JP2015084686A - 細胞培養用ジグおよび自動培地交換システム - Google Patents

Abstract

【課題】小型で簡便な構成のみを用いて培地交換作業を自動化する。
【解決手段】複数の培養容器を略同一向きで整列させて保持する保持部３と、該保持部３に保持された培養容器の各々の開口部に着脱可能な複数の蓋５を有するプレート部材３ａと、該プレート部材３ａに設けられ、保持部３に保持された各培養容器の内部に挿入されて培養容器の底面近傍に開口が配置される複数の配管６とを備え、開口が、互いに略同一の側の培養容器の側壁近傍に配置される細胞培養用ジグ１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養用ジグおよび自動培地交換システムに関するものである。

近年、体外で培養した細胞を生体に移植して組織を再構築する再生医療技術の開発が進められている。再生医療においては培養によって多量の細胞を用意する必要があり、一般な接着性細胞においては数百ｃｍ^２の培養面積を有する培養容器を５〜１０個程度必要とする。細胞培養工程では、培養容器に細胞を播種してから回収するまでの数週間、数日置きに培地を無菌環境下で交換する必要がある。この培地交換作業を人に代わって行う自動細胞培養装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。培地交換作業は細心の注意を要する煩雑な作業であり、この作業の自動化によって効果的にコストダウンを図ることができる。

特開２００９−２９１１０３号公報

しかしながら、特許文献１の記載の自動細胞培養装置は、人による繊細な培地交換作業をロボットによりそのまま再現している。そのために、培養ディッシュの位置やシリンジおよび吸引ピペットの上下動作を制御するための各種センサや複雑な信号処理系統等が必要となる。その結果、装置全体が複雑になるとともに大型化し、製造コストが高くなるという問題がある。さらに、細胞の無菌性を担保するためにロボット全体を無菌的な環境に設置しなければならず、大掛かりな設備が必要になるという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、小型で簡便な構成のみを用いて培地交換作業を自動化することができる細胞培養用ジグおよび自動培地交換システムを提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、複数の培養容器を略同一向きで整列させて保持する保持部と、該保持部に保持された前記培養容器の各々の開口部に着脱可能な複数の蓋を有するプレート部材と、該プレート部材に設けられ、前記保持部に保持された各前記培養容器の内部に挿入されて前記培養容器の底面近傍に開口が配置される複数の配管とを備え、前記開口が、互いに略同一の側の前記培養容器の側壁近傍に配置される細胞培養用ジグを提供する。

本発明によれば、細胞が播種された複数の培養容器を保持部に保持させるとともに、各培養容器の開口部にプレート部材の蓋を取り付けることによって、複数の培養容器が同一姿勢で一体的に保持部およびプレート部材によって保持される。この状態において、各培養容器の底面が水平となるように保持部をインキュベータ内に静置することによって、各培養容器の底面上で細胞を培養することができる。

この場合に、全ての配管の開口が培養容器内において同一側に位置しているので、保持部を傾けることによって、開口が低い位置に位置するように複数の培養容器を同時に傾斜させることができ、この状態で培養容器から培地を排出することによって、全ての培養容器から培地を同時にかつ十分に排出することができる。また、培養容器の内部は蓋によって閉塞されており、培養容器内の培地を交換する作業を非無菌的な環境で行うことができるので、大掛かりな無菌室等の設備が不要である。これにより、小型で簡便な構成のみを用いて培地交換作業を自動化することができる。

上記発明においては、前記配管に接続され、前記培養容器の内部を他の容器の内部と無菌的に接続可能である無菌接続部を備えていてもよい。
このようにすることで、培養容器と、培地タンクのような他の容器とを、培養容器の内部の無菌性を担保しながら容易に接続することができる。

また、上記発明においては、前記保持部を、前記開口が配置される側を下側にして傾斜させる傾斜機構を備えていてもよい。
このようにすることで、培地の排出時に、培養容器内において開口が位置する側に培地が移動するように、保持部を傾斜させることができる。

また、上記発明においては、前記傾斜機構が、前記保持部の、前記開口が配置される側と、該側と対向する側との相対的高さを変更してもよい。
このようにすることで、簡易な構成で保持部を傾斜させることができる。

また、上記発明においては、前記傾斜機構が、前記保持部に設けられ、前記保持部の下端と同一の高さ位置と、前記下端よりも下方に突出した高さ位置との間で高さ方向に移動可能な可動体と、前記傾斜機構が、回転運動を前記可動体の高さ方向の直線運動に変換する運動変換手段とを備えていてもよい。
このようにすることで、培地を送液するための送液ポンプの回転運動を運動変換手段によって可動体の直線運動に変換し、傾斜機構を培地の送液動作と連動させて作動させることができる。

また、本発明は、上記いずれかに記載の細胞培養用ジグと、該細胞培養用ジグに保持された前記複数の培養容器の前記配管を、培地を収容する培地タンクおよび排液タンクに並列に接続する流路と、該流路を介して、前記複数の培養容器と前記培地タンクおよび前記排液タンクとの間で培地を送る送液ポンプと、前記送液ポンプによる前記培地の搬送経路を、前記複数の培養容器と前記培地タンクとを接続する第１の経路と、前記複数の培養容器と前記排液タンクとを接続する第２の経路との間で択一的に切り替える経路切替部と、前記送液ポンプおよび前記経路切替部を制御する制御部とを備える自動培地交換システムを提供する。

本発明によれば、小型で簡便な構成のみを用いて培地交換作業を自動化することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞培養用ジグの（ａ）側方から見た断面図および（ｂ）正面図である。 図１の細胞培養用ジグに培養容器を設置した状態を示す断面図である。 図１の細胞培養用ジグが備えるチューブの構成を示す図である。 傾斜機構の作動によって傾斜したラックを示す側方から見た断面図である。 傾斜機構の構成を示す細胞培養用ジグの背面図である。 本発明の一実施形態に係る培地交換システムの全体構成図である。 培養容器から培地を排出するときの培養容器と培地との関係を説明する図である。 図１の細胞培養用ジグの変形例を示す部分的な構成を示す側方から見た断面図である。 チューブが設置されたアタッチメントプレートを示す正面図である。 （ａ）制御装置の変形例と、（ｂ）（ａ）の制御装置にアタッチメントプレートを取り付けた状態を示す図である。

以下に、本発明の一実施形態に係る細胞培養用ジグ１およびこれを備える培地交換システム１００について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞培養用ジグ１は、図１（ａ），（ｂ）に示されるように、複数の培養容器２を保持するラック（保持部）３と、該ラック３を傾ける傾斜機構４とを備えている。

本実施形態において、培養容器２は、側面に開口部２ａを有する角型フラスコを想定している。ただし、他の種類の培養容器２を使用してもよく、使用する培養容器２の種類に応じて、後述するラック３やキャップ５の形状等を適宜変更してもよい。

ラック３は、全体として略直方体の箱型であり、その内部に複数の（図示する例では５個の）培養容器２を同一向きで該培養容器２の高さ方向に整列させて保持可能に構成されている。具体的には、ラック３は、互いに対向配置された前面パネル３ａおよび背面パネル３ｂと、これらパネル３ａ，３ｂの内側の面に略垂直に設けられた仕切り板３ｃとを備えている。ラック３の内部の空間は、間隔を空けて互いに平行に配列された複数の仕切り板３ｃによって複数の部屋３ｄに分けられており、各部屋３ｄに配置された培養容器２の底面を各仕切り板３ｃが支持するようになっている。

前面パネル３ａは、仕切り板３ｃの配列方向（以下、この方向をラック３の「高さ方向」と定義する。）と同じ方向に間隔を空けて配列され、培養容器２の開口部２ａを塞ぐ５個のキャップ（蓋）５が設けられている。キャップ５は、各部屋３ｄに配置された培養容器２の開口部２ａと対応する位置に設けられ、開口部２ａに着脱可能である。

キャップ５は、例えば、開口部２ａに嵌合する円筒状または円柱状の図示しない弾性部材を有し、キャップ５を開口部２ａに取り付けたときに弾性部材によって開口部２ａとの隙間が密閉されるようになっている。キャップ５には、培養容器２の内部と外部との間の通気性を確保するために、バクテリアやウィルス等の通過を禁止するエアフィルタが設けられていてもよい。

各キャップ５には、前面パネル３ａの外側から内側に延びる配管６が貫通しており、キャップ５を開口部２ａに取り付けたときに、図２に示されるように、配管６の先端部分が培養容器２内に挿入される。このときに、培養容器２内に配置された配管６の先端開口（開口）６ａが、前面パネル３ａ側の培養容器２の側壁近傍において底面近傍に位置するように、配管６の先端部分の長さや角度が設計されている。

各配管６の、前面パネル３ａの外側の端部には、送液用のチューブ（流路）７が接続されている。５本のチューブ７は、図３に示されるように、合流継手８によって１つに合流し、さらに分岐継手９によって２つに分岐している。分岐した２つのチューブ７の基端には中空の穿刺針１０が接続されている。各穿刺針１０は、弾性の保護部材１１によって覆われており、保護部材１１内において無菌状態に維持されている。なお、穿刺針１０および保護部材１１に代えて、その他の無菌接続コネクタ（例えば、日本ポール社製の「クリーンパックコネクタ」や、コールダー・プロダクツ・カンパニー社製の「エイセプティ・クイック」等）を用いてもよい。

傾斜機構４は、図５に示されるように、背面パネル３ｂに、該背面パネル３ｂに平行に設けられた可動プレート（可動体）４ａと、該可動プレート４ａを背面パネル３ｂに沿って高さ方向に直動させる駆動部４ｂとを備えている。符号４ｃは、ラック３の背面パネル３ｂに固定され、可動プレート４ａを高さ方向に案内するガイドレールである。駆動部４ｂは、可動プレート４ａの下端の高さ方向の位置がラック３の下端と一致する水平位置と、可動プレート４ａの下端がラック３の下端よりも下方に所定量だけ突出した傾斜位置との間で可動プレート４ａを移動可能である。

これにより、ラック３を水平なベース上に載置した状態において、可動プレート４ａが水平位置に配置されているときには、図１（ａ）に示されるように、ラック３全体が水平になる。一方、可動プレート４ａが傾斜位置に配置されているときには、図４に示されるように、ラック３全体が、キャップ５側が低くなるように水平に対して所定の角度で傾斜する。なお、可動プレート４ａの下端の、ラック３の下端からの突出量が所定量よりも大きくならないように、可動プレート４ａの下方への可動範囲は図示しないストッパによって制限されている。

駆動部４ｂは、後述する送液ポンプ１７が有するロータの回転運動に連動して可動プレート４ａを移動させるようになっている。具体的には、駆動部４ｂは、ピニオン（運動変換手段）４ｄと、可動プレート４ａに設けられピニオン４ｄと噛み合うラック（運動変換手段）４ｅとを備えている。ピニオン４ｄの回転軸は、ロータの回転運動に連動して回転する回転体１２の軸と、トルク伝達ワイヤ４ｆによって接続されている。これにより、送液ポンプ１７が作動してロータが回転すると、ロータの回転運動が回転体１２およびトルク伝達ワイヤ４ｆを介してピニオン４ｄに伝達され、ピニオン４ｄの回転運動によってラック４ｅが高さ方向に直線運動し、可動プレート４ａが高さ方向に移動する。

ここで、送液ポンプ１７が正転して培養容器２内へ給液動作を行っているときには可動プレート４ａの移動方向が上向きとなり、送液ポンプ１７が反転して培養容器２内から排液動作を行っているときには可動プレート４ａの移動方向が下向きとなるように、駆動部４ｂは設計されている。

なお、トルク伝達ワイヤ４ｆとピニオン４ｄとの接続部には、所定の大きさ以上のトルクが作用したときに空転する機構が設けられている。これによって、可動プレート４ａがストッパに突き当たってそれ以上の下方への移動が制限されている状態においても、送液ポンプ１７のロータは影響を受けることなく回転し続けるようになっている。

次に、このように構成された細胞培養用ジグ１を備える培地交換システム１００について説明する。
本実施形態に係る培地交換システム１００は、図６に示されるように、細胞培養用ジグ１と、培地を収容する培地タンク１３と、排液タンク１４と、細胞培養用ジグ１に保持された培養容器２と培地タンク１３および排液タンク１４との間で培地の送液を制御する制御装置１５とを備えている。

培地タンク１３および排液タンク１４の開口部は、ゴム栓等の弾性体からなる蓋体によって塞がれている。チューブ７に接続された穿刺針１０を、弾性部材および弾性体に貫通させることによって、２つのチューブ７の一方が培地タンク１３に、他方が排液タンク１４に、それぞれ無菌的に接続される。蓋体には、タンク１３，１４の内圧を大気圧に開放するための図示しないエアベントフィルタが設けられている。

培地タンク１３は、温度調整可能な保管庫１６内に保管されている。不使用時に培地タンク１３を冷蔵保存する場合には、培地タンク１３と培養容器２との間のチューブ７を加温するヒータが設けられていてもよい。

制御装置１５は、送液ポンプ１７と、該送液ポンプ１７による培地の送液経路を切り替える経路切替部１８と、送液量を調整する送液量調整部１９とを備えている。
経路切替部１８は、例えば、チューブ７を半径方向に押し潰すことによって流路を閉じるピンチバルブであり、培養容器２を培地タンク１３に接続する供給経路（第１の経路）と、培養容器２を排液タンク１４に接続する排液経路（第２の経路）との間で送液経路を切り替える。

送液量調整部１９は、チューブ７に設けられた流量センサの検出値に基づいて送液ポンプ１７を制御することによって、培地タンク１３から培養容器２への培地の供給量を調整し、また、培養容器２から排液タンク１４への培地の排液量を調整する。流量センサに代えて、各タンク１３，１４の下にロードセルを設け、送液量調整部１９が、ロードセルによって測定された各タンク１３，１４の重量変化に基づいて送液ポンプ１７を制御してもよい。

次に、このように構成された細胞培養用ジグ１およびこれを備える培地交換システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る培地交換システム１００を用いて細胞培養を行うには、まず、安全キャビネット内で培養容器２内に細胞を播種する。次に、ラック３の各部屋３ｄに培養容器２を配置し、各培養容器２の開口部２ａにキャップ５を取り付ける。このときに、開口部２ａへのキャップ５の取り付けと、培養容器２の部屋３ｄへの配置が容易になるように、前面パネル３ａが、背面パネル３ｂに対して分離および連結可能に構成されていてもよい。

次に、安全キャビネットから培養容器２を保持したラック３を取り出し、チューブ７の途中位置を送液ポンプ１７に設置し、２つの穿刺針１０を培地タンク１３および排液タンク１４に接続する。これにより、各培養容器２の内部と培地タンク１３および排液タンク１４の内部とがチューブ７を介して無菌的に接続される。次に、ラック３をインキュベータ２１内に配置し、細胞培養を開始する。培養容器２内において、細胞は、培養容器２の底面に接着し、底面上で培養される。

次に、制御装置１５の作動を開始する。制御装置１５は、予め登録されたプログラムに従って所定の日時に以下の手順を実行することによって、培養容器２の培地交換を定期的に実行する。

まず、経路切替部１８によって排液経路を選択し、送液ポンプ１７を逆転させることによって、５個の培養容器２から排液タンク１４へ培地を同時に排出する。このときに、送液ポンプ１７の作動に連動して傾斜機構４も作動し、前面パネル３ａ側が低くなるようにラック３全体が傾く。ラック３が傾斜した姿勢において、図７に示されるように、培養容器２内の培地Ａは配管６の先端開口６ａが位置するキャップ５側の領域に溜まるので、培養容器２内の培地Ａを残らずに排出することができる。培養容器２から排液タンク１４への培地の排液量が所定量に達したときに、送液量調整部１９によって送液ポンプ１７の作動が停止される。

次に、経路切替部１８によって供給経路を選択し、送液ポンプ１７を正転させることによって、培地タンク１３から５個の培養容器２へ新鮮な培地を同時に供給する。このときに、送液ポンプ１７の作動に連動して傾斜機構４も作動し、ラック３全体が水平に戻る。培地タンク１３から培養容器２への培地の供給量が所定量に達したときに、送液量調整部１９によって送液ポンプ１７の作動が停止される。以上により、５個全ての培養容器２の培地交換が完了する。制御装置１５は、以上の培地交換を数日置きに繰り返す。

培養期間が所定の日数（例えば数週間）に達した後、ユーザは、チューブクランプやチューブシーラ等によってチューブ７の途中位置を閉じ、制御装置１５からチューブ７を取り外し、インキュベータ２１からラック３を取り出す。そして、安全キャビネット内でラック３から培養容器２を取り外し、通常の操作によって培養容器２から細胞を回収する。

このように、本実施形態によれば、複数の培養容器２を、培地タンク１３および排液タンク１４に対して無菌的に並列にチューブ７で接続することによって、各培養容器２内の無菌性を担保しながら複数の培養容器２の培地交換が同時に行われる。さらに、配管６の先端開口６ａを各培養容器２内の同じ側に配置し、培地の排出時においては、先端開口６ａの位置が低くなるように複数の培養容器２を一体的に傾斜させることによって、いずれの培養容器２内の古い培地も残さずに排出される。このように、複雑な信号処理や高精度の制御等を必要とせず、人による手作業と同等の作業培地交換作業を小型で簡便な構成のみを用いてを自動化することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、配管６が排液用および給液用の両方を兼ねており、キャップ５を介して培養容器２内へ挿入されることとしたが、これに代えて、排液用の配管６と吸液用の配管６とが別々に設けられていてもよい。この場合、図８に示されるように、培養容器２が、底面近傍に排液口２ｂを有し、該排液口２ｂに排液用の配管６’が接続されるように構成されていてもよい。
このようにすることで、培養容器２毎に排液口２ｂの位置がばらつくことがないので、全ての培養容器２からさらに均一に培地を排出し、培地の排出残りをさらに確実に防ぐことができる。

また、本実施形態においては、図９に示されるように、チューブ７の途中位置が共通して固定されるアタッチメントプレート２０をさらに備えていてもよい。
アタッチメントプレート２０は、図１０（ａ），（ｂ）に示されるように、穴２０ａにピン１５ａが嵌まるようにアタッチメントプレート２０を制御装置１５の所定位置に取り付けたときに、チューブ７が、送液ポンプ１７、経路切替部１８および送液量調整部１９に対して適切に設置されるようになっている。このようにすることで、チューブ７を制御装置１５に対して簡単にかつ正確に設置することができる。

また、本実施形態においては、傾斜機構４を背面パネル３ｂに設けることとしたが、これに代えて、傾斜機構４を前面パネル３ａに設けてもよい。この場合には、送液ポンプ１７の回転方向と、可動プレート４ａの移動方向との関係が反対になるようにすればよい。
また、本実施形態においては、傾斜機構４をラック３に一体的に設けることとしたが、これに代えて、傾斜機構４をラック３とは別体に設けてもよい。例えば、傾斜機構４が、高さを調節可能な昇降台を備え、この昇降台の上にラック３の背面側の底部を載置してもよい。
また、本実施形態においては、傾斜機構４専用のモータを制御装置１５内に備え、送液ポンプ１７の動作とは独立して傾斜機構４が動作可能に構成してもよい。

１ 細胞培養用ジグ
２ 培養容器
２ａ 開口部
３ ラック
３ａ 前面パネル
３ｂ 背面パネル
３ｃ 仕切り板
３ｄ 部屋
４ 傾斜機構
４ａ 可動プレート（可動体）
４ｂ 駆動部
４ｃ ガイドレール
４ｄ ピニオン（運動変換手段）
４ｅ ラック（運動変換手段）
４ｆ トルク伝達ワイヤ
５ キャップ（蓋）
６，６’ 配管
７ チューブ（流路）
８ 合流継手
９ 分岐継手
１０ 穿刺針（無菌接続部）
１１ 保護部材（無菌接続部）
１２ 回転体
１３ 培地タンク
１４ 排液タンク
１５ 制御装置（制御部）
１６ 保管庫
１７ 送液ポンプ
１８ 経路切替部
１９ 送液量調整部
２０ アタッチメントプレート
２１ インキュベータ
１００ 培地交換システム

Claims (6)

1. 複数の培養容器を略同一向きで整列させて保持する保持部と、
   該保持部に保持された前記培養容器の各々の開口部に着脱可能な複数の蓋を有するプレート部材と、
   該プレート部材に設けられ、前記保持部に保持された各前記培養容器の内部に挿入されて前記培養容器の底面近傍に開口が配置される複数の配管とを備え、
   前記開口が、互いに略同一の側の前記培養容器の側壁近傍に配置される細胞培養用ジグ。
2. 前記配管に接続され、前記培養容器の内部を他の容器の内部と無菌的に接続可能である無菌接続部を備える請求項１に記載の細胞培養用ジグ。
3. 前記保持部を、前記開口が配置される側を下側にして傾斜させる傾斜機構を備える請求項１または請求項２に細胞培養用ジグ。
4. 前記傾斜機構が、前記保持部の、前記開口が配置される側と、該側と対向する側との相対的高さを変更する請求項３に記載の細胞培養用ジグ。
5. 前記傾斜機構が、
   前記保持部に設けられ、前記保持部の下端と同一の高さ位置と、前記下端よりも下方に突出した高さ位置との間で高さ方向に移動可能な可動体と、
   回転運動を前記可動体の高さ方向の直線運動に変換する運動変換手段とを備える請求項４に記載の細胞培養用ジグ。
6. 請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞培養用ジグと、
   該細胞培養用ジグに保持された前記複数の培養容器の前記配管を、培地を収容する培地タンクおよび排液タンクに並列に接続する流路と、
   該流路を介して、前記複数の培養容器と前記培地タンクおよび前記排液タンクとの間で培地を送る送液ポンプと、
   前記送液ポンプによる前記培地の搬送経路を、前記複数の培養容器と前記培地タンクとを接続する第１の経路と、前記複数の培養容器と前記排液タンクとを接続する第２の経路との間で択一的に切り替える経路切替部と、
   前記送液ポンプおよび前記経路切替部を制御する制御部とを備える自動培地交換システム。

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