JP5062163B2 - 細胞用デバイス及び細胞凍結保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の取り扱いに好適に用いられ、中空糸の内部空間に細胞を内包しうる細胞用デバイスに関し、特に中空糸内の細胞への感染防止に適した手段を有する細胞用デバイスに関する。

ヒトの不妊治療や動物のクローンの分野において、卵子や初期胚などの生殖細胞を培養したり凍結保存することがある。この培養や凍結保存において、生殖細胞を培地から取り出したり、凍結保存容器に対して出し入れしたりすることがある。このような生殖細胞の取り扱い作業は、ピペットの如くストロー形状の器具を用いて、生殖細胞をストロー内へ吸い込む或いはストロー内から吐き出すことにより行われている。この他にも、膜状又は板状のデバイス（例えば、北里サプライ社製、クライオトップ）が用いられたり、ループ形状のナイロン糸（例えば、北里サプライ社製、クライオループ）が用いられたりしている。

特許文献１には、初期胚の遺伝情報の判定のために使用される器具が開示されている。この器具は、移植前初期胚から細胞を取り出すために使用され、ピペットに類似するパイプ材（２）を有する。このパイプ材（２）は、細いガラス管であり、その先端に鋭利な突き刺し部（３）が形成されている。パイプ材（２）の他端はマイクロマニピュレータ用の微量吸引及び排出が可能な操作器具に接続されている。初期胚にパイプ材（２）が突き刺され、初期胚内の細胞がパイプ材（２）の内部に吸引される。

特許文献２には、中空糸内部で細胞を培養又は保存するための器具が開示されている。この器具は、細胞懸濁液流通管（１）に中空糸固定部（３）を介して中空糸（４）の束が固定され、その中空糸（４）の束の先端が硬化性樹脂（５）で封止されている。中空糸（４）の束が培地に浸漬された状態で細胞懸濁液流通管（１）が吸引され、細胞懸濁液流通管（１）及び中空糸（４）の束に培地が満たされる。その後、細胞懸濁液流通管（１）を通じて中空糸（４）の束に細胞懸濁液が注入されると、中空糸（４）の内部に細胞が堆積される。

特許文献３には、生体組織マトリックスへ細胞を播種する方法が開示されている。この方法においては、播種すべき細胞が充填された生体分解性中空糸が生体組織片に埋め込まれ、その生体組織片において中空糸から細胞が放出される。

特開２００３−３３２００号公報 特開２００３−３３９３６８号公報 特開２００７−１６８号公報

しかし、生殖細胞の培養において培地を交換する度に、従来のストロー形状の器具を用いて、培地などに対して生殖細胞の取出し及び吐き出しを繰り返す作業は煩雑であるという問題がある。

また、生殖細胞を凍結保存する際に、例えばガラス化により凍結保存するのであれば、濃度勾配を有する複数のガラス化平衡液に生殖細胞を順次浸漬することがあるが、その際に、従来のストロー形状の器具を用いて、複数種のガラス化平衡液に対して生殖細胞の注入及び取出しを繰り返す作業は煩雑であるという問題がある。さらには、凍結保存された生殖細胞を解凍して培地に注入する際にも、同様の煩雑さが問題となる。こられの問題は、生殖細胞のみならず、他の細胞を取り扱う際にも同様に生じる。

本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞の取り扱いに好適であり、特に中空糸が用いられることによって、凍結保存や培養に際しての細胞の取り扱いに適し、かつ中空糸内の細胞を感染から防止する手段を提供することにある。

(1) 本発明に係る細胞用デバイスは、両端が開口された中空糸と、上記中空糸の第１端に接続されて、その内部空間が当該中空糸の内部空間と連続する流路を構成する第１管体と、上記第１管体にスライド可能に設けられて、上記中空糸より当該第１管体側へ退避した第１姿勢、及び上記中空糸の周囲を覆う第２姿勢に姿勢変化可能なカバーと、を具備する。上記カバーは、熱溶着可能な袋形状である。

本発明における細胞としては、生殖細胞が挙げられる。生殖細胞とは、始原生殖細胞、精子、精子細胞、卵子、卵母細胞、初期胚を含む包括的な概念である。ここで、精子細胞とは、精子となる過程における前駆細胞をいう。卵母細胞とは、卵子となる過程における前駆細胞をいう。初期胚とは、着床前の受精卵をいう。なお、本発明に係る細胞用デバイスは、生殖細胞以外にも、ＥＳ細胞のような細胞の取り扱いに用いられてもよい。

中空糸とは、細胞を通過させないが、水や電解質、タンパク質などを通過させうる径の孔を複数有する膜がストロー形状に成形されたものをいう。中空糸を形成する膜として、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、再生セルロースなどが挙げられる。この膜が有する細孔径は、ナノメートルオーダーのものであればよい。また、膜の厚みは、前述の細胞を観察できる程度の透明性を中空糸が有するためには、好ましくは０．５〜３０μｍであり、さらに好ましくは１〜１０μｍである。

中空糸の内径は、対象となる細胞を内包することができる程度が選択され、好ましくは２０〜１０００μｍであり、さらに好ましくは５０〜５００μｍである。

中空糸の長さは、数個の細胞を内包することが可能であり、後述される気泡を形成したりするに適した長さが選択され、好ましくは１〜１００ｍｍであり、さらに好ましくは１０〜４０ｍｍである。中空糸の長さがこの範囲内であれば、卵母細胞、卵子及び初期胚であれば１〜数十個程度を内包することができ、始原生殖細胞、精子及び精子細胞であれば数十〜数万個程度を内包することができ、かつ、その内包された複数個の細胞に対して中空糸の両開口側に気泡を形成することができる。

第１管体は、中空糸と接続可能なものであって、接続された中空糸を支持する剛性を有する。第１管体は、その内部空間が中空糸の内部空間と連続して気体又は液体の流路となり得るものである。第１管体の素材は特に限定されないが、例えば、ステンレスなどの金属や、プラスチック、ガラスなどが挙げられる。

第１管体の形状は、特に限定されず、円管、角管などを採用しうるが、通常、中空糸が円筒形状となるので、円管であることが好ましい。

第１管体の外径又は内径は、中空糸との接続を考慮して選択される。例えば、第１管体に対して中空糸を外嵌させるのであれば、第１管体の外径は中空糸の内径と同程度としてもよい。逆に、中空糸に対して第１管体を外嵌させるのであれば、第１管体の内径は中空糸の外径と同程度としてもよい。また、筒形状のジョイントを用いて中空糸と第１管体とを接続するのであれば、第１管体の外径は中空糸の外径と同程度としてもよい。

第１管体の長さは、ハンドリングを考慮して選択され、５０〜１０００ｍｍ程度がハンドリングに優れるので好適である。

中空糸と第１管体との接続は、内嵌や外嵌、ジョイントによる機械的な接続構造が選択されてもよく、さらに医療用接着剤などを用いて接着固定が行われてもよい。

カバーは、第１管体にスライド可能に設けられている。カバーは、第１管体に対してスライド可能である。カバーの素材は、熱溶着が可能であれば特に限定されないが、例えば、熱可塑性樹脂が用いられる。

カバーの形状は袋形状である。この袋形状は、カバーのスライドを妨げないように、第１管体が挿通される孔を有する。したがって、カバーの袋形状は、必ずしも密閉されている必要はなく、例えば、１枚のシートが二つ折りされて、第１管体の長さ方向に沿って熱溶着され、第１管体の軸線方向の両端が開口されたものが採用される。このような袋状のカバーが第１管体に対してスライドされると、カバーに対して中空糸が出入されうる。

カバーの寸法は、中空糸を覆うに適した寸法が選択される。カバーの寸法は、中空糸を覆うことができる程度であれば、カバーの全域に渡って一定である必要はない。また、中空糸の長さ方向に沿ったカバーの長さは、中空糸の長さを考慮して選択されるが、必ずしも中空糸より長い必要はない。。前述されたように、中空糸の長さは、好ましくは１〜１００ｍｍであり、さらに好ましくは１０〜４０ｍｍであるから、カバーの長さも同程度に設定される。

カバーと第１管体との接続は、カバーが第１管体に対して中空糸に接離する方向、つまり第１管体の長さ方向にスライド可能であれば、公知の接続機構が採用されうる。例えば、カバーが第１管体を覆い、かつ第１管体がカバーに対して挿抜可能であることによって、カバーが第１管体の長さ方向にスライド可能となる。

カバーは、第１管体に対してスライドすることによって、中空糸より第１管体側へ退避した第１姿勢と、中空糸の周囲を覆う第２姿勢とに姿勢変化する。カバーが第１姿勢にされると、カバーは、中空糸の周囲に存在せず、第１管体の周囲を覆った状態となる。したがって、中空糸の周囲が露出されて、中空糸を直接に視認したり、中空糸を直接に切断したりすることが可能となる。カバーが第２姿勢にされると、カバーは中空糸の周囲を覆う。

なお、前述された第１姿勢においては、中空糸の大半が露出されていればよく、カバーが中空糸の一部のみを覆う状態が第１姿勢から除かれるものではない。また、前述された第２姿勢においては、中空糸の大半が覆われていればよく、中空糸の一部のみが露出された状態が第２姿勢から除かれるものではない。

細胞用デバイスの使用に際して、カバーを第１姿勢とする。これにより、中空糸を直接に視認することができる。一方、使用までの間においてカバーが第２姿勢にされることにより、使用前に、中空糸が他の部材に直接に接触することが防止される。

カバーを第１姿勢にした後、例えば、顕微鏡などによって培地中の細胞を確認して、細胞用デバイスの第１管体を操作して、第１管体に接続された中空糸を培地中に挿入し、中空糸の先端を細胞に近接させる。そして、適当な吸引具を用いて、第１管体を通じて中空糸の内部空間を負圧とすると、その負圧が吸引圧となって、中空糸の先端から細胞が培養液と共に中空糸の内部空間へ吸引される。複数個の細胞を中空糸の内部空間へ吸引する場合には、この作業を繰り返す。

培地から取り出した細胞を凍結保存する場合には、中空糸から細胞を取り出すことなく、中空糸に内包された状態の細胞を凍結保存溶液に浸漬する。前述のように、中空糸の孔は、細胞を通過させないが、培養液や凍結保存溶液などを通過させるので、中空糸の内部空間に細胞が内包された状態を維持しながら、中空糸の内部空間の培養液や細胞の細胞内液などを凍結保存溶液に置換することができる。これにより、複数個の細胞を中空糸により一体としたまま凍結保存することができる。

中空糸の内部空間へ細胞を吸引した後、第１姿勢のカバーを第２姿勢にスライドさせる。これにより、中空糸がカバーによって覆われる。第２姿勢のカバーにおける中空糸の長さ方向の両端を熱溶着することによって、袋形状のカバーが密閉されて、その内部に中空糸が内包される。そして、中空糸を第１管体から切断するなどして、中空糸及びカバーを第１管体から分離する。これにより、内部空間に細胞が内包された中空糸がカバーで密封される。

(2) 本発明に係る細胞用デバイスは、上記第１管体の内部空間に対して吸引圧を付与する吸引具を更に具備するものであってもよい。

吸引具とは、中空糸及び第１管体の内部空間を負圧として、中空糸の開口から細胞を液体と共に吸引させることが可能なものである。このような吸引具として、注射筒やマイクロポンプなどが挙げられる。細胞用デバイスをディスポーザブル品とするには、吸引具としてディスポーザブルの注射筒を選択することがコストや廃棄の観点から好ましい。

吸引具と第１管体との接続は特に限定されず、後述されるような第２管体を介して吸引具と第１管体とが接続されても、吸引具に第１管体が直接に接続されてもよい。

(3) 上記第１管体と上記吸引具とが、可撓性を有する第２管体で連結されてもよい。

可撓性を有する第２管体として、例えば天然ゴム、ポリウレタン、シリコーンゴム、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン・プロピレン共重合体などをチューブ形状に成形したものが挙げられる。第２管体の長さは特に限定されないが、第１管体と吸引具とを別々に操作するに適した長さが採用され、５０〜１０００ｍｍ程度であれば、一方の手で第１管体を操作しながら他方の手で吸引具を操作できるの好適である。

第２管体の両端は、第１管体又は吸引具と接続可能な形状である。第２管体と第１管体又は吸引具との接続構造は特に限定されず、外嵌などのように直接に接続されても、ジョイントなどを介して間接に接続されてもよい。

第１管体と吸引具とが可撓性を有する第２管体で連結されることにより、第１管体と吸引具とを離れた位置で別々に操作することができるので、細胞用デバイスのハンドリングが向上される。

(4) 本発明に係る細胞凍結保存方法は、両端が開口された中空糸の内部空間と連続して流路を構成する第１管体の一端から吸引圧を付与して、第１液体中に細胞が浮遊する細胞浮遊液から細胞及び第１液体を、中空糸の他端から内部空間へ吸引する第１ステップと、内部空間に細胞及び第１液体を内包する中空糸を、凍結保存に適した第２液体に浸す第２ステップと、上記第１管体にスライド可能に設けられた袋形状のカバーで、内部空間に細胞を内包する中空糸を覆い、当該カバーを熱溶着して、カバーで中空糸を包む第３ステップと、上記中空糸及び上記カバーを第１管体から分離する第４ステップと、を含む。

凍結保存すべき細胞は第１液体中に浮遊する。第１液体とは、細胞を浮遊させるに適した液体であり、例えば培養液が挙げられる。培養液は細胞の種類及び目的により選択され、例えば、精子細胞や卵母細胞、初期胚を培養する場合には、ＴＣＭ−１９９培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地などが挙げられる。また、ヒトの体外受精を目的とする培地として、ＨＵＣＵＭ培地（ニプロ社製）が挙げられる。ウシの体外受精を目的とする培地として、ＴＣＭ−１９９培地、ＳＯＦ培地、ＣＲ１培地、ＫＳＯＭ培地、ＩＶＦ１００培地、ＩＶＦ１１０Ｓ培地、ＩＶＭＤ１０１培地、ＩＶＤ１０１培地（機能性ペプチド研社製）が挙げられる。ブタの体外受精を目的とする培地として、ＮＣＳＵ培地、ＰＺＭ−５培地（機能性ペプチド研社製）が挙げられる。

細胞浮遊液とは、前述の第１液体中に細胞が浮遊した状態で存在するものである。通常、第１液体中には、単一種類の細胞が複数個浮遊している。

第１ステップにおいて、例えば、顕微鏡などによって第１液中の細胞を確認して、中空糸を細胞浮遊液中に挿入し、中空糸の先端を細胞に近接させる。そして、シリンジやマイクロポンプなどの吸引具を動作させて中空糸の内部空間に吸引圧を付与する。そうすると、中空糸の先端から細胞が第１液と共に中空糸の内部空間へ吸引される。複数個の細胞を中空糸の内部空間へ吸引する場合には、この作業を繰り返す。これにより、中空糸の内部空間に、所望の個数の細胞と第１液体とが取り込まれる。

第２ステップにおいて、内部空間に細胞及び第１液体を内包する中空糸を凍結保存に適した第２液体に浸す。第２液体は、凍結保存に適した液体である。細胞の凍結保存方法として、高濃度の凍害保護液中での急速冷凍と、低濃度の凍害保護液での通常冷凍とが挙げられる。高濃度の凍害保護液中での急速冷凍は、ガラス化とも称され、また、凍害保護液はガラス化溶液とも称される。細胞内保護タイプのガラス化溶液として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有液、エチレングリコール含有液、プロパンジオール含有液などが挙げられる。細胞外保護タイプのガラス化溶液として、シュークロース含有液、トレハロース含有液、フィルコールコンレイ溶液が挙げられる。

中空糸の内部空間に内包された第１液体をガラス化溶液に置換するには、第２液体として、ガラス化溶液と培養液などの第１液体とを、適度な濃度勾配となる比率で混合したものが複数用いられてもよい。つまり、ガラス化溶液の濃度が次第に高くなる複数種の第２液体が用いられてもよい。濃度勾配を有する第２液体の種類が多いほど、緩慢な条件で中空糸の内部空間に内包された第１液体や細胞の細胞内液などをガラス化溶液に置換することができるが、あまりに多いと作業が煩雑になるので、２〜５種類の第２液体を用いることが通常である。

複数種の第２液体を用いる場合には、ガラス化溶液の濃度が低い第２液体へ中空糸を浸す。そして、必要に応じて撹拌しながら置換を所定時間行う。前述のように、中空糸の孔は、細胞を通過させないが、第１液体及び第２液体を通過させる。したがって、中空糸の内部空間や細胞の細胞内液などが第１液体から第２液体に置換される。その際に、細胞は中空糸の内部空間に内包された状態に維持される。これをガラス化溶液の濃度が低い第２液体から順に行うことにより、中空糸の内部空間の第１液体や細胞の細胞内液などがガラス化溶液に置換される。

第３ステップにおいて、第１管体にスライド可能に設けられた袋形状のカバーで、内部空間に細胞を内包する中空糸を覆う。そして、カバーを熱溶着して、袋形状のカバーで中空糸を密封するように包む。中空糸を覆うカバーが熱溶着されると、カバーから外側へ飛び出している中空糸の一部分も熱溶着される。これにより、内部空間の第１液体や細胞の細胞内液などがガラス化溶液に置換された中空糸がカバーで密封される。

第４ステップにおいて、中空糸を密封したカバーを、中空糸と共に第１管体から分離する。この分離は、例えば、中空糸、又は、中空糸及びカバーを、密封状態を破壊しないように切断することによって行うことができる。

カバーに密封されて第１管体から分離された中空糸を、カバーと共に液体窒素などに投入して冷却する。これにより、中空糸の内部空間に内包された細胞が凍結される。液体窒素などに投入されても、中空糸はカバーで密封されているので、液体窒素などを通じて、中空糸の内部空間に細胞への感染源が進入することがない。

なお、前述のように中空糸の内部空間に内包されて凍結保存された細胞は、中空糸と共に加温液に浸すことにより解凍される。解凍されるときも、中空糸はカバーで密封されているので、加温液などを通じて、中空糸の内部空間に細胞への感染源が進入することがない。解凍された中空糸を、カバーを開封して取り出し、中空糸の一端から内部空間へ排出圧を付与すると、中空糸の内部空間から細胞が外部へ排出される。また、中空糸の内部空間に細胞を内包させた状態で培養を行うのであれば、カバーから取り出した中空糸を所望の培地中に投入すればよい。

本発明に係る細胞用デバイスによれば、各々の内部空間が流路として連続されて第１管体と中空糸とが接続されているので、吸引具により流路に吸引圧を付与すると、中空糸の内部空間へ細胞を取り込むことができる。この中空糸の孔は、細胞を通過させないが、培養液や凍結保存溶液などを通過させるので、中空糸の内部空間に細胞が内包された状態を維持しながら、中空糸の内部空間の培養液や細胞の細胞内液などを凍結保存溶液に置換することができる。

また、第１管体に対してカバーがスライドされて第１姿勢と第２姿勢とに姿勢変化されるので、使用前や細胞を内包する中空糸を凍結するときにおいては、第２姿勢のカバーによって中空糸が他の部材と直接に接触することが防止される。一方、細胞を中空糸の内部空間へ吸引するときには、カバーが第１姿勢とされることによって、中空糸を直接に視認することができる。

また、第２姿勢においてカバーを熱溶着することによって、袋形状のカバーを密封して、中空糸を内包させることができる。これにより、凍結保存や培養に際して、細胞の取り扱いに適し、かつ中空糸内の細胞が感染の危険から保護されるデバイス又は方法が実現される。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。

［図面の説明］
図１は、本発明の実施形態にかかる細胞用デバイス１０の全体構成を示す斜視図である。図２は、中空糸１１、注射針１２及びカバー１３の分解斜視図である。図３は、第１姿勢のカバー１３を示す拡大斜視図である。図４は、第２姿勢のカバー１３を示す拡大斜視図である。図５〜図１３は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。なお、図５〜図１３には、細胞用デバイス１０の中空糸１１、注射針１２及びカバー１３の一部のみが示されており、チューブ１４及び注射筒１５は各図に示されていない。

［細胞用デバイス１０］
図１に示されるように、細胞用デバイス１０は、主として、中空糸１１と、注射針１２と、カバー１３と、チューブ１４と、注射筒１５と、を有する。

中空糸１１は、細胞を通過させないが、水や電解質、タンパク質などを通過させうる径の孔を複数有する膜が、両端が開口したストロー形状に成形されたものである。中空糸１１の内径及び長さは、対象となる細胞に対応させて適宜選択されるが、内径は数百μｍ程度であり、長さは数ｃｍ程度である。

注射針１２は、本発明における第１管体の一実施態様である。注射針１２は一般的なものであり、ステンレス製のカヌラがハブに固定されている。注射針１２のカヌラの先端開口に中空糸１１の一端が挿入されて、医療用接着剤により中空糸１１と注射針１２固定されている。これにより、中空糸１１の内部空間が注射針１２のカヌラの内部空間と連続する。この連続した内部空間は、後述されるように吸引圧が付与されて気体又は液体の流路となる。本明細書において、注射針１２と連結された側の中空糸１１の端が第１端と称され、注射針１２から延出された先端が中空糸１１の第２端と称される。

カバー１３は、注射針１２にスライド可能に設けられている。カバー１３は、袋形状であり、中空糸１１の第１端と第２端とを結ぶ方向（矢印１０１）に沿って長い。カバーは、熱溶着可能な熱可塑性樹脂製のシートを二つ折りにし、その二つ折りされたシートの端部２３が矢印１０１に沿って熱溶着されている。これにより、二つ折りされたシートが、袋形状のカバー１３とされている。なお、矢印１０１は、中空糸１１及び注射針１２の軸線１０２の方向と合致している。

袋形状のカバー１３は、矢印１０１に沿った方向の両端が開口している。この各開口端は、注射針１２のハブ側が第１端２１と称され、矢印１０１において反対側の開口端が第２端２２と称される。第１端２１及び第２端２２の各開口は、注射針１２のカヌラの外径より若干大きい。また、第１端２１と第２端２２との間、すなわちカバー１３内においては矢印１０１に沿って、同じ開口寸法の空間が連続している。この第１端２１及び第２端２２に注射針１２のカヌラが挿通されるようにして、注射針１２とカバー１３とが連結されている。このような連結によって、カバー１３は、注射針１２のカヌラをガイドとして矢印１０１に沿ってスライド可能となっている。

カバー１３は、注射針１２のカヌラに対してスライドすることによって、図３に示されるように、中空糸１１より注射針１２側へ退避した第１姿勢と、図４に示されるように、中空糸１１の周囲を覆う第２姿勢とに姿勢変化する。カバー１３が第１姿勢にされると、カバー１３が中空糸１１の周囲に存在せず、注射針１２のカヌラの周囲を覆った状態となる。これにより、中空糸１１の周囲が露出される。カバー１３が第２姿勢にされると、カバー１３が中空糸１１の周囲を覆う。これにより、中空糸１１が他の部材と直接接触しないようにカバー１３によって保護される。

チューブ１４は、本発明における第２管体の一実施態様である。チューブ１４は、シリコーンゴム製である。チューブ１４の内径及び外径は、注射針１２及び注射筒１５に対応させて適宜選択される。図１においては、チューブ１４が、その長さ方向に対して一部が省略されて現されているが、チューブ１４の長さは、注射針１２と注射筒１５とを作業者が両手に分けて持って操作できるに適した長さであり、通常、数十ｃｍ程度である。チューブ１４の可撓性は、注射針１２と注射筒１５とを作業者が両手に分けて持って操作した際にチューブ１４が座屈せず、かつチューブ１４の内部空間が後述される吸引に適した負圧にされた際にチューブ１４が内部空間を閉塞して潰れない程度である。チューブ１４の一端は、ジョイントなどを介して注射針１２のハブと接続されている。これにより、注射針１２の内部空間は、チューブ１４の内部空間と連続されている。このジョイントなどは、公知のものを適宜用いればよいので、ここでは詳細な説明が省略される。

注射筒１５は、本発明における吸引具の一実施態様である。注射筒１５は、シリンジ３１に対してプランジャ３２が引き出されることにより、プランジャ３２の先端に接続された不図示のガスケットが移動して、シリンジ３１の内部空間に負圧を発生させる。この負圧が吸引圧として注射針１２の内部空間に付与される。

注射筒１５の構成は一般的である。シリンジ３１は略円筒形状であり、その先端側が縮径されて円筒形状の取付部３３が形成されている。取付部３３の両端は開口しており、一端がシリンジ３１の内部空間と通ずる。つまり、取付部３３の内部空間は、シリンジ３１の内部空間と外部とを連続させるポートを形成する。この取付部３３にチューブ１４の他端が外嵌されて、シリンジ３１の内部空間とチューブ１４の内部空間とが連続されている。シリンジ３１の基端側は開口されており、その基端側からプランジャ３２が内部空間へ挿入されている。プランジャ３２は、シリンジ３１の内部空間の軸線１０２方向の長さより長く、シリンジ３１の内部空間の最奥部まで挿入された状態で、プランジャ３２の一部がシリンジ３１の基端から外部へ突出している。

各図には現れていないが、プランジャ３２の先端にはガスケットが接続されている。ガスケットは、ゴムなどの弾性素材からなる円柱体であり、シリンジ３１の内部空間に気密に嵌合されて、プランジャ３２とともにシリンジ３１の内部空間を軸線１０２に沿った方向へスライド移動可能である。プランジャ３２が延びる方向は、ガスケットのスライド方向と一致する。ガスケットがシリンジ３１の基端側へ移動されると、シリンジ３１の内部空間が負圧となって、取付部３３から気体又は液体が内部空間へ吸引される。

［細胞凍結保存方法］
以下に、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法が説明される。本実施形態では、細胞用デバイス１０を用いた手法が一例として説明されるが、本発明にかかる細胞凍結保存方法は、細胞用デバイス１０以外の器具が用いられてもよいことは言うまでもない。

以下に説明される細胞凍結保存方法は、主として、細胞浮遊液から細胞４１及び培養液４２を中空糸１１の内部空間へ吸引する第１ステップ（Ｓ１）と、細胞４１及び培養液４２を内包した中空糸１１をガラス化溶液４３に浸漬する第２ステップ（Ｓ２）と、細胞４１を内包する中空糸１１をカバー１３で覆い、カバー１３を熱溶着して密封する第３ステップ（Ｓ３）と、中空糸１１及びカバー１３を注射針１２から分離する第４ステップ（Ｓ４）と、カバー１３で密封された中空糸１１を冷却する第５ステップ（Ｓ５）と、の５つのステップを有する。

凍結保存すべき細胞４１は培養液４２中に浮遊している。培養液４２は、培地皿などの容器に保持されているが、図５〜図１０では容器が省略されて複数個の細胞４１及び培養液４２の一部のみが示されている。培養液４２中には複数個の細胞４１が浮遊しており、これら細胞４１は、同一個体から採取された単一種類のものである。

細胞用デバイス１０の使用に際して、カバー１３を第１姿勢とする。これにより、中空糸１１を直接に視認することができる。一方、使用までの間においてカバー１３が第２姿勢にされることにより、使用前に、中空糸１１が他の部材に接触することが防止される。

図５に示されるように、第１ステップ（Ｓ１）において、細胞用デバイス１０の注射針１２を片手で持って操作し、中空糸１１を培養液４２中に挿入する。そして、他方の手で注射筒１５を操作してプランジャ３２をシリンジ３１から引き出し、中空糸１１内に微量の培養液４２を吸引する。

つづいて、図６に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の先端を培養液４２から取り出し、再び注射筒１５を操作して微量の空気を中空糸１１の内部空間へ吸引する。これにより、中空糸１１に吸引された微量の培養液４２は、中空糸１１の内部空間を注射針１２側へ若干移動する。

つづいて、図７に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の先端を再び培養液４２中に挿入し、顕微鏡を用いて培養液４２中の細胞４１を確認しながら、中空糸１１の先端を細胞４１に近接させる。そして、注射筒１５を操作して、中空糸１１の内部空間へ細胞４１を培養液４２と共に吸引する。これにより、中空糸１１の内部空間において、細胞４１及び培養液４２が存在する液体層４４より第１端側（注射針１２側）に、微量の気体層４５が形成される。つまり、中空糸１１の内部空間には、第１端側（注射針１２側）から順次、培養液４２のみの層、気体層４５、細胞４１及び培養液４２を含む液体層４４がそれぞれ形成される。

つづいて、図８に示されるように、中空糸１１の先端を培養液４２から取り出さずに、その先端を他の細胞４１に近接させ、注射筒１５を操作して、中空糸１１の内部空間へ他の細胞４１を培養液４２と共に吸引する。中空糸１１の内部空間へ吸引する細胞４１の個数は特に限定されないが、本実施形態では、３個の細胞４１が培養液４２とともに中空糸１１の内部空間へ吸引されて液体層４４が形成されている。

中空糸１１の内部空間へ３個の細胞４１を吸引した後、図９に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の先端を培養液４２から取り出し、注射筒１５を操作して、微量の空気を中空糸１１の内部空間へ吸引する。これにより、中空糸１１内の液体層４４及び気体層４５は、中空糸１１の内部空間を注射針１２側へ若干移動する。

つづいて、図１０に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の先端を再び培養液４２中に挿入し、注射筒１５を操作して、中空糸１１の内部空間へ培養液４２を吸引する。これにより、液体層４４に対して第２端側（先端側）に、微量の気体層４６が形成される。

第２ステップ（Ｓ２）において、図１１に示されるように、内部空間に細胞４１及び培養液４２を内包する中空糸１１をガラス化溶液４３に浸す。このとき、カバー１３は、第１姿勢である。前述されたように、中空糸１１の孔は、細胞４１を通過させないが、培養液４２やガラス化溶液４３を通過させるので、中空糸１１の内部空間に細胞４１が内包された状態が維持されながら、中空糸１１の内部空間の培養液４２や細胞４１の細胞内液などがガラス化溶液４３に置換される。

また、中空糸１１内の培養液４２をガラス化溶液４３に置換する際に、細胞４１に対して緩慢な条件を選択したい場合には、ガラス化溶液４３として、培養液４２が適度な濃度勾配で混合された複数種のものが用いられる。このような濃度勾配は、例えば２〜５種類に設定される。複数種のガラス化溶液４３が用いられる場合には、予め調整された各ガラス化溶液４３が準備されており、図１１に示されるようにして、複数種のガラス化溶液４３に中空糸１１が順次浸漬される。

第３ステップ（Ｓ３）において、カバー１３を第２姿勢とする。カバー１３を第２姿勢とすることによって、細胞４１及びガラス化溶液４３を内包する中空糸１１がカバー１３で覆われる。そして、図１２に示されるように、カバー１３の第１端２１側及び第２端２２側をそれぞれ熱溶着する。カバー１３の熱溶着は、例えば公知のヒートシーラを用いて行う。第１端２１側においては、中空糸１１が挿通された状態にあるが、この中空糸１１もカバー１３とともに熱溶着する。第２端２２側においては、第２端２２まで中空糸１１の先端が到達していないので、カバー１３のみを熱溶着できる箇所を適宜選択して熱溶着する。これにより、１枚のシートが二つ折りにされたカバー１３は、第１端２１側、第２端２２側、及び端部２３の３方向に沿って熱溶着されて、内部空間を密封する袋形状となり、その内部空間に中空糸１１が存在する。要するに、袋形状のカバー１３で中空糸１１が密封される。なお、図１２においては、熱溶着された部分が交差線のハッチングで示されている。

第４ステップ（Ｓ４）において、中空糸１１を密封したカバー１３を、中空糸１１と共に注射針１２から分離する。この分離は、中空糸１１及びカバー１３を、密封状態を破壊しないように鋏などで切断することによって行う。切断箇所は、カバー１３において熱溶着された部分より第１端２１側である。これにより、図１３に示されるように、細胞用デバイス１０から、細胞４１及びガラス化溶液４３を内包する中空糸１１と、その中空糸１１を密封するカバー１３とが分離される。

図には示されていないが、第５ステップ（Ｓ５）において、カバー１３に密封されて細胞用デバイス１０から分離された中空糸１１を、カバー１３に密封された状態で液体窒素又は液体ヘリウムに投入して冷却する。これにより、中空糸１１の内部空間に内包された細胞４１がガラス化される。そして、ガラス化された細胞４１を含有する中空糸１１は、カバー１３で密封された状態で、フリーザ内に保存する。

なお、前述のように中空糸１１の内部空間に内包されて凍結保存された細胞４１は、中空糸１１と共に加温液に浸すことにより解凍される。このとき、中空糸１１がカバー１３で密封された状態で解凍することによって、中空糸１１に内包された細胞４１が加温液と直接に接触することがない。解凍を終えた後、カバー１３を開封して中空糸１１を取り出し、中空糸１１の一端から内部空間へ排出圧を付与すると、中空糸１１の内部空間から細胞４１が外部へ排出される。また、中空糸１１の内部空間に細胞４１を内包させた状態で培養を行うのであれば、解凍後に、細胞４１を内包する中空糸１１を所望の培地中に投入すればよい。

［本実施形態の作用効果］
本実施形態に係る細胞用デバイス１０及び細胞凍結保存方法によれば、各々の内部空間が流路として連続されて中空糸１１と注射針１２とが接続されているので、注射筒１５により流路に吸引圧を付与すると、中空糸１１の内部空間へ細胞４１を取り込むことができる。この中空糸１１の孔は、細胞４１を通過させないが、培養液４２やガラス化溶液４３などを通過させるので、中空糸１１の内部空間に細胞４１が内包された状態を維持しながら、中空糸１１の内部空間の培養液４２や細胞４１の細胞内液などをガラス化溶液４３に置換することができる。

また、注射針１２に対してカバー１３がスライドされて第１姿勢と第２姿勢とに姿勢変化されるので、使用前や細胞４１を内包した中空糸１１を液体窒素などに投入するときにおいては、第２姿勢のカバー１３によって中空糸１１が他の部材と直接に接触することが防止される。一方、細胞４１を中空糸１１の内部空間へ吸引するときには、カバー１３が第１姿勢とされることによって、中空糸１１を直接に視認することができる。

また、第２姿勢においてカバー１３を熱溶着することによって、袋形状のカバー１３を密封して、中空糸１１を内包させることができる。これにより、凍結保存や解凍に際して、中空糸１１内の細胞４１が感染の危険から保護される。

なお、本実施形態に係る細胞用デバイス１０は、注射針１２の内部空間に対して吸引圧を付与する注射筒１５、及び注射針１２と注射筒１５とを接続するチューブ１４を具備するが、チューブ１４及び注射筒１５は汎用品を用いることができるので、必ずしも必須の構成とされなくてもよい。つまり、中空糸１１、注射針１２及びカバー１３を主要な構成として細胞用デバイス１０が構成されてもよい。また、注射針１２と注射筒１５との接続も特に限定されず、チューブ１４を介さずに、注射筒１５に注射針１２が直接に接続されてもよいし、注射筒１５が用いられずに、チューブ１４に対して口などから吸引圧が付与されてもよい。

図１は、本発明の実施形態にかかる細胞用デバイス１０の全体構成を示す斜視図である。 図２は、中空糸１１、注射針１２及びカバー１３の分解斜視図である。 図３は、第１姿勢のカバー１３を示す拡大斜視図である。 図４は、第２姿勢のカバー１３を示す拡大斜視図である。 図５は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図６は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図７は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図８は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図９は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図１０は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図１１は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図１２は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。 図１３は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。

符号の説明

１０・・・細胞用デバイス
１１・・・中空糸
１２・・・注射針（第１管体）
１３・・・カバー
１４・・・チューブ
１５・・・注射筒（吸引具）

Claims (4)

1. 両端が開口された中空糸と、
   上記中空糸の第１端に接続されて、その内部空間が当該中空糸の内部空間と連続する流路を構成する第１管体と、
   上記第１管体にスライド可能に設けられて、上記中空糸より当該第１管体側へ退避した第１姿勢、及び上記中空糸の周囲を覆う第２姿勢に姿勢変化可能なカバーと、を具備し、
   上記カバーは、熱溶着可能な袋形状である細胞用デバイス。
2. 上記第１管体の内部空間に対して吸引圧を付与する吸引具を更に具備する請求項１に記載の細胞用デバイス。
3. 上記第１管体と上記吸引具とが、可撓性を有する第２管体で連結された請求項２に記載の細胞用デバイス。
4. 両端が開口された中空糸の内部空間と連続して流路を構成する第１管体の一端から吸引圧を付与して、第１液体中に細胞が浮遊する細胞浮遊液から細胞及び第１液体を、中空糸の他端から内部空間へ吸引する第１ステップと、
   内部空間に細胞及び第１液体を内包する中空糸を、凍結保存に適した第２液体に浸す第２ステップと、
   上記第１管体にスライド可能に設けられた袋形状のカバーで、内部空間に細胞を内包する中空糸を覆い、当該カバーを熱溶着して、カバーで中空糸を包む第３ステップと、
   上記中空糸及び上記カバーを第１管体から分離する第４ステップと、を含む細胞凍結保存方法。

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