CN102089425A - 仿生细胞支架 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含哺乳动物细胞的仿生植入物，其受到其环境的诱导从而产生扩散因子梯度。这可用于引发生理上的促血管生成反应，其刺激植入物附近的组织中的血管生成和血管再形成，例如在其中需要提高血管生成和/或血管发生的治疗应用中。这也可用于提供用于细胞培养和分化的仿生哺乳动物细胞巢。

Description

仿生细胞支架
技术领域
本发明涉及促进细胞活性，如血管形成、血管发生、分化和增殖的三维植入物和组织支架。
背景技术
组织缺氧导致机体内由血管生成素蛋白，包括血管内皮生长因子(VEGF)激发的快速血管生成。目前对于组织活力的观点是较深层的细胞是否接受到充足的营养和氧气用于正常的活动和最终的存活。对于完整的组织，由微血管灌注控制这种必要的营养水平。但是，还没有有效定量确定的3D模型，其能够测试基质和细胞密度的相互作用或相互依赖，和体外的氧消耗的扩散途径。因此，细胞易受到低氧水平的影响的观念、以及细胞反应的性质是不清楚的。
发明内容
本发明人已认识到即使在降低的氧条件下，三维仿生植入物的核心区域中的细胞不发生快速的细胞死亡，并且可较长时间保持活性。在可用于控制哺乳动物细胞生长和增殖的三维仿生移植物中产生营养和/或代谢物梯度。这些梯度也可以诱导细胞产生促血管生成的生理反应。产生这些反应的植入物可用于治疗应用，该应用中，需要提高血管生成和/或血管发生。
本发明的方面涉及仿生空间结构中的营养和/代谢物梯度在控制哺乳动物细胞生长和增殖中的应用。
本发明的一个方面提供了用于哺乳动物细胞培养的支架，包括：
在其表面上具有口袋的凝胶，
其中该口袋中容纳哺乳动物细胞。
合适的哺乳动物细胞包括内皮细胞，成纤维细胞，如人的真皮或肌腱成纤维细胞，基质细胞，如骨髓来源的基质细胞，以及平滑肌细胞，和干细胞。
合适的干细胞包括角膜(缘)干细胞；皮肤表皮干细胞；消化道(肠)干细胞；口腔-生殖(orogenital)干细胞；支气管和其它上皮干细胞；骨髓基质干细胞；和生长板干细胞。
口袋是凝胶表面内的凹形空间或穴形空间。口袋包括凝胶表面上的开口，其可以使细胞进和出，还包括限定了凝胶中口袋的边界的壁。优选，口袋的壁具有足够防止口袋坍塌的刚性。
口袋的尺寸适合于容纳哺乳动物细胞群。口袋的尺寸决定了口袋内细胞的数量和缺氧梯度程度，并且可根据支架的特定应用进行变化。
合适的口袋深度至少为50μm，至少为100μm或至少150μm。合适的口袋深度可达500μm，达1000μm或达1500μm。
合适的口袋直径至少为50μm，至少为100μm或至少150μm。
在一些实施方式中，口袋直径可为50μm至2000μm，更优选直径为100μm至500μm，并且深度可为100μm至5000μm，优选深度为200μm至5000μm。
支架的壁可包括其他的连接蛋白，例如胞外基质蛋白，如纤维连接蛋白、玻连蛋白和纤维蛋白(纤维素，fibrin)。
口袋中的哺乳动物细胞群，如干细胞，形成三种截然不同的细胞-表面和细胞-细胞连接的极性，其模拟了天然哺乳动物细胞巢。接近口袋壁的哺乳动物细胞在一面上具有细胞-胶原蛋白接触，在相对面上具有细胞-细胞接触。不接近口袋壁的(也就是在口袋中心的)哺乳动物细胞被其它细胞所围绕，在其周围都具有细胞-细胞接触。接近口袋开口的哺乳动物细胞具有细胞-细胞接触，在其相对面具有细胞-液体接触。
口袋中的哺乳动物细胞的代谢活性(其可伴随着细胞分裂和细胞密度的升高)消耗扩散因子、营养、氧和葡萄糖，产生代谢废物。因为通过经凝胶的扩散，扩散因子进入口袋，接近凝胶的哺乳动物细胞(如干细胞)接触高水平的这些因子。此外，通过经凝胶的扩散，代谢废物离开口袋，因此这些细胞接触低水平的细胞代谢物。
因为它们被其它消耗可扩散因子(如氧)的哺乳动物细胞所包围，不接近凝胶的哺乳动物细胞接触低水平的这些因子。此外，这些细胞会在所有表面上接触高水平的细胞代谢物。
因此支架可产生和保持模拟哺乳动物细胞巢的口袋中的扩散因子(如营养、氧和葡萄糖)和代谢废物(如CO2、乳酸和氨)的浓度梯度。
口袋中的扩散因子的梯度刺激口袋中的哺乳动物细胞(如干细胞)的分化和增殖。可通过调整梯度浓度和哺乳动物细胞的极性来控制口袋中的哺乳动物细胞的分化和增殖。这可通过改变口袋形状、细胞密度、凝胶性能或因子的外部浓度来实现。
利用口袋中的细胞量确定口袋中可实现的扩散因子(如营养、氧和葡萄糖)的最低水平。优选，口袋中只充满细胞。口袋中接种的细胞数量越大，就实现得越快。例如，口袋可接种超过500万个细胞/毫升，超过1500万个细胞/毫升或超过5000万个细胞/毫升。
随着哺乳动物细胞增殖和口袋内的细胞数量升高，细胞迁移和经口袋开口迁出增多。此外，从口袋迁出的细胞(如干细胞)可能已经被刺激分化了。增殖速率以及口袋和口袋开口的尺寸决定了细胞迁出口袋的速率。
培养哺乳动物细胞的方法可包括：
提供在其表面具有口袋的凝胶，
向口袋接种哺乳动物细胞，以及
在培养基中孵育凝胶；
其中口袋中的细胞代谢造成营养物的量从口袋的侧边向内逐渐降低。
例如，可通过塑性压制成型将口袋模压在凝胶表面上以生产适合于控制哺乳动物细胞生长和增殖的支架。在WO2006/003442中更详细地描述了塑性压制成型。可制造微结构的“模具”或模板，其对应于凝胶中的口袋所需的形状(patterning)。然后，模具和凝胶之间的接触将口袋的形状模压在凝胶中。换句话说，在模具的接触表面存在一个或多个突出，模具和凝胶之间的接触使这些突出将口袋模压在凝胶的表面中。凝胶中的口袋在尺寸和设置上对应于模具上的突出的尺寸和设置，适合于哺乳动物细胞的生长。例如，可通过模具以塑性压制胶原凝胶从而产生如上所述的深度为200μm至5000μm、直径为50-2000μm的穴形口袋。图16示出了包括模压了口袋的胶原凝胶的支架的实施例。
适合于制造模具或模板表面上的突出和其它微结构的技术在所属领域中是熟知的。例如，可通过标准蚀刻技术将突出或其它微结构施加于玻璃或硅模具，或通过电火花腐蚀技术施加于金属模具。
在一些实施方式中，可使用多孔模板或模具。如本文所述，当其被塑性压缩时，这可使液体离开凝胶。例如，可使用已成形为包含用于将口袋模压在支架凝胶中的突出或其它微结构的烧结材料(金属、塑料或陶瓷)来生产多孔模具。
本文所述的用于哺乳动物细胞培养的支架可用于体内细胞生长和仿生植入物。
在3D构建体中的暴露于如氧的扩散因子梯度的哺乳动物细胞可产生血管生成因子，如VEGF。本发明的多个方面涉及植入物中的血管生成因子的产生，其可用于诱导或促进血管生成(例如，医疗应用中)。
在移植之后可原位完全或部分地产生血管生成因子梯度。诱导或促进血管生成的方法包括：
将血管生成植入物定位以接触需要血管形成或灌注的组织，其中该血管生成植入物包括哺乳动物细胞，以及；
允许细胞进行呼吸，
其中细胞呼吸降低植入物的氧压，以及；
氧压的降低致使细胞表达一种或多种血管生成因子。
在一些实施方式中，在被定位以接触组织之前，对包括哺乳动物细胞的植入物进行体外培养，从而体外培养的细胞的呼吸降低植入物中的氧压，并在植入物被定位于体内之前致使细胞表达一种或多种血管生成因子。在移植之后，细胞在宿主体内持续表达血管生成因子。
在其它实施方式中，包括哺乳动物细胞的植入物在被定位以接触组织之前，没有在体外培养。
植入物可包括流动悬浮液中的高密度哺乳细胞团或可包括并入了哺乳动物细胞的凝胶。
移植之前，可在体外完全产生血管生成因子梯度。诱导或促使血管生成的方法包括；
体外培养包括哺乳动物细胞的血管生成植入物，以及；
允许细胞进行呼吸，从而细胞呼吸降低氧压，氧压的降低致使细胞表达一种或多种血管生成因子，
杀死所述哺乳动物细胞，以及，
将血管生成植入物定位以接触需要血管形成或灌注的组织。
因为呼吸细胞对氧的需求超过了通过表面灌注供应的氧，因此氧压降低。随着离植入物表面的距离加大，植入物中的氧压可能从植入物表面向内逐渐降低。这种氧压的逐渐的降低可造成植入物中的细胞表达的血管生成因子的量由植入物表面向内逐渐升高，即，随着离表面的距离加大，氧压降低，而血管生成因子表达量升高。
植入物中的氧压可以逐渐降低至位于植入物核心(即，离表面最远的植入物部分)的最低值。或者，最低氧压可以出现在除了核心的植入物的其它部分，例如当细胞在整个植入物不是均匀分布的情况下。
植入物中的最低氧压取决于移植物中的细胞密度和细胞的代谢活性。与相同密度的具有低代谢活性细胞相比，植入物中具有高代谢活性的细胞会产生较低的氧压。
在一些实施方式中，植入物中的最低氧压是非病理性的，即，不足以降低细胞活性或诱导细胞死亡。非病理性最低氧压可以是大于8mmHg(大于1.1kPa或大于1％氧)。例如，植入物核心的氧压可以在8mmHg至60mmHg之间。
在其它实施方式中，植入物中的最低氧压可以是病理性的，在产生血管生成因子之后在植入物中可以发生细胞死亡。
在移植到宿主之后，包括活的哺乳动物细胞的植入物可在体内产生一种或多种血管生成因子。植入物中的细胞对移植之后植入物中氧压降低做出反应，产生一种或多种血管生成因子。细胞表达的一种或多种血管生成因子扩散到植入物附近的组织中，诱导或促使该组织中血管生成。细胞生理浓度的血管生成因子的生理组合的产生引起组织中的血管生成生理反应的刺激，造成组织的血管形成增加。
在被移植到宿主内之前，植入物可在体外产生一种或多种血管生成因子。植入物中的细胞对标准培养基的体外培养过程中植入物中的氧压降低做出反应，产生一种或多种血管生成因子。适合于培养哺乳动物细胞的条件是所属领域中熟知的。在一些情况下，理想的是降低对体外培养的氧供给，从而提高或加速植入物内的氧压降低(即，开始组织缺氧)。随着植入物内的氧压降低，细胞表达的一种或多种血管生成因子扩散到细胞附近的植入物中。在体外进行预调整(preconditioning)之后，然后包括哺乳动物细胞的植入物可被移植入体内，从而细胞在宿主体内持续表达一种或多种血管生成因子。或者，在体外培养之后可杀死植入物中的哺乳动物细胞，例如通过冷冻。然后，在移植之前可储存移植物。在移植之后，在体外培养过程中植入物中表达的一种或多种血管生成因子扩散到植入物附近的组织中，诱导或促进组织中的血管生成。
本文所述的植入物的生理浓度的血管生成因子生理组合的扩散引起周围组织中的血管生成生理反应的刺激，导致组织的血管形成增多。
血管生成生理反应可以是定向的。例如，血管生成因子的浓度梯度的产生沿着浓度梯度向上促进血管生成(例如，朝向植入物的核心)。
血管生成植入物中的细胞表达的血管生成因子还有助于内皮细胞的分化。合适的内皮细胞可与血管生成植入物整合或定位以接近植入物。
本文所述的血管生成植入物可用于促进血管生成和将血管吸引到需要血管形成或灌注的组织或构建体，例如自然组织、移植物、自体移植物、移植或组织等效构建体。
本文所述的血管生成植入物提供了血管生成促进因子源，并且在组织或构建体中形成血管生成的焦点。血管生成植入物可放置于需要血管形成或灌注提高的任意部位，并且具有广泛医疗应用。
血管生成植入物可用于，例如促进大型(mm等级)组织工程化构建体中的：临床移植物(例如，皮肤或肌腱移植物)、自然自体移植物、移植物、伤口部位；激素植入物；不愈合骨折；和心肌梗死部位的血管形成。
血管生成植入物可用于，例如促进，例如药物储积池(drug depots)；伤口部位；激素植入物；不愈合骨折；和心肌梗死部位的灌注。
在本文所述的方法中，可将植入物置于自然组织中或接触自然组织，优选在需要血管形成或灌注的区域。如果需要的话，可通过任意的常规技术固定植入物。例如，可将其缝合或粘合于合适的位置。在一些实施方式中，可将流动悬浮液中的高密度细胞团在合适深度的组织点进行注射从而形成局部蓄积。适合深度的组织点可包括组织袋和组织间层。
在将包含哺乳动物细胞的植入物置于宿主之后，植入物中的细胞呼吸并耗氧。这降低了血管生成植入物中的氧压，致使细胞表达一种或多种血管生成因子。
无论在移植之前或之后表达，植入物中的血管生成因子从植入物扩散到附近的组织或组织等效构建体中，促进天然组织中的血管生成。需要血管形成或灌注的天然组织可包括修复失败的部位、慢性创伤、不愈合骨折部位和心肌梗死部位或需要提高药物或激素剂量的部位。
在本文所述的方法中，血管生成植入物可定位于外部植入物中。定位之后，血管生成植入物中的细胞呼吸并耗氧。如上所述，这导致血管生成植入物产生血管生成因子并且扩散到外部植入物中，促进外部植入物的血管生成。外部植入物可为天然的或工程化植入物、组织等效构建体、重建或美容整形嫁接物(cosmetic grafts)和移植物。在一些实施方式中，外部植入物可以是非细胞胶原凝胶。
本发明的其它方面涉及包括哺乳动物细胞的血管生成植入物，其可用于本文所述的促进血管生成方法。
本文所述的包括哺乳动物细胞的血管生成植入物可用于促进血管生成的方法，包括：
将血管生成植入物定位以接触需要血管形成或灌注的组织，其中血管生成植入物包括哺乳动物细胞；以及
允许细胞进行呼吸，
其中细胞呼吸降低氧压；以及
氧压的降低致使细胞表达一种或多种血管生成因子。
本文所述的包括哺乳动物细胞的血管生成植入物可用于制造用于促进血管生成的方法的药物，包括：
将血管生成植入物定位以接触需要血管形成或灌注的组织，其中血管生成植入物包括哺乳动物细胞，以及；
允许细胞进行呼吸，
其中细胞呼吸降低氧压，以及；
氧压的降低致使细胞表达一种或多种血管生成因子。
在上文中更详细地介绍了促进血管生成的合适的方法。
本发明的其它方面涉及包括一种或多种血管生成因子的血管生成植入物，其可用于如本文所述的促进血管生成的方法。
可通过以下方法产生血管生成植入物，该方法包括：
体外培养包括哺乳动物细胞的植入物；
允许细胞进行呼吸，从而细胞呼吸降低氧压，氧压的降低致使细胞表达一种或多种血管生成因子；以及
杀死所述哺乳动物细胞。
在表达了一种或多种血管生成因子之后，可处理植入物从而杀死其中的哺乳动物细胞。可以使用任意合适的方法。在一些实施方式中，可冷冻植入物，例如通过浸入液氮。
一旦哺乳动物细胞被杀死，在移植之前可储存植入物。可以按照常规技术，方便地将植入物储藏于4℃、-20℃或-70℃。
包括一种或多种血管生成因子的血管生成植入物可用于促进血管生成的方法，包括：
将血管生成植入物放置到接触需要血管形成或灌注的组织，其中血管生成植入物包括一种或多种血管生成因子；以及
使所述一种或多种血管生成因子从植入物扩散到组织。
包括一种或多种血管生成因子的血管生成植入物可用于制造用于促进血管生成方法的药物，包括：
将血管生成植入物定位以接触需要血管形成或灌注的组织，其中血管生成植入物包括一种或多种血管生成因子；以及
使所述一种或多种血管生成因子从植入物扩散到组织。
血管生成因子包括如趋化因子和细胞因子的蛋白，其刺激或促进组织中新血管的形成、发展和生长。血管生成植入物中的细胞表达的一种或多种血管生成因子可包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子α(TGF-α)和转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、HIF-1a和血管生长素中的一种或多种。在一些实施方式中，一种或多种血管生成因子可包括VEGF。
用于本文所述的植入物和支架的适合凝胶可包括支架纤维基质和间质液。随着纤维形成围绕初始容纳单体的水相间质液的连续网络，通过支架纤维的接合和延长形成凝胶。例如，三螺旋胶原蛋白单体最初可溶解在稀酸中，然后被诱导聚合(凝聚)以形成纤维(例如，于37℃以及中性pH中)。当纤维聚合时，会有相变，纤维的固体网络以大致相同的体积和形状来“支持”剩余的间质液-即其凝胶。由可溶单体至固体聚合物的相变是凝胶的特点。
任意的含水聚合物材料适合用于本文所述的凝胶，包括天然产生的聚合物，例如蛋白，如丝、纤维蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白或胶原(例如，I型胶原蛋白)，糖蛋白如纤维连接蛋白，或多糖如几丁质、或纤维素。在一些优选实施方式中，由胶原制成基质纤维。优选原生纤维形成的胶原类型，包括的胶原类型是I、II、III、V、VI、IX和XI，以及其(例如I，III V或II，IX，XI)的组合。例如，I型胶原可用做凝胶或支架材料。在一些优选的实施方式中，凝胶可包括5％至25％的I型胶原(干/湿重比)，更优选约10％。在一些优选的实施方式中，凝胶可包括15％至20％的I型胶原(干/湿重比)，更优选约10％。
其它合适的纤维支架材料包括合成的聚合物，即不是在人或动物体内天然存在的聚合物。合适的聚合物包括有机聚合物，如聚内酯、多糖(polyglycone)和聚己内酯(polycapryolactone)，无机聚合物，如磷酸盐玻璃，和合成的凝胶化多肽凝胶。
在一些实施方式中，纤维支架材料可以是包括两种或多种不同类型纤维的复合材料。例如，支架可包括纤维连接蛋白和胶原、胶原和聚交酯、纤维蛋白和胶原、胶原纤维和碳纳米管、或纤维、胶原和纤维连接蛋白。
间质液通常是水性液体，其支持容纳在凝胶中的细胞的生长和增殖。合适的液体包括哺乳动物细胞培养基，如Eagles MEM溶液。用作生物材料的凝胶的配制和成形技术在本领域中是熟知的(见，例如，WO2006/003442；WO2007/060459；Marenzana et al 2006 Exp Cell Res 312423-433；Tomasek et al (2002)Nat Rev Mol Cell Biol 3349-363；Harris et al Nature 290(1981)249-251；Elsdale et al 1972 J Cell Biol.54626-637；Kolodney et al J Cell Biol.(1992)11773-82；Eastwood et al Biochem Biophys Acta 1201(1994)186-192)。
通常，优选高密度凝胶从而有利于扩散因子(如氧)的梯度形成。
适合用于本文所述的植入物的凝胶可具有＞70％(湿/干重比)、＞75％、＞80％、＞85％或＞90％的液相。例如，合适的凝胶可具有75％(湿/干重比)至95％的液相，通常是约88％。
本文所述的合适的凝胶可具有1x10-6cm2/s-1至10x10-6cm2/s-1的氧扩散系数，更优选4x10-6cm2/s-1至5x10-6cm2/s-1。
还可通过确定耗尽之后的O2再平衡速率来测量凝胶渗透性，例如使用亚硫酸钠或N2饱和。在一些实施方式中，凝胶可具有经1mm的最短扩散途径的2mmHg/分钟至4mmHg/分钟的O2再平衡速率，优选O2耗尽之后在空气饱和溶液中为约3mmHg/分钟。
适合用于植入物的凝胶渗透性可以与含有5％至25％胶原的凝胶相当，优选约10％的胶原(干/湿重比)。在一些实施方式中，可使用致密的凝胶，其具有与含有15％至20％胶原的凝胶相当的渗透性。
凝胶在整个植入物中可以是均匀的，细胞产生的血管生成因子可经凝胶在各个方向上均匀地扩散。
可替换地，可构建凝胶，以使细胞产生的血管生成因子在特定的方向上经凝胶扩散得更快，并产生血管生成因子的定向梯度，即在远离产生细胞(producer cells)的特定方向上的梯度。例如，凝胶可包括多层。血管生成因子在凝胶层之间的扩散比经过凝胶层更快，产生了血管生成因子的定向梯度。
例如，可通过将平的凝胶卷成圆柱状(cylindrical)植入物来形成包括多层的凝胶(即，具有横截面的圆柱)。血管生成因子经过凝胶的扩散速度在穿过凝胶层的径向(即，与螺旋轴垂直)方向上较慢，而在凝胶层之间的轴向(即，平行于螺旋轴)方向上较快。
这种矢量扩散有助于促进其中定向血管形成比较重要的组织中的血管生成，如肌腱、神经、皮肤和骨骼。
在本文所述的促进血管生成的方法中，凝胶整合了活哺乳动物细胞，优选人细胞。凝胶中可达到的最低氧压是由凝胶中的细胞密度决定的。优选，凝胶中的细胞密度足以将O2水平降低至低于60mmHg，低于50mmHg，低于40mmHg，低于30mmHg，低于20mmHg，低于10mmHg，低于5mmHg或低于1mmHg。例如，凝胶中的细胞密度可足以将O2水平降低至8mmHg至60mmHg之间，优选20mmHg至60mmHg之间。例如，凝胶可接种超过1200万细胞/毫升，超过1500万细胞/毫升或超过2000万细胞/毫升。
在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞，如人真皮或肌腱成纤维细胞。
除了产生胞外基质，成纤维细胞能够耐受低氧压，并且相对于其它细胞类型具有低代谢率，因此氧需求低。因此，成纤维细胞呼吸造成的氧压降低要比其它细胞类型慢得多。此外，相对于整合其它细胞类型的植入物，整合了成纤维细胞的植入物中的血管生成因子的产生也降低或拖延。
在一些优选的实施方式中，用于血管生成植入物中的细胞不是成纤维细胞。相对于成纤维细胞，优选的细胞可具有高代谢活性，因此产生梯度快或对低O2敏感，从而快速产生血管生成因子。合适的细胞可选自由基质细胞(如骨髓来源的基质细胞)，平滑肌细胞和干细胞(如角膜(缘)干细胞、皮肤表皮干细胞、消化道(肠)干细胞、口腔-生殖干细胞、支气管和其它上皮干细胞、骨髓干细胞、生长板干细胞)组成的组。代谢活性升高降低了产生组织缺氧和产生血管生成因子的时间。
在一些优选的实施方式中，合适的细胞包括同种异体的GMP产生细胞(例如，人新生成纤维细胞)、同种异体的或自体血细胞，或骨髓或其它源的同种异体基因的或自体基质干细胞/祖细胞，所有这些都可用于GMP级别的临床应用。
细胞类型可反映血管生成植入物被用于的组织或应用。
合适的细胞可包括引起过敏反应的作废人细胞，如时间过期的骨髓细胞或血细胞；预培养的成纤维细胞；和动物细胞，如来自转基因猪或羊的人源化细胞。
细胞可来源于与血管形成组织相同的组织，或可来源于与血管形成组织不同的组织。
本文列出的结果显示血管生成植入物的核心区域的细胞可在持续时间内保持活性。例如，在一些实施方式中，原位24小时之后，植入物核心的细胞活性可以是至少80％，至少90％或至少95％。原位5天之后，植入物核心的细胞活性可以是至少70％，至少65％或至少80％，在植入物表面上可以是至少80％，至少90％或至少95％。
在其它的实施方式中，细胞不保持活性，但是在细胞死亡之前产生一种或多种血管生成因子。如上文所述，在一些实施方式中，在产生了一种或多种血管生成因子之后，可处理血管生成植入物从而杀死细胞。
可通过将细胞与液体支架基质混合而将细胞接种于基质中，然后使液体基质固化成凝胶。在凝胶形成之前，优选在合适的温度、pH、离子强度和剪切力的条件下进行基质接种从而保持活力。凝胶中的初始细胞密度可以是约1x104至1x107细胞/毫升，更优选约5x105至1x106细胞/毫升。
在一些实施方式中，可通过包括塑性压缩接种了细胞的凝胶的方法来产生如本文所述的血管生成植入物或哺乳动物细胞支架。这提高了凝胶内的细胞密度。塑性压缩涉及使如凝胶的物体变形从而使其体积减小，以致即使撤除了压力源，物体仍基本保持其新体积。塑性压缩是快速的、不依赖于细胞的方法，其是通过将凝胶进行物理处理(如外力或压力)产生，物理处理将间质液从凝胶中排出，从而撤除负载之后不会恢复：即，凝胶进行了塑性压缩。
例如，塑性压缩可形成包括细胞的薄片，其可被卷起或折叠从而产生多层植入物。WO2006/003442更详细介绍了凝胶的塑性压缩，包括接种了细胞的凝胶。
塑性压缩可提高凝胶的机械性能。凝胶的无边界(unconfined)压缩排出了间质液，当撤除负载其不会回复：即，凝胶进行了塑性压缩。在未处理的凝胶中，支架基质通常是体积较大的水合形式。这种支架结构在塑性压缩的过程中坍塌，但是不损失结构细节，使凝胶中的支架脱水，致使密度和强度升高。
可优化塑性压缩方法从而由标准初始凝胶获得理想的纤维和细胞的最终比例。例如，标准凝胶可包括1％至4％的胶原和0.2x106至10x106细胞/毫升。
凝胶环境优选保持在可使细胞生存的生理条件下(例如，温度、pH、水合和离子强度)。优选塑性压缩不会显著改变凝胶液体的离子性能使其偏离生理条件。
在压缩之后，凝胶可进行重复循环的单轴拉伸从而使其机械性能提高。WO2007/060459中描述了合适的循环。在压缩的胶原凝胶中，重复施加作用力(负载)循环提高了胶原蛋白纤维的融合从而产生材料强度提高的生物材料(即，断裂应力、断裂应变和/或弹性模量提高)。
可进行凝胶或生物材料的附加处理从而产生用于促进血管生成的组织等效植入物。例如，可将凝胶或生物材料模制和/或成形从而产生组织等效植入物。凝胶或生物材料可模制成预定的形状和/或可进行对称或不对称的塑性压缩。
包括细胞的凝胶或生物材料可被成形、切割或模制成任意合适的植入物形式，例如小块、大块、管状、带状、条状、环状、圆形、毛细管、卷、片状或线状。组织等效植入物的最终形状将取决于其应用于的特定环境。在一些实施方式中，组织等效植入物可具有可塑的形式，适合于进一步成形。
植入和产生血管生成因子之间的时间取决于植入物的细胞密度、途径长度和细胞代谢活性。可针对特定的应用、部位或组织，通过改变这些参数来优化血管生成植入物的性能。如上所述，植入物可在体外进行预调整从而在植入之前产生血管生成因子。例如，这可用于当植入物接种了数量少的细胞时(例如，2x107细胞/毫升或更少，1x107细胞/毫升或更少，或5x106细胞//毫升或更少)。
一旦形成，如上所述包括细胞的植入物会稳定地具有合适配比和比例的血管生成因子，从而刺激附近组织的血管生成生理反应。
在一些实施方式中，可直接使用或在体外预调整之后将包括活哺乳动物细胞的植入物用作血管生成发生器(motor)。
在其它的实施方式中，在体外培养之后，可整体或通过随后分区或其它控制破碎和/或分割来冷冻或冻干植入物。尽管不再含有活细胞，得到的植入物包括血管生成因子，其从植入物扩散出来从而促进周围组织的血管生成。通过原始凝胶基质的结构(纳米-微米-级别)可控制扩散的方向。
包括血管生成因子而不包含活细胞的植入物是高度稳定的，保存期限(货架寿命)长，可用于临床和兽医应用的现成应用从而刺激血管生成。例如，在外科手术过程中可将植入物直接提供给临床需要的任意位置；使用常规针头注射或使用常规的内窥镜作为其它治疗的部分进行提供。这可使临床医生能够控制局部组织灌注。
本文所述的方法可用于促进需要血管形成或灌注的组织的血管生成，例如具有血管形成缺陷的组织。具有血管形成缺陷的组织可包括其可受益于刺激血管生成、提高血流量和/或提高血管分布的任意组织。
例如，本文所述的方法可用于促进血管生成从而加速或提高创伤或溃疡愈合，皮肤移植物、肌皮瓣(musculocutaneous flaps)或其它的外科手术移植组织(例如，重新接上断肢)的血管形成从而保存其功能和活力；手术缝合(例如，胃肠外科手术之后的肠的重新连接的部分)的愈合或改善皮肤的生长。
本文所述的方法还可用于促进治疗与血管形成降低或受损相关的疾病和状况中的，或可受益于刺激血管生成、提高血流量和/或提高血管形成的疾病和状况中的血管生成。可治疗的状况的实施例包括与血管(如动脉、静脉或毛细血管)堵塞相关的任意情况。情况的实施例包括血管闭塞疾病，如冠状动脉闭塞症、颈动脉闭塞症和动脉闭塞症；外周动脉疾病；动脉粥样硬化；肌内膜增殖(例如，由于血管手术或球囊血管成形术或血管支架术)；血栓闭塞性脉管炎；血栓性疾病；肠系膜缺血或肢体缺血；器官狭窄；脉管炎、心肌梗死或脑梗死或其它的与血流量降低相关的血管性死亡、中风、肢体缺损。
根据本发明的各个其它方面和实施方式对于所属领域的一般技术人员会是显而易见的。
本文所用的“和/或”意指具体公开包括两个特定要素或成分中的每一个或其中之一。例如，“A和/或B”可被认为是具体公开(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每一个，好像每一个在本文中单独列出一样。
除非文中另有说明，上文列出的特征的描述和定义不限定于本发明的任意特定方面或实施方式，并且等效应用于描述的所有方面和实施方式。
附图说明
下面通过实施例的方式并参考下文描述的附图和表来说明本发明的某些方面和实施方式。
图1图示了在塑性压缩的螺旋构建体的中心具有氧探针的实验设置。构建体被培养在50ml培养基中。
图2示出了无细胞的塑性压缩构建体中心的氧水平。
图3示出了具有亚硫酸钠的无细胞的塑性压缩构建体的脱氧作用，随后在DMEM培养基中氧化(值为4.5+/-0.5mmHg/分钟和3.2+/-0.5mmHg/分钟)。利用曲线图的近似直线部分估算梯度(对应于脱氧和再氧化速率)。
图4示出了接种了细胞(cell-seeded)的塑性压缩构建体的中心的氧水平。测量了不同细胞密度的氧水平，5.8x106-23.2x106细胞/ml，放大率比例条50mm(0.5x106-2x106细胞/构建体)，*p＜0.0001。对于每一数据组，n的平均值＝3。时间“0”被认为是当探针被放置于构建体中的时间点。
图5示出了接种了5.8x106细胞/ml(上部)、11.6x106细胞/ml(中部)和23.2x106细胞/ml(下部)的塑性压缩构建体的中心和外部区域的共焦图像。
图6示出了接种了细胞的构建体中心的氧水平，构建体中有2x106个细胞(23.2x106细胞/ml)，经过10天周期，在第5天从构建体的中心和表面具有支持性的细胞活力。曲线图示出了n的平均值＝3。显微图片的放大率比例条是100mm。
图7示出了第24小时不同细胞密度的构建体中的VEGF水平。未发现不同细胞密度之间的VEGF水平的显著差异。
图8示出了经过10天周期含有200万细胞/构建体的构建体的VEGF水平(以GAPDH为参照，以第1天作为固定校准)在第8天测量显示出统计学上的显著升高，其在第10天降低(**p＜0.001，*p＜0.05)。
图9示出了接种2x106细胞，培养8天(VEGF表达峰)的螺旋构建体，将其展开从而研究构建体的三个区域中的VEGF(因为将这些对应的区域螺旋对应于初始构建体中心、中部和表面的三个不等厚度，分别大约是7、5和3层)。VEGF表达归一化到GADPH，以第1天作为固定校准，其在第24h时是23.2x106细胞/ml。发现凝胶中心的VEGF的水平显著较高(*p＜0.001)。
图10示出了本文所述的仿生干细胞穴的实施例。
图11示出了利用ELISA确定的接种了2x106HDF并且体外孵育5和10天的胶原构建体的HIF-1a水平。
图12示出了利用ELISA确定的接种了2x106HDF并且体外孵育5和10天的胶原构建体的VEGF水平。
图13示出了接种了2x106HDF的胶原构建体，通过体外孵育5天进行预调整(上)或没有进行预调整(下)，并且皮下植入兔子内保持1周。
图14示出了接种了2x106HDF，冷冻在液氮中没有进行预调整并且皮下植入兔子内保持1周的对照胶原构建体(上部)，以及没有接种细胞或进行冷冻，皮下植入兔子内持续1周后的对照非细胞胶原构建体(下部)。
图15示出了接种2x106HDF，通过体外孵育10天进行预调整，然后冷冻在液氮中，并且接着皮下植入兔子内保持1周的胶原构建体。
图16示出了具有用于容纳哺乳动物细胞的压模口袋的胶原支架。
具体实施方式
方法
细胞培养和扩增
如以前文献[13]所述，从新生包皮移植人真皮新生成纤维细胞(在包皮环切术之后，从手术室新鲜获得，具有完全伦理许可的)。细胞保持在Dulbecco’s modified Eagles培养基中(DMEM，Gibco，Paisley，英国)，填充了10％FCS(First Link，West Midlands，英国)，2mM谷氨酸盐和青霉素/链霉素(1000U/ml；100mg/ml，Gibco Chemicals)。为了从单层培养物分离细胞，以0.1M PBS洗涤含有细胞的烧瓶，并且与胰岛素(0.5％，5mMEDTA)一起于37℃孵育5分钟。
3D塑性压缩胶原凝胶培养
一旦分离，计数细胞，并且将其植入3D I型胶原凝胶。将胶原凝胶放入模型中(2.2x3.3x1cm3)。为了制备胶原凝胶，将0.5ml 10_EaglesMEM溶液(Gibco)加入到的4ml 0.1M醋酸中的鼠尾I型胶原(First Link)中，蛋白浓度2.035mg/ml，利用从黄色至不均匀的粉红色(cirrus pink)的颜色指示变化以5MNaOH来进行中和[14]。将该凝胶制备物加入到细胞悬浮液中。在设定和孵育之后，常规地通过压缩和使用网孔和纸片层来吸干(blot)的组合将凝胶压缩[12]。简单地说，将165-mm厚的不锈钢网和尼龙网层放置于双层吸水纸上。将胶原凝胶放置于尼龙网上，覆盖第二个尼龙网，在室温下装上120g扁平金属块(钢)持续5分钟，产生在两个尼龙网之间被保护的胶原蛋白平片(50-60mm厚)。然后将这些致密的胶原蛋白片卷起从而产生紧密螺旋缠绕的棒，直径为2.3mm，长度为21mm。通过塑性压缩，细胞密度升高，细胞密度的升高与凝胶体积的降低成正比，最终细胞密度被计算为：初始细胞密度x体积变化倍数。因此对于5ml的一般初始凝胶体积，胶原蛋白的比例是0.2％，在压缩之后其升高至11％(通过干/湿重比测量)，其对应于58倍升高。人们期望细胞密度会以相同的程度改变，由总的100000细胞/ml(或50万细胞/构建体)至580万细胞/ml的终密度；200000细胞/ml(或100万细胞/构建体)至1160万细胞/ml；400000细胞/ml(或200万细胞/构建体)至2320万细胞/ml[15]。
氧监控
将光纤氧探针(Oxford Optronix，Oxford，英国)插入3D螺旋构建体的中心，并且沿着构建体的轴放置于中间(图1)。然后使用氰基丙烯酸酯胶于末端将构建体封住。因为构建体末端被封，因此研究＞1mm的扩散长度，并且主要是指径向(侧向)扩散。传感探针(直径280mm)的尖端整合了在氧渗透基质中的氧敏感发光探针。在分子氧的存在下，发光被淬灭，因此当周围培养基的氧浓度较低时，发光寿命会较长。精确至0.7mmHg的探针的刻度主要依赖于发光寿命(而不是强度)对氧浓度的关系[16]。该方法产生了非常稳定的标准反应，因此每一探针以最慢的取样率可使用达6天。因此，监控构建体超过6天，撤走过期的探针，在第5天插入新探针(见下文)。在每一实验之后，检查外部培养基中的探针的读数从而确定反应没有漂移。光纤探针可与连接于A/D转换器(12位)的OxyLabpO2ETM系统联合使用，使用Labview将结果记录在IBM PC计算机上。结果被表示为分压值，也就是以mmHg计的pO2(例如，7.6mmHg对应于1％的氧)。可根据进行的实验改变取样率，实现总反应时间＜10秒(对于脱氧测量，图2和图3)并且对于如图4和5所示的长期研究达到～30秒。对于氧经过构建体的扩散速率的研究，我们将含有探针的构建体转移至37℃的3％亚硫酸钠的缺氧溶液中。用曲线图的近直线部分估算了脱氧和再氧化的速率，如图1至3所示。将样品保持在7.5％CO2富集培养箱中进行监控。在每一实验的结尾，移走构建体，测试培养基中的环境O2压，其大致保持在140mmHg。
细胞活力
使用活细胞/死细胞生存力/毒性试剂盒(Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit(Molecular Probes，L-3224)估计了细胞活力，该试剂盒是基于分别以钙黄绿素AM和溴乙啡啶均二聚体(EthD-1)同时确定活细胞和死细胞从而定量分析。根据制造商的方案用活细胞/死细胞减少的生物危害生存力/毒性试剂盒(Live/Dead Reduced Biohazard Viability/Cytotoxicity)(Molecular Probes，L-7013)进行了定量分析。使用了绿色荧光核酸染料SYTO_10和Dead Red(溴乙啡啶均二聚体-2)，在捕获图像之后，计数活/死细胞核从而确定活力百分比。从氧测量中独立判断每一构建体中的细胞活力。在塑性压缩的构建体的两个区域(核心和表面)选择确定O2的代表部分，并且使用共聚焦显微镜方法(Bio-Rad Radiance 2100，Carl Zeiss Ltd，Hertfordshire，英国)进行细胞可视化。Mol.Life Sci.Research Article 3。VEGF mRNA的定量PCR分析。与氧测量独立地进行从实验构建体提取RNA。从整个构建体提取RNA，或从螺旋构建体的特定区域(核心、中部和表面)提取。通过展开该螺旋体并且切割成对应于核心、中部和表面的三个不同的区域，在培养后将这些区域分隔开来。使用Qiagen RNeasymethod(Qiagen，英国)从细胞3D塑性压缩构建体分离总细胞RNA。首先将构建体在液氮中速冻，在每一样品中加入含2-巯基乙醇的500ml裂解缓冲液，使其在室温下溶解40分钟(Qiagen，英国)。然后使用21-G针头吸入得到的溶液，然后遵循商业试验方案(Qiagen，英国)。在无RNA酶的水中洗脱RNA，通过260nm和280nm的分光光度计来确定浓度(Genequant，Pharmacia Biotech，NJ，USA)。使用Amplitaq反转录酶进行cDNA第一链的合成(Applied Biosystems，Roche)。将总RNA(0.5mg RNA)在38.85ml的水中稀释。每一管中再加入9.15ml的标准混合物(dNTP、RNA酶抑制剂、MgCl2、寡聚胸腺嘧啶随机引物；Applied Biosystems，Roche)，于70℃加热持续10分钟；然后每一管中加入2ml的反转录酶，在40℃孵育管持续1.5小时，然后于90℃加热持续2分钟从而使残留的任何酶变性。
VEGF的实时定量PCR
使用Applied Biosystems7300实时PCR系统(CA，USA)以Taqman通用PCR标准混合物(Applied Biosystems)进行相对定量PCR。将9ml/反应的cDNA与1ml所需的基因探针(VEGF，Applied Biosystems分析编号：Hs00900057_ml或GAPDH，Applied Biosystems分析编号：Hs99999905_ml)和10ml的Mastermix(Applied Biosystems)在96孔板中进行混合，从而在Applied Biosystems 7300实时PCR机器中进行循环和分析(反应总体积：20ml)。引物序列未公布，由Applied Biosystems(Roche)保密。调整每一引物设置从而在7300实时PCR机器中最优运行。组合热循环和扩增特异性软件能够检测作为单管反应中逐个循环累积的PCR产物。每一样品的值归一化到对应的GAPDH结果，其在任意测试的样品中不会显著变化。通过表示相对于校准的每一样品/GAPDH比来进行相对定量。该校准设定为第1天每一构建体200万个细胞。该校准与每一测试一起运行并进行比较。通过这样做，可以解释运行之间的任意的小变化，因为我们是依赖于相对定量。在每一PCR运行中测量该校准(无显著变化)，并且其总被设定一致，样本的变化表达为相对于其的倍数升高或降低。在细胞密度、培养周期和区域试验的情况下，其被设定为24小时的200万细胞/构建体。因此，基因表达变化的所有相对定量都是相对于其设定的。
结果
图1中示意性显示了3D监控设置。无细胞的构建体上的确认和校正研究(图2)显示了无细胞的构建体的核心中的O2压的稳定基线水平，经过24小时具有可忽略的氧消耗(与外部培养基无显著差异)，与探针的最低O2消耗一致。通过添加并且随后去除和洗去3％的亚硫酸钠溶液来使系统隔绝O2，证实了核心O2水平的细胞依赖性消耗和恢复(图3)。观察到氧水平在几分钟内降低程度逐步加大，在大约30分钟后达到零。注意，探针的时间反应被设置为＜10秒。通过将仍含有探针的构建体转移回空气饱和的溶液测量了恢复至空气饱和pO2水平，其大约以3.2x0.5mmHg/分钟的速率发生。使用N2饱和培养基而不是亚硫酸钠试剂可发现类似的快速再平衡速率。细胞构建体在其核心(其中放置探针)经过24小时的周期表现出时间依赖性氧消耗(图4)。氧水平朝向基本稳定状态或平稳值快速降低，基本稳定状态或平稳值根据细胞密度变化。因此，细胞消耗似乎是影响构建体中的氧水平的唯一因素。细胞密度是氧消耗反应程度的关键决定因素，较低的核心pO2与较高的细胞密度相关，该细胞密度范围是从0、580万、1160万至2320万细胞/ml。在这种情况下，随着细胞密度的每一升高，平稳O2压显著降低(p＜0.001)。接种了50万细胞(终密度为580万细胞/ml)的构建体中心的氧水平在24小时后大约是80mmHg，与接种了200万细胞(最终细胞密度是2320万细胞/ml)的构建体相比，其水平是～25mmHg。
在这24小时期间，在核心，细胞接触低水平氧对细胞活力没有影响。接触了80mmHg和25mmHg之后，构建体核心的细胞都具有超过95％的活力(图5)。因此细胞接触低至25mmHg的氧压在长达5天的时间不会提高细胞死亡。在第10天，在核心中观察到达55％的细胞死亡，与之相比表面上是40％。在这样的3D模型中，关键的较高分子量营养物的扩散也是细胞生存的限定因素。早先已经建立了葡萄糖扩散系数，未发现这对于相同的3D模型中的细胞是有限定的[17]。
图6显示了以初始细胞密度为200万细胞(2320万细胞/ml)接种的构建体的核心O2经过10天的曲线图。重要的是，在初始24小时跌至～25mmHg的第一个平衡水平之后，核心氧压升高至约60mmHg的第二个升高的稳定期。这可能是细胞消耗变化的结果，而不是材料性能变化的结果(图6)。经过10天，通过增殖，细胞数量没有大的变化。5天后，核心细胞活力仍然是80％，表面上的接近于100％。因此，在30小时和36小时培养期之间，稳定的核心O2压升高了35mmHg(升高倍数＞2)，大约达到60mmHg。这是在6个小时期间中发生的，与成纤维细胞代谢的变化和O2利用一致。在随后的24小时基本保持在该水平，然后在随后的72小时中逐渐降回至～20mmHg。
在研究的三种细胞密度的构建体中和经过10天培养的2320万细胞/ml的构建体中测量了VEGF mRNA表达水平(图7和图8)。在24小时阶段，三种细胞密度的相对VEGF基因表达水平没有显著性差异，在这里显示为相对于最高细胞密度(图7)。经过更长的10天周期，2320万细胞/ml构建体中的VEGF表达水平显著变化(图8)。在第1天和第3天之间(2320万细胞/ml)VEGF表达升高了5倍(p＜0.05)，随后在第3天和第7天之间有小的逐步升高，达到了比第1天的水平增长了11倍(p＜0.05)。但是最大的变化是在第7天和第8天之间观察到的。表达跳至140倍，总共达到第1天的151倍。紧接着就是完全表达(149倍)的崩塌，这使到第10天表达已返回至第1天水平。生长因子表达的显著时间峰(temporal spike)的这种模式是基于依次运行的多个不同分子元件的控制系统的特征，这正是对血管生成刺激所预期的。如在该系统中，当只监控有序混合物中的一个生长因子时，则会预期到VEGF表达中这样的尖峰。在研究的较低细胞密度中未观察到经过10天的这种VEGF调节形式。
在8天的培养期确定了贯穿螺旋构建体(2320万细胞/ml)的厚度的VEGF表达的区域变化，沿着O2压梯度也是如此(核心、中部和表面)。在培养之后，通过展开螺旋构建体测量了区域变化(图9)。认为在大部分培养期间，凝胶核心部分的细胞(其是探针取样的区域)接触20mmHg至60mmHg之间的O2水平，中部区域接触60mmHg至100mmHg之间的O2水平，在非常接近通气培养基的外部接触100mmHg至140mmHg之间的O2水平。在核心区域发现VEGF水平显著较高，其中细胞接触最低的O2水平。图9显示在这些条件下(即，第8天的基础区域异质)第8天的(2320万细胞/ml)的VEGF表达梯度。重要的是，表面区域中的细胞仍然表现出水平升高的信息(高于第1天的基础VEGF水平4.7倍)。在中部和核心区域，升高到高于第1天水平的7.1倍和10.1倍的表达，与O2压和VEGF基因表达的直接关系一致。然而，如果在表面区域发现了高O2压，这表示细胞或者对可用的O2的极微弱降低极度敏感，或者更可能是，表面区域细胞对产生的并且从核心细胞扩散出的早期细胞因子或代谢信号(在这里未测量)做出反应。这表示存在扩大VEGF表达提高的区域的系统。
“较深层”细胞接受充足营养物和氧用于正常活性和最终用于生存的能力主导了目前对于组织活力和3D细胞构建体的观点。在完整组织中，这样的因子显然受到微血管灌注的存在和速率的控制。没有该过程时，在3D培养中，细胞完全依赖于从构建体边缘的简单扩散。但是，很少有(如果有的话)有效地定量确定的3D模型，其能够测试基质密度和细胞密度在O2消耗上的相互作用。因此，对于细胞易受低O2的影响的性能，以及其反应的速率、程度和性质(不含细胞死亡)的概念是过分简单的。重要的是，许多是基于肿瘤或其它细胞群，胞外基质环境很少或没有。本研究发展了第一个结缔组织3D监控模型，以便精确确定哪些因素控制并且它们怎样影响驻留细胞的行为和生存。使用该模型，经过几天研究氧对VEGF的时间依赖性，以及空间测量。
在该系统(体内)中有几个达到3D构建体和组织的核心(离灌注点最远)的最低O2压水平和速率的关键决定因素：(1)细胞密度，其被认为是均匀分布的，但是可区域性地变化和随时间变化，(2)基质密度/对限定扩散成分(O2或其它营养物)的可渗透性，和(3)细胞类型或细胞活性(即，细胞的O2需求，其取决于需氧/厌氧和活跃/静止期；例如，软骨细胞、真皮成纤维细胞、成肌细胞)。3D胶原构建体的塑性压缩工艺提供了对所有这些因素的控制。通过初始接种和初始胶原含量(分别)乘以压缩倍数(x58)确定细胞和基质密度。胶原蛋白基质具有约88％水的纳米纤维状网格，使其对于O2是高度渗透的。
在实验的最初10-30分钟，O2的初始消耗速率是非线性的，但是此后基本是稳定的。在该系统中，O2降低的速率和O2的平衡消耗是完全可预知的，取决于细胞密度(图4)。除了相对较高的基质密度和构建体中心产生的O2消耗，以最高的细胞密度，在24小时时，细胞活性未受影响，5天后只是稍微降低(活细胞＞80％)(图6)。为了将这与细胞对低O2水平的反应的其它工作进行联系，病理组织缺氧通常设定为＜1％或8mmHg[6，18]。结果是高细胞密度构建体的核心的pO2水平从未跌至低于18mmHg，因此不是常规的组织缺氧(细胞缺氧)(图6)。这对于认为扩散梯度＞1mm通常损害细胞的传统看法提出了质疑，但是支持这样的观点，即致密的纤维状胶原只是代表了弱的扩散屏障(即，对于小分子是高度渗透性的)。考虑到具有约88％液相的基质纳米纤维状网结构，这种对O2的高度渗透性是合理的。在这里通过4.5x0.5mmHg/分钟的O2再平衡速率(1mm的最短扩散途径)确定了这种高渗透性。
重要的是，核心O2压的更大幅度降低显然取决于细胞数量，显示出不一定是基质扩散途径长度决定细胞反应，而是覆盖的每一个消耗O2的细胞层数目。这深入了解了为什么与结缔组织相比，细胞富集而基质薄弱的结构(肿瘤、器官)的核心更容易发生核心细胞坏死。与第8天的总读数相比，不同区域测量的VEGF整体水平显著较低。这可能是由于处理构建体慢，因为它们必须被小心地展开，在这期间(达1小时)VEGF值可能已经降低，因为整个构建体中的细胞都接触了正常含氧量，包括展开的最后阶段的核心区域。接触低氧压的细胞通过显著升高TGF-b、血小板源生长因子(PDGF)和VEGF表达来产生反应。因此，这样看起来似乎一定程度地接触低水平氧事实上有助于组织构建体成熟，并且事实上会对细胞生存有益。改变O2压对细胞增殖和分化的影响对于理解生理微环境如何影响细胞行为是关键性的，已有工作显示低水平的氧提高了多种细胞类型的增殖，包括成纤维细胞[22，23]。降低的O2压下的细胞生长不一定导致细胞死亡。当在2％氧(～15.2mmHg)下培养时，刺激了滋养层细胞增殖，而当20％(152mmHg)时，细胞确实脱离细胞周期，开始提高分化[22]。本研究中测量到的降低的O2压(降低至15mmHg)接近Ma等人的研究中使用的O2压[22]，虽然直接外推法在这里是不可靠的(dangerous)，但是由于细胞类型和细胞密度的差异，可提取某些类似的。例如，其确实突出了似是而非的观点：3D细胞/基质培养物复合物由于氧消耗在中心可能发生细胞死亡，相较之下，数据显示组织培养中的氧压水平降低能提高细胞增殖，并且事实上模拟了许多天然的细胞环境。因此，氧压的准确和3D定位测量对于决定我们对于任意给定3D组织模型的理解是关键性的。例如，必须调控局部的高水平和低水平氧从而在不同阶段刺激细胞增殖和细胞分化来使模型成熟。
对持续的低氧压(＞24小时，高密度)的三个细胞反应的第一个是显著转换至无氧代谢，在23小时之后表现为氧压的相对升高(图4)。尽管证实这超过了本研究的范围，这样的转换至主导糖分解代谢似乎是最合理的解释，因为在这种情况中可排除能够解释这种核心O2升高的细胞数量或基质可渗透性的变化。这种细胞代谢的一致转换不是令人惊奇的。但是，确实显示出这样的细胞具有低O2反应，即使高于常规的病理组织缺氧，并且这会激发进一步的下游反应。大多数组织修复和组织工程整合方法取决于由数种血管生成蛋白(包括VEGF)激发的快速血管生成。
转录因子HIF-1a诱导VEGF的表达，转录因子HIF-1a具有氧敏感降解结构域[24，25]。到第8天，细胞密集构建体中测量到VEGF mRNA水平的大幅度提高。这种上调的一个起因可能是低水平O2或产生的糖分解代谢的持续期[26]。重要的是证实此时细胞死亡不明显(在第5天＞80％细胞活力)，因为这显示了VEGF反应是不依赖于死亡细胞(dying cells)的。但是，到第10天，测量到细胞活力的降低，这已成为第10天VEGF水平降低的主要原因。此外，能够证明很多(尽管不是全部)VEGF反应是由于构建体核心的细胞，其中水平被认为是20mmHg至60mmHg的范围，而相比下构建体表面的是100mmHg至140mmHg。这是可实现的，因为在氧测量之后可以展开3D螺旋模型，因此这可使我们对应空间位置定量标出哪里的VEGF产生上调。细胞接触O2取决于它们在凝胶构建体中所位于的特定区域，其相应地影响了VEGF水平。重要的是，当构建体接种了不同细胞密度(因此接触构建体中不同的O2梯度)时，至24小时未观察到VEGF的上调。梯度由82mmHg至140mmHg变化(50万)，66mmHg至140mmHg(100万)，和23mmHg至140mmHg(200万)。这种体外受控系统可以使O2-依赖性VEGF调控被仔细监控。因为O2水平未跌至低于15mmHg，并且肯定未低至7.6mmHg(1％氧)，不能说VEGF上调的起因是典型的“病理组织缺氧”。因此，这种低水平O2(生理组织缺氧范围内的)对于细胞刺激VEGF的信号的出现可能是通过其转录因子HIF-Ia的初始上调实现的。
为了评价体外预调整对于血管生成植入物的作用，如上所述产生3D胶原构建体并且接种2x106人真皮成纤维细胞(HDF)。通过ELISA测量体外培养5和10天后构建体中的血管生成因子HIF-1a和VEGF的量。体外培养之后在构建体中观察到高水平的HIF-1a和高水平的VEGF(图11和图12)。通过ELISA，在未进行体外培养的对照凝胶中，HIF-1a和VEGF均未被观察到。
为了评价体内含有活细胞的血管生成植入物的效果，如上所述产生了3D胶原构建体并且接种2x106人真皮成纤维细胞(HDF)(等于23x106细胞/ml)。构建体进行体外预调整5天，或不进行预调整。然后将构建体植入非细胞胶原包裹中，并且皮下植入兔子中(皮下)。1周之后，回收该构建体(见图13)。都观察到从宿主向预调整和未预调整构建体向内生长的血管，表示两种类型的构建体都刺激兔子宿主中的血管生成反应。相对于未预调整的构建体，在预调整的构建体中观察到血管形成的增加。
然后以接种了5x105人真皮成纤维细胞(HDF)(等于5x106细胞/ml)的3D胶原构建体重复以上实验。该构建体进行体外预调整5天，或不进行预调整。然后将构建体植入非细胞胶原包裹中，并且皮下植入兔子中(皮下)。1周之后，回收该构建体并且评价血管形成。观察到进行了体外预调整的构建体中的血管形成。在未进行预调整的含有5x105细胞的构建体中未发生血管形成。
在对照实验中，同时将不含有细胞的3D胶原构建体皮下植入兔子中。1周之后，回收非细胞构建体并且评价血管形成。未观察到血管形成。
为了评价体内不具有活细胞的血管生成植入物的效果，如上所述产生3D胶原构建体并且接种2x106人真皮成纤维细胞(HDF)(等于23x106细胞/ml)。该构建体不进行预调整(对照)或通过体外培养10天进行预调整，然后将所有的构建体在液氮中冷冻5分钟，植入非细胞胶原蛋白包裹中，皮下植入兔子中(皮下)。1周之后，回收该构建体。在未进行预调整的对照构建体中未观察到明显的血管形成(图14)。与之相对，在冷冻之前观察到宿主血管向内生长到已进行预调整的胶原植入物中(图15)。
因此，显示出本文所述的细胞和非细胞血管生成植入物都促进血管生成。
综上所述，我们已经建立了基本模型，用于研究3D胶原基质中的人真皮成纤维细胞的O2消耗。非常明显，观察到由于接触较低水平的氧未对细胞活力造成有害影响。进而，确定了在低pO2但是非组织缺氧条件下的VEGF调节模式。本研究还显示可改变自然发生的血管生成信号，用于在植入之后在这样的3D组织工程改造构建体中诱导血管生成。对于3D构建体核心中的VEGF的产生，以及其它的细胞产生的血管生成信号，细胞产生的水平越低，它们离表面越近，这些信号的梯度会诱导从3D构建体的表面朝向核心的血管形成，在体内情况下可能引起从构建体外部的血管形成。例如，通过了解确定密度的和在确定基质中的细胞何时和何处会上调VEGF产生，可用于促进植入物的体内整合。
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Claims (55)

1.一种用于细胞培养的支架，包括：
在其表面上具有口袋的凝胶，其中所述口袋容纳哺乳动物细胞。
2.根据权利要求1所述的支架，其中所述凝胶是胶原凝胶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的支架，其中所述口袋的深度是200μm至5000μm。
4.根据前述权利要求任一项所述的支架，其中所述口袋的直径是50μm至2000μm。
5.根据前述权利要求任一项所述的支架，其中所述口袋容纳超过500万细胞/毫升。
6.根据前述权利要求任一项所述的支架，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
7.根据权利要求6所述的支架，其中所述干细胞选自由角膜干细胞；皮肤表皮干细胞；消化道干细胞；口腔-生殖干细胞；上皮干细胞；骨髓基质干细胞；和生长板干细胞组成的组。
8.根据前述权利要求任一项所述的支架，其中所述口袋只容纳细胞。
9.根据前述权利要求任一项所述的支架，其中所述哺乳动物细胞在所述口袋内产生扩散因子和代谢废物的浓度梯度。
10.根据权利要求9所述的支架，其中所述浓度梯度刺激所述口袋中的细胞分化和增殖。
11.一种培养哺乳动物细胞的方法，包括：
在其表面上提供具有口袋的凝胶；
向所述口袋接种哺乳动物细胞，以及
在培养基中孵育所述凝胶；
其中所述口袋中的所述细胞的代谢致使营养物的量从所述口袋侧边向内逐渐降低。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述凝胶是胶原凝胶。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述口袋的深度是200μm至5000μm。
14.根据权利要求11至13的任一项所述的方法，其中所述口袋的直径是50μm至2000μm。
15.根据权利要求11至14的任一项所述的方法，其中所述口袋容纳超过500万细胞/毫升。
16.根据权利要求11至15的任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
17.根据权利要求11至16的任一项所述的方法，其中所述干细胞选自由角膜干细胞；皮肤表皮干细胞；消化道干细胞；口腔-生殖干细胞；
上皮干细胞；骨髓基质干细胞；和生长板干细胞组成的组。
18.根据权利要求11至17的任一项所述的方法，其中所述口袋只容纳哺乳动物细胞。
19.根据权利要求10至16的任一项所述的方法，其中所述营养物的浓度的逐渐降低刺激所述口袋中的哺乳动物细胞的分化和增殖。
20.一种产生用于培养哺乳动物细胞的支架的方法，包括：
提供凝胶，
将所述凝胶的表面与在其表面上具有一个或多个突出的模具接触，以使所述突出在所述凝胶的表面内压出口袋；以及
向所述口袋接种哺乳动物细胞。
21.一种诱导或促进血管生成的方法，包括：
将血管生成植入物定位以接触需要血管形成或灌注的组织，其中所述血管生成植入物包括哺乳动物细胞；以及
允许所述细胞呼吸，
其中所述细胞的呼吸使得氧压降低；以及
所述氧压的降低致使所述细胞表达一种或多种血管生成因子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在包括所述哺乳动物细胞的所述植入物被定位以与所述组织接触之前，进行体外培养，
其中体外培养的所述细胞的呼吸降低所述植入物中的氧压，并且使所述细胞表达一种或多种血管生成因子。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在包括所述哺乳动物细胞的所述植入物被定位以与所述组织接触之前，没有进行体外培养。
24.根据权利要求21至23的任一项所述的方法，其中将组织等效植入物定位以接触所述组织之后，所述植入物中的所述哺乳动物细胞的活力为至少80％，持续至少24小时。
25.一种诱导或促进血管生成的方法，包括：
体外培养包括哺乳动物细胞的血管生成植入物；以及
允许所述细胞呼吸，从而所述细胞的呼吸降低氧压，所述氧压降低致使细胞表达一种或多种血管生成因子，
杀死所述哺乳动物细胞，以及
将所述血管生成植入物定位以与需要血管形成或灌注的组织接触。
26.根据权利要求25所述的方法，其中通过冷冻所述植入物杀死所述哺乳动物细胞。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中在被定位以与所述组织接触之前，储存所述血管生成植入物。
28.根据权利要求21至27的任一项所述的方法，其中所述呼吸造成所述植入物内的氧压从植入物表面向内逐渐降低。
29.根据权利要求21至28的任一项所述的方法，其中所述凝胶中的所述细胞表达至少一种血管生成因子，所述血管生成因子的量从所述植入物表面向内逐渐升高。
30.根据权利要求21至29的任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是成纤维细胞。
31.根据权利要求21至30的任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是非成纤维细胞。
32.根据权利要求21至31的任一项所述的方法，其中所述植入物内的氧压降低至8mmHg至60mmHg之间的水平。
33.根据权利要求21至32的任一项所述的方法，其中所述植入物包括并入所述哺乳动物细胞的凝胶。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述凝胶是胶原凝胶。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述凝胶包括5％至25％(干/湿重比)的胶原。
36.根据权利要求33至35的任一项所述的方法，其中所述凝胶被塑性压缩。
37.根据权利要求21至36的任一项所述的方法，其中所述植入物包括超过1200万哺乳动物细胞/毫升。
38.根据权利要求21至37的任一项所述的方法，其中所述一种或多种血管生成因子从所述植入物扩散到所述组织。
39.根据权利要求21至38的任一项所述的方法，其中所述植入物包括多层，并且所述一种或多种血管生成因子优选在所述层的平面内扩散。
40.根据权利要求21至39的任一项所述的方法，其中通过提供接种哺乳动物细胞的凝胶、并且塑性压缩所述凝胶产生所述植入物。
41.根据权利要求21至40的任一项所述的方法，其中所述组织是皮肤或手术移植的组织。
42.根据权利要求21至41的任一项所述的方法，其中所述组织包括一种或多种创伤或溃疡，并且所述组织中的血管生成反应促进所述创伤或溃疡愈合。
43.根据权利要求21至41的任一项所述的方法，其中所述组织包括手术造成的缝合。
44.根据权利要求21至40的任一项所述的方法，用于在治疗与血管形成减少或受损相关的状况中促进血管生成。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述状况选自由血管闭塞疾病；
外周动脉疾病；动脉粥样硬化；肌内膜增殖；血栓闭塞性脉管炎；
血栓性疾病；肠系膜缺血或肢体缺血；器官狭窄；脉管炎、心肌梗死或脑梗死或其它的与血流量降低相关的血管性死亡、中风和肢体缺损组成的组。
46.一种包括哺乳动物细胞的血管生成植入物，
所述植入物用于诱导或促进血管生成的方法；包括：
将所述血管生成植入物定位以与需要血管形成或灌注的组织接触；以及
允许所述细胞呼吸，
其中所述细胞呼吸降低所述凝胶中的氧压，所述氧压的降低致使所述细胞表达一种或多种血管生成因子。
47.包括哺乳动物细胞的血管生成植入物用于根据权利要求21至45的任一项所述的诱导或促进血管生成的方法。
48.包括哺乳动物细胞的血管生成植入物在制造用于诱导或促进血管生成的方法的药物中的应用，包括：
将所述血管生成植入物定位以与需要血管形成或灌注的组织接触；以及
允许所述植入物中的所述细胞呼吸，
其中所述细胞的呼吸降低所述植入物中的氧压，所述氧压的降低导致所述细胞表达一种或多种血管生成因子。
49.根据权利要求48所述的应用，其中所述促进血管生成的方法是根据权利要求21至45的任一项所述的方法。
50.一种包括利用一种方法形成的一种或多种血管生成因子的血管生成植入物，所述方法包括：
体外培养包括哺乳动物细胞的植入物；
允许所述细胞呼吸，从而所述细胞的呼吸降低氧压，所述氧压的降低导致所述细胞表达一种或多种血管生成因子；以及
杀死所述哺乳动物细胞。
51.根据权利要求50所述的血管生成植入物，其中通过冷冻所述植入物杀死所述细胞。
52.根据权利要求50或51所述的包括一种或多种血管生成因子的血管生成植入物用于促进血管生成的方法，包括：
将所述血管生成植入物定位以与需要血管形成或灌注的组织
接触，其中所述血管生成植入物包括一种或多种血管生成因子；以及
使所述一种或多种血管生成因子从所述植入物扩散到所述组织。
53.根据权利要求50所述的血管生成植入物，其中所述促进血管生成的方法是根据权利要求21至45的任一项所述的方法。
54.根据权利要求50或51所述的包括一种或多种血管生成因子的血管生成植入物在制造用于促进血管生成的方法的药物中的应用，包括：
将所述血管生成植入物定位以与需要血管形成或灌注的组织
接触，其中所述血管生成植入物包括一种或多种血管生成因子；以及
使所述一种或多种血管生成因子从所述植入物扩散到所述组织。
55.根据权利要求54所述的应用，其中所述促进血管生成的方法是根据权利要求21至45的任一项所述的方法。
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