JP5851220B2 - 細胞培養容器、その開放器具、及び開放方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養する細胞培養容器、それに用いる開放器具、開放方法等に関するものである。

自身もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞は、しばしば、培養して細胞の数を増やす、あるいは培養して然るべき組織を形成させた後に、治療に用いられる。治療に用いる細胞の取扱いは， ヒト幹細胞を用いる臨床研究に関する指針に定められているように、 GMP (Good Manufacturing Practice) に準拠しなければならない。即ち、（１）細胞プロセシングセンタ（Cell Processing Center：CPC）という生物学的汚染が最小限に留まるように設計されたクリーンルームで細胞を調製し、（２）手順書に従った細胞培養， ならびに， 作業記録の厳密な管理を行い、（３）調製した細胞が生物学的に汚染されていないことを保証する必要がある。

再生医療における細胞培養は、上記のような制約の中で、熟練された作業者によって行われるために、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという課題があった。

この課題を解決する手段として、手作業の細胞培養操作を自動化する装置が開発されてきた。このような装置では培養液の交換が自動で行われるために、作業者の負担は軽減できるという利点がある。しかしながら、従来手作業で用いられてきた培養容器は、培養液の交換の際に、培養容器の蓋を開けるといった開放系の細胞培養操作が含まれるために、交差汚染や微生物を含む粒子混入の危険性があるという課題が残されていた。

これに対して、一定品質の細胞の安定供給を目的として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。これは、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、開放系の操作を含まずして、細胞培養工程の自動化が達成されるものである。

他方、細胞には、増殖させる過程においてフィーダー細胞を必要とする細胞種と必要としない細胞種がある。再生医療において注目されている、ES(Embryonic Stem)細胞やiPS(Induced Pluripotent Stem)細胞および皮膚上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞といった細胞種の培養には、しばしばフィーダー細胞が必要である。そして、培養した細胞を治療に用いる場合、フィーダー細胞と治療に用いられる細胞は、２層に空間分離されるなど、分離された状態で培養することが望ましい。

特許文献１では、物質透過膜を介して上層及び下層に培地を満たし、角膜上皮細胞を物質透過膜上で培養し、物質透過膜下層にフィーダー細胞を培養させ、物質透過膜上の角膜上皮細胞を重層化させる培養容器について開示されている。また、当該培養容器の蓋部に、容器内の培地のガス交換を行うためのガス透過膜を装着し、容器内で無菌的に培養可能な構造が提案されている。特許文献２では、閉鎖系細胞培養容器の培地漏れを防止し、培地交換時においても容器内の無菌性が保持される構造が提案されている。

特開２００８−２７１９１２号公報 特開２０１１−１０５９９号公報

しかしながら、特許文献１、２に記載のような培養容器においては、培養中の無菌性を維持する閉鎖系構造を有しているものの、培養終了時に内部の細胞を取り出す際の無菌性の保持に関しては考慮されていなかった。また、取り出しの際に細胞に与えるダメージについて考慮されていなかった。

本発明の目的は、上記の課題を解決し、培養終了時に内部の細胞を取り出す際の無菌性の保持を可能とする細胞培養容器、細胞培養容器の開放器具、細胞培養容器の開放方法等を提供することにある。

また、本発明の目的は、上記の課題を解決し、取り出しの際に細胞に与えるダメージ低減を可能とする細胞培養容器、細胞培養容器の開放器具、細胞培養容器の開放方法等を提供することにある。

上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞を培養する閉鎖系の細胞培養容器であって、容器枠体と、容器枠体内部に形成された培地保持部と、培地保持部の少なくとも片面に形成されたガス透過膜とを備え、ガス透過膜が形成される周囲近傍の容器枠体の表面に、ガス透過膜を切り取る器具をガイドするガイド部を形成したことを特徴とする構成の細胞培養容器を提供する。

また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞培養容器の開放器具であって、容器枠体の内部に形成された培地保持部の少なくとも片面にガス透過膜を備えた細胞培養容器の、ガス透過膜が形成される周囲近傍の容器枠体に形成された容器側ガイドに合致する開放器具側ガイドと、ガス透過膜を押し切る切断部と、開放器具を操作するための持ち手を備える構成の細胞培養容器の開放器具を提供する。

更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞培養容器の開放方法であって、容器内部に設けられた培地保持部と、培地保持部の少なくとも片面に形成されたガス透過膜と、ガス透過膜の周囲近傍の容器枠体部分に形成された容器側ガイドとを備える細胞培養容器のガス透過膜を、容器側ガイドに合致する開放器具側ガイドと、ガス透過膜を押し切る切断部と、開放器具を操作するための持ち手を備える開放器具を用い、容器側ガイドと器具側ガイドを合致させて、ガス透過膜を切り取る細胞培養容器の開放方法を提供する。

本発明によれば、閉鎖系細胞培養容器で細胞培養後、培養容器内や培養細胞が汚染または損傷を受けることなく培養容器を開放することができる。

第１の実施例に係る、培養空間が二段の細胞培養容器の構造の一例を示す図である。 第１の実施例に係る、培養空間が二段の細胞培養容器の構造の他の例を示す図である。 第１の実施例に係る、培養空間が一段の細胞培養容器の構造を示す図である。 第１の実施例に係る、単針の細胞培養容器開放器具の構造を示す図である。 第１の実施例に係る、複針の細胞培養容器開放器具の構造を示す図である。 第２の実施例に係る、細胞培養容器に培養終了後二重フィルムを接着させて容器を開放する場合の手順を示す図である。 第３の実施例に係る、細胞培養容器が培養前から上部ガス透過膜を２枚有する場合の容器開放手順を示す図である。 各実施例に係る、培養容器を搭載した細胞培養装置の一例を示す図である。

以下、本発明の実施形態を順次説明するが、それに先立ち、本発明が対象とする閉鎖系細胞培養容器の開放時の状況について説明する。

培養された細胞を取出して治療等に用いる際、閉鎖系の培養容器を開放して細胞を外部に取出す必要がある。この閉鎖系細胞培養容器の開放時には、従来は滅菌処理された外科用メスを用いて培養容器の蓋に形成されたガス透過膜を切り取り、内部の細胞を空間露出させ、培養した細胞や組織を取出していた。

しかしながら、メスが清潔なものであったとしても細胞培養容器内部が汚染されうる状況、細胞培養容器内部の細胞がダメージを受けうる状況が発生する。具体的には以下の（１）〜（４）に記載するような状況が発生しうる。

（１）メスの刃の微細な凹凸によってガス透過膜を切り取る際に細かな切りくずが発生し、当該切りくずが培地中に混入する場合がある。刃を用いてガス透過膜を切断する際の破壊形態は脆性破壊であり、この場合、破断面に切りくずが生じやすい。またガス透過膜を素早く切ろうとすると切りくずはさらに生じやすくなる。

（２）細胞培養容器はガス透過膜を通して培地中にガスを供給しているため、蓋から細胞培養面までの距離が短く設定されることが多い。そのため、メスの刃が培養表面まで容易に到達することから、メスの刃が培養した細胞に当たりこれを傷つける場合がある。

（３）培養容器の内側は清浄性が保持されているものの、培養容器の外側に当たるガス透過膜表面は不潔野に相当することになる。ここでメスによってガス透過膜を切り取る際、不潔野である膜表面の一部が培地や培養細胞等に触れてしまう場合がある。

（４）切り終えたガス透過膜が培地中に水没し、これをピンセット等で取り除く際、ピンセット等が培養細胞に当たりこれを傷つける場合がある。

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、培養終了後の開放時においても培養細胞および培養空間を汚染しない、また培養細胞を破損しない、細胞培養容器の構造、開放器具の構造、及び細胞培養容器の開放方法、更には、細胞培養装置を提供する。

図１Ａは第１の実施例の細胞培養容器の一例を示す図である。図１Ａの（a）は上面図、（b）はそのＡ−Ａ断面図である。本実施例の細胞培養容器の枠体１は、正方形で扁平形状の容器であって、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの可塑性と共に剛性を有するプラスチックから成る。この枠体１は射出成形などにより形成され、その内部に培地保持空間である２層の培地保持部４を形成する円部１０１、１０２及び１０３が形成されている。そして、円部１０１には上部ガス透過膜２、円部１０２には物質透過膜７、円部１０３には下部ガス透過膜３が溶着されている。

ガス透過膜２、３と物質透過膜７の円部１０１、１０２、１０３それぞれへの溶着は、細胞の生存に影響を及ぼす接着剤を使用しない、熱溶着や超音波溶着やレーザー溶着が好ましい。これらの各層と枠体１により、本実施例においては、ほぼ円形形状を有する、２層の培地保持部４が構成される。

同図において、ポート５は培地保持部４に培養液である培地を供給し、排出する一対の突起構造部である。ポート５は、細胞培養容器の枠体１の上面から、ガス透過膜２、３の膜面に垂直な方向に突出している。図１Ａの（a）では点線で示された培地流路６は、ポート５から円形の培養空間である培地保持部４までの一対の培養液流路である。一対の培地流路６は、培地保持部４のそれぞれの層において、ほぼ円形形状の対抗する側面位置に接続されている。これは、後で説明するように、細胞培養容器１を垂直にしたとき、培養空間の最頂部及び最底部に、一対の培養液通路が接続されるようにするためである。また、同図において、枠体１の表面にガイド、あるいはガイド部と呼ばれる、同心円状の溝８が形成されているが、本実施例におけるガイド、あるいはガイド部である溝８の機能については後で説明する。

なお、ここで互いに対となるポート５は、同図における対角線上に存在する２つのポートを想定しているが、対角線上に必ずしも存在する必要は無い。また、円部１０１、１０２及び１０３を楕円部とすることにより、培地保持部４をほぼ楕円形状にすることも可能である。

培養容器の培養保持部４の下層からの栄養分を必要とする細胞種を、培養容器の上層の培養保持部４で培養する目的で培養容器を使用する場合、物質透過膜７の平均孔径は、タンパク質等は通過するが、細胞は通過しない大きさがよい。

ガス透過膜２，３と物質透過膜７の素材は、ポリカーボネートやポリスチレンといったガス透過性を有し、細胞培養観察可能な透明のものであればよくこれに限定されるものではない。熱溶着、超音波溶着、レーザー溶着で対象物同士を溶着させる場合、融点の関係で枠体１とガス透過膜２、３、物質透過膜７の材質は同一または融点が近いものがよい。

ここでは、図１Ａの(a)と(b)を用いて枠体１と透過膜とを溶着する例について説明したが、枠体１の円部１０１，１０３とガス透過膜２、３は、後の培養した細胞や組織の取り出しを考慮して着脱可能に枠体１と接続できるように構成しても良い。この変形例として図１Ｂを示す。図１Ｂの(a)はガス透過膜と一体化した構成の枠体の一部の上面図、図１Ｂの(b)はガス透過膜と一体化した構成の枠体の一部の側面図、図１Ｂの(c)はガス透過膜と一体化した構成の枠体をフタとして用いた培養容器の側面図である。この場合、強度を維持するために、ガス透過膜を囲う枠体１５を別途設ける必要がある。また、このガス透過膜を囲う枠体１５と培養容器の枠体１とを接続する際、密閉性を維持するために、ガス透過膜を囲う枠体１５と培養容器の枠体１との間にシール部材１６を設けるとよい。このシール部材の材質は、生体にとって有害とならない弾性部材が好ましく、たとえばシリコンゴム等を用いることが好ましい。例では密閉用シール部材１６は枠体１側に設けているが枠体１５側に設置することも可能である。

また、このように枠体１とガス透過膜部分とを着脱可能とすることで、使用目的、使用環境に応じて膜の材質を変化させることが容易となる。このように材質を変化することが可能となることで、気体透過性をコントロールし、低酸素培養など特殊な環境下における細胞培養を容易に実現することができる可能性がある。

培養中、ポート５は自動培養の場合には、後で説明する自動培養装置にチューブを介して接続される。培養容器に設けられたポート５における一対の突起構造部は、培養容器に一体成形されたものであり、弾性部材から成るチューブを接続できるものである。チューブの内径は、ポート５の突起構造部の内径と同等であれば、突起構造部にチューブを接続した状態で通液しても液漏れが生じることはない。図１Ａ、図１Ｂに示した突起構造部は先端が台形になっているが、この形状に限定されるものではなく、チューブが接続できる形状であればよい。また、突起構造部５の高さは特に制限されるものではないが、ユーザビリティーの観点から、チューブを接続するために必要な高さがあればよい。ここでは自動培養装置に本実施例の培養容器を接続する例を主に示すが、これに限らず、手技培養にも本実施例の培養容器を用いることも可能である。この場合、ポート５に対して密栓をして使用され、培養容器内の閉鎖環境を保った状態で細胞培養が可能となる。

ここで、チューブとの接続に際し、接続部をポート５のような突起構造としているが、チューブと接続できれば必ずしも突起構造である必要はなく、突起構造に当たる部分に穴部を設け、密閉可能なシール部材を別途設けることでチューブとの密閉接続するように構成することも可能である。

このような構造をもつ本実施例の培養容器は、枠体１に備わる物質透過膜７およびガス透過膜２、３によって形成される培地保持部４を培養液で充填することで、密閉空間における細胞培養が可能となる。培地保持部４に培養液を充填する際には、気泡が発生しないようにするために、対を形成する一方の突起構造部が下になるように培養容器の枠体１を立て、下側となるポート５の突起構造部から培養液を注入して、上側となるポート５の突起構造部から培養液を排出する。

そのために、２層構造の培養容器の場合は、効率的な上下層への注液のため、図１Ａのように細胞培養容器の突起構造部、すなわち、上層の２つの突起構造同士、及び下層の２つの突起構造同士が水平に維持されていると良い。

また、突起構造部から円形の培養空間である培地保持部４までの培地流路６は、培養容器を垂直にしたときの培養空間の最頂部及び最底部に接続されている。これにより、効率的に培養液注入及び排出することができる。また、上述したように、本実施例による培養容器の中央の培地保持部４は、ほぼ円柱又は楕円柱などの円形形状又は楕円形状の空間となっている。これは、例えば角膜等、円形や楕円形の培養対象を円形、楕円形のままで回収するためである。

なお、図１Ａ、図１Ｂの培養容器は２層型である必要はなく、種々の変形実施例が構成される。例えば、培養する細胞種に応じて、図２に示すように、枠体１にガス透過膜２が溶着された１層型の細胞培養容器であってもよい。図２の(a)は１層型細胞培養容器の上面図、図２の(b)はそのA−A断面図である。同図においても図１Ａと同様、ガイド、或いはガイド部と呼ばれる溝８は枠体１の上面に形成されているが、本実施例における溝８の機能については後で説明する。同図において、ポート５の突起構造部は先端が台形でない場合を図示した。

更に、図１Ａ、図２に示した各実施例の培養容器の突起構造部は、培養容器を水平に置いたとき、対応するそれぞれの培地保持部４より上に位置する枠体１の上面に設置する必要はなく、図１Ｂのように培養容器の枠体１の側面に位置されていてもよい。

＜細胞培養装置の構成＞
図７は、本実施例の細胞培養容器が適用される細胞培養装置の一実施例を示す図である。同図は、送液管や廃液管であるチューブが接続可能な突起構造を具備する、細胞培養容器の枠体１が内部に配置された細胞培養装置１５の全体の構成を模式的に示す図である。

この細胞培養装置は、細胞培養容器を保持する培養ステージと、培養液を保管するための培養液保管部と、廃液を溜めるための廃液収容部と、培養液保管部から細胞培養容器まで培養液を供給するための送液管と、細胞培養容器から廃液を回収し、廃液を廃液収容部まで送る廃液管を備え、その細胞培養容器は、容器内部に培地保持部と、培養液を供給、排出するための一対の接続部と、接続部から培地保持部まで通ずる一対の培地流路とを有し、培地保持部の少なくとも片面にガス透過膜を備え、ガス透過膜周囲近傍の容器枠体部分に、ガス透過膜を切り取る器具をガイドするガイド部が形成されている。

図７において、細胞培養装置１５は、細胞培養容器を保持する培養ステージ１６と、培養ステージ１６を回転運動させるための駆動部１７を有している。また、細胞培養容器に繋がる送液管１８および廃液管１９は、制御部２０を介して培養液保管部２１および廃液収容部２２に接続されている。培養液保管部２１と廃液収容部２２は、例えば４℃に設定される保冷庫２３に収納されている。そして、培養液は適宜、制御部２０内の図示を省略したヒータ等で３７℃に温められてから細胞培養容器に供給される。

培養ステージ１６の上もしくは下には、ＺＹＸ可動軸２４を具備した細胞観察用機器２５が設けられており、必要に応じて培養している細胞の状態をモニタ及び記録することができるようになっている。

また、細胞培養容器１への培養液の充填は、細胞培養容器内部に気泡が発生しないように以下のように行う。即ち、細胞培養容器に繋がる送液管１８が下になるように、駆動部１７により培養ステージ１６を矢印Ａ方向に垂直に立て、細胞と培養液の混合液を細胞培養容器１に充填する。細胞と培養液を充填後、培養ステージ１６を駆動部１７により水平にして、所定の温度、湿度、ガス組成および濃度で所定時間培養を実施する。培養途中に培地を交換する時は、細胞培養容器１に繋がる廃液管１９が下になるように駆動部１７により培養ステージ１６を矢印Ｂ方向に垂直に立て、細胞培養容器１から培地を吸引する。吸引後、細胞培養容器１に繋がる送液管１８が下になるように、駆動部１７により培養ステージ１６を垂直に立て、細胞培養容器１に培地を充填する。培地を充填後、再び培養ステージ１６を駆動部１７により水平にして、所定の温度、湿度、ガス組成および濃度で所定時間培養を再開する。

＜細胞培養終了後の細胞培養装置と細胞培養容器の接続解除＞
細胞培養終了後、細胞培養装置１５と細胞培養容器の接続を解除するためには、細胞培養容器のポート５の突起構造部に接続されている、送液管１８や廃液管１９のチューブの途中に、図示を省略したクレンメ等のチューブを閉鎖する部材で、送液管１８や廃液管１９であるチューブの途中を遮断する。当該遮断した先を滅菌済のハサミ等で切断することで、細胞培養装置１５から細胞培養容器の枠体１を取り出すことができる。

なお、容器の取り出し方法は、上記記載方法に限定されるものではなく、チューブの途中に閉鎖系システムを可能とする部材を設けておき、細胞培養容器と細胞培養装置の接続を解除する方法でもよい。ここで、チューブとの接続に際し、接続部をポート５の突起構造としているが、チューブと接続できれば必ずしも突起構造である必要はなく、突起構造に当たる部分に穴部を設け、密閉可能なシール部材を別途設けることでチューブとの密閉接続するように構成することも可能であることは云うまでもない。

＜細胞培養容器からの培養液の排出＞
次に、細胞培養装置１５から接続を解除した細胞培養容器からの培養液の排出は、培養液を排出させたい側のポート５の突起構造が下になるように細胞培養容器を傾けることで、培養液を簡単に排出することができる。培養液の排出は、再生組織の乾燥を防ぐために、作製した再生組織が必要となる時の直前でよい。

この培養液を排出した後に、培養された細胞等を取出すことになるが、従来は、細胞培養容器の上層に溶着された上部ガス透過膜２をカッターナイフなどで除去し、再生組織を回収していた。
しかしながら、このようなこれまでの取出し方法では、先に説明した課題が残されており、これまで無菌的に培養してきた細胞等が汚染もしくはダメージを受ける可能性がある。

そこで本実施例の細胞培養容器では、培養容器から細胞にダメージを与えることなく、容器内部の無菌性を維持した状態で、培養細胞、組織を取出すことが可能となることを、二層の培地保持部からなる細胞培養容器を用いて説明する。

＜ガイドのある細胞培養容器および細胞培養容器開放器具の構成＞
図３は、培養容器のガス透過膜２を無菌的に切り出すための切断部を有する細胞培養容器開放器具の一実施例を示す図である。図３の(a)は細胞容器開放器具の下面図、図３の(b)はその側面図、図３の(c)は細胞培養容器側のガイド、或いはガイド部である溝８に、細胞容器開放器具側の突起で構成されるガイド１０を合わせたときの側断面図である。この細胞培養容器開放器具３０は、持ち手９とガイド１０と針状の切断部１１から構成されている。

ガイド１０の幅と高さは細胞培養容器の枠体１の上面に形成されたガイド部である溝８に合う大きさであり、切断部１１はガイド１０を溝８に合わせるように器具をセットしたときに、切断部１１の先端が培養表面まで到達しないものとする。細胞培養容器を開放する際には、開放器具３０のガイド１０を細胞培養容器の溝８に合わせて操作する。

まず器具のガイド１０を細胞培養容器のガイド部である溝８に合わせるときに、切断部１１の先端でガス透過膜に穴を開け、次に持ち手９を保持して器具を溝８に沿って移動させることによりガス透過膜２を切断する。切断部にメスのような刃を用いた場合、ガス透過膜２が開放時に脆性破断を受け切りくずが発生しやすいが、この器具の切断部に針状の部材を用いることによりガス透過膜２は押し切られることになり、このような延性破断においては切りくずが発生しにくい。またこのときガス透過膜２が完全に円周状に切り抜かれる前にガス透過膜２の一部をピンセットなどで保持し引くことにより容器を開放する方法により、ガス透過膜２が培地中に水没することなく回収される。

このように、本実施例における細胞培養容器の枠体１のガイド部である溝８は、ガイド１０を嵌着させることで、ガス透過膜２の切断部分をガイドし、且つ切断部１１の先端が培養表面まで到達しないように作用する。

ここで、図３において切断部１１の形状が針状のものを例示したが、必ずしも針状に限定されるものではなく、切りくずが生じにくい切断形状を有する部材形状であれば良いことは云うまでも無い。また溝８の形状はガイド１０の形状と合致しガイド１０が操作しやすい形状を選択する。例えば、図３においては溝８とガイド１０は角ばった形状をしているが、必ずしもこの形状に限定されるものではなく、両方が丸みを帯びた形状などでも良い。なお、溝８とガイド１０は理想的には培養容器の中心を仮想中心として、同図の（ｃ）における、溝８とガイド１０の上部が中心に向かって内側に少し傾斜していることが操作上好ましい。

また切断部１１の材質はステンレスなど剛性が高い金属が適しているが、切断部１１も含め器具の材質は滅菌できるものであれば特に限定されない。

更に、上記のような手順に従って開放作業を行ったとしても、開放作業は人手で行うことから、ガス透過膜２を開放器具３０により開放する際、培養容器内部の培地保持部４の空間が培地で満たされていると、振動や傾きにより不意に内部の培地があふれ出てしまう可能性がある。このあふれ出た培地が逆流し、再び容器内に侵入することで培養空間や培養細胞が汚染される可能性もある。
このとき、本実施例の培養容器の枠体１の溝８が円部１０１近傍に設けられていることで、上述したガイドとしての機能の他に、あふれ出た培地の逆流を防ぎ、細胞培養容器内部の汚染を抑制することも可能となる。

上記の実施例では、開放器具のガイドとしての機能と、培地逆流を防止する機能とを併せ持つ溝８を例に説明したが、これらの機能を別個達成するために、ガイド用の溝と、逆流を抑制する凹部とを別に設けることも可能である。図示を省略するが、この凹部は、枠体１の上面に溝８と同心円状に形成することができる。

また、上述した実施例ではガイド、或いはガイド部として溝８を例に説明したが、上記機能を達成できる形状・構成であれば、ガイド部は溝である必要はない。例えば、培養容器と開放器具のガイド部としての溝と突起を逆にすることも可能であり、培養容器の枠体の表面に凸部を、開放器具に合致する凹部を形成することができる。また、ガイドに支えられる開放器具の支点は１つに限らない。開放器具を安定して支え使用するためには、支点が複数あることが好ましい。

図４は、開放器具の変形実施例である、複針の細胞培養容器開放器具３１であって、持ち手９とガイド１０と複数本の切断部１１から構成されている。図４の(a)は複針の細胞培養容器開放器具の下面図、図４の(b)はその側面図、図４の(c)は細胞培養容器の溝に開放器具のガイドを合わせたときの側断面図である。

ガイド１０の幅と高さは細胞培養容器の溝８に合う大きさであり、溝８一周とガイド１０一周が合致する関係になっている。切断部１１はガイド１０を溝８に合わせるようにセットしたときに切断部１１先端が培養表面まで到達しないものとする。また、切断部１１は器具３１の本体に対し垂直に設置されておらず、周の横方向および容器中心方向へ傾斜している。細胞培養容器を開放する際には器具３１のガイド１０を細胞培養容器の溝８に合わせて操作する。器具３１のガイド１０が溝８に合うように器具を細胞培養容器に当て、器具３１を傾斜している針の先端の方向に時計回りに捻りながらガイド１０が溝８の奥に届くまで押さえつけることによりガス透過膜２を切る。ガス透過膜２は器具の切断部１１に囲まれた空間に入るため、膜２は器具を持ち上げるときに同時に回収される。

このような構成に寄れば、切断したガス透過膜２が培養容器内に脱落することなく、切断部１１に巻き込まれるように保持されるため、脱落したガス透過膜を排除する際の培養細胞の汚染および破損リスクがなく容器開放が可能となる。

続いて、第２の実施例として、上部膜を二重に有する細胞培養容器を図５を用いて説明する。

＜上部膜を二重に有する細胞培養容器の構成＞
図５は、培養終了後に上部ガス透過膜２を二重に有する細胞培養容器の一構成例の断面、及び開放する際の細胞培養容器の開放手順を示す図である。図５の(a)は培養終了直後の細胞培養容器側断面図、図５の(b)は(a)に二重フィルムを接着させたときの細胞培養容器側断面図、図５の(c)は、(b)の二重フィルム上層を剥離したときの細胞培養容器側断面図である。細胞１２は培地保持部４の物質透過膜７上で培養される。同図の（a）に示す細胞培養容器の場合、培養終了後の上部ガス透過膜２の表面は無菌状態ではないため、このまま上部のガス透過膜２を破壊した場合には細胞培養容器内部にガス透過膜２の表面部分が入り、汚染が起こる可能性がある。

そのため、同図の（ｂ）に示すように、開放前に、上部ガス透過膜２に上部ガス透過膜２と同程度の大きさの二重フィルム１３，１４を細胞培養容器枠体１の淵とその内側までの円周部に接着部５０において接着する。このとき二重フィルムは、二重フィルム下層１３のみを上部ガス透過膜２に接着させる。二重フィルム下層１３、二重フィルム上層１４同士は容易に剥離可能であり、フィルム間は無菌であるものとする。二重フィルム接着法には例えばレーザー溶着が挙げられる。一般的な剥離可能な二重フィルムに、フィルム下層１３にPET，PP，PE，PCなどのプラスチック層、フィルム上層１４にシリコン層から成るフィルムがある。それぞれのフィルム層は厚さ25−200μｍ程度である。

これを上部ガス透過膜２にレーザー溶着させる場合、二重フィルム下層１３にはガス透過膜２と同じ材料または相転移温度が近い材料が適している。二重フィルム下層１３の表面溶着予定箇所はレーザー光を吸収するために磨りをいれ、滅菌済みの水で湿らせた上部ガス透過膜２の上に載せ溶着予定箇所を密着させる。レーザー光を溶着予定箇所に照射、掃引すると二重フィルム上層１４はレーザー光を透過し、二重フィルム下層１３の磨り部位が加熱され上部ガス透過膜２に溶着する。このときシリコン層はプラスチック層にくらべ融点が非常に高く、融解しない。

次に図５の(c)に示したように、清潔野において、二重フィルム上層１４を二重フィルム下層１３からピンセットで剥離すると、二重フィルム下層１３の無菌表面が出現する。ここで上部ガス透過膜２と二重フィルム下層１３の接着部５０に細胞培養容器開放器具の切断部１１が通るようにして器具で細胞培養容器を開放する。この手順においては、従来の閉鎖系細胞培養容器と同じ酸素透過性環境において培養可能となるため、すべての培養細胞を対象とすることができる。

続いて、第３の実施例として、培養前からガス透過膜が二重に配置されている細胞培養容器の実施例を図６を用いて説明する。

図６は、培養前からガス透過膜が二重に配置されている細胞培養容器の一構成例の断面、及び該容器を開放する際の手順を示す図である。図６の(a)は培養終了直後の細胞培養容器側断面図、図６の(b)は(a)の培養容器の溝より内側の上部ガス透過膜を切り取ったときの細胞培養容器側断面図である。

同図の（a）に示すように、細胞１２は培地保持部４の物質透過膜７上で培養される。細胞培養容器枠体１の高さは、溝８の内側よりも外側が高くなっている。二重構造を形成する上部ガス透過膜２は細胞培養容器の溝８の内側枠体１に円周状に接着し、上部ガス透過膜５１は溝外側枠体に円周状に接着しており、ガス透過膜２、５１同士は接着していない。上部ガス透過膜５１の表面は無菌状態ではないが、上部ガス透過膜２の表面を含む二重ガス透過膜間は無菌であるものとする。この構成の場合には、培養中からガス透過膜が二重になっているため、培地に供給される酸素量に配慮が必要となる。例えば、上部ガス透過膜２は、培地蒸発量をできる限り少なくするため水蒸気透過度の低い素材を選択し、上部ガス透過膜５１はシリコンのように酸素透過性の非常に高い素材、または気体透過性に関わらずポア径0.2ｍｍ以下の穴を有する素材を選択する。

上部ガス透過膜５１の枠体１への接着方法としては、接着時に接着面を押さえつけることが可能なため、超音波溶着、レーザー溶着、接着剤など複数の接着手段が容易に可能である。培養終了後、清潔野において、溝８より内側の上部ガス透過膜５１を取り除くと、同図の（ｂ）に示すように、上部ガス透過膜２の無菌表面が出現する。上部ガス透過膜５１は溝８にメスを入れ取り除いても構わない。次に細胞培養容器開放器具を用いて上部ガス透過膜２を取り除く。

ここでは、枠体１と上部ガス透過膜５１とを溶着する例について説明したが、枠体１と上部ガス透過膜５１は容易に着脱可能に枠体１と接続できるように構成しても良い。この場合、強度を維持するために、先の実施例で説明したように、上部ガス透過膜を囲う枠体を別途設ける必要がある。また、この枠体と培養容器の枠体１とを接続する際、密閉性を維持するために上部ガス透過膜を囲う枠体を覆うシール部材を設けるとよい。

また、このように枠体１と上部ガス透過膜部分とを着脱可能とすることで、使用目的、使用環境に応じて膜の材質を変化させることが可能となる。このように材質を変化することが可能となることで、上部ガス透過膜の材質により気体透過性をコントロールし、低酸素培養など特殊な環境下における細胞培養を容易に実現することができる可能性がある。

上記の溝のある細胞培養容器の構成と、上部膜を二重に有する細胞培養容器の構成を組み合わせることにより、培養終了後の開放時においても培養細胞および培養空間を汚染しないことを実現する。

以上説明した各種の実施例において、培養容器から細胞にダメージを与えることなく、容器内部の無菌性を維持した状態で、培養細胞、組織を取出す構成例を示してきたが、上記特徴を一例としてまとめると以下のようになる。

各実施例の細胞培養容器は、容器枠体上部にガス透過膜を接着させることにより、培地を保持する培地保持部を形成している。培地保持部は培養する細胞の種類により一段若しくは多段からなる。培養終了後は上部のガス透過膜を破壊することにより培養細胞を取り出す。このとき、上述した（１）ら（４）の課題は、それぞれ以下の（１）から（４）のいずれかの構造および方法により解決することが可能となる。

（１）上部ガス透過膜を破壊する手段として針状のもので膜に穴を開け、膜を押し切る。
当該構成によれば、メスにより膜を切り出す手法に比べて、切りくずが出にくいことから、切りくずによる容器内の汚染を抑止することが可能となる。

（２）上部ガス透過膜接着部周辺の細胞培養容器枠体にガイド、或いはガイド部を設ける。針とガイドを有する細胞培養容器開放器具を用い、細胞培養容器側のガイド部に開放容器側のガイドを合わせて操作する。針は、両者のガイド部を合致させたときに針先端が培養表面まで到達しないものとする。当該構成によれば、上記（１）と同様に切りくずを抑制でき、さらに、溝、突起などのガイド部がストッパーとなり切断部が培養層に届くことが防げることから、細胞を損傷せずに容器開放を実行できる。

（３）培養終了後、細胞培養容器開放前に、上部ガス透過膜と同程度の大きさの清潔な膜を上部ガス透過膜上に接着させる。両膜が接着している部位に細胞培養容器開放器具の針を入れて膜を開ける。または、培養前からガス透過膜が二重に配置されている培養容器を用いることも可能であり、この場合には二重のガス透過膜同士は接着しておらず、より上側のガス透過膜を開放した後に、残ったガス透過膜に針を入れ容器を開放する。
当該構成によれば、不意にガス透過膜が容器内に脱落することによる汚染を防ぐことが可能となり、清浄性を維持した容器開放が可能となる。

（４）細胞培養容器開放器具に針を複数設け、針は器具本体に対し垂直に設置されておらず、周の横方向および容器中心方向へ傾斜している。器具は膜に対してねじ切るように回転しながら押し切る。
当該構成によれば、切断したガス透過膜２が培養容器内に脱落することなく、切断部１１に巻き込まれるように保持されるため、脱落したガス透過膜を排除する際の培養細胞の汚染および破損リスクがなく容器開放が可能となる。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。

また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

更に、本明細書においては、特許請求の範囲に記載された発明以外に、種々の発明が開示されているが、その一例を下記に示す。

細胞培養装置であって、細胞培養容器を保持する培養ステージと、培養液を保管するための培養液保管部と、廃液を溜めるための廃液収容部と、培養液保管部から細胞培養容器まで培養液を供給するための送液管と、細胞培養容器から廃液を回収し、当該廃液を廃液収容部まで送る廃液管を備え、細胞培養容器は、容器内部に培地保持部と、培養液を供給、排出するための一対の接続部と、接続部から培地保持部まで通ずる一対の培地流路とを有し、培地保持部の少なくとも片面にガス透過膜を備え、当該ガス透過膜の周囲近傍の容器枠体の表面に、ガス透過膜を切り取る器具をガイドするガイド部が形成された細胞培養装置、などが開示されている。

１、１５ 枠体
２、５１ 上部ガス透過膜
３ 下部ガス透過膜
４ 培地保持部
５ ポート
６ 培地流路
７ 物質透過膜
８ 溝
９ 持ち手
１０ ガイド
１１ 切断部
１２ 培養細胞
１３ 二重フィルム下層
１４ 二重フィルム上層
１６ シール部材
３０ 細胞培養容器の開放器具
５０ 接着部

Claims (15)

1. 細胞を培養する閉鎖系の細胞培養容器であって、
   容器枠体と、
   前記容器枠体の内部に形成された培地保持部と、
   前記培地保持部の少なくとも片面に形成されるガス透過膜とを備え、
   前記ガス透過膜が形成される周囲近傍の前記容器枠体の表面に、前記ガス透過膜を切り取る器具をガイドするガイド部が形成されている
   ことを特徴とする細胞培養容器。
2. 請求項１に記載の細胞培養容器であって、
   前記ガス透過膜上に貼付された、二枚のフィルムからなる二重フィルムを備え、前記二重フィルムの前記二枚のフィルム間は無菌空間であり、上部の前記フィルムは、下部の前記フィルムから剥離可能である
   ことを特徴とする細胞培養容器。
3. 請求項１に記載の細胞培養容器であって、
   前記ガイド部は、前記容器枠体の表面に形成された溝であり、
   前記容器枠体は前記溝の内側よりも外側が高い
   ことを特徴とする細胞培養容器。
4. 請求項１に記載の細胞培養容器であって、
   前記ガス透過膜は二重構造で形成され、当該二重構造をなす二枚のガス透過膜同士は接着しておらず、前記ガイド部の内側に、前記容器枠体に接着された前記ガス透過膜の表面を含む、二枚の前記ガス透過膜間が無菌状態である
   ことを特徴とする細胞培養容器。
5. 請求項１に記載の細胞培養容器において、
   前記培地保持部は物質透過膜を挟んだ２層構造を有し、２層構造の前記培地保持部各々は、一対の培養液流路と、当該培養液流路にそれぞれ接続する一対の突起構造部とを備える
   ことを特徴とする細胞培養容器。
6. 細胞培養容器の開放器具であって、
   容器枠体の内部に形成された培地保持部の少なくとも片面にガス透過膜を備える細胞培養容器の、前記ガス透過膜の周囲近傍の容器枠体部分に形成された容器側ガイドに合致する開放器具側ガイドと、
   前記ガス透過膜を押し切る切断部と、
   当該開放器具を操作するための持ち手を備える
   ことを特徴とする細胞培養容器の開放器具。
7. 請求項６に記載の細胞培養容器の開放器具であって、
   前記切断部の長さは、前記開放器具側ガイドを前記容器側ガイドに合致させたときに前記切断部の先端が前記容器の培養表面まで到達しない長さである
   ことを特徴とする細胞培養容器の開放器具。
8. 請求項６に記載の細胞培養容器の開放器具であって、
   前記容器側ガイドが、前記容器枠体の表面に形成された溝であり、
   前記開放器具側ガイドが、前記溝に合致する突起である
   ことを特徴とする細胞培養容器の開放器具。
9. 請求項６に記載の細胞培養容器の開放器具であって、
   前記持ち手の周りに同心円状に配置された複数個の前記切断部を備える
   ことを特徴とする細胞培養容器の開放器具。
10. 請求項９に記載の細胞培養容器の開放器具であって、
    複数の前記切断部が当該開放器具本体に対し周の横方向および容器中心方向へ傾斜している
    ことを特徴とする細胞培養容器の開放器具。
11. 細胞培養容器の開放方法であって、
    容器内部に設けられた培地保持部と、当該培地保持部の少なくとも片面に形成されるガス透過膜と、当該ガス透過膜の周囲近傍の容器枠体に形成された容器側ガイドとを備える細胞培養容器の前記ガス透過膜を、
    前記容器側ガイドに合致する開放器具側ガイドと、前記ガス透過膜を押し切る切断部と、
    当該開放器具を操作するための持ち手を備える開放器具を用い、前記容器側ガイドと前記器具側ガイドを合致させて切り取る
    ことを特徴とする細胞培養容器の開放方法。
12. 請求項１１記載の細胞培養容器の開放方法であって、
    前記容器側ガイドが、前記容器枠体の表面に形成された溝であり、前記開放器具側ガイドが、前記溝に合致する突起であり、前記溝に前記突起を合致させて前記ガス透過膜を切り取る
    ことを特徴とする細胞培養容器の開放方法。
13. 請求項１２記載の細胞培養容器の開放方法であって、
    前記切断部の長さは、前記突起を前記溝に合致させたときに、前記切断部の先端が前記細胞培養容器の培養表面まで到達しない長さである
    ことを特徴とする細胞培養容器の開放方法。
14. 請求項１１記載の細胞培養容器の開放方法であって、
    前記ガス透過膜に、剥離可能な二枚のフィルムからなる二重フィルムを前記ガス透過膜の表面に貼付けし、
    前記二重フィルムの前記ガス透過膜に貼付されていないフィルムを剥離し、
    その後、前記開放器具を用いて前記ガス透過膜を貼付された前記フィルムと共に切り取ることを特徴とする細胞培養容器の開放方法。
15. 請求項１１記載の細胞培養容器の開放方法であって、
    前記ガス透過膜は、前記培地保持部側とは反対側の表面に接着された、剥離可能な二枚のフィルムからなる二重フィルムを備え、
    当該二重フィルムの前記ガス透過膜に接着されていないフィルムを剥離した後、前記開放器具を用いて前記ガス透過膜を貼付された前記フィルムと共に切り取る
    ことを特徴とする細胞培養容器の開放方法。

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