JP6345826B2 - 培養生成液製造方法 - Google Patents
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Description
11 コンピュータ
12 バーコードリーダ
13 電子顕微鏡
14 キーボード
15 マウス
16 ディスプレイ
17 第1コード用紙
18 原料骨髄液
19 ガラス試験管
20 試験管立て
21 恒温槽
22 中間層骨髄液
23 培養液
24 第1培養容器(第1扁平培養容器)
25 第2培養容器(第2扁平培養容器)
26 第1間葉系幹細胞(第1幹細胞)
27 底面
28 遠心分離器
29 ガラス試験管
30 第2間葉系幹細胞(第2幹細胞)
31 培養生成液
32 保存容器
33 保存容器
34 冷蔵庫
35 第3培養容器(第3扁平培養容器)
36 試料ホルダ
37 上面
38 底部
39 スペーサー
40 頂部
41 注入口
42 蓋
43 頂部
44 底部
45 注入口
46 蓋
47 頂部
48 底部
49 注入口
50 蓋
Claims (12)
- ドナーから採取した骨髄液から作られる幹細胞を利用して培養生成液を製造する培養生成液製造方法において、
前記培養生成液製造方法が、前記ドナーから採取した骨髄液を層状に分離する骨髄液分離工程と、前記骨髄液分離工程によって層状に分離した骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を抽出する骨髄液抽出工程と、前記骨髄液抽出工程によって抽出した前記中間層骨髄液と所定の培養液とを所定容量かつ所定面積の底面を有する第1培養容器に注入し、前記第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置して前記中間層骨髄液に含まれる第1幹細胞を該第1培養容器の底面に定着させる幹細胞第1定着工程と、前記幹細胞第1定着工程によって前記第1幹細胞を前記第1培養容器の底面に定着させた後、前記第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第1培養容器に注入し、前記第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置して該第1培養容器の底面面積に対する前記第1幹細胞の総平面面積が第1目標割合に達するまで該第1幹細胞を培養する幹細胞第1培養工程と、前記幹細胞第1培養工程における前記第1幹細胞の培養過程において、前記第1幹細胞の総平面面積が前記第1目標割合に達した場合、前記第1培養容器から前記第1幹細胞を採取する幹細胞第1採取工程と、前記幹細胞第1採取工程によって採取した前記第1幹細胞を層状に遠心分離する幹細胞分離工程と、前記幹細胞分離工程によって層状に分離した前記第1幹細胞のうちの最下層に位置する第2幹細胞を採取する幹細胞第2採取工程と、前記幹細胞第2採取工程によって採取した前記第2幹細胞と所定の培養液とを前記第1培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の底面を有する第2培養容器に注入し、前記第2培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置して前記第2幹細胞を該第2培養容器の底面に定着させる幹細胞第2定着工程と、前記幹細胞第2定着工程によって前記第2幹細胞を前記第2培養容器の底面に定着させた後、前記第2培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第2培養容器に注入し、前記第2培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置して該第2培養容器の底面面積に対する前記第2幹細胞の総平面面積が第2目標割合に達するまで該第2幹細胞を培養する幹細胞第2培養工程と、前記幹細胞第2培養工程における培養過程において、前記第2幹細胞の総平面面積が前記第2目標割合に達した場合、増殖した単一種の前記第2幹細胞から分泌された所定の代謝物質を含む前記培養生成液を前記第2培養容器から抽出する培養生成液第1抽出工程とを有することを特徴とする培養生成液製造方法。 - 前記培養生成液製造方法が、前記培養生成液第1抽出工程によって前記第2培養容器内から培養生成液を抽出した後、前記第2培養容器から前記第2幹細胞を採取する幹細胞第2採取工程と、所定容量かつ所定面積の底面を有して前記第2培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の底面を有する第3培養容器に前記幹細胞第2採取工程によって採取した前記第2幹細胞とあらたな培養液とを注入し、前記第3培養容器を所定時間静的に放置して前記第2幹細胞を該第3培養容器の底面に定着させる幹細胞第3定着工程と、前記幹細胞第3定着工程によって前記第2幹細胞を前記第3培養容器の底面に定着させた後、前記第3培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第3培養容器に注入し、前記第3培養容器を所定時間静的に放置して該第3培養容器の底面面積に対する前記第2幹細胞の総平面面積が第3目標割合に達するまで該第2幹細胞を培養する幹細胞第3培養工程と、前記幹細胞第3培養工程における培養過程において、前記第2幹細胞の総平面面積が前記第3目標割合に達した場合、増殖した単一種の前記第2幹細胞から分泌された所定の代謝物質を含む前記培養生成液を前記第3培養容器から抽出する培養生成液第2抽出工程とを含む請求項1に記載の培養生成液製造方法。
- 前記幹細胞第3定着工程および前記幹細胞第3培養工程では、前記第3培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置する請求項2に記載の培養生成液製造方法。
- 前記骨髄液分離工程が、前記ドナーから2〜3ccの骨髄液を採取し、前記2〜3ccの骨髄液を上下方向へ延びる分離容器に注入し、前記分離容器を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して該骨髄液を該分離容器内において上下方向へ層状に分離させ、前記骨髄液抽出工程が、前記分離容器内において層状に分離した前記骨髄液のうちの中間層に位置する前記中間層骨髄液を抽出する請求項1ないし請求項3いずれかに記載の培養生成液製造方法。
- 前記第1培養容器の容量が、約20〜30ccであり、前記第1幹細胞の初期平面形状が、略円形であり、前記第1幹細胞の変形後の平面形状が、前記略円形を核として該第1幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、前記幹細胞第1定着工程では、前記第1培養容器を体温と略同一の温度で12〜24時間静的に放置しつつ、前記12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で前記第1培養容器内の第1幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、前記第1幹細胞が初期平面形状から前記不定形の扁平形状に変形した場合、該第1幹細胞が前記第1培養容器の底面に定着したと判断する請求項1ないし請求項4いずれかに記載の培養生成液製造方法。
- 前記幹細胞第1採取工程では、前記第1培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、前記36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で前記第1培養容器の底面に定着した前記第1幹細胞の該第1培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する請求項1ないし請求項5いずれかに記載の培養生成液製造方法。
- 前記第1培養容器の底面面積に対する前記第1幹細胞の総平面面積の第1目標割合が、70〜80%である請求項6に記載の培養生成液製造方法。
- 前記幹細胞分離工程が、前記第1幹細胞を分離容器に注入し、前記分離容器を遠心分離器に設置して該第1幹細胞を遠心分離させ、前記幹細胞第1採取工程が、前記分離容器内において層状に遠心分離した前記第1幹細胞のうちの最下層に位置する前記第2幹細胞を採取する請求項1ないし請求項7いずれかに記載の培養生成液製造方法。
- 前記第2培養容器の容量が、約40〜60ccであり、前記第3培養容器の容量が、約70〜80ccであり、前記第2幹細胞の初期平面形状が、略円形であり、前記第2幹細胞の変形後の平面形状が、前記略円形を核として該第2幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、前記幹細胞第2定着工程および前記幹細胞第3定着工程では、前記第2培養容器および前記第3培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、前記36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で前記第2および第3培養容器内の第2幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、前記第2幹細胞が初期平面形状から前記不定形の扁平形状に変形した場合、該第2幹細胞が前記第2および第3培養容器の底面に定着したと判断する請求項2ないし請求項8いずれかに記載の培養生成液製造方法。
- 前記幹細胞第2採取工程および前記幹細胞第3採取工程では、前記第2培養容器および前記第3培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、前記36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で前記第2および第3培養容器の底面に定着した前記第2幹細胞の該第2および第3培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する請求項2ないし請求項9いずれかに記載の培養生成液製造方法。
- 前記第2培養容器の底面面積に対する前記第2幹細胞の総平面面積の第2目標割合が、88〜92%であり、前記第3培養容器の底面面積に対する前記第2幹細胞の総平面面積の第3目標割合が、88〜92%である請求項2ないし請求項10いずれかに記載の培養生成液製造方法。
- 前記第1および第2幹細胞が、間葉系幹細胞である請求項1ないし請求項11いずれかに記載の培養生成液製造方法。
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