CN115192608A

CN115192608A - 一种用于促进创面愈合的间充质干细胞囊泡修复液

Info

Publication number: CN115192608A
Application number: CN202110402854.2A
Authority: CN
Inventors: 卢佳豪; 王丽莎; 李治寰
Original assignee: Dongguan Enlian Stem Cell Biotechnology Research Institute
Current assignee: Dongguan Enlian Stem Cell Biotechnology Research Institute
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2022-10-18

Abstract

本发明属生命科学技术领域，公开了一种间充质干细胞囊泡修复液的制备方法，所述间充质干细胞囊泡修复液由间充质干细胞囊泡与含3～5％人血清替代物的培养基组成。本发明选用脂肪间充质干细胞，在细胞培养融合度为75～85％时收集细胞和培养基上清，利用微量脂质体挤出器将细胞以微孔过滤的方法制备细胞内囊泡，同时利用聚乙二醇(PEG8000)沉淀的方法制备培养基上清中的细胞外囊泡。将细胞内外囊泡混合，用含3～5％人血清替代物的培养基为溶媒配置修复液，该修复液可用于促进皮肤创面修复，加速伤口愈合。

Description

一种用于促进创面愈合的间充质干细胞囊泡修复液

技术领域

背景技术

脂肪间充质干细胞属于成体干细胞中的一类多能干细胞，它具有干细胞的共性，即自我更新和多向分化能力，相较于其他类型的干细胞而言，其具有低免疫原性与无致瘤性的特点。脂肪间充质干细胞广泛应用于关节病、自身免疫性疾病、心血管系统疾病等的研究。研究发现，脂肪间充质干细胞可能是通过旁分泌产生细胞外囊泡与外泌体发挥其生物学效应。细胞外囊泡是细胞主动释放的纳米级膜囊泡。基于其生物发生、大小和生物物理性质，可以进一步分类(例如外泌体、微泡等)。最初囊泡被认为是细胞碎片，但随着研究的不断深入，细胞外囊泡越来越被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体。

间充质干细胞来源的囊泡与外泌体因其本身携带丰富的蛋白质、RNA、DNA等活性物质，被发现具有促进组织修复、免疫调节功能。从脂肪组织分离出的外泌体通过影响成纤维细胞的特性来加速皮肤伤口的愈合，来自间充质干细胞的细胞外囊泡也显示出相似的特性。研究发现，间充质干细胞外泌体中含有丰富的Wnt蛋白，能活化β-catenin信号通路，同时通过激活ERK1/2信号通路正调控成血管基因——VEGFA、Cox-2、FGF2等的表达，进而促进了二度烧伤大鼠模型深部创伤后血管的重生、胶原蛋白合成和皮肤损伤修复。

间充质干细胞囊泡与外泌体在创面修复、皮肤抗老、瘢痕修复等方面有着显著的治疗效果，因此如何从细胞液中有效地提取并获得完整的外泌体是开展外泌体研究的前提与关键。当前外泌体的分离方法包括超速离心法、聚合物沉淀法、体积排阻与超滤法、免疫亲和捕获法和微流体芯片技术等，其中超速离心法又称差速离心法是外泌体分离的标准方法，该方法虽然成本不高，但最终所得外泌体纯度低，且需要进行再提纯，回收率不稳定，故其是一个耗时耗力的过程。最近也有实验将超速离心法与蔗糖密度梯度离心法组合起来用于分离低丰度外泌体。因技术限制，囊泡与外泌体的获得成为其向临床应用转化的一个无法避免的问题。

针对现有的技术问题，本发明提供了一种可有效提高脂肪间充质干细胞囊泡产量的方案，采用微孔过滤的方法分离细胞内囊泡，并在此基础上通过聚乙二醇沉淀进一步分离收集细胞培养基中的细胞外囊泡。进一步通过急性皮肤切除创伤小鼠模型评价干细胞囊泡制备而成的修复液对创面愈合的效果。结果显示，在实验第4、6、9天利用修复液进行治疗的处理组愈合率显著高于对照组，表明间充质干细胞囊泡修复液可有效促进伤口创面愈合。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高脂肪间充质干细胞囊泡产量的方案。

本发明的另一目的是制备一种可用于促进创面愈合的修复液，并用急性皮肤切除创伤小鼠模型评价其促进创面愈合效果。

具体实施方案

1.脂肪间充质干细胞培养

取液氮冻存的P3脂肪间充质干细胞1支，冻存密度为1.5*106个细胞/mL/支，快速置于37℃水浴锅中解冻复苏。复苏后加入到含5％血清替代物的9mL完全培养基中吹打混匀。400xg，离心5min后弃上清。细胞沉淀重新加入5mL完全培养基，轻轻吹打，制成细胞悬液。取20μL细胞悬液用CountStar细胞计数仪进行细胞计数，根据细胞计数结果，以6800个细胞/cm2的密度将细胞接种至T175培养瓶中，补加完全培养基至25mL，摇匀后置于5％CO2，37℃培养箱中培养。待细胞融合度达75～85％，进行细胞传代。

细胞传代时，倒掉培养基，加入5mL生理盐水洗涤细胞后，加入4mL 0.125％胰酶，37℃消化1min后，加入12mL含5％血清替代物的细胞培养基终止消化，400xg，离心5min弃上清，收集细胞沉淀进行传代，传代至P5进行脂肪间充质干细胞收集与囊泡制备。

脂肪间充质干细胞收集与囊泡制备

细胞传代至P5，细胞融合度达75～85％，收集细胞上清以备用。消化，离心，收集细胞。细胞沉淀用无RNA酶的DPBS缓冲液将细胞重悬至2*106个细胞/mL以备用。

使用微量脂质体挤出器，通过微孔过滤的方法分离细胞内囊泡。脂质体挤出器结构包括挤压机、气密注射器、聚碳酸酯膜、过滤膜支架和加热模块。使用前用酒精棉清洁挤压机、气密注射器、加热模块。完成清洁后将挤压机、过滤膜支架与聚碳酸酯膜进行装配并放置于加热模块上，安装孔径为10μm的聚碳酸酯膜进行第一次微孔过滤。使用气密注射器吸取细胞悬液，每次吸取1mL。将装有细胞悬液的气密注射器和另外1个空的气密注射器分别装于挤压机两端，检查是否松动。手推装有细胞悬液的气密注射器一端，将注射器推至底部，使细胞悬液通过聚碳酸酯膜过滤至另一端气密注射器，再用另一端气密注射器将细胞悬液重新推回。依照该步骤反复推注6～8次后取下气密注射器，取50mL离心管收集液体，再重新吸取新的细胞悬液过滤。全部细胞悬液均推注完成后进行第二次微孔过滤。取下10μm孔径聚碳酸酯膜，重新换上5μm聚碳酸酯膜。重新用气密注射器吸取收集悬液进行反复推注6～8次，取50mL离心管收集悬液。全部悬液推注完成后，将收集的悬液4℃，1500rpm离心10min。取上清4℃，12000xg离心30min，收集沉淀(沉淀1)，此沉淀为收集的细胞内囊泡。

配置1000mL 50％的PEG8000储液并用0.22μm滤网过滤除菌，取PEG8000储液200mL与收集的P5细胞培养基上清800mL(1∶4)混匀并静置12h。将混合液4℃，3000xg离心30min，收集沉淀(沉淀2)，此沉淀为收集的细胞外囊泡。

2.于细胞囊泡蛋白浓度测定及囊泡修复液配置

将沉淀1和沉淀2用含5％人血清替代物的培养基50mL重悬合并，混匀后取10μL进行蛋白浓度测定，根据测定结果将修复液蛋白浓度调整至3mg/mL。用1.5mL EP管以500μL/支体积分装，-80℃冻存以备用。干细胞囊泡修复液安全性检验

为确保干细胞囊泡修复液的安全性，取样对修复液进行无菌检测、支原体检测以及内毒素检测。

无菌检测：取配置好的干细胞囊泡修复液200μL样本接种至大豆酪蛋白琼脂(TSA)平皿上，将接种后的平皿置于隔水式恒温培养箱中32.5℃倒置培养7天，逐日观察。结果显示，在培养7天后，平皿无菌落生长，表明无菌检查结果为阴性，符合规定。

支原体检测：选用翊圣生物的一步法支原体检测试剂盒进行支原体检测，具步骤如下：

配置反应体系：在超净工作台中配制下表体系，配制后涡旋混匀，离心，再加到各个反应管中。

表1一步法支原体检测试剂加样体积

产品组分	单次反应体积
		MycAway TM-ColorA	24μL
MycAway TM-Color B	1μL

加样：在阴性对照管中加入1μL超纯水，在待测管中加入1μL待测干细胞囊泡修复液，向阳性对照管中加入1μL Positive Control，最后加入20μL矿物油至各个反应管中。

孵育并观察结果：将反应管置于微量台式离心机中离心，恒温孵育60min。取出反应管，置于室温观察结果。如果反应液仍为蓝紫色，则判定为阴性；若反应液为天蓝色，则判定为阳性。结果显示，阴性对照管为阴性、阳性反应管为阳性、待测管为阴性。表明干细胞囊泡修复液支原体检测阴性，符合规定。

内毒素检测：使用凝胶法进行内毒素检测，具体操作步骤如下：

恒温水浴锅预热至37℃，取细菌内毒素标准品(10EU)一支，加入1mL BET检查用水，振荡器上混匀15min，逐级稀释。取鲎试剂(0.25EU/mL)8支，各取100μL无菌检查用水溶解鲎试剂。

表3内毒素检测不同溶液配置组分与方法

按照上表加样完成后，用封口膜密封安瓿瓶，垂直放入37℃水浴锅中，保温60±2min。缓慢倒转180°，观测供试品样本是否凝集结果显示A与D溶液未凝集，B与C溶液凝集，表明内毒素检查结果为内毒素含量＜0.5EU/mL，符合规定。

3.建立急性皮肤切除创伤模型评价囊泡修复液效果

选用4～5周雄性KM小鼠共6只，用小鼠专用打孔器在小鼠背部皮肤进行打孔，建立急性皮肤切除创伤小鼠模型。

第1天，小鼠称重记录，10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，注射体积80μL/10g。待小鼠完全麻醉后，在小鼠“手术区”(左侧界限为脊椎左侧旁2cm，右侧界限为脊椎右侧旁2cm，上界为肩胛下缘，界为髂骨上缘)使用小型电动剃毛器将手术区毛发剔除，75％乙醇溶液对皮肤表面消毒。利用打孔器依照小鼠脊椎为对称，分别在左右两侧皮肤进行皮肤全层切除，左右两侧各切除2孔，直径10mm，左右孔间隔5mm，上下孔间隔5mm。术后创面自然止血。按照皮肤切除位置按照表5所示对创面区域进行命名并进行不同组分给药，用巴氏吸管分别吸取100μL液体均匀滴在小鼠伤口上。给药完成后，将小鼠分置清洁笼内单笼饲养，保持伤口干燥以防感染。在实验的第4、6、9、11天按照同样的方式进行给药，观察创面恢复情况并拍照记录。

表5造模小鼠不同孔位给药成分

名称	位置	给药成分
			孔1	背部左上	囊泡+5％人血清替代物培养基
孔2	背部右上	5％人血清替代物培养基
			孔3	背部左下	囊泡+生理盐水
孔4	背部右下	生理盐水(对照)

伤口愈合统计与面积比较

将拍照后的伤口图片用软件ImageJ进行面积测算，并计算创面愈合率，结果见表6：

表6伤口愈合率统计表(％，x±s，n＝6)

注：T检验，与孔4比较，*P＜0.05

附图说明

图1是脂肪间充质干细胞融合度达到75～85％左右收获前生长情况。可见细胞生长密度均匀，呈梭形，贴壁生长。

图2是脂肪间充质干细胞收集后利用微量脂质体挤出器进行干细胞囊泡与外泌体挤出示意图。

图3是脂肪间充质干细胞挤出形成囊泡后镜下观察图。可见细胞在经过微孔滤膜过滤后无细胞残留且变成直径更小的囊泡结构。

图4是干细胞囊泡修复液囊泡无菌检测结果，可见修复液接种至TSA平皿后7天后无菌落生长。

图5是干细胞囊泡修复液支原体检测结果，可见阳性对照颜色深呈蓝紫色，检测样本颜色浅呈天蓝色。

图6是鲎试剂凝胶法检测干细胞囊泡修复液内毒素的检测结果，图中A(供试品)与D(阴性对照)溶液未凝集，B(供试品阳性对照)与C(阳性对照)溶液凝集，表明内毒素检查结果为内毒素含量＜0.5EU/mL，符合规定。

图7是急性皮肤切除创伤模型小鼠的伤口愈合情况随时间变化情况，小鼠背部数字代表小鼠造模后创面孔位命名。

图8是急性皮肤切除创伤模型小鼠伤口愈合率随时间变化情况比较。(T检验，与孔4比较，*P＜0.05)。

Claims

1.一种用于促进创面愈合的间充质干细胞囊泡修复液，其特征在于，所述间充质干细胞囊泡修复液由脂肪间充质干细胞囊泡与含3～5％人血清替代物的培养基组成，按照3～5mg/mL蛋白浓度的比例将干细胞囊泡与含3～5％人血清替代物的培养基混合。

2.一种如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，脂肪组织经过酶消化法分离培养获得原代脂肪间充质干细胞，液氮冻存；

第二步，原代脂肪间充质干细胞复苏后，进行传代扩大培养；

第三步，脂肪间充质干细胞传代至第五代，当细胞培养融合度达到75～85％时，收集干细胞和培养基上清用于制备间充质干细胞囊泡。

3.一种如权利要求2所述的间充质干细胞囊泡的制备方法，其特征在于将细胞以微孔过滤的方法制备细胞内囊泡，同时利用PEG8000沉淀的方法制备培养基上清中的细胞外囊泡，将细胞内外囊泡混合。

4.一种如权利要求3所述的细胞内囊泡的制备方法，其特征在于，利用微量脂质体挤出器(品牌：avanti；货号：610000)对脂肪间充质干细胞进行物理挤压，形成直径更小的含有细胞内容物的囊泡。

5.一种如权利要求3所述的制备细胞外囊泡的方法，其特征在于，如权利要求2所述的培养基上清收集后，按照质量体积比6～10％添加PEG8000至培养基上清，混匀室温静置过夜后离心收集细胞外囊泡沉淀。

6.一种如权利要求1所述间充质干细胞囊泡修复液的安全性检验，其特征在于，选用含3～5％人血清替代物的培养基重悬间充质干细胞囊泡，利用超微量紫外分光光度计(品牌：Thermo Scientific^TMNanoDrop^TMOne)进行蛋白浓度测定，根据测得数据将溶液蛋白浓度调整至3～5mg/mL，取样进行无菌、内毒素、支原体检测，结果间充质干细胞囊泡修复液的无菌、支原体检测结果为阴性；内毒素＜0.5EU/mL。安全性检验结果合格。

7.一种急性皮肤切除创伤小鼠模型，用于对修复液的治疗效果进行评价。选用4～5周龄雄性KM小鼠进行背部皮肤切除造模，取权利要求1所述的间充质干细胞囊泡修复液均匀滴在创面上给药，给药体积为100μL/只/次，给药时间为第1、4、6、9、11天。

8.一种评价小鼠创面愈合情况的方法。其特征如权利要求7所述，拍照记录小鼠创面愈合情况，采用ImageJ(V 1.80版本)软件进行计算机图形处理测算创面面积，按照如下公式计算创面愈合率。