточные и молекулярно-генетические механизмы полноценной репаративной регенерации реберного хряща человека исследованы недостаточно полно.
Известна животная модель посттравматического восстановления реберного хряща на примере реберного хряща у лабораторных мышей. В известных исследованиях показано, что полная замена резецированного хряща происходит быстро (в течение 1-2 месяцев), клетки регенерата правильно дифференцируются, но обращено внимание, что восстановление происходит спонтанно только при сохранении надхрящницы специальными хирургическими приемами в ходе создания экспериментального дефекта реберного хряща (Srour М.K., Fogel J.L., Yamaguchi K.T., Montgomery A.P., А.K Izuhara, A.L Misakian, S. Lam, Lakeland D.L., M.M Urata, J.S Lee, F.V Mariani Natural Large-Scale Regeneration of Rib Cartilage in a Mouse Model/ J Bone Miner Res. 2015 Feb; 30(2):297-308. https://doi.org/10.1002/ibmr.2326).
В экспериментах на крысах установлено, что надхрящница, пересаженная в дефекты суставного хряща, не только стимулировала регенерацию, но и сама интегрировалась в состав регенератов на хрящевых суставных поверхностях. Трансплантаты надхрящницы развились в суставоподобный гиалиновый хрящ (Dou Z, Muder D, Baroncelli M, Bendre A, Gkourogianni A, Ottosson L, Vedung T, Nilsson O. Rat perichondrium transplanted to articular cartilage defects forms articular-like, hyaline cartilage. Bone. 2021 Oct; 151:116035. doi: 10.1016/j.bone.2021.116035. Epub 2021 Jun 8. PMID: 34111644).
Известна группа изобретений, в которой трансплантат в виде клеточных сфероидов из надхрящницы ребра субъекта, обладает выраженным регенерационным потенциалом и используется для восстановления хряща. Недостатком известного способа является необходимость заполнения всего пространства посттравматических дефектов хряща клеточными сфероидами и их удержанием на месте, что требует подготовки большого количества биомассы аутологичных клеточных культур и решения вопроса об удержании сфероидов в необходимом пространстве определенной формы для восстановления нормальной анатомической структуры хряща в восстанавливаемой части тела. Толщина суставного хряща составляет несколько миллиметров, объем небольшой и легко заполняем, дно дефекта жесткое и надежно держит форму, поэтому данное изобретение направлено в больше степени на ремонт суставного хряща (Ковалев А.В., Родионов С.А. Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей. Патент на изобретение 2731314 С1, 01.09.2020. Заявка №2019134905 от 30.10.2019 г.).
Таким образом, несмотря на имеющиеся способы восстановления хрящей, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, в том числе, связанных с приживлением, участием в тканеспецифической полноценной репаративной регенерации, достаточным питанием и дыханием пересаженных клеток в конструктах, а также удержанием сфероидов в нужном для восстановления тканей месте и формирования регенерата правильной формы и объема в живом организме, это важно для восстановления анатомически правильной формы травмированных органов, восстановления их функций, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных проблем.
Задачей изобретения является создание трансплантата - тканеинженерной надхрящницы для восстановления хряща субъекта.
Техническим результатом является обеспечение восстанавление структуры и формы хрящей на месте посттравматических дефектов хрящей за счет инициации репаративной регенерации хрящевой ткани под трансплантатом-тканеинженерной надхрящницей, причем источником клеточной регенерации хряща являются трансплантированные внутри сфероидов клетки, входящих в конструкт, участвующие в регенерационном хондрогенезе.
Технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предложен трансплантат - тканеинженерная надхрящница для восстановления хряща субъекта, включающий скаффолд и живые клетки, отличающийся тем, что скаффолд представлен пластом донорской децеллюляризованной надхрящницы, на верхней части которого расположены клеточные сфероиды, причем клеточные сфероиды представлены трехмерными агрегатами в форме сфер, состоящими из контактирующих друг с другом аутологичных, предварительно культивированных адгезивных клеток камбиального слоя надхрящницы в количестве 8000 клеток на сфероид, частично слившихся между собой и погруженных в скаффолд, сверху конструкт покрыт слоем геля на основе гиалуроновой кислоты с сурамин содержащими липосомами толщиной 250-500 мкм. При этом субъект представляет собой человека. При этом клеточные сфероиды состоят из аутологичных культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в количестве 6000-8000 клеток на сфероид. При этом гель на основе гиалуроновой кислоты с сурамин содержащими липосомами размещен между скаффолдом с клеточными сфероидами и хрящевой тканью восстанавливаемого хряща, заполняя все свободное пространство. При этом донорская децеллюляризованная надхрящница с расположенными на ее поверхности клеточными сфероидами может быть свернута в форме трубы, где слой клеточных сфероидов расположен на ее внутренней цилиндрической поверхности, а внутреннее пространство трубы заполнено гелем на основе гиалуроновой кислоты с сурамин содержащими липосомами.
Настоящее изобретение также относится к трансплантату - тканеинженерной конструкции для восстановления эластических и гиалиновых хрящей в виде эластичной тонкой пластины на основе донорской децеллюлизированной надкостницы и клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надхрящницы, которые из прилипших к матрице надхрящницы сфероидов проникают в децеллюлизированной матрикс, причем при тканевом культивировании сфероиды укладываются со стороны камбиального слоя надхрящницы на ее поверхность, где сливаются между собой (тканевое слияние сфероидов), перед применением на тканеинженерную конструкцию наноситься гель на основе гиалуроновой кислоты с добавлением сурамина на сторону, свободную от сфероидов, тканеинженерная надхрящница может быть сформирована в виде трубы, где просвет трубы заполняется гелем, для восстановления краевых дефектов хрящей гель расположен в сторону реципиентной поверхности для эффективного восстановления хрящей, регенераты которых развиваются от слоя сфероидов.
Тканеинженерная надхрящница по данному устройству объединяет в себе достоинства клеточных сфероидов, которые имеют ряд преимуществ в сравнение с клеточной терапией - введения суспензий отдельных культивированных клеток. Недостатками терапии разрозненными культивированными клетками соединительной ткани являются быстрая гибель клеток после аутотрансплантации в живом организме, невозможность длительного удержания клеток на месте, потеря жизнеспособности из-за ограниченных передачи сигналов от клетки к клетке и взаимодействия клетки с клеточным матриксом, недостижение порога количества клеток, необходимого для хондрогенеза, необходимость длительного взаимодействия с организованным субстратом (внеклеточным матриксом) для целевой дифференцировки.
3D-системы культивирования, в том числе бесскаффолдные технологии, применяемые при выращивании сфероидов лучше воспроизводят межклеточную среду. Основные преимущества применения клеточных сфероидов в тканевой инженерии - это увеличение жизнеспособности клеток в составе сфероидов, микросреда в сфероидах частично приближается к ин виво межклеточному окружению; сфероиды характеризуются высокой клеточной емкостью для реконструкции; большей биосовместимостью; способностью к эффективной механотрансдукции; более выраженной способностью к биоинтеграции с организмом реципиента и способностью к большей пластичности и индуцируемой клеточной дифференцировке. Тканевое слияние сфероидов позволяет объединить сфероиды в более крупную бесскаффолдную тканеинженерную конструкцию, которая, однако, не обладает достаточной механической прочностью для хирургических манипуляций и проблематично удержать форму в течение срока достаточного для участия и реализации морфогенетических процессов, формирования органотипичных регенератов. Донорская обработанная надхрящница выполняет объединяющую роль для сфероидов, обладает свойствами индуктора дифференцировки, и является биоразлагаемым барьером для проникновения в область регенерации окружающих мягких тканей и предотвращает замещение восстанавливаемого пространства тканевого дефекта соединительнотканным рубцом. Толщина конструкции позволяет обеспечить клеточное дыхание и поступление питательных веществ путем диффузии от реципиентной поверхности при трансплантации в живой организм. Крайне важно обеспечить после трансплантации создать благоприятную локальную среду за счет формирования относительно изолированного пространства по типу ин виво биореактора и поддержку требуемого состава этой локальной среды регенерации, способствующей регенеративному хондрогенезу.
В качестве источника клеток для производства сфероидов выбрана надхрящница. Получение клеточной культуры и производство сфероидов из этих клеток осуществлялось согласно известному методу (патент РФ №2731314, «Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей»). Взятие надхрящницы осуществляли с реберного хряща в ходе амбулаторной операции под местной анестезией, для бережного отделения и забора надхрящницы от нижележащего хряща под надхрящницу с помощью иглы шприца вводили изотонический раствор, образуя своеобразный купол, который отсекался скальпелем и лоскут надхрящницы сразу переносился в пробирку с транспортной средой. Выделение клеток из надхрящницы реберного хряща производили путем предварительного механического измельчения с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей. Выделенные клетки надхрящницы высевали в пластиковые культуральные флаконы для адгезивных клеточных культур с питательной средой следующего известного состава, пригодного для культивирования соединительнотканных клеток: DMEM 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО2 для получения первичной культуры клеток. Субкультивирование монослойной культуры клеток надхрящницы осуществляли до третьего пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня. После третьего пассажа клетки снимали с дна пластиковых культуральных флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывали от трипсина/ЭДТА, в том числе средой DMEM с 10% сывороткой и с последующим центрифугированием при 200g в течение 10 минут, затем переносили в 81 -луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 миллионов клеток на планшет. Внутри лунок формируются сфероиды в течение 6-7 суток.
Приготовление геля на основе гиалуроновой кислоты (ГК, НА) осуществлялась по известным методикам (Bulpitt, P., Aeschlimann, D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: Preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels (1999) J. Biomed. Матер. Рез. 47, 152-169). Гиалуроновая кислота (Genzyme) химически модифицировали так, чтобы он содержал альдегидные группы (HA-ALD) путем реакции с периодатом натрия и гидразидными группами (HA-ADH) в процессе взаимодействия с адипиновым дигидразидом. Гидрогели ГК получали смешиванием равных объемов 2% (мае. / Об.) водных растворов HA-ALD и HA-ADH. Сурамин (Bayer, Леверкузен, Германия) был включен в свободную (0,4 моль / литр) и инкапсулированную в липосомы (0,4 моль / литр) формы во время гелеобразования. Сураминсодержащие липосомы были получены с использованием ранее описанного метода (Kim S, Turker M.S., Chi E.Y., Sela S., Martin G.M. Preparation of multivesicular liposomes. Biochim Biophys Acta. 1983 Mar 9;728(3):339-48. doi: 10.1016/0005-2736(83)90504-7. PMID: 6824663; Hunziker EB, Driesang IM. Functional barrier principle for growth-factor-based articular cartilage repair. Osteoarthritis Cartilage. 2003 May; 11(5):320-7. doi: 10.1016/s 1063-4584(03)00031-1. PMID: 12744937). Такой гель, как известно, способствует регенеративному хондрогенезу внутри пространства ин виво биоректора, искусственно созданного под надкостницей (гель вводится под надкостницу диафиза длинной трубчатой кости, формируя дополнительное пространство между костью и надкостницей.
Скаффолд децеллюляризованного внеклеточного матрикса был получен из донорской надхрящницы (бык, овца, кролик) из реберного хряща. Такие скаффолды относят к биоматериалам, которые составляют органы или ткани человека или животных - это донорский материал с удалением иммуногенных клеточных компонентов с помощью одной из известных технологий децеллюляризации (Hinderer S. et al. ЕСМ and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy// Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 97, 1 February 2016, Pages 260-269, https://doi.Org/10.1016/j.addr.2015.11.019). Каркасы децеллюляризованного внеклеточного матрикса в основном состоят из внеклеточного матрикса, который представляет собой трехмерный каркас, содержащий внеклеточные макромолекулы, такие как коллаген, эластин, фибронектин, ламинин и важные матрицеллюлярные белки. Особенностью подобных технологий является максимальное сохранение физико-химических сигналов и биологических характеристик такого матрикса после децеллюляризации, что обеспечивает получение полезного субстрата биологического происхождения как для механической поддержки, так и биологический 3D-носитель макромолекул для последующего выращивания клеток. Из надхрящницы получается удачный биоматериал, пригодный для пересадок в живой организм, хорошей механической поддержки 3D клеточных культур и при сохранении стабильности каркаса в живом организме на протяжении достаточно длительного времени. Пластинка из такой надхрящницы может быть надежно подшита к надхрящнице, окружающей дефект хряща в живом организме. Такой матрикс был получен методом детергентно-ферментативной децеллюляризации, использовался специальный детергент, содержащих ряд веществ: 1) натриевую соль лаурил-серной кислоты (анионоактивное поверхностно активное вещество, чистящее и смачивающее средство (SDS); 2) Triton X 100 - неионное поверхностно активное вещество (детергент для экстракции ДНК как часть литического буфера); 3) раствор кальция хлорида и магнезии сульфата для активации эндогенных нуклеаз; 4) диоксирибонуклеаза (эндонуклеаза, синтезируется в основном в тканях пищеварительного тракта). В стерильном растворе детергента надхрящница находилась на качающейся платформе 72 часа при 37°С, затем отмывалась в стерильном растворе Рингера и подвергалась ферментной обработке, с последующей отмывкой в стерильных апирогенных физиологических растворах натрия хлорида или Рингера. Скаффолд децеллюляризованного внеклеточного матрикса (ДЦМ) надхрящницы замораживался про -25°С, а затем подвергался сублимационной сушке, причем перед сушкой скаффолд растягивался на прямоугольной рамке для получения в виде расправленного листа. Важно не терять где находиться слой матрикса, ассоциированный с камбиальным слоем надхрящницы, и фиброзным слоем.
Для получения тканеинженерной конструкции ДЦМ укладывается на дно культурального флакона (матрасы для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой с поверхностью роста 150 см2. Причем сторона ассоциированная с камбиальным слоем надхрящницы располагается сверху. Заливалась культуральная питательная среда температурой 37°С для смачивания и насыщения скаффолда раствором. На лист ДЦМ укладывается стерильное техническое приспособление в виде скрепленных под углом друг к другу четырех стержней прямоугольной формы (боковая сторона - 0,5 мм высотой и две стороны верха и низа по 4 мм длиной) скрепленных между собой под прямым углом из титана, в виде металлической рамы. Рама придавливает ДЦМ ко дну флакона, и образует ограниченное внутренними краями рамы пространство. Клеточные сфероиды в виде суспензии в культуральной питательной среде выливаются в получаемое пространство, ограниченное внутренними боковыми поверхностями рамы. С помощью планки, двигающейся по верхним поверхностям рамы, сфероиды аккуратно распределяются в один слой на ДЦМ под визуальным контролем с помощью лупы бинокулярной медицинской, излишек питательной среды смахивается планкой, сфероиды с помощью пипеток добавляются для формирования сплошного слоя из сфероидов, покрывающих всю верхнюю поверхность ДЦМ, ограниченную внутренними краями рамы из титана. Рама служит не только для сохранения формы ДЦМ, но и обеспечивает возможность в жидкой среде обеспечить плотное покрытие сфероидами ДЦМ, что необходимо для эффективного тканевого слияния клеточных сфероидов между собой. Внутрь культурального флакона для работы с адгезивными культурами клеток аккуратно добавляется культуральная питательная среда (ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона), в которую вноситься добавка культуральная MSCgo™ Chondro-genic Differentiation Supplement Mix, Biological Industries, в количестве 3 мл добавки на 100 мл питательной среды, что составляет 30% от рекомендуемого производителем количества для индукции хондрогенной дифференцировки мультипотентных стромальных клеток костного мозга). Условия культивирования включают инкубацию ткане-инженерной конструкции с постоянной температурой 37°С под тонким слоем культуральной среды во влажной воздушной атмосфере газовой фазы внутри культурального флакона с добавлением 5% углекислого газа в атмосферный воздух флакона внутри культурального флакона. Смена питательные среды проводят каждый день. Уровень культуральной питательной среды не менее, чем на 750 мкм должен превышать верхний край титановой рамы, удерживающей конструкцию. Количество на поверхности ДЦМ сфероидов зависит от их размера, при диаметре в 400-500 мкм размещают 4 сфероида на 1 мм2 ДЦМ. Культивируют сфероиды в хондрогенной среде в течение 4-6 суток, причем на дне культурального сосуда находится скаффолд, а сверху сфероиды. В этом варианте применения сфероиды представляют собой новый развивающийся подход к клеточной пересадке, и, клетки, мигрирующие из сфероидов, могут диссеминировать и распространяться на поверхность каркаса, в результате чего образуется цельная эластичная конструкция сфероид-каркас, достаточно прочно удерживающая слившиеся сфероиды на своей поверхности.
Клетки этого трансплантата является источником репаративной регенерации хряща, позволяющий воспроизводить биомиметический подход к восстановлению хряща, а именно естественный способ репаративной регенерации хряща под надхрящницей воспроизвести под тканеинженерной конструкцией в пространстве дефекта хрящевой ткани (само пространство дефекта заполняется гелем на основе гиалуроновой кислоты с сураминсодержащими липосомами). Со стороны слоя слившихся сфероидов матрицы надхрящницы должен быть размещен этот специальный гель на основе гиалуроновой кислоты. Такая конструкция позволяет свернуть себя в трубку и быть трансплантирована в живой организм, как в форме трубки, а если не сворачивать, то используется в форме заплатки, края тканеинженерной надхрящницы должны быть подшиты рассасывающимся хирургическим швом к краям надхрящницы вокруг хрящевого дефекта. В живом организме в пространстве, заполненном гелем, формируется регенерат хряща.
Сущность предложенного трансплантата - тканеинженерной надхрящницы для восстановления хряща субъекта поясняется чертежом, где на фиг. 1 показана принципиальная схема тканеинженерной надхрящницы для восстановления хрящей. На фиг. 1 цифрами обозначены следующие позиции: 1 - децел-люляризованная донорская надхрящница; 2 - аутологичные клеточные сфероиды; 3 - гель на основе гиалуроновой кислоты с добавлением сурамина, заполняющий пространство посттравматического дефекта хряща; 4 - реберный хрящ; 5 - интактная надхрящница вокруг посттравматического дефекта хряща; 6 - хирургический шов.
Сущность предложенного трансплантата - тканеинженерной надхрящницы для восстановления хряща субъекта поясняется примерами осуществления.
Пример 1. У кролика в ходе экспериментальной операции иссекли участок надхрящницы площадью 4 кв. см, провели механическое измельчение и выделение клеток из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща, путем ферментной обработки далее клетки выделили из внеклеточного матрикса и их перевели в культуру. В ходе той же операции из гребня подвздошной кости таза с помощью аспирационной иглы забрали костный мозг, выделили мононуклеары костного мозга на градиенте концентрации, затем перевели мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга в адгезивную культуру. Кролика оставили под наблюдением для последующего моделирования хрящевого дефекта и пересадки тканеинженерной конструкции для полноценного восстановления экспериментального повреждения хряща.
Выделенные клетки раздельно культивировали в адгезивных 2D культурах без хондрогенной дифференцировочной среды на протяжении четырех пассажей в течение 28 дней в базовой питательной среде с добавлением к этой среде 10% тромболизата (PLTGold®, Merck). Далее клетки двух полученных клеточных линий сняли с матрасов и перенесли в пластиковые лунки (неадгезивный пластик) NanoCulture® плиты для 3D-культивирования сфероидов (Corning®), причем на этом этапе перед началом 3D культивирования клетки суспензии клеток 2-х клеточных линий смешивают между собой в соотношении клеток надхрящницы к мультипотентным мезенхимальным клеткам костного мозга 2:1. Клеточный сфероид состоит из 8000 клеток, срок 3D культивирования клеток внутри лунок составляет 7 суток при ежедневном обновлении культуральной питательной среды.
На дно пластикового культурального флакона с боковой дверцей уложили децеллюляризованную и лиофиллизированную аллогенную надхрящницу кролика, сверху на лист этой приготовленной надхрящницы уложили стерильную титановую рама прямоугольной формы (боковая сторона сечения бруска рамы - 0,5 мм высотой и две стороны верха и низа по 4 мм длиной). Суспензию сфероидов в культуральной питательной среде перенесли в пространство ограниченное внутренними стенками металлической рамы, ее размеры позволяют уложить выращенные сфероиды в один ряд, постоянно добавляли суспензию сфероидов и смахивали планкой избыток питательной среды, при этом на 1 мм2 матрицы приходится около 4-х сфероидов. В культуральный флакон заливали питательную среду, состоящую из среда DMEM, без глутамина, сод. глюкозы 4,5 г/л, с HEPES, с пируватом Na 450 мл (ПанЭ-ко), L-глутамина 292 мг, эмбриональной телячьей сыворотки 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, в которую вносили добавку культуральной MSCgo™ Chondrogenic Differentiation Supplement Mix (Biological Industries), для индуцирования хондрогенной дифференцировки в количестве 12,5 мл.
Культивировали сфероиды на ДЦМ аллогенной надхрящницы в хондрогенной среде в течение 4-6 суток, причем на дне культурального сосуда находится этот скаффолд, а сверху сфероиды участвуют во взаимном тканевом слиянии, часть клеток сфероидов проникает в глубь скаффолда, откладывает внеклеточный матрикс, включая коллагеновые фибриллы, что формирует объединяющий конструкцию волоконный остов, способствующий дополнительному удержанию распластанных сфероидов в тканеинженерной конструкции, фактически происходила матурация (дозревание) тканеинженерной конструкции.
Далее в ходе второй последовательной операции под медикаментозным наркозом тому же кролику провели пересадку тканеинженерной конструкции, клетки которой аутологичны для этого животного. Для этого осуществили доступ к хрящевой части ребра. Провели иссечение бокового фрагмента хряща с надхрящницей на 1/2 толщины реберного хряща длиной 1 см. По размеру удаленной надхрящницы произвели выкраивание лоскута тканеинженерной конструкции. Далее с помощью наложения хирургических швов тканеинженерная надхрящница подшили к краям надхрящницы, окружающей дефект хряща. Под подшитую тканеинженерную надхрящницу с помощью шприца пространство послеоперационного дефекта реберного хряща заполнили гелем на основе гиалуроновой кислоты с сурамин содержащими липосомами. Края надхрящницы, к которой подшивается тканеинженерная конструкция, пометили тушевыми метками - красящий пигмент вводили точечно и вдоль хирургических швов на расстоянии в 3 мм. Произвели послойное ушивание раны.
При резекции участка реберного хряща, ограниченного тушевыми метками, у этого же кролика через 4 месяца после пересадки отметили полное восстановление утраченной массы хрящевой ткани, форма хряща полностью восстановлена. При гистологическом исследовании подтвердили образование полноценного регенерата гиалинового хряща на месте послеоперационного дефекта.
Пример 2. Из полученной тканеинженерной надхрящницы иссекли два квадрата с длиной стороны 0,8 см, сшили под операционным микроскопом между собой тонкой шелковой хирургической нитью, соединенной с атравматической хирургической иглой, причем сшивание производили в чашке Петри, заполненной питательной средой DMEM, без глутамина, сод. глюкозы 4,5 г/л, с HEPES, с пируватом Na 450 мл (ПанЭко), L-глутамина 292 мг, 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, с добавлением 50 мл 10% тромболизата (PLTGold®, Merck). Причем слои сфероидов были обращены друг к другу и находились во внутренней части конструкта. С помощью иглы шприца конструкт заполнили между двумя тканеинженерными надхрящницами гелем на основе гиалуроновой кислоты с сурамин содержащими липосомами.
Далее полученный конструкт перенесли в диффузную камеру (EMD Millipore's Diffusion Chamber, Merck) диаметром 13 мм, которую имплантируют под капсулу почки взрослого кролика в ходе экспериментальной операции, причем клетки тканеинженерной конструкции аутологичны для животного. При извлечении диффузной камеры из тела животного на 50 сутки провели гистологическое исследование образца. Обнаружили формирование гиалинового хряща внутри диффузной камеры с тканеинженерной надхрящницей.
Claims (5)
1. Трансплантат - тканеинженерная надхрящница для восстановления хряща субъекта, включающий скаффолд и живые клетки, отличающийся тем, что скаффолд представлен пластом донорской децеллюляризованной надхрящницы, на верхней части которого расположены клеточные сфероиды, причем клеточные сфероиды представлены трехмерными агрегатами в форме сфер, состоящими из контактирующих друг с другом аутологичных предварительно культивированных адгезивных клеток камбиального слоя надхрящницы в количестве 8000 клеток на сфероид, частично слившихся между собой и погруженных в скаффолд, сверху конструкт покрыт слоем геля на основе гиалуроновой кислоты с сураминсодержащими липосомами толщиной 250-500 мкм.
2. Трансплантат по п. 1, отличающийся тем, что субъект представляет собой человека.
3. Трансплантат по п. 1, отличающийся тем, что клеточные сфероиды аутологичных культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга - в количестве 6000-8000 клеток на сфероид.
4. Трансплантат по п. 1, отличающийся тем, что гель на основе гиалуроновой кислоты с сураминсодержащими липосомами размещен между скаффолдом с клеточными сфероидами и хрящевой тканью восстанавливаемого хряща, заполняя все свободное пространство.
5. Трансплантат по п. 1, отличающаяся тем, что донорская децеллюляризованная надхрящница с расположенными на ее поверхности клеточными сфероидами может быть свернута в форме трубы, где слой клеточных сфероидов расположен на ее внутренней цилиндрической поверхности, а внутреннее пространство трубы заполнено гелем на основе гиалуроновой кислоты с сураминсодержащими липосомами.
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022111850A Division RU2807692C2 (ru) | 2022-04-29 | Способ получения трансплантата - тканеинженерной надхрящницы на основе клеточных сфероидов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2822238C1 true RU2822238C1 (ru) | 2024-07-03 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2731314C1 (ru) * | 2019-10-30 | 2020-09-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2731314C1 (ru) * | 2019-10-30 | 2020-09-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LUO Z. et al. Comparison of various reagents for preparing a decellularized porcine cartilage scaffold, Am J Transl Res, 2019, vol. 11, N. 3, pp. 1417-1427. * |
РОДИОНОВ С. А. и др. Регенерация хряща в органной культуре с помощью тканевых сфероидов, сформированных из клеток надхрящницы ребра, Гены и Клетки, 2019, т. 14, N. S, c. 197. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zurina et al. | Tissue engineering using a combined cell sheet technology and scaffolding approach | |
Chang et al. | Cartilage tissue engineering on the surface of a novel gelatin–calcium‐phosphate biphasic scaffold in a double‐chamber bioreactor | |
US9217129B2 (en) | Oscillating cell culture bioreactor | |
Jawad et al. | Myocardial tissue engineering. | |
CA2441994C (en) | Composition and methods for the production of biological tissues and tissue constructs | |
RU2104039C1 (ru) | Заменитель живой кожи, способ его получения и способ обработки повреждений живой кожи | |
CA2591979A1 (en) | Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue | |
Wang et al. | Functional acellular matrix for tissue repair | |
CN102892880A (zh) | 生物工程化组织构建物及其制备和使用方法 | |
AU2002306835A1 (en) | Composition and Methods for the Production of Biological Tissues and Tissue Constructs | |
Woźniak et al. | Candidate bone-tissue-engineered product based on human-bone-derived cells and polyurethane scaffold | |
CN102089425A (zh) | 仿生细胞支架 | |
US9629939B2 (en) | Collagenous foam materials | |
Ghosh et al. | Decellularized extracellular matrix and silk fibroin-based hybrid biomaterials: A comprehensive review on fabrication techniques and tissue-specific applications | |
KR20030093009A (ko) | 세포외기질을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자기질 및 그의 제조방법 | |
RU2822238C1 (ru) | Трансплантат - тканеинженерная надхрящница для восстановления хряща субъекта | |
RU2807692C2 (ru) | Способ получения трансплантата - тканеинженерной надхрящницы на основе клеточных сфероидов | |
JP4344112B2 (ja) | 生体組織様構造体、骨髄幹細胞の培養方法および培養用キット | |
RU2819284C2 (ru) | Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта | |
RU2818176C1 (ru) | Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов | |
RU2744664C1 (ru) | Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза | |
Bharti et al. | Biomaterials and Scaffolds in Stem Cell Therapy | |
Garner | Tissue engineering and the trauma surgeon | |
Nguyen et al. | In vivo techniques and strategies for enhanced vascularization of engineered bone | |
Feng et al. | VEGF-Loaded Nanoparticle-Modified Bacterial Cellulose Combined with Multiple Cells in Tissue-Engineered Bladder |