CN108350426A - 干细胞培养方法 - Google Patents

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Kimoto Cell Power Plant
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Abstract

一种干细胞培养方法，其中，一第二骨髓抽吸抹片23为一中间层，且萃取自分离为多层的一第一骨髓抽吸抹片19；以一培养液培养该第二骨髓抽吸抹片23，且第一干细胞固定于一第一培养容器的一底表面；当该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积达一第一目标比，自该第一培养容器萃取该第一干细胞；上层第二干细胞萃取自分层的第一干细胞，且以一培养液培养该第二干细胞，该第二干细胞固定于一第二培养容器的一底表面；及当该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积达一第二目标比，自该第二培养容器萃取该第二干细胞。

Description

干细胞培养方法
技术领域
本发明关于一种使用收集自一捐赠者的一骨髓抽吸抹片(bone marrowaspirate)，以培养干细胞的干细胞培养方法。
背景技术
现有的干细胞培养方法具有用以培养干细胞的一培养基及通过照射低输出二氧化碳气体雷射以活化该干细胞的照射光，该低输出二氧化碳气体雷射的照射能量大于0及10焦耳/平方厘米(joule/cm2)或以下，雷射功率密度为0.1瓦特/平方厘米(W/cm2)或以下，其被散焦至一照射能量为0.1或以上及2.5焦耳/平方厘米或以下以照射整个培养基，其中，通过照射用以活化该干细胞的低输出雷射以及后续的预订休息期间(rest period)，以活化该干细胞而能够增殖至一目标数量。依据此干细胞培养方法，存在于收集自人体或非人体(动物)的组织或细胞中的干细胞被活化且可以被显著地增殖。
发明内容
本发明所解决的问题
由于收集自一捐赠者的组织或细胞存在各种干细胞，纵使培养存在于该组织或细胞的干细胞，也会增殖出各种干细胞，而无法只培养出特定种类的干细胞。该干细胞被应用于心血管疾病、中枢神经系统疾病等各种疾病的治疗(treatment)、再生医学(regenerative medicine)或非治疗性的应用，然而，相比于该干细胞只包括特定种类的干细胞的状况，培养出的各种干细胞对于各种疾病的治疗效果或再生医学中的再生效果有限，对于要完全治愈(completely cure)各种疾病的可能性低、对于要再生各种组织或各种器官的可能性也不佳。一种如上述的干细胞培养方法已经公开于专利文献1(日本公开第2015-186465A号专利申请)，其培养出各种干细胞，而无法只培养出特定种类的干细胞。
本发明的目的是提供一种干细胞培养方法，其可以防止各种干细胞的增殖，且可以只培养出特定种类的干细胞。本发明的另一目的是提供一种干细胞培养方法，其所培养出的干细胞对于各种疾病具有良好治疗效果、或对于再生医学具有良好再生效果、对于要完全治愈各种疾病及要再生各种组织或各种器官具有高度可能性。
解决问题的技术手段
为了解决上述问题，本发明的技术特征为，本发明的前提为使用收集自一捐赠者的一第一骨髓抽吸抹片，以培养特定种类的干细胞的干细胞培养方法。
于上述前提中，该干细胞培养方法包括：一骨髓抽吸抹片分离步骤，将收集自该捐赠者的第一骨髓抽吸抹片分为多层；一骨髓抽吸抹片萃取步骤，自于该骨髓抽吸抹片分离步骤分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中的一中间层萃取一第二骨髓抽吸抹片；一干细胞第一萃取步骤，将该骨髓抽吸抹片萃取步骤中萃取的第二骨髓抽吸抹片及一预定培养液注入一第一培养容器，该第一培养容器具有一预定体积，该第一培养容器的一底表面具有一预定面积，将该第一培养容器静置一预定时间，使一第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面，并进行增殖，当该第一干细胞于该第一培养容器的底表面扩张一平面形状，使该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积达一第一目标比时，自该第一培养容器萃取该第一干细胞；一干细胞离心步骤，将于该干细胞第一萃取步骤中萃取的第一干细胞离心以分离为多层；一干细胞第二萃取步骤，于以该干细胞离心步骤将该第一干细胞分离为多层后，萃取位于最底层的第二干细胞；及一干细胞第三萃取步骤，将于该干细胞第二萃取步骤中萃取的第二干细胞及该预定培养液注入一第二培养容器，该第二培养容器具有相比于该第一培养容器较大的容量及较大的底表面积，将该第二培养容器静置一预定时间，使该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，并进行增殖，及当该第二干细胞于该第二培养容器的底表面扩张一平面形状，使该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积达一第二目标比时，自该第二培养容器萃取该第二干细胞。
于本发明的一实施例中，该干细胞培养方法包括：一变形第一观察步骤，将该骨髓抽吸抹片萃取步骤中萃取的第二骨髓抽吸抹片及该培养液注入该第一培养容器，接着，以将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察于该第一培养容器中的第一干细胞自一起始平面形状的变形状态；及一总表面积第一观察步骤，当该变形第一观察步骤的观察结果为该第一干细胞自该起始平面形状变形为一预定平面形状，即判断该第一干细胞已固定于该第一培养容器的底表面，以将该培养液自该第一培养容器中取出，并将一新的培养液注入该第一培养容器中，及以将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察固定于该第一培养容器的底表面的第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底面积，当该总表面第一观察步骤的观察结果为该第一干细胞进行增殖使该第一干细胞的平面形状扩张，且该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积达该第一目标比时，于该干细胞第一萃取步骤中，自该第一培养容器萃取该第一干细胞。
于本发明的另一实施例中，该干细胞培养方法包括：一变形第二观察步骤，将该干细胞第二萃取步骤中萃取的第二干细胞及该培养液注入该第二培养容器，接着，以将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察于该第二培养容器中的第二干细胞自一起始平面形状的变形状态；及一总表面积第二观察步骤，当该变形第二观察步骤的观察结果为该第二干细胞自该起始平面形状变形为一预定平面形状，即判断该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，以将该培养液自该第二培养容器中取出，并将一新的培养液注入该第二培养容器中，及以将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察固定于该第二培养容器的底表面的第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积，当该总表面积第二观察步骤的观察结果为该第二干细胞进行增殖使该第二干细胞的平面形状扩张，且该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积达该第二目标比时，于该干细胞第三萃取步骤中，自该第二培养容器萃取该第二干细胞。
于本发明的另一实施例中，于该骨髓抽吸抹片分离步骤中，自该捐赠者收集2～3毫升的该第一骨髓抽吸抹片，将该2～3毫升的第一骨髓抽吸抹片注入沿一垂直方向延伸的一分离容器，于与体温大致相同的温度下静置该分离容器一预定时间，以使该第一骨髓抽吸抹片于该分离容器中呈一垂直方向分离为多层，且于该骨髓抽吸抹片萃取步骤中，自于该分离容器中分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中的一中间层萃取该第二骨髓抽吸抹片。
于本发明的另一实施例中，该第一培养容器的容量约为20～30毫升，该第一干细胞的起始平面形状略呈圆形，该第一干细胞于变形后的平面形状为大体上以该圆形作为核心朝一方向不规则地延伸的扁形，且于该变形第一观察步骤中，将该第一培养容器于与体温大致相同的温度下静置12～24小时，且于第12～24小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第一培养容器中的该第一干细胞自一起始平面形状变形的状态，当该第一干细胞变形为一不规则扁形，即判断该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面。
于本发明的另一实施例中，于该总表面积第一观察步骤中，将该第一培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第一培养容器的底表面的第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积。
于本发明的另一实施例中，该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积的第一目标比为70～80％。
于本发明的另一实施例中，于该干细胞离心步骤中，将该第一干细胞注入该分离容器，该分离容器位于一离心机上，以离心该第一干细胞，且于该干细胞第二萃取步骤中，该第一干细胞于该分离容器中被离心分离为多层，接着萃取位于最底层的第二干细胞。
于本发明的另一实施例中，该第二培养容器的容量为约40～60毫升，该第二干细胞的起始平面形状略呈圆形，该第二干细胞于变形后的平面形状为大体上以该圆形作为核心朝一方向不规则地延伸的扁形，且于该变形第二观察步骤中，将该第二培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第二培养容器中的第二干细胞自一起始平面形状变形的状态，当该第二干细胞变形为一不规则扁形，即判断该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面。
于本发明的另一实施例中，于该总表面积第二观察步骤中，将该第二培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第二培养容器的底表面的第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积。
于本发明的另一实施例中，该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积的第二目标比为88～92％。
于本发明的另一实施例中，该第一干细胞及该第二干细胞为间充质干细胞。
本发明的效果
依据本发明的干细胞培养方法，自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中的一中间层萃取该第二骨髓抽吸抹片，以一培养液培养该第二骨髓抽吸抹片，以使该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面，并进行增殖，当该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积达该第一目标比时，自该第一培养容器萃取该第一干细胞。将该第一干细胞离心分离为多层后，萃取位于最底层的第二干细胞，以该培养液培养该第二干细胞，以使该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，并进行增殖，当该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积达该第二目标比时，自该第二培养容器萃取该第二干细胞。因此，通过自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中萃取特定的第二骨髓抽吸抹片，及自分离为多层的第一干细胞中萃取特定的第二干细胞，可以避免增殖各种干细胞，而可以只增殖特定种类的干细胞(该第二干细胞)，其为可以培养的制造目标，其中可以去除非必要的干细胞，而制造纯的(genuine)干细胞。该干细胞培养方法可以只培养特定种类的干细胞，因此可以培养出对于各种疾病具有良好治疗效果、或对于再生医学具有良好再生效果、对于要完全治愈各种疾病及要再生各种组织或各种器官具有高度可能性的干细胞。
于该干细胞培养方法中，将萃取出的第二骨髓抽吸抹片及该培养液注入该第一培养容器后，以将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察于该第一培养容器中的第一干细胞自一起始平面形状的变形状态，当该第一干细胞的变形状态的观察结果为该第一干细胞自该起始平面形状变形为一预定平面形状，即判断该第一干细胞已固定于该第一培养容器的底表面。自该第一培养容器中取出该培养液，并将一新的培养液注入该第一培养容器中，以将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察固定于该第一培养容器的底表面的第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积，及当该总面积的观察结果为该第一干细胞进行增殖使该第一干细胞的平面形状扩张，且该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底面积达该第一目标比时，接着自该第一培养容器萃取该第一干细胞。通过将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，该第一干细胞可以稳固地固定于该第一培养容器的底表面，及于该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面后，自该第一培养容器中取出该培养液，将一新的培养液注入该第一培养容器中，并将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，可以有效促进该第一干细胞的增殖状态。于该干细胞培养方法中，通过观察该第一干细胞于该第一培养容器中的变形状态，可以准确地确认该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面，并可以精确地确认该第一干细胞的总表面积相对于该第一目标比的达到程度。于该干细胞培养方法中，可以准确地确认该第一干细胞固定于该第一培养容器并于其中增殖，且可以精确地确认该第一干细胞的总表面积相对于该第一目标比的达到程度，因而能够只培养该第一干细胞而不包括其他干细胞，进而避免增殖各种干细胞，而可以只增殖特定种类的干细胞(该第二干细胞)，其为可以培养的制造目标。
于该干细胞培养方法中，将萃取出的第二干细胞及该培养液注入该第二培养容器后，以将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察该第二培养容器中的第二干细胞自一起始平面形状的变形状态，当该第二干细胞的变形状态的观察结果为该第二干细胞自该起始平面形状变形为一预定平面形状，即判断该第二干细胞已固定于该第二培养容器的底表面。自该第二培养溶液中取出该培养液，并将一新的培养液注入该第二培养容器中，以将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察固定于该第二培养容器的底表面的第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积，及当该总面积的观察结果为该第二干细胞进行增殖使该第二干细胞的平面形状扩张，且该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底面积达该第二目标比时，接着自该第二培养容器萃取该第二干细胞。通过将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，该第二干细胞可以稳固地固定于该第二培养容器的底表面，及于该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面后，自该第二培养容器中取出该培养液，将一新的培养液注入该第二培养容器中，并将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，可以有效促进该第二干细胞的增殖状态。于该干细胞培养方法中，通过观察该第二干细胞于该第二培养容器中自一起始平面形状的变形状态，可以精确地确认该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，并可以精确地确认该第二十一干细胞的总表面积相对于该第二目标比的达到程度。于该干细胞培养方法中，可以准确地确认该第二干细胞固定于该第一培养容器并于其中增殖，且可以精确地确认该第二干细胞的总表面积相对于该第二目标比的达到程度，因而能够只培养该第二干细胞而不包括其他干细胞，进而避免增殖各种干细胞，而可以只增殖特定种类的干细胞(该第二干细胞)，其为可以培养的制造目标。
于该干细胞培养方法中，自该捐赠者收集2～3毫升的上述第一骨髓抽吸抹片，将该2～3毫升的第一骨髓抽吸抹片注入沿该垂直方向延伸的分离容器，于与体温大致相同的温度下静置一预定时间，以使该第一骨髓抽吸抹片于该分离容器中沿该垂直方向分离为多层，且自于该分离容器中分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中的一中间层萃取该第二骨髓抽吸抹片，通过将包括各种干细胞的第一骨髓抽吸抹片于与体温大致相同的温度下静置一预定时间，以使该第一骨髓抽吸抹片沿该垂直方向分离为多层，可以确定地自该第一骨髓抽吸抹片萃取出，特定的第二骨髓抽吸抹片，且可以移除该第一骨髓抽吸抹片中所包括的不必要的干细胞，可以只培养特定种类的干细胞(该第二干细胞)，其为可以培养的制造目标。虽然为了培养干细胞，一般而言需要150～200毫升的骨髓抽吸抹片，于该干细胞培养方法中，自该捐赠者收集2～3毫升的骨髓抽吸抹片，以少量的骨髓抽吸抹片即可以培养特定种类的干细胞(该第二干细胞)，因而该骨髓抽吸抹片的采样时间可以大幅地缩短，收集该骨髓抽吸抹片的花费也会下降，在收集该骨髓抽吸抹片当时对该捐赠者的负担也可以降到最低。
于该干细胞培养方法中，该第一培养容器的容量约为20～30毫升，该第一干细胞的起始平面形状略呈圆形，该第一干细胞于变形后的平面形状大体上以该圆形作为一核心朝一方向不规则地延伸的扁形，将该第一培养容器于与体温大致相同的温度下静置12～24小时，且于第12～24小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第一培养容器中的第一干细胞自一起始平面形状变形的状态，当该第一干细胞变形为一不规则扁形，即判断该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面。当于使该第一干细胞固定时使用容量超过30毫升的大型培养容器时，对该第一干细胞而言，要固定于该容器的底部是困难的，且该第一干细胞的增殖也会趋缓，但是通过使用具有上述容量的第一培养容器，该第一干细胞可以快速地、容易地固定于该第一培养容器的底表面，且该第一干细胞可以于该第一培养容器中迅速地进行增殖。于该干细胞培养方法中，由于将该第一培养容器于与体温大致相同的温度下静置12～24小时，且于第12～24小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第一培养容器中的该第一干细胞自一起始平面形状变形的状态，绝对不会没注意到该第一干细胞的变形，可以精确地确认该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面，且于确认该第一干细胞的固定之后，通过自该第一培养容器中取出该培养液，并将一新的培养液注入该第一培养容器中，可以确定地促进该第一干细胞的增殖作用。于该干细胞培养方法中，当该第一干细胞大体上以该圆形作为核心朝一方向不规则地延伸为一扁形，即判断该第一干细胞固定于该该第一培养容器的底表面，绝对不会没注意到该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面，且通过该第一干细胞的平面形状的改变，可以精确地掌握该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面。
于该干细胞培养方法中，将该第一培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第一培养容器的底表面的第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积，通过以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第一培养容器的底表面的第一干细胞的总表面积，可以精确地确认该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积，且也可以确定地掌握该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积达该第一目标比。于该干细胞培养方法中，可以在维持该第一干细胞的活性的状况下自该第一培养容器萃取该第一干细胞，不会错认自该第一培养容器萃取该第一干细胞的时机。
于该干细胞培养方法中，该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积的第一目标比为70～80％。当该第一干细胞增殖至该第一干细胞的总表面积超过该第一培养容器的底表面积的80％，该第一干细胞的活性会渐渐消失。当该第一干细胞的总表面积达该第一培养容器的底表面积的70～80％时，自该第一培养容器萃取该第一干细胞，因此可以保持该第一干细胞的活性，且该第一干细胞可以在保持其活性的状况下进行增殖。
于该干细胞培养方法中，将该第一干细胞注入该分离容器，该分离容器位于一离心机上，以离心该第一干细胞，该第一干细胞于该分离容器中被离心分为多层，接着，萃取位于最底层的第二干细胞。通过以一离心机进行离心，将包括不必要的混种的干细胞(mongrel stem cells)的第一干细胞分为多层，萃取位于离心分为多层的第一干细胞中最底层的第二干细胞，因而可以确定地自该第一干细胞萃取该特定的第二干细胞，且可以自该第一干细胞中移除不必要的干细胞，只取得特定种类的干细胞(该第二干细胞)，其为可以培养的制造目标。
于该干细胞培养方法中，该第二培养容器的容量约为40～60毫升，该第二干细胞的一起始平面形状略呈圆形，该第一干细胞于变形后的平面形状大体上以该圆形作为一核心朝一方向不规则地延伸的扁形，将该第二培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第二培养容器中的第二干细胞自一起始平面形状变形的状态，当该第二干细胞变形为一不规则扁形，即判断该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面。如果使该第二干细胞固定时使用容量超过60毫升的大型培养容器时，对该第二干细胞而言，要固定于该容器的底表面是困难的，且该第二干细胞的增殖也会趋缓，但是通过使用具有上述容量的第二培养容器，该第二干细胞可以快速地、容易地固定于该第二培养容器的底表面，且该第二干细胞可以于该第二培养容器中迅速地进行增殖。于该干细胞培养方法中，由于将该第二培养容器于体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第二培养容器中的该第一干细胞自一起始平面形状变形的状态，绝对不会没有注意到该第二干细胞的变形，可以精确地确认该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，且于确认该第二干细胞的固定之后，通过自该第二培养容器中取出该培养液，并将一新的培养液注入该第二培养容器，可以确定地促进该第二干细胞的增殖作用。于该干细胞培养方法中，当该第二干细胞大体上以该圆形作为核心朝一方向不规则地延伸为一扁形，即判断该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，绝对不会没注意到该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，且通过该第二干细胞的平面形状的改变，可以精确地掌握该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面。
于该干细胞培养方法中，将该第二培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第二培养容器的底表面的第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积，通过以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第二培养容器的底面积的第二干细胞的总表面积，可以精确地确认该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积，且也可以确定地掌握该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积达该第二目标比。于该干细胞培养方法中，可以在维持该第二干细胞的活性的状况下自该第二培养容器萃取该第二干细胞，不会错认自该第二培养容器萃取该第二干细胞的时机。
于该干细胞培养方法中，该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积的第二目标比为88～92％。当该第二干细胞增殖至该第二干细胞的总表面积超过该第二培养容器的底表面积的92％，该第二干细胞的活性会渐渐消失。当该第二干细胞的总面积达该第二培养容器的底表面积的88～92％时，自该第二培养容器萃取该第二干细胞，因此可以保持该第二干细胞的活性，且可以制造具有高度活性的第二干细胞。于该干细胞培养方法中，可以培养只有具有高度活性的特定种类的干细胞(该第二干细胞)，因此可以培养对于各种疾病具有良好治疗效果、或对于再生医学具有良好再生效果、对于要完全治愈各种疾病及要再生各种组织或各种器官具有高度可能性的干细胞。
于该干细胞培养方法中，该第一干细胞及该第二干细胞为间充质干细胞，通过自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中萃取该特定的第二骨髓抽吸抹片，及通过自分离为多层的第一间充质干细胞中萃取该特定的第二间充质干细胞，可以移除不必要的混种的间充质干细胞(mongrel mesenchymal stem cells)，并避免增殖各种间充质干细胞，因此可以只培养特定种类的间充质干细胞(该第二间充质干细胞)，其为可以培养的制造目标。该干细胞培养方法可以只培养特定种类的间充质干细胞，因而可以培养对于各种疾病具有良好治疗效果、或对于再生医学具有良好再生效果、对于要完全治愈各种疾病及要再生各种组织或各种器官具有高度可能性的间充质干细胞。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为作为一实施例的干细胞培养系统的示意图；
图2为一说明图，其显示一骨髓抽吸抹片分离步骤的一实施例；
图3为一说明图，其显示接续图2的一骨髓抽吸抹片分离步骤；
图4为一说明图，其显示接续图3的一骨髓抽吸抹片分离步骤；
图5为一说明图，其显示一变形第一观察步骤的一实施例；
图6为一第一平面培养容器(first flat culture vessel)的侧视图；
图7为一局部放大图，其显示第一间充质干细胞的平面形状的一实施例；
图8为一局部放大图，其显示第一间充质干细胞的平面形状的另一实施例；
图9为一局部放大图，其显示第一间充质干细胞的平面形状的另一实施例；
图10为一说明图，其显示一干细胞离心步骤的一实施例；
图11为一说明图，其显示一干细胞第二萃取步骤的一实施例；
图12为一说明图，其显示一变形第二观察步骤的一实施例；
图13为第二平面培养容器(second flat culture vessel)的侧视图；
图14为一局部放大图，其显示第二间充质干细胞的平面形状的一实施例；
图15为一局部放大图，其显示第二间充质干细胞的平面形状的另一实施例；
图16为一局部放大图，其显示第二间充质干细胞的平面形状的另一实施例；
图17为一附图，其显示保存第二间充质干细胞的一实施例。
具体实施方式
搭配例如图1等的附图所示，图1为作为一实施例的一干细胞培养系统10的示意图。本发明的干细胞培养方法的细节将会如后说明。附带一提，图2为一说明图，其显示一骨髓抽吸抹片分离步骤的一实施例，图3为一说明图，其显示接续图2的一骨髓抽吸抹片分离步骤，图4为一说明图，其显示接续图3的一骨髓抽吸抹片分离步骤。
该干细胞培养方法使用收集自多个捐赠者(人体)的一第一骨髓抽吸抹片，且历经一骨髓抽吸抹片分离步骤、一骨髓抽吸抹片萃取步骤、一变形第一观察步骤、一总表面积第一观察步骤、一干细胞第一萃取步骤、一干细胞离心步骤、一干细胞第二萃取步骤、一变形第二观察步骤、一总表面积第二观察步骤及一干细胞第三萃取步骤，自包括负数类型的间充质干细胞的一第一骨髓抽吸抹片19中培养特定种类的单一类型的间充质干细胞。
该干细胞培养系统10由一计算机11、一条形码读取器12及一电子显微镜13所形成，该计算机11具有一中央处理器(CPU或虚拟CPU)、一内存储存单元(内存或虚拟内存)及一大量储存区域(一硬盘或一虚拟硬盘等)，且由一物理操作系统或一虚拟操作系统所操控。该计算机通过一接口(无线或有线)连接例如一键盘14及一鼠标15等的一输入设备，及例如一显示器16及一打印机(图未示)等的一输出装置。
于该干细胞培养系统10中，以该二维条形码﹝QR code(注册商标)﹞来处理捐赠者数据(捐赠者可识别讯息)，于该捐赠者资料中包括该捐赠者的姓名、地址、电话号码、生日、性别、血型、身高、体重、电子邮件信箱等。于该干细胞培养系统10中，该二维条形码(QRcode)作为一二维条形码(two-dimentaional code)，且除了该二维条形码(QR code)外，也可以使用一矩阵系统SP条形码(matrix system SP code)、vericode条形码(VeriCode)、maxicode条形码(MaxiCode)、CP条形码(CP code)、DataMatric条形码(DataMatric)、Code1条形码(Code1)、Aztec Code条形码(AztecCode)、intacta code条形码(intacta code)及card e条形码(carde)。附带一提，该干细胞培养系统10中所使用的二维条形码包括未来所要开发的所有二维条形码。此外，也可以用IC卷标(IC芯片)来处理该捐赠者数据(捐赠者可识别讯息)。
于该骨髓抽吸抹片分离步骤中，将收集自一捐赠者的第一骨髓抽吸抹片19分离为多层，于收集该骨髓抽吸抹片的过程中，自该捐赠者的胸骨(sternum)或髂骨(iliacbone)﹝骨盆(pelvis)﹞收集2～3毫升的第一骨髓抽吸抹片19，以“骨髓穿刺法(bone marrowaspiration)”(标记)收集该第一骨髓抽吸抹片19，对该捐赠者施予局部麻醉(localanesthesia)，续穿刺骨髓，及抽吸出该骨髓抽吸抹片﹝骨髓血液(bone marrow blood)﹞。于收集该第一骨髓抽吸抹片19的同时，医生、护士及研究人员等负责人员于该计算机11中启动(activate)该干细胞培养系统10，并以键盘14、鼠标15等输入设备将该捐赠者数据输入至该计算机11。
该计算机11生成一独特的捐赠者识别符(donor identifier)，其具体指定所输入的每次每一个捐赠者的捐赠者资料(每次收集自该捐赠者的第一骨髓抽吸抹片19)并以该捐赠者资料与该捐赠者识别符﹝捐赠者数据储存手段(donor data storage means)﹞相关联的方式储存(记忆)于该储存区域。该计算机11以一二维条形码写入功能(QR codewriter funcion)﹝二维条形码转换手段(QR code coverting means)﹞将输入的捐赠者数据转换为一二维条形码(QR code、two-dimentional code)，并将该二维条形码打印输出为第一代码表18a、第二代码表18b、第三代码表18c及第四代码表18d﹝二维条形码输出手段(QR code output means)﹞，并以该二维条形码与该捐赠者识别符相关联的方式储存(记忆)于该储存区域，该捐赠者识别符具体指定各捐赠者﹝二维条形码储存手段(QR codestorage means)﹞。
附带一提，于打印于该第一代码表18a的二维条形码打印有编号1(NO.1)，该编号1(NO.1)储存有该骨髓抽吸抹片分离步骤及该骨髓抽吸抹片萃取步骤，于打印于该第二代码表18b的二维条形码打印有编号2(NO.2)，编号2(NO.2)储存有该变形第一观察步骤、该总表面积第一观察步骤及该干细胞第一萃取步骤。于打印于该第三代码表18c的二维条形码上打印有编号3(NO.3)，编号3(NO.3)储存有该干细胞离心步骤及该干细胞第二萃取步骤，及于打印于该第四代码表18d的二维条形码上打印有编号4(NO.4)，编号4(NO.4)储存有该变形第二观察步骤、该总表面积第二观察步骤及该干细胞第三萃取步骤。该计算机11将储存于该储存区域的捐赠者数据，与自该骨髓抽吸抹片分离步骤至该干细胞第三萃取步骤中的每一个步骤中，以该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据进行比对。
请参照图2所示，将收集自该捐赠者的2～3毫升的第一骨髓抽吸抹片19注入(供应)沿该垂直方向延伸的玻璃试管20(该分离容器)中。附带一提，于2～3毫升的第一骨髓抽吸抹片19中，包括0.5～1毫升(约5×107细胞/毫升)的多种类型的间充质干细胞。一第一代码表18a黏贴于内部注入有该第一骨髓抽吸抹片19的玻璃试管20的外周面。请参照图3所示，内部注入有该第一骨髓抽吸抹片19的玻璃试管20置于一试管架21，且该试管架21容置于一自动调温腔(thermostat chamber)22中。
医生、护士及研究人员等负责人员将印有该二维条形码的第一代码表18a黏贴于该玻璃试管20的外环周面，接着以该条形码读取器12读取该玻璃试管20的二维条形码，该条形码读取器12通过一接口(有线或无线)连接该计算机11，该条形码读取器12将所读取的二维条形码传输至该计算机11。
该计算机11析取该编号1(NO.1)及传输自该条形码读取器12的二维条形码所指、来自该储存区域的捐赠者数据，将其读取至该高速缓存储存器(cache memory)，并显示于一显示器16的一处理第一显示屏幕(图未示)。该处理第一显示屏幕上显示该编号1(NO.1)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第一显示屏幕上也显示有一骨髓抽吸抹片分离钮、一骨髓抽吸抹片萃取钮、一变形第一观察钮、一总表面积第一观察钮、一干细胞第一萃取钮、一干细胞离心钮、一干细胞第二萃取钮、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮、一干细胞第三萃取钮及一注销钮。当未进行该干细胞的培养时，即点击该注销钮。当点击该注销钮时，该计算机11中的干细胞培养系统10即会停止。
在点击该显示器16上的骨髓抽吸抹片分离钮之后，该负责人员自一注射器将该第一骨髓抽吸抹片19注入该玻璃试管20中，其中被注入该第一骨髓抽吸抹片19的玻璃试管20插设于该试管架21上。请参照图3所示，该负责人员使该试管架21容纳于该自动调温腔22中，且被注入该第一骨髓抽吸抹片19的玻璃试管20静置(将其静静放置不要移动)于该自动调温腔22一预定时间(约2小时)，该自动调温腔22中的温度维持于约36～37℃，其为与体温大致相同的温度。该计算机11于该显示器16上显示印于该第一代码表18A的二维条形码所指的该编号1(NO.1)及该捐赠者资料，该显示器16上也显示骨髓抽吸抹片分离进行讯息及一骨髓抽吸抹片分离终止钮。
请参照图4所示，通过将该玻璃试管20静置于该自动调温腔22一预定时间(约2小时)，注入该玻璃试管20的第一骨髓抽吸抹片19于该玻璃试管20中沿该垂直方向被分离为多层(三层)。一般而言，为了培养干细胞需要150～200毫升的骨髓抽吸抹片；但是于该干细胞培养方法中，只需自该捐赠者收集2～3毫升的第一骨髓抽吸抹片19即已经足够，且以少量的骨髓抽吸抹片19即能够培养(制造)特定种类的间充质干细胞(该第二间充质干细胞31)，因而该骨髓抽吸抹片19的采样时间可以大幅地缩短，收集该骨髓抽吸抹片19的花费也会下降，在收集该骨髓抽吸抹片19当时对该捐赠者的负担也可以降到最低。
于将该第一骨髓抽吸抹片19分离为多层的骨髓抽吸抹片分离步骤之后，进行该骨髓抽吸抹片萃取步骤。于该骨髓抽吸抹片萃取步骤中，自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片19中萃取该第二骨髓抽吸抹片23。于确认该第一骨髓抽吸抹片19分离为多层后，该负责人员点击显示于该显示器16上的骨髓抽吸抹片分离终止钮。
当点击该骨髓抽吸抹片分离终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第二显示屏幕(图未示)。于该处理第二显示屏幕上显示该编号1(NO.1)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第二显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取钮、一变形第一观察钮、一总表面积第一观察钮、一干细胞第一萃取钮、一干细胞离心钮、一干细胞第二萃取钮、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员点击该处理第二显示屏幕上的骨髓抽吸抹片萃取钮，使该条形码读取器12读取该玻璃试管20上的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，于该显示器16上显示该编号1(NO.1)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取进行讯息及一骨髓抽吸抹片萃取终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
该负责人员自该自动调温腔22内部取出该试管架21，自该试管架21上拿下该玻璃试管20，并萃取存在于分离为多层的第一骨髓抽吸抹片19的一特定层的第二骨髓抽吸抹片23，该负责人员以一注射器(syringe)(图未示)自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片19萃取(吸取)位于一中间层的第二骨髓抽吸抹片23，其厚度为3～4毫米；或者，以一移液器(pipette)自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片19萃取(吸取)位于分离为多层的第一骨髓抽吸抹片19的一中间层的第二骨髓抽吸抹片23，其厚度为3～4毫米。于该干细胞培养方法中，于将包括多种间充质干细胞的第一骨髓抽吸抹片19于该垂直方向分离为多层(三层)之后，能够以一注射器或一移液器确定地自该第一骨髓抽吸抹片19中萃取特定的(中间的)第二骨髓抽吸抹片23，且可以移除该第一骨髓抽吸抹片19所包括的不必要的间充质干细胞。
图5为一说明图，其显示一变形第一观察步骤的一实施例，图6为一第一平面培养容器(first flat culture vessel)25(该第一培养容器)的侧视图，图7为一局部放大图，其显示第一间充质干细胞35的平面形状的一实施例，图8为一局部放大图，其显示第一间充质干细胞35的平面形状的另一实施例。图7～8为由该电子显微镜13所拍摄的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像。
于自该第一骨髓抽吸抹片19中萃取位于该中间层的特定的第二骨髓抽吸抹片23的骨髓抽吸抹片萃取步骤之后，进行一变形第一观察步骤。于该变形第一观察步骤中，将该第二骨髓抽吸抹片23及一培养液24注入(供应)该第一平面培养容器25(第一培养容器)(该细胞培养容器)，维持该第一平面培养容器25于与体温大致相同的温度(约36～37℃)下，将该第一平面培养容器25静置(将其静静放置不要移动)12～24小时，于第12～24小时内，以每隔约1～2小时的间隔，以该电子显微镜13观察于该第一平面培养容器25中的第二骨髓抽吸抹片23所含有的第一间充质干细胞35(该第一干细胞)自一起始平面形状的变形状态，并判断该第一间充质干细胞35是否固定于第一平面培养容器25的底表面36。被注入该第二骨髓抽吸抹片23及该培养液24的第一平面培养容器25的底表面36(该底墙的外侧表面)贴附有该第二代码表18b，其上的二维条形码明确说明该捐赠者。
于自该第一骨髓抽吸抹片19中萃取特定的第二骨髓抽吸抹片23之后，医生、护士及研究人员等负责人员点击显示于该显示器16上的骨髓抽吸抹片萃取终止钮。当点击该骨髓抽吸抹片萃取终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第三显示屏幕(图未示)。该处理第三显示屏幕上显示该编号1(NO.1)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第三显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察钮、一总表面积第一观察钮、一干细胞第一萃取钮、一干细胞离心钮、一干细胞第二萃取钮、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员将印制有该二维条形码的第二代码表18b贴附于该第一培养容器25的底表面36(该底墙的外侧表面)，接着，点击该处理第三显示屏幕上的变形第一观察钮，使该条形码读取器12读取该培养容器25上的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，于该显示器16上显示该编号2(NO.2)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察进行讯息及一变形第一观察终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
用于该变形第一观察步骤的第一平面培养容器25为以透明玻璃或透明塑料所制成的一平面容器，其具有小容量、一预定面积的一底表面36，且具有略呈方形的平面形状。该第一平面培养容器25具有一顶部26、一底部28、位于该顶部26及该底部28之间的一中间部27，及形成于该顶部26的一注入口29，一盖30紧密地封闭该注入口29。该第一平面培养容器25的容量约为20～30毫升(较佳为25毫升)，且其底表面积约为25～36平方毫米，该第一平面培养容器25于其一侧的长度为5～6毫米。附带一提，该第一平面培养容器25也可以为平面形状为圆形或椭圆形，且具有小容量及一预定面积的一底表面28的一平面容器。
该负责人员自该注入口29移除该盖30，以一注射器或一移液器吸取该第二骨髓抽吸抹片23，并通过该第一平面培养容器25的注入口29将该第二骨髓抽吸抹片23注入(容纳)该第一平面培养容器25中，及以该注射器或该移液器吸取该培养液24，并通过该第一平面培养容器25的注入口29将该培养液24注入(容纳)该第一平面培养容器25中，并以该盖30封闭该注入口29。
该培养液24为添加有青霉素(penicillin)(100单位/毫升)、两性霉素(amphotericin)(约100毫微克/毫升)、链霉素(streptomycin)(约100mkg/mL)、L-麸酰胺酸(约2～4毫升)及20％胎牛血清，且含有胺基酸的一矿物盐溶液。注入该第一平面培养容器25的该第二骨髓抽吸抹片23所包括的第一间充质干细胞35以该培养液24进行培养，随时间流逝会固定于该第一平面培养容器25的底表面36，并于该第一平面培养容器25的底表面36上渐渐增殖(分化)，以形成细胞集落(colony)。
将该第二骨髓抽吸抹片23及该培养液24注入该第一平面培养容器25之后，该负责人员使该第一平面培养容器25定位(组装)于该电子显微镜13的一样品架31上。附带一提，将一间隔件33(spacer)插入该电子显微镜13的样品架31的一上表面32与该第一平面培养容器25的底部28之间，使该第一平面培养容器25的底部28由该间隔件33所撑起，使该第一平面培养容器25以一预定角度呈倾斜状态，因而该第一平面培养容器25的底部28位于上方而该第一平面培养容器25的顶部26(该注入口29)位于下方。另外地，将该间隔件33插入该电子显微镜13的样品架31的上表面32与该第一平面培养容器25的顶部26之间，使该第一平面培养容器25的顶部26由该间隔件33所撑起，能够使该第一平面培养容器25以一预定角度呈倾斜状态，因而该第一平面培养容器25的顶部26位于上方而该第一平面培养容器25的底部28位于下方。该第一培养容器25相对于该样品架31的上表面32的一倾斜角α1介于2～5°的范围内，较佳介于2～3°的范围内。
于该干细胞培养方法中，通过使该第一平面培养容器25相对于该样品架31的上表面32以上述倾斜角呈倾斜状态，于该第一平面培养容器25中，该第二骨髓抽吸抹片23及该培养液24朝向该第一平面培养容器25的顶部26的一侧(或该第一平面培养容器25的底部28的一侧)呈倾斜状态，该第二骨髓抽吸抹片23及该培养液24的水压上升，且该第一间充质干细胞35集中于该第一平面培养容器25的底表面36的一侧，使该第一间充质干细胞35的活性增加，该第一间充质干细胞35可以容易地、快速地固定于该第一平面培养容器25的底表面36。
该电子显微镜13通过一接口(有线或无线)连接该计算机11，该电子显微镜13具有一影像拍摄功能(image photographing function)，通过一影像撷取组件(image pickupelement)拍摄一被摄物(subject)的一放大图像，该电子显微镜13具有一影像传输功能(image transmission function)，将该放大图像发送至该计算机11。该电子显微镜13以每隔约1～2小时的间隔拍摄注入该第一平面培养容器25的第二骨髓抽吸抹片23所包括的第一间充质干细胞35的平面形状的一放大图像，并将所拍摄的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像以每隔约1～2小时的间隔传输至该计算机11，该电子显微镜13的拍摄图像的时间间隔与图像传输的时间间隔能够以例如该键盘14及该鼠标15等一输入设备，于1～2小时的范围内自行设置。
该计算机11将该第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜13的拍摄时间，以与捐赠者识别符[干细胞影像储存手段(stem cells image storagemeans)]相关的状态储存(记忆)于一储存区域中。该计算机11于该显示器16上显示该第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜35的拍摄时间，于第12～24小时内，该负责人员以每隔约1～2小时的间隔确认(查看)显示于该显示器16上的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像，观察该第二骨髓抽吸抹片23所包括的第一间充质干细胞35的平面形状的变化。附带一提，于第12～24小时内，该负责人员也能够以每隔约1～2小时的间隔，直接自该电子显微镜13的观测窗口(observation window)观察该第一间充质干细胞35的平面形状的变化。
该第一间充质干细胞35的一起始平面形状略呈圆形，且当该第一间充质干细胞35的平面形状为略呈圆形时，该第一间充质干细胞35并未固定于该第一平面培养容器25的底表面36(该底墙的内表面)，且该第一间充质干细胞27尚未开始进行增殖(分化)。于固定的前，该第一间充质干细胞27于变形后的平面形状大体上以该圆形作为一核心朝一方向(预定方向)不规则地延伸(扩张)的扁形，该第一间充质干细胞27固定于该第一平面培养容器25的底表面36(该底墙的内表面)，且该第一间充质干细胞27开始进行增殖(分化)。
请参照图6所示，当该变形第一观察步骤的观察结果为：显示于该显示器16上的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像为略呈圆形，该负责人员判断该第一间充质干细胞35尚未固定于该第一平面培养容器25的底表面36(该底墙的内表面)，且继续以每隔约1～2小时的间隔持续观察该第一间充质干细胞35的平面形状的变化。请参照图7所示，当该变形第一观察步骤的结果为：显示于该显示器16上的第一间充质干细胞35的平面形状自略呈圆形变形为大体上以该圆形作为一核心的一扁形，该负责人员判断该第一间充质干细胞35固定于该第一平面培养容器25的底表面35。
当于使该第一间充质干细胞35固定时使用容量超过30毫升、底表面积超过36平方毫米的大型培养容器时，对该第一间充质干细胞35而言，要固定于该大型培养容器的底表面是困难的，且该第一间充质干细胞35的增殖也会趋缓，但是于该干细胞培养方法中，通过使用上述容量及上述底表面积的第一平面培养容器25，该第一间充质干细胞35可以容易地固定于该第一平面培养容器25的底表面36，且该第一间充质干细胞27可以于该第一平面培养容器25中快速地增殖。
于该干细胞培养方法中，由于将该第一平面培养容器25于与体温大致相同的温度下静置12～24小时，且于第12～24小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第一平面培养容器25中的第一间充质干细胞35自一起始平面形状变形的状态，绝对不会没注意到该第一间充质干细胞35的变形，可以精确地确认该第一间充质干细胞35固定于该第一平面培养容器25的底表面36。
图9为一局部放大图，其显示第一间充质干细胞35的平面形状的另一实施例。图9显示由该电子显微镜13所拍摄的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像。当该变形第一观察步骤的观察结果为：该第一间充质干细胞35(该第一干细胞)自一略呈圆形的形状(一起始平面形状)变形为大体上以该圆形作为一核心的一扁形，且于确认该第一间充质干细胞35固定于该第一平面培养容器25(该第一培养容器)的底表面36的变形第一观察步骤之后，进行该总表面积第一观察步骤。
于该总表面积第一观察步骤中，将注入该第一平面培养容器25中的培养液24自该第一平面培养容器25中取出，并将一新的培养液24注入(供应)该第一平面培养容器25，接着，将该第一平面培养容器25于与体温大致相同的温度下(约37℃)静置(将其静静放置不要移动)36～48小时，并于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔，利用该电子显微镜13观察固定于该第一平面培养容器25的底表面36的第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积，并评估该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积是否达该第一目标比，该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积的第一目标比为70～80％﹝融合度为70～80％(70～80％confluent)﹞。
于确认该第二骨髓抽吸抹片23所包括的第一间充质干细胞35固定于该第一平面培养容器25的底表面36之后，医生、护士及研究人员等负责人员点击显示于该显示器16上的变形第一观察终止钮。当点击该变形第一观察终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第四显示屏幕(图未示)。该处理第四显示屏幕上显示该编号2(NO.2)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第四显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察钮、一干细胞第一萃取钮、一干细胞离心钮、一干细胞第二萃取钮、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员点击该处理第四显示屏幕上的一干细胞第二观察钮，自该电子显微镜16的样品架31上移除该第一平面培养容器25，及以该条形码读取器12读取该第一平面培养容器25的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，该显示器16上显示该编号2(NO.2)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察进行讯息及一总表面积第一观察终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
于该变形第一观察步骤中，该负责人员使用一注射器或一移液器自该第一平面培养容器25中将注入该第一平面培养容器25的培养液24取出，并将以一注射器或一移液器吸取的新的培养液24注入(容纳)该第一平面培养容器25。该新的培养液24与于该变形第一观察步骤中所注入者相同。于将该新的培养液24注入该第一平面培养容器25之后，该负责人员将该第一平面培养容器25定位(组装)于该电子显微镜13的样品架13上。
附带一提，将该间隔件33插入该电子显微镜13的样品架31的一上表面32与该第一平面培养容器25的底部28之间，使该第一平面培养容器25的底部28由该间隔件33所撑起，使该第一平面培养容器25以一预定角度呈倾斜状态，因而该第一平面培养容器25的底部28位于上方而该第一平面培养容器25的顶部26(该注入口29)位于下方(如图6所示)。又，将该间隔件33插入该电子显微镜13的样品架31的上表面32与该第一平面培养容器25的顶部26之间，使该第一平面培养容器25的顶部26由该间隔件33所撑起，能够使该第一平面培养容器25以一预定角度呈倾斜状态，因而该第一平面培养容器25的顶部26位于上方而该第一平面培养容器25的底部28位于下方。该第一培养容器25相对于该样品架31的上表面32的一倾斜角α1介于2～5°的范围内，较佳介于2～3°的范围内。
于该干细胞培养方法中，于确认该第一间充质干细胞35固定之后，通过自该第一平面培养容器25中取出该培养液24，并将一新的培养液24注入该第一平面培养容器25，可以确定地促进该第一间充质干细胞35进行增殖。于该干细胞培养方法中，通过使该第一平面培养容器25相对于该样品架31的上表面32以上述倾斜角呈倾斜状态，于该第一平面培养容器25中，该第一间充质干细胞35及该培养液24朝向该第一平面培养容器25的顶部26的一侧(或该第一平面培养容器25的底部28的一侧)，于该第一平面培养容器25的顶部26的一侧(或该第一平面培养容器25的底部28的一侧)，该第一间充质干细胞35及该培养液24的水压上升，且该第一间充质干细胞35集中于该第一平面培养容器25的底表面36的一侧，使该第一间充质干细胞35的活性增加，该第一间充质干细胞35可以容易地、快速地于该第一平面培养容器25的底表面36进行增殖(分化)。
该电子显微镜13以每隔约1～2小时的间隔拍摄该第一平面培养容器25中的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像，并将所拍摄的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像以每隔约1～2小时的间隔传输至该计算机11。该计算机11将该第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜13的拍摄时间，以与捐赠者识别符[干细胞影像储存手段(stem cells image storage means)]相关的状态储存(记忆)于一储存区域中。该计算机11于该显示器16上显示该第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜35的拍摄时间。
于第36～48小时内，该负责人员以每隔约1～2小时的间隔确认(查看)显示于该显示器16上的第一间充质干细胞35的平面形状的放大图像，且于观察固定于该第一平面培养容器25的底表面36的第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积时，判断该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积是否达该第一目标比(融合度为70～80％)。附带一提，于第36～48小时内，该负责人员也能够以每隔约1～2小时的间隔，直接自该电子显微镜13的观测窗口观察该第一充间质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积，并可以判断该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积是否达该第一目标比(融合度为70～80％)。
请参照图8所示，当该总表面积第一观察步骤的观察结果为：显示于该显示器16上的第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积尚未达该第一目标比(融合度为70～80％)，该负责人员以每隔约1～2小时的间隔，持续观察该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积。附带一提，当该第一间充质干细胞35的总表面积相对于显示于该显示器16上的放大图像的总表面积达该第一目标比时，判断该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积达该第一目标比。
当该总表面积第一观察步骤的观察结果为：该第一间充质干细胞35于该第一平面培养容器25的底表面36(该底墙的内表面)增殖，该第一间充质干细胞35形成细胞集落，该第一间充质干细胞35的平面形状扩张，且显示于该显示器16上的第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积达该第一目标比(融合度为70～80％)时(如第9图所示)，进行该干细胞第一萃取步骤，自该第一平面培养容器25中萃取该第一间充质干细胞35。于该干细胞第一萃取步骤中，自该第一平面培养容器25萃取于该第一平面培养容器25中增殖(分化)的第一间充质干细胞35。
于确认该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积达该第一目标比之后，医生、护士及研究人员等负责人员点击显示于该显示器16上的总表面积第一观察终止钮。当点击该总表面积第一观察终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第五显示屏幕(图未示)。该处理第五显示屏幕上显示该编号2(NO.2)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第五显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第二观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取钮、一干细胞离心钮、一干细胞第二萃取钮、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员点击该处理第五显示屏幕上的干细胞第一萃取钮，使该条形码读取器12读取该第一平面培养容器25上的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，该显示器16上显示该编号2(NO.2)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第二观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取进行讯息及一干细胞第一萃取终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
于该总表面积第一观察步骤中，该负责人员使用一注射器或一移液器自该第一平面培养容器25中将注入该第一平面培养容器25的培养液24取出，且于以磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗该第一平面培养容器25的内部之后，将以该注射器或该移液器吸取的胰蛋白酶溶液(trypsin solution)注入该第一平面培养容器25，当该胰蛋白酶溶液注入该第一平面培养容器25，固定于该第一平面培养容器25的底表面36的第一间充质干细胞35会由于该胰蛋白酶溶液而自该第一平面培养容器25的底表面36剥离，并漂浮于该胰蛋白酶溶液的表面。该负责人员使用一移液器以吸取该第一间充质干细胞35并将该第一间充质干细胞35容纳于该移液器。
于该干细胞培养方法中，通过以每隔约1～2小时的间隔观察该第一间充质干细胞35的总表面积，可以精确地确认该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该该第一平面培养容器25的底表面积，且可以确定地掌握该第一间充质干细胞27的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积已达该第一目标比。
图10为一说明图，其显示一干细胞离心步骤的一实施例。于自该第一平面培养容器25萃取该第一间充质干细胞35的干细胞第一萃取步骤之后，进行该干细胞离心步骤。于该干细胞离心步骤中，以一离心机37将于该干细胞第一萃取步骤中萃取出的第一间充质干细胞35离心以分离为多层，医生、护士及研究人员等负责人员以一移液器自该第一平面培养容器25吸取该第一间充质干细胞35，并点击显示于该显示器16上的干细胞第一萃取终止钮。
当点击该干细胞第一萃取终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第六显示屏幕(图未示)。该处理第六显示屏幕上显示该编号2(NO.2)及该捐赠者数据，且于此同时，该处理第六显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心钮、一干细胞第二萃取钮、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员将印有该二维条形码的第三代码表18c黏贴于注入有该第一间充质干细胞35的玻璃试管38的外环周面，接着点击于该处理第六显示屏幕上的干细胞离心钮，使该条形码读取器12读取该玻璃试管38的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，于该显示器16上显示该编号3(NO.3)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心进行讯息及一干细胞离心终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
该负责人员以一移液器将该第一间充质干细胞35注入(容纳)该玻璃试管38，并将该玻璃试管38定位(组装)于该离心机37。该负责人员通过该离心机37离心分离该第一间充质干细胞35一预定时间，并自该离心机37中将该玻璃试管38取出，于该玻璃试管38中的第一间充质干细胞35通过该离心机37沿该垂直方向分离为两层。
图11为一说明图，其显示一干细胞第二萃取步骤的一实施例。于将该第一间充质干细胞35分离为多层的干细胞离心步骤之后，进行该干细胞第二萃取步骤。于该干细胞第二萃取步骤中，自分离为多层的第一间充质干细胞35中萃取位于较下层(该最底层)的第二间充质干细胞39，医生、护士及研究人员等负责人员以该离心机37使该第一间充质干细胞35沿该垂直方向分离为多层，接着，自该离心机37中取出该玻璃试管38，并点击显示于该显示器16上的干细胞离心终止钮。
当点击该干细胞离心终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第七显示屏幕(图未示)。于该处理第七显示屏幕上显示该编号3(NO.3)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第七显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取钮、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员点击该处理第七显示屏幕上的干细胞第二萃取钮，使该条形码读取器12读取该玻璃试管38上的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，于该显示器16上显示该编号3(NO.3)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取进行讯息及一干细胞第二萃取终止讯息。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
该负责人员自于该玻璃试管38中分离为多层的第一间充质干细胞35中萃取位于较下层(该最底层)的第二间充质干细胞39，该负责人员以一注射器自分离为多层的第一间充质干细胞35中萃取(吸取)位于较下层(该最底层)的第二间充质干细胞39；或者，以一移液器自分离为多层的第一间充质干细胞35中萃取(吸取)位于较下层(该最底层)的第二间充质干细胞39。
于该干细胞培养方法中，通过于该离心机37中离心分离包括不必要的干细胞的第一间充质干细胞35，以将该第一间充质干细胞35沿该垂直方向分离为多层，及萃取离心分离为多层的第一间充质干细胞35中位于较下层(该最底层)的第二间充质干细胞39，可以确定地自该第一间充质干细胞35中萃取特定的第二间充质干细胞39，且可以自该第一间充质干细胞35中移除不必要的间充质干细胞。
当该第一间充质干细胞35增殖至该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25(该第一培养容器)的底表面积超过80％时，该第一间充质干细胞35的活性会渐渐消失。但是于该干细胞培养方法中，当该第一间充质干细胞35增殖至该第一间充质干细胞35相对于该第一平面培养容器25的底表面积为70～80％时，自该第一平面培养容器25萃取该第一间充质干细胞35，进而可以保持该第一间充质干细胞35的活性，且该第一间充质干细胞35可以在保持其活性的状况下进行增殖，因此自该第一间充质干细胞35萃取出的第二间充质干细胞39具有活性。
图12为一说明图，其显示一变形第二观察步骤的一实施例，图13为第二平面培养容器25(该第二培养容器)的侧视图，图14为一局部放大图，其显示第二间充质干细胞的平面形状的一实施例，图15为一局部放大图，其显示第二间充质干细胞的平面形状的另一实施例。图14～15为由该电子显微镜13所拍摄的第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像。
于自该第一间充质干细胞35中萃取位于较下层(该最底层)的特定的第二间充质干细胞39的干细胞第二萃取步骤之后，进行该变形第二观察步骤。于该变形第二观察步骤中，将该第二间充质干细胞39及该培养液24注入(供应)该第二平面培养容器34(该第二培养容器)(该细胞培养容器)，维持该第二平面培养容器34于与体温大致相同的温度下(约37℃)下，将该第二平面培养容器34静置(将其静静放置不要移动)36～48小时，于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔，以该电子显微镜13观察于该第二平面培养容器34中的第二间充质干细胞39(该第二干细胞)自一起始平面形状的变形状态，并判断该第二间充质干细胞39是否固定于该第二平面培养容器34的底表面36。被注入该第二间充质干细胞39及该培养液24的第二平面培养容器34的底表面45(该底墙的外侧表面)贴附有一第四代码表18d，其上的二维条形码明确说明该捐赠者。
于自该第一间充质干细胞35中萃取特定的第二间充质干细胞39之后，医生、护士及研究人员等负责人员点击显示于该显示器16上的一干细胞第二萃取终止讯息。当点击该干细胞第二萃取终止讯息，该计算机11于该显示器16上显示一处理第八显示屏幕(图未示)。该处理第八显示屏幕上显示该编号4(NO.4)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第八显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取终止讯息、一变形第二观察钮、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员将印有该二维条形码的第四代码表18d黏贴于该第二平面培养容器34的底表面45(该底墙的外侧表面)，接着点击于该处理第八显示屏幕上的变形第二观察钮，使该条形码读取器12读取该第二平面培养容器34的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，于该显示器16上显示该编号4(NO.4)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取终止讯息、一变形第二观察讯息及一变形第二观察终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
该负责人员以一注射器或一移液器吸取的第二间充质干细胞39注入(容纳)该第二平面培养容器34，并以一注射器或一移液器吸取的培养液24注入该培养容器34。用于该变形第二观察步骤的第二平面培养容器34(该第二培养容器)为以透明玻璃或透明塑料所制成的一平面容器，其具有小容量、一预定面积的一底表面45，且具有略呈四边形的平面形状，且该底表面45的面积为该第一平面培养容器25(该第一培养容器)的约2倍。该第二平面培养容器34具有一顶部40、一底部42、位于该顶部40及该底部42的间的一中间部41，及形成于该顶部40的一注入口43，一盖44紧密地封闭该注入口43。
该第二平面培养容器34(该第二培养容器)的容量约为40～60毫升(较佳为50毫升)，且其底表面积约为50～72平方毫米，该第二平面培养容器26于其一侧的长度约为7～8.5毫米。附带一提，该第二平面培养容器34也可以为平面形状为圆形或椭圆形，且具有小容量及一预定面积的一底表面45的一平面容器。该培养液24与该变形第一观察步骤中所注入的培养液相同，注入该第二平面培养容器34的第二间充质干细胞39以该培养液24进行培养，随时间流逝会固定于该第二平面培养容器34的底表面45，并于该第二平面培养容器34的底表面45上渐渐增殖(分化)，以形成细胞集落。
该负责人员自该注入口43移除该盖44，以一移液器吸取该第二间充质干细胞39，并通过该第二平面培养容器34的注入口43将该第二间充质干细胞39注入(容纳)该第二平面培养容器34中，及以一注射器或一移液器吸取该培养液24，并通过该第二平面培养容器34的注入口43注入(容纳)该第二平面培养容器34中，并以该盖44封闭该注入口43。将该第二间充质干细胞39及该培养液24注入该第二平面培养容器34之后，该负责人员使该第二平面培养容器34定位(组装)于该电子显微镜13的样品架31上。
将该间隔件33插入该电子显微镜13的样品架31的上表面32与该第二平面培养容器34的底部42之间，使该第二平面培养容器34的底部42由该间隔件33所撑起，使该第二平面培养容器34以一预定角度呈倾斜状态，因而该第二平面培养容器34的底部42位于上方而该第二平面培养容器34的顶部40(该注入口43)位于下方。又，将该间隔件33插入该电子显微镜13的样品架31的上表面32与该第二平面培养容器34的顶部40之间，使该第二平面培养容器34的顶部40由该间隔件33所撑起，能够使该第二平面培养容器34以一预定角度呈倾斜状态，因而该第二平面培养容器34的顶部40位于上方而该第二平面培养容器34的底部42位于下方。该第二平面培养容器34相对于该样品架31的上表面32的一倾斜角α2介于2～5°的范围内，较佳介于2～3°的范围内。
于该干细胞培养方法中，通过使该第二平面培养容器34相对于该样品架31的上表面32以上述倾斜角呈倾斜状态，于该第二平面培养容器34中，该第二间充质干细胞39及该培养液24朝向该第二平面培养容器34的顶部40的一侧(或该第二平面培养容器34的底部42的一侧)呈倾斜状态，于该第二平面培养容器34的顶部40的一侧(或于该第二平面培养容器34的底部42的一侧)，该第二间充质干细胞39及该培养液24的水压上升，且该第二间充质干细胞39集中于该第二平面培养容器34的底表面45的一侧，使该第二间充质干细胞39的活性增加，该第二间充质干细胞39可以容易地、快速地固定于该第二平面培养容器34的底表面45。
该电子显微镜13以每隔约1～2小时的间隔拍摄注入该第二平面培养容器34的第二间充质干细胞39的平面形状的一放大图像，并将所拍摄的第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像以每隔约1～2小时的间隔传输至该计算机11。该计算机11将该第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜35的拍摄时间，以与捐赠者识别符[干细胞影像储存手段(stem cells image storage means)]相关的状态储存(记忆)于一储存区域中。该计算机11于该显示器16上显示该第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜35的拍摄时间，于第36～48小时内，该负责人员以每隔约1～2小时的间隔确认(查看)显示于该显示器16上的第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像，观察该第二间充质干细胞39的平面形状的变化。附带一提，于第36～48小时内，该负责人员也能够以每隔约1～2小时的间隔，直接自该电子显微镜13的观测窗口观察该第二间充质干细胞39的平面形状的变化。
该第二间充质干细胞39的起始平面形状略呈圆形，该第二间充质干细胞39并未固定于该第二平面培养容器34的底表面45(该底墙的内表面)，且该第二间充质干细胞39尚未开始进行增殖(分化)。该第二间充质干细胞39于变形后的平面形状大体上以该圆形作为一核心朝一方向不规则地延伸的扁形，该第二间充质干细胞39固定于该第二平面培养容器34的底表面45(该底墙的内表面)，且该第二间充质干细胞39开始进行增殖(分化)。
请参照图14所示，当该变形第二观察步骤的观察结果为：显示于该显示器16上的第二间充质干细胞39的平面形状仍为略呈圆形，该负责人员判断该第二间充质干细胞39尚未固定于该第二平面培养容器34的底表面45(该底墙的内表面)，且继续以每隔约1～2小时的间隔持续观察该第二间充质干细胞39的平面形状的变化。请参照图15所示，当该变形第二观察步骤的结果为：显示于该显示器16上的第二间充质干细胞39的平面形状自略呈圆形变形为大体上以该圆形作为一核心的一扁形，该负责人员判断该第二间充质干细胞39固定于该第二平面培养容器34的底表面45。
当于使该第二间充质干细胞39固定时使用容量超过60毫升、底表面积超过72平方毫米的大型培养容器时，对该第二间充质干细胞39而言，要固定于该大型培养容器的底表面是困难的，且该第二间充质干细胞39的增殖也会趋缓，但是于该干细胞培养方法中，通过使用上述容量及上述底表面积的第二平面培养容器34，该第二间充质干细胞39可以容易地固定于该第二平面培养容器34的底表面45，且该第二间充质干细胞39可以于该第二平面培养容器34中快速地增殖。
于该干细胞培养方法中，由于将该第二平面培养容器34于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第二平面培养容器34中的第二间充质干细胞39自一起始平面形状变形的状态，绝对不会没注意到该第二间充质干细胞39的变形，可以精确地确认该第二间充质干细胞39固定于该第二平面培养容器34的底表面45。
图16为一局部放大图，其显示第二间充质干细胞39的平面形状的另一实施例，图17为一附图，其显示保存第二间充质干细胞39的一实施例。图16显示由该电子显微镜13所拍摄的第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像。当该变形第二观察步骤的观察结果为：该第二间充质干细胞39(该第二干细胞)自一略呈圆形的形状(一起始平面形状)变形为大体上以该圆形作为一核心的一扁形，且于确认该干细胞39固定于该第二平面培养容器34(该第二培养容器)的底表面45的干细胞第三观察步骤之后，进行该总表面积第二观察步骤。
于该总表面积第二观察步骤中，将注入该第二平面培养容器34中的培养液24自该第二平面培养容器34中取出，并将一新的培养液24注入(供应)该第二平面培养容器34，接着，将该第二平面培养容器34于与体温大致相同的温度下(约36～37℃)静置(将其静静放置不要移动)36～48小时，并于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔，利用该电子显微镜13观察固定于该第二平面培养容器34的底表面45的第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积，并评估该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积是否达该第二目标比，该第二间充质干细胞39的总表面积相对于第二平面培养容器34的底表面积的第二目标比为88～92％﹝融合度为88～92％(88～92％confluent)﹞。
于确认该第二间充质干细胞39固定于该第二平面培养容器34的底表面45之后，医生、护士及研究人员等负责人员点击显示于该显示器16上的变形第二观察终止钮。当点击该变形第二观察终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第九显示屏幕(图未示)。该处理第九显示屏幕上显示该编号4(NO.4)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第九显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取终止讯息、一变形第二观察终止讯息、一总表面积第二观察钮及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员点击该处理第九显示屏幕上的总表面积第二观察钮，以自该电子显微镜13的样品架31上移除该第二平面培养容器34，并使该条形码读取器12读取该第二平面培养容器34的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，该显示器16上显示该编号4(NO.4)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取终止讯息、一变形第二观察终止讯息、一总表面积第二观察进行讯息及一总表面积第二观察终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
于该总表面积第二观察步骤中，该负责人员使用一注射器或一移液器自该第二平面培养容器34中将注入该第二平面培养容器34的培养液24取出，并将以一注射器或一移液器吸取的新的培养液24注入(容纳)该第二平面培养容器34。该新的培养液24与该变形第一观察步骤中所注入者相同。于将该新的培养液24注入该第二平面培养容器34之后，该负责人员将该第二平面培养容器34定位(组装)于该电子显微镜13的样品架31上。
将该间隔件33插入该电子显微镜13的样品架31的上表面32与该第二平面培养容器34的底部42的间，使该第二平面培养容器34的底部42由该间隔件33所撑起，使该第二平面培养容器34以一预定角度呈倾斜状态，因而该第二平面培养容器34的底部42位于上方而该第二平面培养容器34的顶部40(该注入口43)位于下方(如图13所示)。另外地，将该间隔件33插入该电子显微镜13的样品架31的上表面32与该第二平面培养容器34的顶部40之间，使该第二平面培养容器34的顶部40由该间隔件33所撑起，能够使该第二平面培养容器34以一预定角度呈倾斜状态，因而该第二平面培养容器34的顶部40位于上方而该第二平面培养容器34的底部42位于下方。该第二平面培养容器34相对于该样品架31的上表面32的一倾斜角α2介于2～5°的范围内，较佳介于2～3°的范围内。
于该干细胞培养方法中，于确认该第二间充质干细胞39固定之后，通过自该第二平面培养容器34中取出该培养液24，并将一新的培养液24注入该第二平面培养容器34，可以确定地促进该第二间充质干细胞39进行增殖。于该干细胞培养方法中，通过使该第二平面培养容器34相对于该样品架31的上表面32以上述倾斜角呈倾斜状态，于该第二平面培养容器34中，该第二间充质干细胞39及该培养液24朝向该第二平面培养容器34的顶部40的一侧(或该第二平面培养容器34的底部42的一侧)，于该第二平面培养容器34的顶部40的一侧(或该第二平面培养容器34的底部42的一侧)，该第二间充质干细胞39及该培养液24的水压上升，且该第二间充质干细胞39集中于该第二平面培养容器34的底表面45的一侧，使该第二间充质干细胞39的活性增加，该第二间充质干细胞39可以容易地、快速地于该第二平面培养容器34的底表面45进行增殖(分化)。
该电子显微镜13以每隔约1～2小时的间隔拍摄该第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像，并将所拍摄的第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像以每隔约1～2小时的间隔传输至该计算机11。该计算机11将该第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜35的拍摄时间，以与捐赠者识别符[干细胞影像储存手段(stemcells image storage means)]相关的状态储存(记忆)于一储存区域中。该计算机11于该显示器16上显示该第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像及传输自该电子显微镜35的拍摄时间。
于第36～48小时内，该负责人员以每隔约1～2小时的间隔确认(查看)显示于该显示器16上的第二间充质干细胞39的平面形状的放大图像，且于观察固定于该第二平面培养容器34的底表面45的第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积时，判断该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积是否达该第二目标比(融合度为88～92％)。附带一提，于第36～48小时内，该负责人员也能够以每隔约1～2小时的间隔，直接自该电子显微镜13的观测窗口观察该第二间充质干细胞39的第二平面培养容器34的总表面积相对于该底表面积(该第二平面培养容器34的底表面积)，并可以判断该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积是否达该第二目标比(融合度为88～92％)。
请参照图15所示，当总表面积第二观察步骤的观察结果为：显示于该显示器16上的第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积尚未达该第二目标比(融合度为88～92％)，该负责人员以每隔约1～2小时的间隔，持续观察该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积。附带一提，当该第二间充质干细胞39的总表面积相对于显示于该显示器16上的放大图像的总表面积达该第二目标比时，判断该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积达该第二目标比。
当该总表面积第二观察步骤的观察结果为：该第二间充质干细胞39于该第二平面培养容器34(该第二培养容器)的底表面45(该底墙的内表面)增殖，该第二间充质干细胞39形成细胞集落，该第二间充质干细胞39的平面形状扩张，且显示于该显示器16上的第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积达该第二目标比(融合度为88～92％)时(如图16所示)，进行该干细胞第三萃取步骤，自该第二平面培养容器34中萃取该第二间充质干细胞39。于该干细胞第三萃取步骤中，自该第二平面培养容器34萃取于第二平面培养容器34中增殖(分化)的第二间充质干细胞39。于该干细胞培养方法中，通过以每隔约1～2小时的间隔观察该总表面积，可以精确地确认该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积，且可以确定地掌握该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积已达该第二目标比。
于确认该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积达该第二目标比之后，医生、护士及研究人员等负责人员点击显示于该显示器16上的总表面积第二观察终止钮。当点击该总表面积第二观察终止钮，该计算机11于该显示器16上显示一处理第十显示屏幕(图未示)。该处理第十显示屏幕上显示该编号4(NO.4)及该捐赠者数据，于此同时，该处理第十显示屏幕上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取终止讯息、一变形第二观察终止讯息、一总表面积第二观察终止讯息及一干细胞第三萃取钮。
该负责人员点击该处理第十显示屏幕上的干细胞第三萃取钮，使该条形码读取器12读取该第二平面培养容器34上的二维条形码。当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，该显示器16上显示该编号4(NO.4)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取终止讯息、一变形第二观察终止讯息、一总表面积第二观察终止讯息及一干细胞第三萃取终止钮。当这些捐赠者资料不相符时，该计算机11于该显示器16上显示一错误讯息及一培养停止讯息。
于该总表面积第二观察步骤中，该负责人员使用一注射器或一移液器自该第二平面培养容器34中将注入该第二平面培养容器34的培养液24取出，且于以磷酸盐缓冲生理盐水清洗该第二平面培养容器34的内部之后，将以一注射器或一移液器吸取的胰蛋白酶溶液注入该第二平面培养容器34，当该胰蛋白酶溶液注入该第二平面培养容器34，固定于该第二平面培养容器34的底表面45的第二间充质干细胞39会由于该胰蛋白酶溶液而自该底表面45剥离，并漂浮于该胰蛋白酶溶液的表面。
该负责人员使用一移液器以吸取该第二间充质干细胞39，并将该第二间充质干细胞39自一移液器注入(容纳)一保存容器46。注入该保存容器46的第二间充质干细胞39为特定种类(基本上为单一类型)的纯的间充质干细胞，其具有活性，且为移除非必要的间充质干细胞的培养目标。于自一移液器将该第二间充质干细胞39注入该保存容器46之后，该负责人员将印有该二维条形码的第四代码表18d黏贴于该保存容器46的外环周面。
该负责人员点击显示于该显示器16上的处理第十显示屏幕上的一干细胞第三萃取终止钮，使该条形码读取器12读取该保存容器46上的二维条形码，接着注入有该第二间充质干细胞39的保存容器46于一冰箱47中进行搅拌。该第二间充质干细胞39于约3～4℃的温度下保存于该冰箱47中。
当该二维条形码自该条形码读取器12传输至该计算机11，该计算机11比对显示于该显示器16上的捐赠者数据(自该内存读取的捐赠者数据)及由该条形码读取器12所读取的二维条形码所指的捐赠者数据，且当这些捐赠者资料相符时，该显示器16上显示该编号4(NO.4)及该捐赠者资料，且于此同时，该显示器16上也显示一骨髓抽吸抹片分离终止讯息、一骨髓抽吸抹片萃取终止讯息、一变形第一观察终止讯息、一总表面积第一观察终止讯息、一干细胞第一萃取终止讯息、一干细胞离心终止讯息、一干细胞第二萃取终止讯息、一变形第二观察终止讯息、一总表面积第二观察终止讯息及一干细胞第三萃取终止讯息。
如果该第二间充质干细胞39增殖至第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34(该第二培养容器)的底表面积超过92％，该第二间充质干细胞39的活性会渐渐消失。但是于该干细胞培养方法中，当该第二间充质干细胞39增殖至该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积为88～92％时，自该该第二平面培养容器34萃取该第二间充质干细胞39，进而可以保持该第二间充质干细胞39的活性，且该第二间充质干细胞39可以在保持其活性的状况下进行增殖。
于该干细胞培养方法中，自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片19中萃取位于一中间层的第二骨髓抽吸抹片23，以该培养液24培养该第二骨髓抽吸抹片23以使该第一间充质干细胞35(该第一干细胞)固定于该第一平面培养容器25(该第一培养容器)的底表面36，并使该第一间充质干细胞35于该第一平面培养容器25(该第一培养容器)的底表面36进行增殖。当该第一间充质干细胞35的总表面积相对于该第一平面培养容器25的底表面积达该第一目标比时，自该第一平面培养容器25萃取该第一间充质干细胞35，自离心分离为多层的第一间充质干细胞35中萃取位于较下层(该最底层)的第二间充质干细胞39(该第二干细胞)，以该培养液24培养该第二间充质干细胞39以使该第二间充质干细胞39固定于该第二平面培养容器34的底表面45，并使该第二间充质干细胞39于该第二平面培养容器34的底表面45进行增殖。当该第二间充质干细胞39的总表面积相对于该第二平面培养容器34的底表面积达该第二目标比，自该第二平面培养容器34萃取该第二间充质干细胞39。因此，通过自分离为多层的第一骨髓抽吸抹片19中萃取一特定的第二骨髓抽吸抹片23，及通过自分离为多层的第一间充质干细胞35中萃取特定的第二间充质干细胞39，可以避免增殖各种干细胞，而可以只增殖特定种类的干细胞(该第二间充质干细胞)，且可以移除不必要的干细胞，其为可以培养的制造目标，而可以移除不必要的干细胞并制造纯的干细胞。
该干细胞培养方法可以只培养特定种类的干细胞(第二间充质干细胞39)，可以培养对于各种疾病具有良好治疗效果、或对于再生医学具有良好再生效果、对于要完全治愈各种疾病及要再生各种组织或各种器官具有高度可能性的干细胞。
附图标记说明
10 干细胞培养系统
11 计算机
12 条形码读取器
13 电子显微镜
14 键盘
15 鼠标
16 显示器
18a 第一代码表
18b 第二代码表
18c 第三代码表
18d 第四代码表
19 第一骨髓抽吸抹片
20 玻璃试管
21 试管架
22 自动调温腔
23 第二骨髓抽吸抹片
24 培养液
25 第一平面培养容器(第一培养容器)
26 顶部
27 中间部
28 底部
29 注入口
30 盖
31 样品架
32 上表面
33 间隔件
34 第二平面培养容器(第二培养容器)
35 第一间充质干细胞(第一干细胞)
36 底表面
37 离心机
38 玻璃试管
39 第二间充质干细胞(第二干细胞)
40 顶部
41 中间部
42 底部
43 注入口
44 盖
45 底表面
46 保存容器
47 冰箱。

Claims (12)

1.一种使用收集自一捐赠者的一第一骨髓抽吸抹片，以培养特定种类的干细胞的干细胞培养方法，其特征在于，其中，
该干细胞培养方法包括：
一骨髓抽吸抹片分离步骤，将收集自该捐赠者的第一骨髓抽吸抹片分为多层；
一骨髓抽吸抹片萃取步骤，自于该骨髓抽吸抹片分离步骤分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中的一中间层萃取一第二骨髓抽吸抹片；
一干细胞第一萃取步骤，将该骨髓抽吸抹片萃取步骤中萃取的第二骨髓抽吸抹片及一预定培养液注入一第一培养容器，该第一培养容器具有一预定体积，该第一培养容器的一底表面具有一预定面积，将该第一培养容器静置一预定时间，使一第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面，并进行增殖，当该第一干细胞于该第一培养容器的底表面扩张一平面形状，使该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积达一第一目标比时，自该第一培养容器萃取该第一干细胞；
一干细胞离心步骤，将于该干细胞第一萃取步骤中萃取的第一干细胞离心以分离为多层；
一干细胞第二萃取步骤，于以该干细胞离心步骤将该第一干细胞分离为多层后，萃取位于最底层的第二干细胞；及
一干细胞第三萃取步骤，将于该干细胞第二萃取步骤中萃取的第二干细胞及该预定培养液注入一第二培养容器，该第二培养容器具有相比于该第一培养容器较大的容量及较大的底表面积，将该第二培养容器静置一预定时间，使该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，并进行增殖，及当该第二干细胞于该第二培养容器的底表面扩张一平面形状，使该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积达一第二目标比时，自该第二培养容器萃取该第二干细胞。
2.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，该干细胞培养方法包括：
一变形第一观察步骤，将该骨髓抽吸抹片萃取步骤中萃取的第二骨髓抽吸抹片及该培养液注入该第一培养容器，接着，将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察于该第一培养容器中的第一干细胞自一起始平面形状的变形状态（deformation）；及
一总表面积第一观察步骤，当该变形第一观察步骤的观察结果为该第一干细胞自该起始平面形状变形为一预定平面形状，即判断该第一干细胞已固定于该第一培养容器的底表面，以将该培养液自该第一培养容器中取出，并将一新的培养液注入该第一培养容器中，及将该第一培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第一培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察固定于该第一培养容器的底表面的第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底面积，当该总表面第一观察步骤的观察结果为该第一干细胞进行增殖使该第一干细胞的平面形状扩张，且该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积达该第一目标比时，于该干细胞第一萃取步骤中，自该第一培养容器萃取该第一干细胞。
3.如权利要求2所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，该干细胞培养方法包括：
一变形第二观察步骤，将该干细胞第二萃取步骤中萃取的第二干细胞及该培养液注入该第二培养容器，接着，将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察于该第二培养容器中的第二干细胞自一起始平面形状的变形状态；及
一总表面积第二观察步骤，当该变形第二观察步骤的观察结果为该第二干细胞自该起始平面形状变形为一预定平面形状，即判断该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面，以将该培养液自该第二培养容器中取出，并将一新的培养液注入该第二培养容器中，及将该第二培养容器以一预定角度倾斜的状态，静置该第二培养容器一预定时间，于该预定时间的期间，每隔一预定时间的间隔，观察固定于该第二培养容器的底表面的第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积，当该总表面积第二观察步骤的观察结果为该第二干细胞进行增殖使该第二干细胞的平面形状扩张，且该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积达该第二目标比时，于该干细胞第三萃取步骤中，自该第二培养容器萃取该第二干细胞。
4.如权利要求1～3中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，于该骨髓抽吸抹片分离步骤中，自该捐赠者收集2～3毫升的该第一骨髓抽吸抹片，将该2～3毫升的第一骨髓抽吸抹片注入沿一垂直方向延伸的一分离容器，于与体温大致相同的温度下静置该分离容器一预定时间，以使该第一骨髓抽吸抹片于该分离容器中呈一垂直方向分离为多层，且于该骨髓抽吸抹片萃取步骤中，自于该分离容器中分离为多层的第一骨髓抽吸抹片中的一中间层萃取该第二骨髓抽吸抹片。
5.如权利要求2～4中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，该第一培养容器的容量约为20～30毫升，该第一干细胞的起始平面形状略呈圆形，该第一干细胞于变形后的平面形状为大体上以该圆形作为核心朝一方向不规则地延伸的扁形（flat shape），且于该变形第一观察步骤中，将该第一培养容器于与体温大致相同的温度下静置12～24小时，且于第12～24小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第一培养容器中的该第一干细胞自一起始平面形状变形的状态，当该第一干细胞变形为一不规则扁形，即判断该第一干细胞固定于该第一培养容器的底表面。
6.如权利要求1～5中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，于该总表面积第一观察步骤中，将该第一培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第一培养容器的底表面的第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积。
7.如权利要求1～6中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，该第一干细胞的总表面积相对于该第一培养容器的底表面积的第一目标比为70～80%。
8.如权利要求1～7中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，于该干细胞离心步骤中，将该第一干细胞注入该分离容器，该分离容器位于一离心机上，以离心该第一干细胞，且于该干细胞第二萃取步骤中，该第一干细胞于该分离容器中被离心分离为多层，接着萃取位于最底层的第二干细胞。
9.如权利要求3～8中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，该第二培养容器的容量约为40～60毫升，该第二干细胞的起始平面形状略呈圆形，该第二干细胞于变形后的平面形状为大体上以该圆形作为核心朝一方向不规则地延伸的扁形，且于该变形第二观察步骤中，将该第二培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察该第二培养容器中的第二干细胞自一起始平面形状变形的状态，当该第二干细胞变形为一不规则扁形，即判断该第二干细胞固定于该第二培养容器的底表面。
10.如权利要求1～9中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，于该总表面积第二观察步骤中，将该第二培养容器于与体温大致相同的温度下静置36～48小时，且于第36～48小时内，以每隔约1～2小时的间隔观察固定于该第二培养容器的底表面的第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积。
11.如权利要求1～10中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，该第二干细胞的总表面积相对于该第二培养容器的底表面积的第二目标比为88～92%。
12.如权利要求1～11中任一项所述的干细胞培养方法，其特征在于，其中，该第一干细胞及该第二干细胞为间充质干细胞（mesenchymal stem cells）。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2751239C2 (ru) * 2016-03-10 2021-07-12 Кинтароселлспауэр Ко., Лтд. Способ изготовления жидкого культурального продукта

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1699557A (zh) * 2005-05-26 2005-11-23 南开大学 一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法
CN102140440A (zh) * 2011-04-27 2011-08-03 中国农业大学 用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法
US20110195497A1 (en) * 2003-08-06 2011-08-11 Claudia Lange Method for purifying mesenchymal stem cells
CN102791276A (zh) * 2010-03-10 2012-11-21 智再如股份有限公司 含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法
CN103436491A (zh) * 2013-09-05 2013-12-11 东南大学 一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法
CN104152409A (zh) * 2014-08-18 2014-11-19 云南农业大学 同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003513648A (ja) * 1999-10-29 2003-04-15 フイラデルフイア・ヘルス・アンド・エデユケーシヨン・コーポレーシヨン ヒト骨髄ストローマ細胞の単離および拡張
JP4542409B2 (ja) * 2004-10-14 2010-09-15 オリンパス株式会社 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法
RU2502999C1 (ru) * 2012-07-25 2013-12-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи
JP6452695B2 (ja) * 2013-08-06 2019-01-16 リジェネックス， エルエルシー 骨髄脂肪部分単離のデバイスおよび方法
JP2015084686A (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 オリンパス株式会社 細胞培養用ジグおよび自動培地交換システム
JP6628253B2 (ja) * 2014-02-11 2020-01-08 ブレインストーム セル セラペウティクス リミテッド 細胞の適性を判定する方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110195497A1 (en) * 2003-08-06 2011-08-11 Claudia Lange Method for purifying mesenchymal stem cells
CN1699557A (zh) * 2005-05-26 2005-11-23 南开大学 一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法
CN102791276A (zh) * 2010-03-10 2012-11-21 智再如股份有限公司 含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法
CN102140440A (zh) * 2011-04-27 2011-08-03 中国农业大学 用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法
CN103436491A (zh) * 2013-09-05 2013-12-11 东南大学 一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法
CN104152409A (zh) * 2014-08-18 2014-11-19 云南农业大学 同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLAUDIA LANGE ET AL.: "High-Potential Human Mesenchymal Stem Cells", 《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》 *
GIULIA GRISENDI ET AL.: "GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion", 《CYTOTHERAPY》 *
KAREN BIEBACK ET AL.: "Clinical Protocols for the Isolation and Expansion of Mesenchymal Stromal Cells", 《TRANSFUS MED HEMOTHER》 *
PENFORNIS ET AL.: "Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem Cells/Multipotential Stromal Cells from Human Bone Marrow", 《MESENCHYMAL STEM CELL ASSAYS AND APPLICATIONS》 *
吴明明等: "体外构建气管黏膜上皮组织的研究 ", 《第四军医大学学报》 *
洪智敏等: "鸡胚小肠上皮细胞的分离及原代培养研究 ", 《江西农业大学学报》 *
王世雄，胡琴，李一峰，曹英，黄荣魁: "羊水细胞培养诊断染色体病 ", 《上海第二医科大学学报》 *
秦宏敏等: "骨髓间充质干细胞实验室分离的方法 ", 《中国临床康复》 *
財団法人福岡県産業等: "自己組織由来幹細胞デリバリーシステム を応用した運動器再生医療の開発", 《研究成果報告書》 *

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