JP2023167506A - 生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法 - Google Patents

生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023167506A
JP2023167506A JP2022078750A JP2022078750A JP2023167506A JP 2023167506 A JP2023167506 A JP 2023167506A JP 2022078750 A JP2022078750 A JP 2022078750A JP 2022078750 A JP2022078750 A JP 2022078750A JP 2023167506 A JP2023167506 A JP 2023167506A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
extracellular vesicles
rab18
shh
hsp90
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022078750A
Other languages
English (en)
Inventor
庸介 田中
Yosuke Tanaka
碩 王
Shuo Wang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to JP2022078750A priority Critical patent/JP2023167506A/ja
Priority to PCT/JP2023/017656 priority patent/WO2023219119A1/ja
Publication of JP2023167506A publication Critical patent/JP2023167506A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

【課題】本発明は、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog；Shh）などの生理活性物質を含有する細胞外小胞を効率的に生産する方法の提供を課題とする。【解決手段】本発明は、細胞外小胞を生産する方法であって、Rab18等のRab GTPaseを不活性化する処理を行った細胞から分泌される細胞外小胞を取得することを含む方法を解決手段とし、好ましくは当該細胞がShhを発現する細胞である。また、本発明は、Shhを含有し、粒径が800 nm以上および／または体積が109nm3以上である細胞外小胞を解決手段とする。【選択図】なし

Description

本発明は、生理活性物質を含有する細胞外小胞を効率的に生産する方法に関する。
細胞外小胞は、モルフォゲン、脂質およびmiRNAなどの生理活性物質を運搬し、これら生理活性物質を細胞外に放出する。放出された生理活性物質は、受容細胞に作用し、細胞の機能を変化させる。細胞外小胞の構成因子であるHsp90は、細胞外小胞の放出に必須の膜変形（membrane deformation）を介して細胞外小胞の産生と生理活性を促進する。中性スフィンゴミエリナーゼ（Neutral sphingomyelinase；nSMase）は、セラミドを産生し、多胞性エンドソーム（multivesicular bodies；MVBs）からの細胞外小胞の分泌を促進する。
また、細胞外小胞は、創傷治癒、がんの促進および進行、循環器疾患および神経疾患などの疾患の病理過程および治療経過にも関係していることが報告されている。従って、細胞外小胞の生理機能をより深く理解し、疾患の治療的効果を示す細胞外小胞を効率的に産生させる方法を見つけることは、難治性疾患の新たな治療方法を確立する上でも、非常に重要なことである。
ヒト間葉系幹細胞（human mesenchymal stem cells；hMSC）由来の細胞外小胞（hMSC-EV）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）の血管新生を促進する効果を有することが見出されており、心筋梗塞、動脈硬化性閉塞症および手術創からの回復に有用であると考えられている（非特許文献１）。hMSC-EVは、hMSCよりも免疫原性が低いため、hMSC-EVを治療剤として患者に投与することは、hMSCsを直接投与することよりも安全性が高いと考えられる。ただし、hMSCから放出されるhMSC-EVは、予めhMSCに対し、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog；Shh）シグナルパスウェイを増強させるための処理を行わないと、その治療的効果を十分に発揮できない（非特許文献２～非特許文献４）。例えば、CD34+hMSCをShhで前処理すると、心筋梗塞後症候群を含む循環器疾患の改善に効果的なShh含有細胞外小胞（Shh-EV）の分泌が増大することが報告されている（非特許文献５および６）。
ヘッジホッグシグナルパスウェイ（Hedgehog signaling pathway）は、胚の発生や組織の再生において各細胞が正しい位置情報を得るために重要な役割を果たしており、ヘッジホッグタンパク質を中心とするシグナル伝達経路である。このパスウェイを阻害すると、重篤な発達異常等が引き起こされ、致死となる場合もある（非特許文献７）。成体では、異常なヘッジホッグシグナルが、骨芽腫、基底細胞がんおよび横紋筋肉腫などの腫瘍の形成および進行に関与していることが報告されている（非特許文献８および非特許文献９など）。そのため、ヘッジホッグパスウェイを創薬のターゲットとする研究が進んでおり、例えば、アゴニストは、脳梗塞や脳出血などの脳虚血の治療薬（非特許文献１０）としての利用に注目が集まっている。
ヘッジホッグパスウェイの主役であるヘッジホッグタンパク質は、哺乳類ではソニック（Sonic）ヘッジホッグ、インディアン（Indian）ヘッジホッグおよびデザート（Desert）ヘッジホッグの３つのヘッジホッグホモログが同定されている。なかでも、ソニックヘッジホッグに関する研究が最も進んでいる。ソニックヘッジホッグは、例えば、脳の初期発生における神経管の体軸の決定において、モルフォゲンとして機能する。
小分子GTPaseであるRabは、GTPを結合した活性型が様々なエフェクターと結合することで、細胞内の小胞輸送を制御している（非特許文献１１）。Rabには多くのアイソフォームがあり、Rab18はその中の１つで、ゴルジ装置、小胞体および脂肪滴などの他、ART-EVsと称されるShh-EVに含まれていることが報告されている（非特許文献１２；Coulterら, Cell reports 24, 973-986.e978 2018）。しかしながら、Shh-EVにおけるRab18の役割は、よく分かっていない。
Liら, Adv Skin Wound Care 18, 491-500; quiz 501-492 2005 Mackieら, Circ Res 111, 312-321 2012 Hyunら, Sci Rep 5, 14135 2015 Jiaら, Acta neurochirurgica 163, 2297-2306 2021 Salybekovら, International journal of molecular sciences 19, 3040 2018 Fleuryら, Front Immunol 5, 370 2014 Zhangら, Cell 106, 781-792 2001 SekulicおよびVon Hoff, Cell 164, 831 2016 Rimkusら, Cancers 8, 22 2016 Doi:10.3390/cancers8020022 Hadden, ChemMedChem 9, 27-37 2014 Dejgaardら, Cellular and molecular life sciences : CMLS 76, 1935-1945 2019 Coulterら, Cell reports 24, 973-986.e978 2018
上記事情に鑑み、本発明は、生理活性物質を含有する細胞外小胞を効率的に生産する方法の提供を目的とする。より具体的には、本発明は、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog；Shh）を含有する細胞外小胞を効率的に生産する方法、およびShhを多く含有することを特徴とする新規な細胞外小胞の提供を目的とする。
本発明者らは、間葉系幹細胞内のRab18を不活性化する処理を行ったところ、培養液に放出された細胞外小胞分画に特異的に生理活性物質であるソニックヘッジホッグの含有量が増加すること、Rab GTPaseを不活性化する処理により、サイズの大きい細胞外小胞（粒径が約800 nm以上、体積が109 nm3以上）の産生量が特異的に増大することを見出した。上記の現象は、間葉系幹細胞以外のソニックヘッジホッグ発現細胞（例えば、ソニックヘッジホッグ発現線維芽細胞）を用いた場合にも認められた。さらに、Rab18の不活性化処理におり産生量が増大した細胞外小胞は、ソニックヘッジホッグの効果として知られている血管新生を促進することが確認された。
以上の結果から、ソニックヘッジホッグ発現細胞に対して、Rab GTPaseを不活性化する処理を行うと、ソニックヘッジホッグを多く含有する粒径の大きい細胞外小胞の放出が促進されると考えられる。
本発明は以上の知見に基づいて完成された。
すなわち、本発明は以下の（１）～（１５）である。
（１）細胞外小胞を生産する方法であって、Rab、特にRab18を不活性化する処理を行った細胞から分泌される細胞外小胞を取得することを含む方法。
（２）前記細胞が、ソニックヘッジホッグを発現することを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）前記細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（４）前記Rab GTPaseを不活性化する処理が、Rab GTPase阻害剤で処理することである、上記（１）に記載の方法。
（５）前記Rab GTPaseを不活性化する処理が、Rab18-GDP型変異体を前記細胞内へトランスフェクションすることである、上記（１）に記載の方法。
（６）前記細胞外小胞が、ソニックヘッジホッグを含有することを特徴とする上記（１）から（５）までのいずれかに記載の方法。
（７）前記細胞外小胞が、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上であることを特徴とする上記（１）から（５）までのいずれかに記載の方法。
（８）ソニックヘッジホッグを発現する細胞であって、Rab GTPaseを不活性化する処理を行った細胞。
（９）Hsp90遺伝子およびnSMase2遺伝子を発現可能な状態で保持している、上記（８）に記載の細胞。
（１０）ソニックヘッジホッグを含有し、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上である細胞外小胞。
（１１）上記（１０）に記載の細胞外小胞を有効成分として含む医薬または医薬組成物。
（１２）以下の（ａ）および（ｂ１）、（ｂ２）もしくは（ｂ３）の工程を含むRab GTPaseを不活性化する物質のスクリーニング方法。
（ａ）ソニックヘッジホッグを発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ｂ１）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞から分泌される細胞外小胞の粒径および／または体積を測定する工程、
（ｂ２）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞の細胞核周囲にソニックヘッジホッグまたはHsp90の集積の有無を確認する工程、
（ｂ３）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞内のRab18に結合しているKIF5Aの量が減少すること、または、Hsp90もしくは nSMaseの量が増加することを確認する工程。
（１３）前記工程（ｂ１）の細胞外小胞にソニックヘッジホッグが含まれているかどうかを確認する工程（ｃ）をさらに含む、上記（１２）に記載の方法。
（１４）以下の（ｄ）および（ｅ１）もしくは（ｅ２）の工程を含むRab GTPaseを活性化する物質のスクリーニング方法。
（ｄ）ソニックヘッジホッグを発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ｅ１）工程（ｄ）において候補物質と接触させた細胞から分泌される細胞外小胞の粒径および／または体積を測定する工程、
（ｅ２）細胞質におけるソニックヘッジホッグまたはHsp90の発現量が上昇し、かつ、当該ソニックヘッジホッグまたは当該Hsp90が細胞質内に放散して存在することを確認する工程、
（ｅ３）工程（ｄ）において候補物質と接触させた細胞内のRab18に結合しているKIF5Aの量が増加すること、または、Hsp90もしくは nSMaseの量が増加することを確認する工程。
（１５）前記工程（ｅ１）の前記細胞外小胞にソニックヘッジホッグが含まれているかどうかを確認する工程（ｆ）をさらに含む上記（１４）に記載の方法。
本発明により、生理活性物質（例えば、ソニックヘッジホッグ）を多く含有する細胞外小胞を効率的に生産することが可能となる。その結果、様々な疾患の治療剤として有用な細胞外小胞薬剤の製造が容易になる。
Rab GTPase阻害剤であるCID1067700で 処理をしたヒト間葉系幹細胞から分泌された細胞外小胞の分析。Ａは、ヒト間葉系幹細胞の培養上清から細胞外小胞を単離する方法の概要を示す。Ｂは、CID1067700で処理したヒト間葉系幹細胞由来細胞外小胞（hMSC-EV）またはDMSO (CID1067700の溶媒)のみで処理したhMSC-EVについて、抗Shh抗体、抗TSG101抗体または抗Hsp90抗体によるイムノブロッティングを行った結果である。Ｃは、Ｂのイムノブロッティングの結果を定量した結果である。NS、p ≧0.05; *p < 0.05; Welch’s t test, n = 3. 全ての図において、データは、平均値±標準誤差で示した。 CID1067700で処理をしたヒト間葉系幹細胞から分泌された細胞外小胞による、HUVEC 細胞血管新生活性の促進。ＡおよびＢは、CID1067700処理（Ｂ）またはDMSOのみ処理（Ａ）のヒト間葉系幹細胞から生産されたhMSC-EVによって刺激されたHUVEC細胞をプレーティングしてから90分後の顕微鏡観察像である。スケールバーは100μmを示す。Ｃ～Ｅは、血管新生のレベルを、形成された管の数、分岐点数または管の長さを指標にして定量した結果である。*p < 0.05、Welch’s t test、n = 5。 CID1067700処理によって分泌されるhMSC-EVに関する、ナノ粒子トラッキング解析。ヒト間葉系幹細胞の培養上清1 mLあたりに存在する細胞外小胞の体積（Ａ、Ｃ、Ｅ）、細胞外小胞の数（Ｂ、Ｄ、Ｆ）をナノ粒子トラッキングで解析した結果である。Ａ、ＢおよびＥ、Ｆ中の丸（●）はDMSOのみ処理のヒト間葉系幹細胞の培養上清を用いた結果で、Ｃ、ＤおよびＥ、Ｆ中の四角（■）はCID1067700処理のヒト間葉系幹細胞の培養上清を用いた結果である。***p < 0.001；Welch’s t test。データは、3回の独立した実験から得たものである。CID1067700処理により、粒径が800 nmより大きな細胞外小胞の数が顕著に増加した。ナノ粒子トラッキング解析の結果を統計処理することにより、細胞外小胞の総数（Ｇ）、100～800 nmの細胞外小胞の数（Ｈ）および>800 nmの細胞外小胞の数（Ｉ）を算出した結果である。NS, p ≧ 0.05；*p < 0.05；Welch’s t test、n = 4。 CID1067700処理によって分泌が増加する細胞外小胞の解析。ＡおよびＢは、CID1067700処理（Ｂ）またはDMSOのみ処理（Ａ）により得られたhMSC-EVペレットの透過電子顕微鏡（TEM）観察像を示す。スケールバーは1μmを示す。矢印は電子密度の低い細胞外小胞を示す。ＣおよびＤは、TEMで観察されたhMSC-EVの直径を統計処理した結果を示す。ＣおよびＤは、直径が100 nmより大きいhMSC-EVの数のヒストグラム（Ｃ）と散布図（Ｄ）を示す。***p < 0.001；Welch’s t-test、n = 100。 CID1067700によるShh-EV生産の促進に対する、nSMaseおよびHsp90の関与。Ａ～Ｉは、ShhN-EGFPを形質導入したNIH3T3細胞をCID1067700（40μMで24時間）で処理し、蛍光顕微鏡で取得したタイムラプス蛍光イメージ（Ａ）、およびCID1067700非存在下（ＢおよびＦ）または存在下（Ｃ－Ｅ、Ｇ－Ｉ）におけるナノ粒子トラッキング解析結果である。ＤおよびＨはnSMase阻害剤であるGW4896存在下（1.25μM、24時間）、ＥおよびＩはHsp90阻害剤であるTAS116存在下（0.5μM、48時間）での解析結果。Ｂ～Ｅは細胞の蛍光イメージあり、Ｆ～Ｉは蛍光イメージ無しである。スケールバーは10μm（Ａ）および50μm（Ｂ－Ｉ）を示す。ShhN-EGFPの形質導入効率はほぼ100%であった。Ｊは、0.025 mm2の視野内でランダムな動きをするShh-EVの数を定量した結果である。***p < 0.001；One-way ANOVA、n = 5。 セラミドの生産量に対するCID1067700の影響の検討。Ａ～Ｃは、細胞をDMSOのみ（Ａ）、CID1067700（40μM）（ＢおよびＣ）、GW4869（2.5μM）で24時間処理した。スケールバーは10μmを示す。Ｄは、細胞質に存在するセラミド由来の蛍光シグナル強度を統計処理により算出した結果を示す。***p < 0.001；One-way ANOVA；n = 10。CID1067700処理によるセラミドの生産量の増加分は、nSMase阻害剤処理によって相殺された。 Rab18、AP-1およびAP-3の細胞内局在の観察。ＡおよびＢは、GDP結合型を模倣するRab18S22N-EGFPとGTP結合型を模倣するRab18Q67L-EGFPをトランスフェクションしたNIH3T3のAP-1（Ａ）またはAP-3（Ｂ）に対する免疫染色の蛍光顕微鏡イメージである。矢頭は、Rab18変異体とAP-1の共局在している状態を示す。矢印は、Rab18S22N-EGFP過剰発現細胞においてAP-3が核周囲に集積している状態を示す。スケールバーは20μmを示す。 ShhおよびHsp90の細胞内における分布とRab18のヌクレオチドの状態の関係。ＡおよびＢは、ヌクレオチド状態の変異体であるEGFP-Rab18S22N（GDP結合型；グリーン)またはEGFP-Rab18Q67LGTP（GTP結合型；グリーン）、およびShh-tagRFP（レッド）またはHsp90-tagRFP（レッド）を二重に形質導入したNIH3T3細胞の蛍光イメージである。スケールバーは10μm。矢印は、細胞核周囲に共局在しているRab18-GDP と Shh- tagRFP（Ａ）または Rab18-GDP とHsp90-tagRFP（Ｂ）を示す。ＣおよびＤは、Rab18変異体とShh-tagRFPが共局在している、または共局在していない細胞の割合（%）（Ｃ）、Rab18変異体とHsp90 -tagRFPが共局在している細胞または共局在していない細胞の割合（%）（Ｄ）を統計処理により算出した結果を示す。***p < 0.001；chi-square test；細胞数n=88-169。ＥおよびＦは、Rab18ポジティブピクセルに対するShh-tagRFP（Ｅ）およびHsp90-tagRFP（Ｆ）の平均蛍光強度を統計処理により算出した結果を示す。Rab18-GDPはShhとHsp90を顕著にリクルートしている。***p < 0.001；Welch’s t-test；n = 10。 マウス脳溶解物をGST-Rab18WT、GST-Rab18 Q67L、GST-Rab18 S22Nによってプルダウンした結果。マウス脳溶解物をGST-tagged Rab18ヌクレオチド変異体によってプルダウンした沈降物に対するイムノブロッティングの結果を示す。3回の実験で同様の結果を得た。Rab18S22N (GDP)は特異的にnSMase2およびHsp90と相互作用するが、Rab18野生型とRab18Q67L (GTP) は特異的にKIF5Aキネシンと相互作用する。 CID1067700処理によって細胞から放出される構造体の解析。Ａ～Ｆは、ShhN-EGFP（グリーン）およびHsp90-TagRFP（レッド）を発現するNIH3T3生細胞をDMSO（ＡおよびＢ）またはCID1067700（40μM）（Ｂ、Ｄ－Ｆ）で24時間処理し、蛍光顕微鏡で観察した蛍光イメージである。ＡおよびＢはx-yイメージ、ＣおよびＤはx-zイメージ、ＥおよびＦは3次元に再構築したイメージである。スケールバーは20μmを示す。矢印はShhおよびHsp90を含む細胞外の領域である。Ｇは、CID1067700処理またはDMSOのみ処理の細胞において、Shh/Hsp90を放出する細胞の割合を統計処理により算出した結果を示す。***p < 0.001；Welch’s t-test。 Rab18GTPaseの不活性化によるShh-EVの放出過程の概念図。細胞外小胞を生産するために、核周囲の多胞体へShh、nSMase2およびHsp90を特異的に取り込むことにより、Shh-EVの生産を制御するRab18 GTPaseサイクルの概念図である。TAS116、GW4869およびCID1067700は、各々、Hsp90、nSMase2およびRab18を阻害する。Rab18S22NおよびRab18Q67L変異体は、各々、GDP結合Rab18 GTPaseとGTP結合型Rab18 GTPaseの活性を模倣する（ミミックする）変異体である。 Rab18のGTPaseサイクルとShh-EV生産との関係。ＡおよびＢは、EGFP-Rab18S22N（Ａ）およびEGFP-Rab18Q67L（Ｂ）をトランスフェクトした、 ShhN-tagRFP形質導入NIH3T3細胞のナノ粒子トラッキングを示す。スケールバーは50 μmを示す。Ｃは、0.025 mm2の視野内でランダムな動きをするShh-EVの数を定量した結果である。***p < 0.001; One-way ANOVA; n = 5。**p < 0.01；Welch’s t test；n = 4。
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
第１の実施形態は、細胞外小胞を生産する方法であって、Rab GTPase、特にRab18を不活性化する処理を行った細胞から分泌される細胞外小胞を取得することを含む方法である。
本実施形態において、Rab GTPaseの不活性化について、Rab18を例に説明を行う。Rab18を不活性化する処理とは、Rab18のGTP結合型（Rab18-GTP）の活性を抑制または阻害する処理のことである。具体的には、細胞内のRab18を、GDP結合状態のRab18にする処理のことで、例えば、CID1067700などのGTPase阻害剤で細胞を処理することで達成できる。また、細胞内のRab18の不活性化は、GDP結合型Rab18を模倣する（mimic）変異体（例えば、Rab18 S22N（22番目のセリンがアスパラギンに置換されたRab18変異体）など）を、細胞内で過剰発現することによっても達成できる。
本実施形態において、細胞外小胞を生産するために使用される好ましい細胞は、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog；Shh、以下「Shh」とも記載する）を発現する細胞である。Shhを発現する細胞としては、例えば、間葉系幹細胞などがある。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell:：MSC）は、体性幹細胞の1種で中胚葉由来の組織（例えば、骨、軟骨、脂肪、血管、心筋細胞など）の他、外胚葉由来の神経細胞やグリア、内胚葉由来の幹細胞などに分化する能力を有する細胞である。ヒト間葉系幹細胞は、例えば、細胞表面マーカーであるCD73およびCD105などが陽性であり、かつ、骨髄系マーカーのCD34、CD14、CD45およびMHCクラスII抗原などが陰性であることによって特徴付けられる。間葉系幹細胞は、骨髄や歯髄、脂肪から採取することができる他、市販されているものを入手することもできる。
さらに、Shhを発現する細胞としては、間葉系幹細胞以外にも、任意の株化細胞にShh発現するベクターを導入し、Shhが発現し得る状態にある細胞であってもよい。例えば、実施例に示すShh発現NIH3T3細胞などを例示することができる。さらに、Shhを発現する細胞として、Shh遺伝子の他、hsp90遺伝子および／またはnSMase2遺伝子を発現する各発現ベクターを導入し、これらの遺伝子の発現を増加させ得る状態にある細胞であってもよい。
Rab GTPase、特にRab18を不活性化する処理を行った細胞から分泌される細胞外小胞分画においては、Shhを含有する細胞外小胞存在比率が高いことが発明者らによって確認された。また、細胞をRab18の不活性化処理を行うと、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上の細胞外小胞が分泌されるようになる。これらの知見から、Shhを発現する細胞を、Rab18の不活性化処理を行うと、Shhを多く含有する粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上の細胞外小胞の分泌が促進されると考えられる。なお、細胞外小胞の粒径および体積は、ナノ粒子トラッキング解析法（Nanoparticle tracking analysis；NTA、Filipeら, Pharmaceutical Research, 27, 796-810 2010）、光散乱法（例えば、動的光散乱（dynamic light scattering：DLS）法）、電子顕微鏡観察法などの方法により測定することができる。ここで、「粒径が800 nm以上」および「体積が109 nm3以上」とは、ナノ粒子トラッキング解析により算定したものである。従って、他の方法で測定した値については、ナノ粒子トラッキング解析法で測定した値を基準にして、換算することが望ましい。
細胞から分泌された細胞外小胞は、当該技術分野において周知の方法によって、単離することができる。例えば、Rab GTPaseの不活性化処理を行った細胞を培養した培地を回収し、回収した培地から細胞および残渣を除去した培養上清を、必要に応じて、限外ろ過等により濃縮した後、例えば、超遠心法、密度勾配遠心法、サイズ排除クロマトグラフィーなどを単独で、または組み合わせて行うことで、所望の細胞外小胞を単離、精製することができる。また、Shhを多く含有する粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上の細胞外小胞は、当該技術分野において周知の方法によって、単離することが可能である。例えば、細胞外小胞画分を分画遠心法、サイズ排除クロマトグラフィー、至適なポアサイズのろ過膜を使用したろ過法、密度勾配遠心法、フローサイトメトリーなどによって分離することができる。さらに、Shhは、細胞外小胞の表面にも存在することが報告されていることから（Tanakaら, Nature 435, 172-177 2005）、これらの方法に、Shhに対する抗体を使用したイムノアフィニティー分離法またはフローサイトメトリーを組み合わせた方法によって、Shhを多く含有する粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3の細胞外小胞を分離することができる。
第２の実施形態は、ソニックヘッジホッグを発現する細胞であって、Rab GTPase、特にRab18を不活性化する処理を行った、前記細胞である。
第２の実施形態における「ソニックヘッジホッグを発現する細胞」および「Rab GTPaseを不活性化する処理」については、第１の実施形態に関する説明の箇所を参照されたい。
第３の実施形態は、ソニックヘッジホッグを含有し、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上の細胞外小胞である。第３の実施形態にかかる細胞外小胞は、例えば、第１の実施形態にかかる方法によって生産することができる。これまでに、Shhを含有し、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上の細胞外小胞の報告はない。また、第１の実施形態にかかる方法によって、生産される細胞外小胞は、血管新生を促進するなどの生理活性を有している。従って、第３の実施形態にかかる細胞外小胞は、医薬または医薬組成物としての利用が可能である。
そこで、第４の実施形態は、ソニックヘッジホッグを含有し、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上の細胞外小胞（すなわち第３の実施形態にかかる細胞外小胞）を有効成分として含む、医薬または医薬組成物である。上述のように、第３の実施形態にかかる細胞外小胞は、血管新生を促進することから、虚血（虚血性心疾患や脳虚血など）、虚血後の再生医療、末梢循環障害などの治療に効果を示すと考えられる。また、Shhを含む細胞外小胞が、脊髄損傷治癒（Jiaら, Regen Ther. 8：309-315. doi: 10.1016/j.reth.2021.08.007. eCollection 2021；Jiaら, Acta Neurochir (Wien) . 163：2297-2306 doi: 10.1007/s00701-021-04829-9. Epub 2021 Apr 5.）や創傷治癒（Roefsら, Trends in Cell Biology 30, No. 12 9901013-https://doi.org/10.1016/j.tcb.2020.09.009）に関与しているとの報告がある。さらに、統合失調症モデルにおいてラメリポディアの動きがよくないところ（Yoshiharaら, Cell Reports 35, 108971, https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.10897 2021）、Shhを含む細胞外小胞がラメリポディアの動きを活発にする（Nishimuraら, Developmental Cell 56, 842-859, March 22, 2021）との報告もある。従って、第３の実施形態にかかる細胞外小胞は、創傷や統合失調症の治療にも効果を発揮すると考えられる。
第３の実施形態にかかる細胞外小胞自体を投与しても良いが、一般的には、有効成分である当該細胞外小胞の他、1または2以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与してもよい。また、本実施形態にかかる医薬または医薬組成物には、その有効成分として、第３の実施形態にかかる細胞外小胞以外に、治療対象疾患の治療に有効な既知の他の成分を配合してもよい。
本実施形態にかかる医薬または医薬組成物の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤および点鼻剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、有効成分等を水等に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
経口投与用または非経口投与用の製剤は、任意の製剤形態で提供される。製剤形態としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤または液剤等の形態の経口投与用医薬または医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤（点鼻スプレー剤など）、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬または医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
本実施形態にかかる医薬または医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬または医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して1重量％から90重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは、エチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
本実施形態にかかる医薬または医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。
一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は0.01～1000mg（有効成分重量）程度であり、一日１回または数回に分けて、あるいは、数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量0.001～100mg（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
本実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。
本実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる薬剤は、医薬または医薬組成物の構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。
また、キットには使用説明書が添付されてもよい。当該キットの使用説明は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROM、DVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。
第５の実施形態は、第４の実施形態にかかる医薬または医薬組成物を、治療対象に投与し、虚血（虚血性心疾患や脳虚血など）、虚血後の再生医療、末梢循環障害、創傷、統合失調症等の精神神経疾患、腎不全、糖尿病、脂肪肝炎などを治療または予防する方法である。
治療または予防の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
第６の実施形態は、以下の（ａ）および（ｂ１）、（ｂ２）もしくは（ｂ３）の工程を含むRab GTPase、特にRab18を不活性化する物質のスクリーニング方法である。場合によっては、工程（ｃ）をさらに含んでもよい。
（ａ）ソニックヘッジホッグを発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ｂ１）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞から分泌される細胞外小胞の粒径および／または体積を測定する工程、
（ｂ２）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞の細胞核周囲にソニックヘッジホッグまたはHsp90の集積の有無を確認する工程、
（ｂ３）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞内のRab18に結合しているKIF5Aの量が減少すること、または、Hsp90もしくは nSMaseの量が増加することを確認する工程、
（ｃ）工程（ｂ１）の細胞外小胞（すなわち、工程（ｂ１）において粒径および／または体積を測定した細胞外小胞）にソニックヘッジホッグが含有されるかどうか確認する工程。
Rab GTPaseを不活性化する物質とは、Rab GTPaseのGTP結合型（Rab-GTP）の活性を抑制または阻害する物質のことで、Rab GTPaseをGDP結合型にする物質、例えば、阻害剤であるCID1067700などのことである。CID1067700を、培地に添加するなどして、Shhを発現する細胞に接触させると、当該細胞から分泌される細胞外小胞画分中に、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上であってShhを含有する細胞外小胞が出現する（実施例を参照のこと）。従って、Shhを発現する細胞に、候補物質を接触させた場合に、当該細胞から粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上であってShhを含有する細胞外小胞の分泌量が増加した場合には、当該候補物質は、Rab GTPaseを不活性化する物質である可能性があると判断することができる。また、Shhを発現する細胞に、候補物質を接触させた場合に、細胞核周囲にShhまたはHsp90が集積する場合には、当該候補物質は、Rab GTPaseを不活性化する物質である可能性があると判断することができる。
また、Rab GTPaseが不活性化すると、Rabに対するGTP型エフェクターであるKIF5Aの結合量が減少し、GDP型エフェクターであるHsp90またはnSMaseの結合量が増加する。従って、上記（ａ）の工程の後、Rab18とのKIF5Aの結合量が減少するか、Hsp90またはnSMaseの結合量が増加する場合には、候補物質がRab18を不活性化する物質であると判断することができる。Rab18に結合しているエフェクターは、例えば、Rab18の免疫沈降物やGST-Rab18によるプルダウンアッセイ沈降物に対するイムノブロッティング（KIF5A、または、Hsp90もしくはnSMaseに対する抗体を用いて）などにより同定することができる。GTP結合型Rab18あるいはGDP結合型Rab18特異的な結合を同定するには、Rab18Q67LあるいはRab18S22N点突然変異体を用いるか、あるいは反応溶液にGTPγSあるいはGDPβSなどの試薬を混和することによって、容易に成し遂げることができる（詳細は、実施例を参照のこと）。
第７の実施形態は、Rab GTPaseを不活性化する物質の使用である。生体内におけるRab GTPase、特にRab18が不活性化されると、Shhを多く含有する細胞外小胞の分泌が促進される。従って、Rab GTPaseを不活性化する物質（例えばRab18を不活性化する物質）は、Shhの投与が治療効果を発揮する疾患、例えば、虚血（虚血性心疾患や脳虚血など）、虚血後の再生医療、末梢循環障害、創傷、統合失調症などの予防または治療のために使用することができる。
第８の実施形態は、以下の（ｄ）および（ｅ１）もしくは（ｅ２）の工程を含むRab GTPase、特にRab18を活性化する物質のスクリーニング方法である。場合によっては、工程（ｆ）をさらに含んでもよい。
（ｄ）ソニックヘッジホッグを発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ｅ１）工程（ｄ）において候補物質と接触させた細胞から分泌される細胞外小胞の粒径および／または体積を測定する工程、
（ｅ２）細胞質におけるソニックヘッジホッグまたはHsp90の発現量が上昇し、かつ、当該ソニックヘッジホッグまたは当該Hsp90が細胞質内に放散して存在することを確認する工程、
（ｅ３）工程（ｄ）において候補物質と接触させた細胞内のRab18に結合しているKIF5Aの量が増加すること、または、Hsp90もしくは nSMaseの量が増加することを確認する工程、
（ｆ）工程（ｅ１）の細胞外小胞（すなわち、工程（ｅ１）において粒径および／または体積を測定した細胞外小胞）にソニックヘッジホッグが含まれているかどうかを確認する工程。
Rab GTPaseを活性化する物質とは、Rab GTPaseのGDP結合型（Rab-GDP）を活性化する物質のことで、Rab GTPaseをGTP結合型にする物質、例えば、GDP-GTP置換促進剤などのことである。Shhを発現する細胞に、Rab18のGTP型変異体であるRab18-Q67Lを導入すると、当該細胞から分泌される細胞外小胞画分中に含まれる、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上であってShhを含有する細胞外小胞の数が減少する（実施例を参照のこと）。従って、Shhを発現する細胞に、候補物質を接触させた場合に、当該細胞から粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上であってShhを含有する細胞外小胞の分泌量が減少した場合には、当該候補物質は、Rab18を活性化する物質である可能性があると判断することができる。また、Shhを発現する細胞に、候補物質を接触させた場合に、ShhまたはHsp90の発現量が上昇し、かつ、当該Shhまたは当該Hsp90が細胞質内に放散して存在する場合には、当該候補物質は、Rab18を活性化する物質である可能性があると判断することができる。
また、Rab GTPaseが活性化すると、Rabに対するGTP型エフェクターであるKIF5Aの結合量が増加し、GDP型エフェクターであるHsp90またはnSMaseの結合量が減少する。従って、上記（ｄ）の工程の後、Rab18とのKIF5Aの結合量が増加するか、Hsp90またはnSMaseの結合量が減少する場合には、候補物質がRab18を活性化する物質であると判断することができる。Rab18に結合しているエフェクターは、例えば、Rab18の免疫沈降物やGST-Rab18を用いたプルダウンアッセイ沈降物に対するイムノブロッティング（KIF5A、または、Hsp90もしくはnSMaseに対する抗体を用いて）などにより同定することができる（詳細は、実施例を参照のこと）。
第９の実施形態は、Rab GTPaseを活性化する物質の使用である。Shhを発現する細胞に、RabGTPase、特にRab18を活性化する物質を細胞に接触させると、当該細胞からのShhを含有する細胞外小胞の分泌が抑制または阻害される。がん関連線維芽細胞から分泌される細胞外小胞に含まれるShhは、がん細胞の増殖と運動（転移）を促進するとの報告がある（Zhaoら, Cancer Medicine. 9：2500-2513 2020）。従って、生体内のがん環境に存在する、Shhを分泌する細胞に、Rab18活性化物質を接触させることにより、がん（例えば、食道がんなど）の増殖および／またはがん細胞の転移を抑制し、がんの予防または治療が可能であると考えられる。
以上のことから、RabGTPase を活性化する物質（例えばRab18を活性化する物質）は、Shhを含有する細胞外小胞の放出を抑制するための方法の手段として使用することができ、また、がんの予防または治療のために使用することができる。
本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．実験方法
１－１．細胞
ヒト間葉系幹細胞（human mesenchymal stem Cell；hMSC）は、Lonza（Basel、Switzerland、#PT-2501）から購入し, メーカーが提供してくれたプロトコルに従って培養され、特徴づけられた。ヒト間葉系幹細胞は、サプリメントおよび成長因子を添加したMesenchymal Stem Cells Basal Medium（Lonza、#PT3238）中、10 cmディッシュ（Thermo Scientific、#150466）にて培養を行った。培養ディッシュにトリプシン/EDTA溶液（Lonza、#CC-3232）を添加し37℃で5分間インキュベートして、細胞をディッシュから剥がした。剥がした細胞を回収した後、5,000～6,000 細胞/cm2となるように播種し、7日毎に植え継ぎを行った。なお、植え継ぎ回数が6回以内の細胞を実験に使用した。培地は、3日毎に交換した。
HUVEC細胞は、Lonza（#C-2519AS）から購入し、サプリメントおよび成長因子を添加したEGM-2 media（Lonza、#CC-5022）中で培養した。細胞は、HEPESバッファー（Lonza、#CC-5022）でリンスし、トリプシン/EDTA溶液（Lonza、#CC-5012）を添加し37℃で3-5分間インキュベートして、ディッシュから剥がし、トリプシン中和溶液（Lonza、#CC-5002）中に回収し、約2,500細胞/cm2となるように播種し、7日毎に植え継ぎを行った。なお、植え継ぎ回数が4回以内の細胞を実験に使用した。培地は、3日毎に交換した。HUVEC細胞は、植え継ぎ毎に、Matrigel（Corning、#356231）で予めコートした8ウェルのLabTek II チャンバー#1.5 ジャーマンカバーグラスシステム（Thermo Scientific Nunc、Denmark、#155409）にプレーティングし、血管新生アッセイに用いた。
NIH3T3細胞は、10% FBS（JRH Biosciences、#F7524、Lot #BCBT3482）を含むDMEM（High Glucose；FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Japan、#044-29765）中で、標準的な方法で培養を行った。NIH3T3細胞は、Lipofectamine LTX-Plus reagent （Thermo Fisher）を用いて、Rab-GFPプラスミドで形質転換し、200μg/ml G418（Thermo Fisher、#10131035）で選択し、サブクローニングを行った。
１－２．抗体
抗体KIF5A抗体（#kif5a(n)、RRID:AB_2571744、1:1,000）は、既報のものを使用した（Kanaiら,The Journal of neuroscience 20, 6374-6384 200）。ウサギ抗Shh抗体（#20697-1-AP、RRID:AB_10694828、1:1,000）は、Proteintechから購入した。ラット抗Hsp90モノクローナル抗体 16F1（#ADI-SPA-835、RRID:AB_311881、1:500）は、Enzo Life Sciencesから購入した。マウス抗TSG101モノクローナル抗体 4A10（# MA1-23296、RRID:AB_2208088、1:1,000）は、Thermo Fisher Scientificから購入した。ウサギ抗GST抗体 (#A5838, RRID:AB_258261, 1:1,000)、マウス抗γ-アダプチン(AP-1)モノクローナル抗体 (#A4200, RRID:AB_476720, 1:1000)、マウス抗AP-3モノクローナル抗体（#A4825、RRID:AB_258203、1:1,000）および抗セラミド抗体（#C8104、RRID:AB_259087、1:500）は、Sigma-Aldrichから購入した。マウス抗nSMase2抗体 (# sc-166637, RRID:AB_2270817, 1:1,000) は、Santa Cruz Biotechnology から購入した。
2次抗体については、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase；HRP）結合抗ウサギIgG抗体およびHRP結合抗マウスIgG抗体（1:1,000）をGE Healthcare Life Sciencesから購入し、Alexa-Fluor 405- 488-および568を結合した、抗マウスIgG、抗ラットIgG、抗ウサギIgG、および抗マウスIgM抗体（1:200～1:500）は、Thermo Fisherから購入した。
１－３．発現ベクター
Shh-N-EGFP発現ベクターおよびShh-N-TagRFP発現ベクターを構築するために、マウスShh cDNA（Andrew P. McMahon博士からご供与頂いた）のN末端から594塩基（アミノ酸1～198に相当する）をPCRで増幅し、pEGFPベクター（#6077-1、Clontech）のHindIII-NcoIサイトに挿入された。その後、Shh-Nを挿入したpEGFPベクターをHindIIIおよびEcoRIで切断して、Shh-N-EGFP断片を得た。Shh-N-EGFP断片をpBK-CMVプラスミド（#212209、Agilent Technologies）に挿入してpShh-N-EGFP発現プラスミドベクターを構築した。次に、Shh-N cDNAを以下に示すプライマーを使用してPCRで増幅した。
Sal-ShhATGKozak-fwd：
5’-ACC GTCGACCATGGTGCTGCTGCTGGCCAGATG-3’（配列番号１）
Bam-Shh198-rev：
5’-CAA GGATCCCGGCCGCCGGATTTGGCCGCCACG-3’（配列番号２）
増幅した断片は、pTagRFP-Nベクター（#FP142、Evrogen）に挿入して、Shh-N-TagRFP発現プラスミドベクターを構築した。これらの発現ユニットは、ViraPower Adenoviral Expression System（Thermo Fisher）を用いて、使用説明書に従って、細胞に導入した。
Hsp90発現ベクターを構築するために、マウスHsp90aal cDNAは、ファントムクローン#I1C0020P08から以下に示すプライマーを使用してPCR法で増幅された。
Xho+hsp90aa1atgFw：
5’- ACCCTCGAGCTATGCCTGAGGAAACCCAGACCCAAG-3’（配列番号３）
Kpn+hsp90 aa1stopRev：
5’-ACCGGTACCTTAGTCTACTTCTTCCATGCGTGATGTGTC-3’（配列番号４）
そして、XhoI および KpnI サイトを利用し、pTagRFP-C1ベクターに挿入した。挿入されたDNA断片が、pEGFP-C1 (Clontech)ベクターに導入され、Hsp90-EGFP発現ベクターをも構築した。これらの発現ベクターは、使用説明書（Thermo Fisher）に従ってまたViraPowerアデノウイルスシステムに導入した。
EGFP-Rab18Q67L（Addgene plasmid #49596；http://n2t.net/addgene：49596；RRID：Addgene_49596）、EGFP-Rab18S22N（Addgene plasmid #49597；http://n2t.net/addgene：49597；RRID：Addgene_49597）、およびEGFP-Rab18 （Addgene plasmid #49550；http://n2t.net/addgene：49550；RRID：Addgene_49550）発現ベクターは、Marci Scidmore氏からご供与頂いた（Huangら, Cell Microbiol 12, 1292-1307 2010）。
GST-tagged Rab18タンパク質の大腸菌内での発現に関し、各プラスミドのRab18断片を以下に示すプライマーを使用してPCRで増幅し、増幅断片をpGEX-4T-3ベクター（Cytiva Life Sciences）のEcoRI-NotIサイトに挿入した。
5’-TCCGAATTCCATGGACGAGGACGTGCTGACCACTCTG-3’（配列番号５）
5’-AATGCGGCCGCCTATAGCACAGAGCAGTAACCGCCGCAGGCG-3’（配列番号６）
１－４．トランスフェクションおよびトランスダクション（形質導入）
発現ベクターは、細胞へ、Lipofectamine LTX-Plusを使用してプラスミドをトランスフェクションにより導入するか、またはアデノウイルスベクターによるトランスダクションにより導入した。
１－５．阻害剤
CID1067700（#SML0545-5MG）は、Sigma-Aldrichから購入し、40 mMとなるようにDMSOに溶解させ、細胞に対しては、最終濃度40μMとなるように添加して24時間培養した。GW4869（#13127）は、Cayman Chemicalから購入し、5 mMとなるようにDMSOに溶解させ、細胞に対しては、最終濃度1.25μMとなるように添加して24時間培養した。TAS116（#HY-15785）は、MedChemExpressから購入し、1 mMとなるようにDMSOに溶解させ、細胞に対しては、最終濃度0.5μMとなるように添加して48時間培養した。
１－６．細胞外小胞（extracellular vesicles；EV）の単離
ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離は、MISEV2018ガイドライン（Theryら, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles 7, 1535750 (2018).）に従って行った。
ヒト間葉系細胞を5,000～6,000細胞/cm2の密度で、3枚の10 cm培養ディッシュにプレーティングした。培養開始から6日後、1ディッシュあたり、10 mL のサプリメントを添加したEV Production Basal Medium（FUJIFILM-Wako、#053-09451および# 298-84001）で培地交換を行った（交換培地は、適宜、添加化合物を含む）。5% CO2、37℃の条件で24時間培養した後、培地を回収し、4℃にて2,000 gで30分間遠心を行い、細胞片を除去し、Millipore Amicon Ultra 30,000 MWCO filter（Pall、#MAP030C37）を用いて、4℃にて、4,000 gで60分間遠心して1 mlに濃縮した。濃縮した培養上清は、500μL のTotal Exosome Isolation Reagent（Invitrogen、#4478359）を添加し、転倒混和しながら一晩インキュベーションした。一晩混和した溶液を10,000 gで少なくとも1時間遠心して、細胞外小胞を沈殿に回収し、これを30μLのPBSに再懸濁した。得られた細胞外小胞は、4℃で保存し、1週間以内に実験に使用した。
１－７．ナノ粒子トラッキング解析（Nanoparticle tracking analysis；NTA）
上記の培養上清は、PBSで希釈してZetaview Nanoparticle Tracking Analysis Instrument（Particle Metrix、Germany）を用いて解析を行った。収集したデータは、Prism software（Graphpad、ver. 7 and 9.3.1）で解析し、グラフ化した。
１－８．透過型電子顕微鏡による観察
透過型電子顕微鏡（Transmission electron microscopy；TEM）による観察は、既報（Nonakaら, Cell 95, 829-837 1998；Takeiら, The Journal of cell biology 131, 1789-1800 1995）の標準的な方法により実施した。細胞外小胞の沈殿をHalf Kalnovsky fixative中、37℃にて10分間および4℃で一晩固定した後、1% OsO4（0.1 M cacodylate buffer (pH 7.4)中）で、氷上にて1.5時間、後固定した。その後、サンプルを1 %酢酸ウラニルで1時間、電子染色を行った後、段階的濃度のエタノールシリーズで脱水した。最終的に、脱水した細胞外小胞サンプルをQuetol-812 （Nisshin EM）に包埋し、それを超薄切片にカットし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で電子染色し、100 keVでJEM2000 microscopeを用いて観察するか、または80 keVでJEM-1400Flash microscopeを用いて観察した。
１－９．インビトロにおける細胞外小胞の放出の画像化
Shh細胞外小胞のブラウン運動を追跡するために、NIH3T3細胞を、ポリLリジンで予めコードした8ウェルのLabTek II チャンバー#1.5 ジャーマンカバーグラスシステムに、1×104細胞/wellとなるようにプレーティングした。培養後3日目に、NIH3T3細胞に、アデノウイルスShh-N-EGFP発現ベクターを導入した。培地は、添加化合物を含む完全培地または含まない完全培地で、培養後4日目に交換した。培地交換から24時間後、スピニングディスク顕微鏡（Yokogawa/ZEISS）で、既報（Tanakaら, Neuron 90, 1215-1229 2016）に準じて、5% CO2、37℃の条件にて、5秒間隔でタイムラプス撮影を実施した。ブラウン運動を行うShh細胞外小胞は、Imaris 8 software（Bitplane）を用いて同定し、定量した。
１－１０．血管新生アッセイ
血管新生アッセイは、基本的に、Lonza corporationから提供されたプロトコルに従って実施した（Fujioら, Journal of tissue engineering and regenerative medicine 11, 2116-2126 2017）。8ウェルのグラスボトムチャンバー（Thermo Scientific Nunc、Denmark）を、1ウェルあたり250μlの冷Matrigel（Corning、#356231）で予めコートし、室温で10分間、5% CO2、37°Cの条件で少なくとも30分間インキュベーションした。
7日間培養したHuvec細胞は、ウェル毎、65,000～80,000細胞/cm2の密度で植え継いだ。精製した新鮮な細胞外小胞を各ウェルに添加した後、LSM780 共焦点顕微鏡（ZEISS）を使用して、5% CO2、37°Cの条件下、少なくとも4時間、複数の位置において、HUVEC細胞の画像を取得した。細胞外小胞については、10 cmディッシュの培養上清の半量から回収した細胞外小胞の総量を、ウェルの1 cm2に添加するようにした。データは、Plan-Apochromat 10x/0.45 M27レンズを使用し、488 nmレーザー光により、微分干渉顕微鏡モードで収集した。その後、収集したデータは、ImageJ softwareで解析し、形成された血管数、血管の分岐点および血管の全周長を定量した（Fujioら, Journal of tissue engineering and regenerative medicine 11, 2116-2126 2017；Linら, Frontiers in pharmacology 10, 1273 2019）。
１－１１．GSTプルダウンアッセイ
GSTプルダウンアッセイは、基本的には、既報（Niwaら, Nature cell biology 10, 1269-1279 2008）に準じて行ったが、大腸菌の回収に関しては、B-PER Bacterial Cell Lysis Reagent（Thermo Fisher Scientific）を使用した。
１－１２．イムノブロッティング
イムノブロッティングは、既報（Yinら, Neuron 70, 310-325 2011）に準じて行った。サンプルの調製に関し、精製した細胞外小胞を1/3量の4 × Laemmli’s sample bufferで溶解させ、98℃で1～2分間熱処理した。その後、サンプルをSDS-PAGEにロードし、PVDF膜（Immobilon-P、EMD Millipore）に転写した。転写後のPVDF膜は、Can Get Signal solution 1 と 2で希釈された一次抗体およびHRP結合2次抗体とインキュベートし、ECL（GE Healthcare life Sciences、USA）法で、抗体で認識されたバンドを可視化した。バンドは、ImageQuant LAS 4000 mini system（GE Healthcare life Sciences、USA）を使用して検出し、ImageJ softwareで定量した。あるいは、膜は、既報（Kondoら, J Cell Biol 125, 1095-1107）の記述に準じてアルカリホスファターゼ結合二次抗体(Cappel)とインキュベートし、BCIP and NBT (Roche)で発色した。タンパク質分子量マーカーはBioRad（Herculus、CA、USA）から購入した。
１－１３．蛍光顕微鏡
光学顕微鏡観察に関し、細胞は、ポリLリジン（1:1,000、Sigma、#P4707）で1時間コートした35 mmガラスボトムディッシュ（Matsunami、Japan、#D11130H）にプレーティングした。免疫蛍光標識は、上述の抗体を用いて実施した。簡単に述べると、細胞を1次抗体と、4℃にて一晩インキュベーションした後、2次抗体と1時間インキュベーションした後、5分間ずつ三回PBSで洗浄した。その後、前述のようにスピニングディスク顕微鏡（Yokogawa/ZEISS）またはAiryscan を搭載したLSM780共焦点顕微鏡を用いて、細胞の観察を行った。細胞の3次元再構築はimaris 8ソフトウェアを使用して行った（Bitplane）。
２．結果
２－１．Rab阻害剤のCID1067700はヒト間葉系幹細胞（hMSC）からのShh-EVの放出を促進する。
Rab阻害剤であるCID1067700（(2-(benzoylcarbamothioylamino)-5,5-dimethyl-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyran-3-carboxylic acidまたは ML282）（以下「CID」とも記載する）はヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の放出を制御するかどうか調べるために、培養上清から細胞外小胞フラクションを単離した（図１Ａ）。細胞を40μMのCID1067700またはDMSOで24時間処理した。各培養上清を遠心して夾雑物を除去した後、Exosome Isolation Reagent（Invitrogen）と混合して、細胞外小胞を沈殿させた。細胞外小胞フラクションについて、Shh、TSG101およびHsp90に対する抗体を用いてイムノブロッティングを行った（図１ＢおよびＣ）。一般的なエクソソームマーカーであるTSG101とHsp90の量に大きな変化はなかったが、CIDで処理した細胞から放出された細胞外小胞に含有されるShhの量は、DMSOで処理した細胞と比較して、著しく増加していた。これらの結果から、Shh含有細胞外小胞の生産が特異的かつ顕著に増加したことが示唆された。
２－２．CID1067700はヒト間葉系幹細胞由来細胞外小胞の血管新生活性を増加させる。
CID1067700で刺激したヒト間葉系幹細胞由来細胞外小胞の機能を明らかにするためのバイオアッセイとして、HUVEC細胞のインビトロにおける血管新生に対する影響を調べた。6.5～8×104個のHUVEC細胞をヒト間葉系細胞の培養上清（10 cmプレート）から単離した細胞外小胞と混合し、Matrigel-coated chamber slide上に混合物をプレーティングした。プレーティングしてから90分後、血管新生レベルを比較した（図２ＡおよびＢ）。その結果、CID1067700で刺激したヒト間葉系幹細胞由由来の細胞外小胞で処理した場合、血管の数（図２Ｃ）、分岐点の数（図２Ｄ）および血管の全周長（図２Ｅ）を定量すると、コントロールと比較して、およそ4～5倍血管新生が促進されることが明らかとなった。これらの結果は、CID1067700でヒト間葉系幹細胞を処理すると、細胞外小胞により血管新生活性が顕著に増大することを示唆している。
２－３．CID1067700は大きな粒径の細胞外小胞の生産を促進する。
CID1067700が細胞外小胞の形態に及ぼす影響を調べるために、ナノ粒子トラッキング解析（NTA）と透過型電子顕微鏡観察（TEM）を行った。
まず、ヒト間葉系幹細胞をCID1067700の存在下または非存在下において、サプリメントを添加したEV産生用基礎培地（FUJIFILM-Wako）で24時間培養し、遠心により夾雑物を除去した培養上清を用いてNTAを実施した（図３）。直径1μm程度の大きな粒径の細胞外小胞をカウントできるZetaView systemを用いて、「highest」のモードで測定を行った。その結果、DMSOのみで処理したヒト間葉系幹細胞由来のサンプルとCID1067700で処理したヒト間葉系幹細胞由来のサンプルは、1 mlあたりほぼ同じ量の直径100～800 nmの細胞外小胞を含んでいた（DMSOのみで処理したサンプル；4.4±0.4 × 108 粒子/ml、CID1067700で処理したサンプル；3.2±1.9 × 108粒子/ml 、p ≧ 0.05、Welch’s t test、n = 4）（図３Ｈ）。しかしながら、CID1067700で処理した細胞の培養上清中にのみ、直径が800 nmよりも大きな細胞外小胞が、6.6 ± 2.2 × 107粒子/ml（p < 0.05、Welch’s t test、n = 4；図３Ｉ)で含まれていた。この結果は、CID1067700はヒト間葉系細胞からの大きな細胞外小胞の生産を特異的に促進することを示している。
次に、細胞外小胞のペレットをTEMで観察を行った（図４）。従来から知られているエクソソーム様の小さな（およそ直径100 nm程度）粒子の他に、電子密度の低い（明るい）直径が800 nmより大きな粒子が、CID1067700処理ヒト間葉系細胞由来の細胞外小胞画分に含まれており、その粒子は脂質二重層に囲まれる傾向が見られた（図４ＡおよびＢ）。100 nmより大きな粒子サイズのヒストグラムから、細胞外小胞の数が、CID1067700処理によって大きなサイズの細胞外小胞が著しく増加したことが明らかになった（図４ＣおよびＤ）。以上の電子顕微鏡観察の結果も、大きなヒト幹細胞由来の細胞外小胞の生産を、CID1067700が特異的に促進していることを示している。
２－４．CID1067700はHsp90およびnSMase2パスウェイを介してShh-EVの生産を増大させる。
Shhを含む大粒径の細胞外小胞を、CID1067700で処理したShhN-EGFP形質導入NIH3T3線維芽細胞内の生細胞イメージングで可視化した（図５）。図５Ａに示す通り、およそ1μmの明るい粒子が、培養細胞表面の上方の培地中をランダムに運動する様子が頻繁に観察された。
これらの粒子は自動的にトラッキングされ、薬剤（CID1067700、GW4869、TSA116）添加条件において、細胞からら放出される細胞外小胞として同定された（図５Ｂ～Ｉ）。生細胞イメージングの結果から、CID1067700で24時間処理した場合、コントロール（DMSO処理）と比較して、Shh-EVの数が著しく増加することが確認された（図５Ｊ）。しかしながら、このようなCID1067700処理よるShh-EVの放出量の増加は、5μMのTSA116（Hsp90阻害剤）と共に48時間、あるいは、1.25μMのGW4869（nSMase2阻害剤）と共に24時間処理すると、消失した（図５Ｊ）。この結果は、Hsp90およびnSMase2がCID1067700によって促進される細胞外小胞の生産経路に関与する因子として機能することを示唆している。
２－５．CID1067700はnSMase2を介したセラミドの合成を促進する。
nSMase2活性がCID1067700処理によって影響を受けるかどうかを調べるために、NIH3T3細胞をCID1067700および／またはGW4869で処理した後、セラミドの免疫染色を行った（図６）。その結果、細胞質中のセラミドの発現量は、CID1067700で24時間処理すると、DMSOのみで処理した場合と比較して顕著に増大した（図６ＢおよびＤ）。このCID1067700によるセラミドの発現量の増加は、GW4869で同時に処理すると顕著に抑制されたことから（図６ＣおよびＤ）、CID1067700は、nSMase2活性およびセラミドの合成を促進し、Shh-EVの生産を促進していることが示唆された。
２－６．Rab18-GDPとRab18-GTPはAP-1へ別々に共局在する。
ShhおよびHsp90の動態がRab18のヌクレオチド状態によって、空間的にどのように制御されるのか調べるために、EGFP-Rab18S22N（GDP結合型Rab18の状態を模倣する変異体）またはEGFP-Rab18Q67L（GTP結合型Rab18の状態を模倣する変異体）をNIH3T3細胞に安定形質導入した（図７および図８）。Rab18S22Nは核周囲に集積される傾向にあるが、Rab18Q67Lは 細胞質の斑点状のオルガネラおよびサイトネーム（cytoneme）様の細胞外突起に分布する傾向を示した。
これらのRab18陽性オルガネラの性質を調べるために、これらの安定形質導入細胞をアダプタータンパク質のAP-1およびAP-3に対する免疫染色を行った（図７）。非常に興味深いことに、AP-1は核周囲のRab18-S22NポジティブなオルガネラとRab18-Q67Lポジティブな細胞質中の斑点状オルガネラに共局在した（図７Ａ）。しかしながら、AP-3とRab18は互いに異なる局在を示した（図７Ｂ）。AP-1はTGN（trans-Golgi network；トランスゴルジ網）からエンドソームへのソーティングに関与していることが報告されているので（Delevoyeら, J Cell Biol 187, 247-264 2009；Nakagawaら, Cell 103, 569-581 2000；Schmidtら, National Academy of Sciences of the United States of America 106, 15344-15349 2009）、Rab18-GDPはエンドソーム系のMVB（multivesicular body）経路を介してエクソソームの生合成に関与している可能性が考えられる。
２－７．Rab18-GDPはShhおよびHsp90の核周囲への蓄積を増大させる。
次に、Rab18変異を発現する細胞に、ShhN-tagRFP 発現ベクター（図８Ａ）またはHsp90-tagRFP発現ベクター（図８Ｂ）をトランスフェクトし、2波長蛍光顕微鏡で観察した。Rab18S22Nの発現下では、ShhおよびHsp90が、Rab18S22Nと共にゴルジ領域に集積する様子が観察された。しかしながら、Rab18Q67Lの発現下では、ShhおよびHsp90からの蛍光シグナルは、細胞質においてより強くなり放散して分布する様子が観察された。
蛍光シグナルを定量したところ、異なるヌクレオチド状態のRab18の発現下における、ShhおよびHsp90の分布の変化は統計的に有意であることが確認された（図８Ｃ～Ｆ）。これらのデータは、Rab18-GDPがShhおよびHsp90を核周囲のオルガネラにリクルートすることを示唆している。
さらに、これらの細胞にShhN-tagRFP発現ベクターをトランスフェクトし、赤色蛍光の細胞外小胞（Shh含有細胞外小胞）の数を測定した（図１２）。その結果、Rab18S22N-EGFPをトランスフェクトした細胞の培養上清中の赤色蛍光の細胞外小胞の数は、Rab18Q67L-EGFPをトランスフェクトした細胞の培養上清中の赤色蛍光の細胞外小胞の数よりも顕著に多かった。このことは、Rab18のGTPaseサイクルが、もっぱらShh-EVの生産の割合を制御していることを示唆している。
２－７．Hsp90およびnSMaseはRab18-GDPのエフェクターである。
Rab18は、結合しているヌクレオチドの状態に応じて、異なるEV制御タンパク質と結合するのかどうか調べるために、GSTプルダウンアッセイを行った。まず、大腸菌で発現させたGST-Rab18S22NおよびGST-Rab18Q67Lをマウスの脳溶解物に加え、GSTプルタウンを行った。その結果、Rab18-GTPにはkinesin-1 モータータンパク質であるKIF5Aが優先的に結合していた（図９）。これに対し、Hsp90とnSMase2は、Rab18-GDPに優先的に結合しており、Rab18-GDPは、Shh-EVの前駆体小胞の蓄積と成熟、および細胞外への放出過程において、Hsp90とnSMase2が適切に機能するように機能していることが示唆される。
２－８．CID1067700はHsp90およびShhの雲状分泌（cloud-like secretion）を促進する。
CID1067700処理細胞から分泌されたHsp90に媒介されるShh-EVの形態的特徴を観察した。Shh-tagRFPおよびHsp90-EGFPを共にNIH3T3細胞に形質導入し、CID1067700で24時間処理した効果を比較した。細胞を固定し、z-stacksで写真を撮り、 3次元モデルを構築した。非常に興味深いことに、20～40μmの高さをもつHsp90およびShhを含む多くの大きな細胞外構造体が、CID1067700処理後の細胞層の上方に浮かぶ様子が観察された（図１０）。このような構造体は培地を除去し、細胞を固定した後に観察されたため、細胞外小胞放出過程の中間構造として細胞と相互作用していると考えられる。この構造体は、同程度の高さをもつ2つの種類の構造体から構成されている。1つは、約10μm程度の直径で強く圧縮された蛍光像を示し（図１０Ｅ）、他方は約20～30μm程度の直径をもつ雲状の蛍光像を示し、Shh/Hsp90ダブルポジティブな多くの細胞外小胞を含んでいた（図１０）。前者は、後者の前駆体で、Hsp90を含むポリマーに覆われたShh-EVがまだ膜によって被覆されている状態と考えられる。これらの細胞外の構造体を伴う細胞は、CID1067700処理で顕著に増加した（図１０Ｇ）。
本実施例において示したデータを総合すると、Rab18-GDPが、Hsp90およびnSMase2を核周囲のmulivesicular bodiesへ取り込むことにより、大粒径のShh-EVの細胞外への放出を促進していることが示唆される（図１１）。
本発明によれば、ソニックヘッジホッグを多く含有する細胞外小胞の細胞からの分泌を促進することが可能である。ソニックヘッジホッグは血管新生の増進を通して様々な疾患（例えば、虚血など）の治癒等に関与していることから、本発明は医療分野における利用が期待される。

Claims (15)

  1. 細胞外小胞を生産する方法であって、Rabを不活性化する処理を行った細胞から分泌される細胞外小胞を取得することを含む、前記方法。
  2. 前記細胞が、ソニックヘッジホッグを発現することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記Rab GTPaseを不活性化する処理が、Rab GTPase阻害剤で処理することである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記Rab GTPaseを不活性化する処理が、Rab18-GDP型変異体を前記細胞内へトランスフェクションすることである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記細胞外小胞が、ソニックヘッジホッグを含有することを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記細胞外小胞が、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上であることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載の方法。
  8. ソニックヘッジホッグを発現する細胞であって、Rab GTPaseを不活性化する処理を行った、前記細胞。
  9. Hsp90遺伝子およびnSMase2遺伝子を発現可能な状態で保持している、請求項８に記載の細胞。
  10. ソニックヘッジホッグを含有し、粒径が800 nm以上および／または体積が109 nm3以上である、細胞外小胞。
  11. 請求項１０に記載の細胞外小胞を有効成分として含む、医薬または医薬組成物。
  12. 以下の（ａ）および（ｂ１）、（ｂ２）もしくは（ｂ３）の工程を含むRab GTPaseを不活性化する物質のスクリーニング方法。
    （ａ）ソニックヘッジホッグを発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
    （ｂ１）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞から分泌される細胞外小胞の粒径および／または体積を測定する工程、
    （ｂ２）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞の細胞胞核周囲にソニックヘッジホッグまたはHsp90の集積の有無を確認する工程、
    （ｂ３）工程（ａ）において候補物質と接触させた細胞内のRab18に結合しているKIF5Aの量が減少すること、または、Hsp90もしくは nSMaseの量が増加することを確認する工程。
  13. 前記工程（ｂ１）の前記細胞外小胞にソニックヘッジホッグが含まれているかどうかを確認する工程（ｃ）をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 以下の（ｄ）および（ｅ１）もしくは（ｅ２）の工程を含むRab GTPaseを活性化する物質のスクリーニング方法。
    （ｄ）ソニックヘッジホッグを発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
    （ｅ１）工程（ｄ）において候補物質と接触させた細胞から分泌される細胞外小胞の粒径および／または体積を測定する工程、
    （ｅ２）細胞質におけるソニックヘッジホッグまたはHsp90の発現量が上昇し、かつ、当該ソニックヘッジホッグまたは当該Hsp90が細胞質内に放散して存在することを確認する工程、
    （ｅ３）工程（ｄ）において候補物質と接触させた細胞内のRab18に結合しているKIF5Aの量が増加すること、または、Hsp90もしくは nSMaseの量が増加することを確認する工程。
  15. 前記工程（ｅ１）の前記細胞外小胞にソニックヘッジホッグが含まれているかどうかを確認する工程（ｆ）をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
JP2022078750A 2022-05-12 2022-05-12 生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法 Pending JP2023167506A (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022078750A JP2023167506A (ja) 2022-05-12 2022-05-12 生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法
PCT/JP2023/017656 WO2023219119A1 (ja) 2022-05-12 2023-05-11 生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022078750A JP2023167506A (ja) 2022-05-12 2022-05-12 生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023167506A true JP2023167506A (ja) 2023-11-24

Family

ID=88730314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022078750A Pending JP2023167506A (ja) 2022-05-12 2022-05-12 生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2023167506A (ja)
WO (1) WO2023219119A1 (ja)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7655419B2 (en) * 2006-08-25 2010-02-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for identifying anti-HCV agents
EP2484765A1 (en) * 2011-02-04 2012-08-08 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Cell transfection under rab37 deficiency or inhibition
US8765803B1 (en) * 2011-03-02 2014-07-01 Stc.Unm Rab7 GTPase inhibitors and related methods of treatment
US20210046109A1 (en) * 2018-03-14 2021-02-18 The Regents Of The University Of California Suppressive Exosomes in Cancer and for Immunosuppression
JP7231917B2 (ja) * 2018-09-18 2023-03-02 国立大学法人山口大学 癌細胞における免疫チェックポイント因子の発現抑制剤及び癌治療用医薬組成物
KR20220131902A (ko) * 2019-12-04 2022-09-29 유나이티드 쎄러퓨틱스 코포레이션 세포외 소포 및 이의 용도
JP2023513395A (ja) * 2020-01-20 2023-03-30 イーブイ、セル、バイオテック、（コアンチョウ）、カンパニー、リミテッド 小胞及びその使用
JP2023130530A (ja) * 2020-07-27 2023-09-21 株式会社Exorphia 細胞外小胞溶液

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023219119A1 (ja) 2023-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Quiros et al. Macrophage-derived IL-10 mediates mucosal repair by epithelial WISP-1 signaling
Santos-Zas et al. Cytotoxic CD8+ T cells promote granzyme B-dependent adverse post-ischemic cardiac remodeling
US20210113625A1 (en) Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells
Zhou et al. Microglial debris is cleared by astrocytes via C4b-facilitated phagocytosis and degraded via RUBICON-dependent noncanonical autophagy in mice
US9926561B2 (en) Composition for regenerating normal tissue from fibrotic tissue
JP5968442B2 (ja) 心筋梗塞の修復再生を誘導する多能性幹細胞
Zhu et al. Enhanced angiogenesis promoted by human umbilical mesenchymal stem cell transplantation in stroked mouse is Notch1 signaling associated
JP2017530158A (ja) 筋ジストロフィーの処置における心筋球由来細胞およびこのような細胞によって分泌されたエキソソーム
RU2637372C2 (ru) Средство для лечения фиброза кишечника
CN110312515B (zh) 新的抗血管生成细胞外囊泡
CN112870228B (zh) 一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用
CA3136137A1 (en) Very-long-chain polyunsaturated fatty acids, elovanoid hydroxylated derivatives, and methods of use
JP6474549B2 (ja) 幹細胞の培養産物の評価指標及びその利用
EP3154580B1 (en) Use of negative functional modulators of erythropoietin for therapy
WO2023219119A1 (ja) 生理活性物質を含有する細胞外小胞を生産する方法
KR20190141234A (ko) 간엽계 줄기세포의 제조 방법, 간엽계 줄기세포의 치료 효과 마커, 치료 효과 판정 방법, 및 간엽계 줄기세포를 포함하는 세포 제제
JP2021176848A (ja) 治療用コネキシン４５阻害剤
JP6023824B2 (ja) 線維化組織から正常組織を再生するための組成物
Yu et al. Apoptotic Extracellular Vesicles Induced Endothelial Cell-Mediated Autologous Stem Cell Recruitment Dominates Allogeneic Stem Cell Therapeutic Mechanism for Bone Repair
RU2805066C2 (ru) Внеклеточные везикулы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток
JP6936496B2 (ja) 移植片対宿主病の治療剤又は予防剤、ファイブロサイト浸潤抑制剤、及び涙液減少と杯細胞の減少の抑制剤
Shahoei The immunomodulatory roles of small heterodimer partner and their implications in breast cancer progression
JP2007252288A (ja) ヒトプリオン病を処置するための組成物