CN113349160B - 一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的建立方法。本发明的检测技术平台的建立，包括鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型和小鼠PDX模型的建立，模型肿瘤样本的多组学分析，基于模型的肿瘤药物药敏实验，以及肿瘤药物药敏分析等四部分。本发明四个部分的关键技术方法及思路具体为：受精鹅蛋胚的孵育；肿瘤组织的制备，人源肿瘤微组织块种植于鹅胚绒毛膜尿囊膜表面；模型肿瘤微组织块种植于小鼠皮下；肿瘤药物滴加或注射；观察肿瘤组织大小、终止观察后行多组学分析肿瘤药物敏感性；最后综合分析出肿瘤患者的个体精准治疗方案。本发明通过联合两个PDX模型，可有效及全面筛选出患者个体化肿瘤药物治疗方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的建立方法。
背景技术
随着检测手段的更新，我国恶性肿瘤患者被检出数逐年升高。我国每年新发恶性肿瘤病例高达450万，每年因为恶性肿瘤致死患者高达300万。肿瘤诊治方式发展日新月异，给予患者和医生的选择也琳琅满目，但如何筛选适合个体的精准治疗方案，一直是我国医学界的研究和工作重点。
传统的抗肿瘤药效研究都是基于细胞为载体进行研究，但是由于细胞系长期体外传代导致生物学特征、基因谱表达水平、肿瘤异质性发生改变，药效评价结果与临床相似度不到5%。PDX模型则能很好保留上述特征，药效评价结果与临床相似度高达87%以上，因此越来越受重视。目前PDX模型载体多建立于免疫缺陷鼠及鸡胚绒毛尿囊系统，但是其缺点分别是小鼠构建周期长，价格昂贵；鸡胚绒毛尿囊系统观察周期过短，仅有一周观察时间，且对于需要通过肝代谢药物无法筛选。鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX联合小鼠PDX辅助筛选癌症患者术后肿瘤药物的检测技术平台可完美弥补两者的缺点，鹅胚绒毛膜尿囊膜系统可观察时间为14-16天，构建成本低，成功率高，可更好地评价及筛选药物。同时通过鹅胚绒毛膜尿囊膜系统培养的肿瘤，由于肿瘤纯度的提升，可有效缩短小鼠PDX构建的周期。
未来可通过鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX联合小鼠PDX辅助筛选癌症患者术后肿瘤药物的检测技术平台为肿瘤患者筛选出个体化的治疗方案，有可能为患者的精准治疗提供依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的建立方法。
本发明基于鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX联合小鼠PDX辅助筛选癌症患者术后肿瘤药物的检测技术平台对各类实体肿瘤及胸、腹水中游离肿瘤细胞筛选最为适宜的肿瘤药物，进而达到个体精确治疗的临床目标。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的建立方法，所述建立方法为构建鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型和小鼠PDX模型，并利用鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型联合小鼠PDX模型辅助进行抗肿瘤药物的筛选。
作为本发明所述建立方法的优选实施方式，所述建立方法包括以下步骤：
S1：鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型和小鼠PDX模型的建立；
S2：模型肿瘤样本的多组学分析；
S3：基于模型的肿瘤药物药敏实验，以及肿瘤药物药敏分析。
作为本发明所述建立方法的优选实施方式，所述建立方法具体包括以下步骤：
（1）组装和平衡孵化器，保持37.8℃和60-70%的湿度，注意使用无菌水以减少污染的可能；
（2）收到种蛋后，用纸巾或干布将表面擦干净，如表面粘连可用稍湿的布擦拭干净，并立即擦干，然后小头朝下静置12-24h；
（3）鹅蛋孵育；
（4）鹅胚绒毛膜尿囊开窗；
（5）接种肿瘤；
（6）观察肿瘤：将完成步骤（5）的种蛋置于培养箱中继续培养，每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况，完成模型构建；
（7）肿瘤药物筛选：建模7天后，根据基因测序分析肿瘤用药及常规化疗药物进行筛选，将药物滴加或血管注射至模型，每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况；
（8）若前期肿瘤药物分析为需经肝代谢药物，则需进一步构建小鼠PDX模型；
（9）根据鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型及小鼠PDX模型，分析肿瘤药物敏感性，得出药物治疗效果，对数据综合分析，指导患者个体精准治疗。
作为本发明所述建立方法的优选实施方式，步骤（3）中所述鹅蛋孵育具体为：种蛋置于孵化器内孵化，孵化当天为0日龄，在蛋面记录日期，使用37.8℃恒温，湿度设置为1-7天60-65%；第一次照蛋在孵化的第7天，内有蜘蛛血丝即为受精蛋，可继续进一步实验。
作为本发明所述建立方法的优选实施方式，步骤（4）中所述开窗为第7-10天，因为第10天开始胚胎的免疫细胞开始产生。
作为本发明所述建立方法的优选实施方式，步骤（4）中所述开窗具体为：
S41：将生物安全柜用70%的乙醇消毒；
S42：将7日龄的种蛋置于蛋架上转移到已用70%乙醇消毒的生物安全柜里，照蛋，去除未受精蛋或坏蛋，其余的定位及标记气囊中心和静脉系统，用钻孔器在气囊中心和静脉系统中心开孔，注意保留内层的白膜，然后用18G针轻柔刺破白膜，不需要去除膜片；若孔中有血或白蛋白溢出，则种蛋需要丢弃；
S43：吸机辅助下将气囊从侧方移至静脉的上方，标记新气囊的边缘，用胶带封好，放回孵育箱；
S44：取出种蛋，用切割器和弯剪打开一个1.5cm×1.5cm的圆窗；确认胚胎的活力：活的胚胎将显示广泛的脉管系统，清楚的白蛋白，胚胎运动，或可见的心跳；
S45：用镊子夹持棉花轻擦去鹅胚绒毛膜尿囊膜表面的蛋壳，将浸泡过0.01%多聚赖氨酸的无菌硅胶圈放于鹅胚绒毛膜尿囊膜上，用无菌玻璃棒在圈内轻轻研磨数下。
作为本发明所述建立方法的优选实施方式，步骤（5）中所述接种肿瘤具体为：去除临床肿瘤样本的坏死组织、脂肪和纤维组织，然后切成1-2mm的薄片，放在活检组织培养基中浸洗，取出；将肿瘤组织样本置于所述硅胶圈中央，并加入20-50ul细胞外基质，用透明薄膜敷料密封，放回培养箱，湿度调整为50-55%。
作为本发明所述建立方法的优选实施方式，步骤（8）中所述小鼠PDX模型的构建方法具体为：选择高度免疫缺陷小鼠，麻醉后将小鼠俯卧位固定，碘伏消毒接种区域皮肤；通过解剖显微镜，使用显微眼科剪将接种区域皮肤切开，用50ul微量进样针吸取微小组织块混悬液或者，缓慢注射如接种区域；每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况；建模两周后，进行药物筛选，根据药物动力学，选择注射或灌胃等给药方式；每隔24h拍照，记录肿瘤生长情况。
本发明同时提供一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台，所述检测技术平台为利用所述建立方法构建得到。
本发明还提供所述筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的用途，用于筛选癌症患者术后抗肿瘤药物。
本发明的有益效果：
（1）本发明包涵了四个部分的关键技术方法及思路，具体包括以下步骤：受精鹅蛋的孵育；肿瘤组织的制备，人源肿瘤微组织块种植于鹅胚绒毛膜尿囊膜表面；模型肿瘤微组织块种植于小鼠皮下；肿瘤药物滴加或注射；观察肿瘤组织大小、终止观察后行多组学分析肿瘤药物敏感性；最后综合分析出肿瘤患者的个体精准治疗方案。
（2）现有肿瘤患者的术后化疗和靶向药治疗存在着很多随机性与盲目性。本发明可以筛选出最为合适患者的肿瘤药物，有利于提高肿瘤患者的治愈率和生存率，并且可减轻患者治疗过程中的副作用和经济负担。同时本发明对医学科研事业有极大的推进作用，可有效减低新药研发的成本和时间。
附图说明
图1：本发明鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX联合小鼠PDX辅助筛选癌症患者术后肿瘤药物的检测技术平台构建的操作流程图；
图2：鹅胚绒毛膜尿囊膜系统发育图；
图3：鹅胚孵育以及肿瘤的接种；
图4：小鼠PDX模型的构建；
图5：肿瘤药物的滴加及注射示意图；
图6：移植瘤与原始肿瘤组织学上的对比；
图7：移植瘤与原始肿瘤基因学上的对比。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1
1.1组装和平衡孵化器
将孵化器温度调至37.8℃，湿度调至60-70%，并使用无菌水。
1.2 鹅蛋孵化前准备
收到种蛋后，用纸巾或干布将表面擦干净，如表面粘连可用稍湿的布擦拭干净，并立即擦干（用<43.3℃的液体湿壳，会污染种蛋；若要清洗或消毒种蛋，液体温度应为43.3-48.9℃，过高的温度会煮熟种蛋），然后小头朝下静置12-24h。
1.3孵化相关
种蛋（孵化当天为0日龄，在蛋面记录日期）置于孵化器内孵化，使用37.8℃恒温，湿度设置为1-7天60-65%；第一次照蛋在孵化的第7天，内有蜘蛛血丝即为受精蛋，可继续进一步实验。
1.4鹅胚绒毛膜尿囊开窗
将生物安全柜用70%的乙醇消毒，准备物品：蛋架、照蛋器、marker笔、钻孔器、圆形切割轮、18 G针、吸机、包装胶带、直剪、弯剪、血管钳、棉球、6×7cm的透明薄膜敷料、硅胶圈、玻璃搅拌棒，全程应尽可能使用无菌、一次性或高压灭菌的工具。将7日龄的种蛋置于蛋架上转移到已用70%乙醇消毒的生物安全柜里，照蛋，去除未受精蛋或坏蛋（理想胚胎在中心区域有一个大的血管，并且小的血管从这里分叉），其余的定位及标记气囊中心和静脉系统，用钻孔器在气囊中心和静脉系统中心开孔，注意保留内层的白膜，然后用18G针轻柔刺破白膜（不需要去除膜片；若孔中有血或白蛋白溢出，则种蛋需要丢弃）。吸机辅助下将气囊从侧方移至静脉的上方，标记新气囊的边缘，用胶带封好，放回孵育箱。取出种蛋，用切割器和弯剪打开一个1.5cm×1.5cm的圆窗（如果破膜上有血，则不适合植入；若大部分未能完全打开，可以等待一天后，让鹅胚绒毛膜尿囊膜发育良好后再开窗）。确认胚胎的活力：活的胚胎将显示广泛的脉管系统，清楚的白蛋白，胚胎运动，或可见的心跳。用镊子夹持棉花轻擦去鹅胚绒毛膜尿囊膜表面的蛋壳，将浸泡过0.01%多聚赖氨酸的无菌硅胶圈放于鹅胚绒毛膜尿囊膜上（血管丛的分叉点），用无菌玻璃棒在圈内轻轻研磨数下。
1.5 接种肿瘤
去除肺鳞癌样本的坏死组织、脂肪和纤维组织，然后切成1-2mm的薄片，放在活检组织培养基中浸洗，取出；将肿瘤组织样本置于硅胶圈中央，并加入20-50ul细胞外基质，用透明薄膜敷料密封，放回培养箱，湿度调整为50-55%。
1.6 观察肿瘤
将完成步骤1.5的种蛋置于培养箱中继续培养，每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况，完成模型构建。
1.7 肿瘤药物筛选
建模7天后，根据基因测序分析肿瘤用药（环磷酰胺）及常规化疗药物（吉西他滨和紫杉醇）进行筛选，将药物滴加或血管注射至模型，每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况。由于环磷酰胺为需经肝代谢药物，则需进一步构建小鼠PDX模型。
1.8小鼠PDX模型构建及药物筛选
在SPF级动物房，选择高度免疫缺陷小鼠，麻醉后将小鼠俯卧位固定，碘伏消毒接种区域皮肤。通过解剖显微镜，使用显微眼科剪将接种区域皮肤切开，用50ul微量进样针吸取微小组织块混悬液或者，缓慢注射如接种区域；每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况。建模两周后，进行药物筛选，根据药物动力学，选择注射或灌胃等给药方式。每隔24h拍照，记录肿瘤生长情况。
1.9 分析统计数据，得出适宜治疗方案
根据鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型及小鼠PDX模型，分析肿瘤药物敏感性，得出药物治疗效果，对数据综合分析，指导患者个体精准治疗。
本发明提供了一个有关环磷酰胺、吉西他滨和紫杉醇在肺鳞癌药物筛选的操作范例，其核心通过将鹅胚成功孵化，接种新鲜肿瘤组织至鹅胚和小鼠，然后进行药物筛选实验并科学观察统计。操作时长根据具体情况为14-40天，根据基因测序分析肿瘤用药及常规化疗药物进行筛选，得出药物治疗效果，对数据综合分析，指导患者个体精准治疗。
随着人口老龄化的加速及自然环境和社会环境的改变，我国恶性肿瘤呈高发态势。但其治疗一直不太理想，患者在忍受巨大副作用的同时，并没有得到肿瘤的有效缓解。并且，肿瘤由于基因的差异，其多态性被广大医务工作者接受。也就是说，没有完全相同的两个肿瘤，同一个肿瘤，在不同的时期，也会有各种各样的差异。每位患者都应该得到适时个体化精准治疗。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的建立方法，其特征在于，所述建立方法为构建鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型和小鼠PDX模型，并利用鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型联合小鼠PDX模型辅助进行抗肿瘤药物的筛选；
所述建立方法包括以下步骤：
S1：鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型和小鼠PDX模型的建立；
S2：模型肿瘤样本的多组学分析；
S3：基于模型的肿瘤药物药敏实验，以及肿瘤药物药敏分析；
所述建立方法具体包括以下步骤：
（1）组装和平衡孵化器，保持37.8℃和60-70%的湿度，注意使用无菌水以减少污染的可能；
（2）收到种蛋后，用纸巾或干布将表面擦干净，如表面粘连可用稍湿的布擦拭干净，并立即擦干，然后小头朝下静置12-24h；
（3）鹅蛋孵育；
（4）鹅胚绒毛膜尿囊开窗；
（5）接种肿瘤；
（6）观察肿瘤：将完成步骤（5）的种蛋置于培养箱中继续培养，每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况，完成模型构建；
（7）肿瘤药物筛选：建模7天后，根据基因测序分析肿瘤用药及常规化疗药物进行筛选，将药物滴加或血管注射至模型，每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况；
（8）若前期肿瘤药物分析为需经肝代谢药物，则需进一步构建小鼠PDX模型；
（9）根据鹅胚绒毛膜尿囊膜PDX模型及小鼠PDX模型，分析肿瘤药物敏感性，得出药物治疗效果，对数据综合分析，指导患者个体精准治疗。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤（3）中所述鹅蛋孵育具体为：种蛋置于孵化器内孵化，孵化当天为0日龄，在蛋面记录日期，使用37.8℃恒温，湿度设置为1-7天60-65%；第一次照蛋在孵化的第7天，内有蜘蛛血丝即为受精蛋，可继续进一步实验。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤（4）中所述开窗为第7-10天，因为第10天胚胎的免疫细胞开始产生。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤（4）中所述开窗具体为：
S41：将生物安全柜用70%的乙醇消毒；
S42：将7日龄的种蛋置于蛋架上转移到已用70%乙醇消毒的生物安全柜里，照蛋，去除未受精蛋或坏蛋，其余的定位及标记气囊中心和静脉系统，用钻孔器在气囊中心和静脉系统中心开孔，注意保留内层的白膜，然后用18G针轻柔刺破白膜，不需要去除膜片；若孔中有血或白蛋白溢出，则种蛋需要丢弃；
S43：吸机辅助下将气囊从侧方移至静脉的上方，标记新气囊的边缘，用胶带封好，放回孵育箱；
S44：取出种蛋，用切割器和弯剪打开一个1.5cm×1.5cm的圆窗；确认胚胎的活力：活的胚胎将显示广泛的脉管系统，清楚的白蛋白，胚胎运动，或可见的心跳；
S45：用镊子夹持棉花轻擦去鹅胚绒毛膜尿囊膜表面的蛋壳，将浸泡过0.01%多聚赖氨酸的无菌硅胶圈放于鹅胚绒毛膜尿囊膜上，用无菌玻璃棒在圈内轻轻研磨数下。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于：步骤（5）中所述接种肿瘤具体为：去除临床肿瘤样本的坏死组织、脂肪和纤维组织，然后切成1-2mm的薄片，放在活检组织培养基中浸洗，取出；将肿瘤组织样本置于所述无菌硅胶圈中央，并加入20-50ul细胞外基质，用透明薄膜敷料密封，放回培养箱，湿度调整为50-55%。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤（8）中所述小鼠PDX模型的构建方法具体为：选择高度免疫缺陷小鼠，麻醉后将小鼠俯卧位固定，碘伏消毒接种区域皮肤；通过解剖显微镜，使用显微眼科剪将接种区域皮肤切开，用50ul微量进样针吸取微小组织块混悬液，缓慢注射到接种区域；每隔24h镜检拍照，记录肿瘤生长情况；建模两周后，进行药物筛选，根据药物动力学，选择注射或灌胃给药方式；每隔24h拍照，记录肿瘤生长情况。
7.一种筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台，其特征在于，所述检测技术平台为利用权利要求1~6任一所述建立方法构建得到。
8.权利要求7所述筛选癌症患者术后抗肿瘤药物的检测技术平台的用途，其特征在于，用于筛选癌症患者术后抗肿瘤药物。
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