RU2018107552A

RU2018107552A - Способ культивирования стволовых клеток

Info

Publication number: RU2018107552A
Application number: RU2018107552A
Authority: RU
Inventors: Алексей ГЛАДКОВ
Original assignee: Кинтароселлспауэр Ко., Лтд.
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2016-12-06
Publication date: 2020-01-10
Also published as: HK1254737A1; SG11201800503YA; JP2017104094A; US20180291346A1; JP6153653B2; EP3315603A4; EP3315603A1; PH12018500160A1; CN108350426A; RU2018107552A3; RU2732238C2

Claims

1. Способ культивирования стволовых клеток для культивирования определенных типов стволовых клеток с использованием первого аспирата костного мозга, полученного от донора, где

способ культивирования стволовых клеток включает стадию разделения аспирата костного мозга для разделения первого аспирата костного мозга, полученного от донора, на слои, стадию выделения аспирата костного мозга для выделения второго аспирата костного мозга, расположенного в промежуточном слое между первым аспиратом костного мозга, разделенным на слои на стадии разделения аспирата костного мозга, стадию первого выделения стволовых клеток для введения второго аспирата костного мозга, выделенного на стадии выделения аспирата костного мозга, и заданную культуральную среду в первый культуральный сосуд, имеющий заданный объем и заданную площадь поверхности, статически выдерживая первый культуральный сосуд в течение заданного времени для прикрепления первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда и пролиферации первых стволовых клеток, и когда общая площадь поверхности первых стволовых клеток по отношению к нижней поверхности первого культурального сосуда достигла первого установленного соотношения путем увеличения плоской формы первых стволовых клеток на нижней поверхности первого культурального сосуда, извлечение первых стволовых клеток из первого культурального сосуда, стадию центрифугирования стволовых клеток для центрифугирования первых стволовых клеток, выделенных на стадии первого выделения стволовых клеток, для получения в слоев, стадию второго выделения стволовых клеток для выделения вторых стволовых клеток, расположенных в нижнем слое, после разделения первых стволовых клеток на слои на стадии центрифугирования стволовых клеток, и стадии третьего выделения стволовых клеток для введения вторых стволовых клеток, выделенных на стадии второго выделения стволовых клеток, и заданную культуральную среду во второй культуральный сосуд, имеющий большую емкость и большую площадь нижней поверхности, чем те, что у первого культурального сосуда, статически выдерживая второй культуральный сосуд в течение заданного времени для прикрепления вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда и пролиферации вторых стволовых клеток, и, когда общая площадь поверхности вторых стволовых клеток по отношению к нижней поверхности второго культурального сосуда достигла второго установленного соотношения путем увеличения плоской формы вторых стволовых клеток на площади нижней поверхности второго культурального сосуда, извлечение вторых стволовых клеток из второго культурального сосуда.

2. Способ культивирования стволовых клеток по п. 1, где способ культивирования стволовых клеток включает стадию первого наблюдения деформации для введения второго аспирата костного мозга, выделенного на стадии выделения аспирата костного мозга, и культуральную среду в первый культуральный сосуд, затем наблюдение деформации первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени статически в состоянии наклона первого культурального сосуда под заданным углом с заданными временными интервалами, и стадии первого наблюдения общей площади поверхности для подачи новой культуральной среды в первый культуральный сосуд при отводе культуральной среды в первом культуральном сосуде путем оценки первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда, когда первые стволовые клетки деформируются из первоначальной плоской формы в заданную плоскую форму в итоге наблюдения на стадии первого наблюдения деформации, и наблюдение общей площади поверхности первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона первого культурального сосуда под заданным углом с заданными временными интервалами, и на стадии первого выделения стволовых клеток, когда плоскую форму первых стволовых клеток увеличивают путем пролиферации первых стволовых клеток, и общая площадь поверхности первых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда достигла первого заданного соотношения в итоге наблюдения на стадии первого наблюдения общей площади поверхности, первые стволовые клетки извлекаются из первого культурального сосуда.

3. Способ культивирования стволовых клеток по п. 2, где способ культивирования стволовых клеток включает стадию второго наблюдения деформации для введения вторых стволовых клеток, выделенных на стадии второго выделения стволовых клеток, и культуральную среду во второй культуральный сосуд, затем наблюдение деформации вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона второго культурального сосуда под заданным углом в течение заданного времени статически с заданными временными интервалами, и стадию второго наблюдения общей площади поверхности для подачи новой культуральной среды во второй культуральный сосуд при отводе культуральной среды во втором культуральном сосуде путем оценки вторых стволовых клеток, прикрепленных на нижней поверхности второго культурального сосуда, когда вторые стволовые клетки деформируются из первоначальной плоской формы в заданную плоскую форму в итоге наблюдения на стадии второго наблюдения деформации, и наблюдение общей площади поверхности вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона второго культурального сосуда под заданным углом с заранее определенными временными интервалами, и на стадии третьего выделения стволовых клеток, в итоге наблюдения на стадии второго наблюдения общей площади поверхности, когда плоская форма вторых стволовых клеток увеличивается путем пролиферации вторых стволовых клеток, и общая площадь поверхности вторых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда достигла второго установленного отношения, вторые стволовые клетки извлекаются из второго культурального сосуда.

4. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 1-3, где на стадии разделения аспирата костного мозга собирают 2-3 см³ первого аспирата костного мозга от донора, 2-3 см³ первого аспирата костного мозга вводят в разделительный сосуд, находящийся в вертикальном положении, и разделительный сосуд статически выдерживается при фактически той же температуре, что и температура тела, в течение заданного времени, для разделения в вертикальном положении первого аспирата костного мозга в разделительном сосуде на слои, и на стадии выделения аспирата костного мозга выделяется второй аспират костного мозга, расположенный в промежуточном слое в первом аспирате костного мозга, разделенного на слои в разделительном сосуде.

5. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 2-4, где емкость первого культурального сосуда составляет приблизительно 20-30 см³, первоначальная плоская форма первых стволовых клеток является фактически круглой, плоская форма первых стволовых клеток после деформации является плоской формой, в которой первые стволовые клетки удлиняются неравномерно в одном направлении, с фактически круглым ядром, и на стадии первого наблюдения деформации деформация первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 12-24 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая первый культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 12-24 ч, и когда первые стволовые клетки деформируются в неправильную плоскую форму, первые стволовые клетки оцениваются как прикрепленные к нижней поверхности первого культурального сосуда.

6. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 1-5, где на стадии первого наблюдения общей площади поверхности общая площадь поверхности первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда, по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая первый культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч.

7. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 1-6, где первое установленное соотношение общей площади поверхности первых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда составляет 70-80%.

8. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 1-7, где на стадии центрифугирования стволовых клеток первые стволовые клетки вводят в разделительный сосуд, разделительный сосуд расположен в центрифуге для центрифугирования первых стволовых клеток, и на стадии второго выделения стволовых клеток первые стволовые клетки центрифугируют для получения слоев в разделительном сосуде, и затем выделяют вторые стволовые клетки, расположенные в самом нижнем слое.

9. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 3-8, где емкость второго культурального сосуда составляет приблизительно 40-60 см³, первоначальная плоская форма вторых стволовых клеток является фактически круглой, плоская форма первых стволовых клеток после деформации вторых стволовых клеток представляет собой плоскую форму, в которой вторые стволовые клетки удлиняются неравномерно в одном направлении, с фактически круглым ядром, и на стадии второго наблюдения деформации деформация вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч, и когда вторые стволовые клетки деформируются в неправильную плоскую форму, вторые стволовые клетки считаются прикрепленными к нижней поверхности второго культурального сосуда.

10. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 1-9, где на стадии второго наблюдения общей площади поверхности наблюдается общая площадь поверхности вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч.

11. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 1-10, где второе установленное соотношение общей площади поверхности вторых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда составляет 88-92%.

12. Способ культивирования стволовых клеток по любому из пп. 1-11, где первые и вторые стволовые клетки являются мезенхимальными стволовыми клетками.