WO2022221969A1 - Vesículas extracelulares de células mesenquimales de cordón umbilical para el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes. - Google Patents

Vesículas extracelulares de células mesenquimales de cordón umbilical para el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes. Download PDF

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Francisca ALCAYAGA
Aliosha FIGUEROA
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Definitions

  • Extracellular vesicles of mesenchymal cells from the umbilical cord for the treatment of osteoarticular and autoimmune diseases are included in the umbilical cord.
  • the invention relates to the general field of biotechnology, and specifically relates to the field of regenerative medicine and the manufacture of therapy products based on human mesenchymal cells, specifically extracellular vesicles, for the treatment of osteoarticular and autoimmune diseases.
  • vesicles naturally secreted by the cells during cell culture, since it has been seen that they have great potential to constitute cell-free therapies.
  • researchers have studied the function of these vesicles in various fields, among them it has been found that they play an important role in intercellular communication, that they have an effect on the formation and/or modulation of diseases through their content, which corresponds to essentially proteins and RNA. It has been found especially that these vesicles contain a high quantity and variety, between 2000 to 3000 types of microRNA or miRNA. These molecules are non-coding RNA chains, which play an important role in the regulation of gene expression.
  • a subset of the extracellular vesicles are exosomes (30 to 200 nm), which have already been used as delivery vehicles for different drugs.
  • mesenchymal cell exosomes are used for the treatment of some diseases, such as glaucoma, US20190224242A1 (Tomarev et al, 2019-07-25), but the composition used and the properties observed in that document are far from the composition of the invention, for example in the application the exosomes have the markers CDllc + and CD63 + , while in the invention the markers CD63, CD81 and CD9 are required, to name only one difference.
  • the invention aims at a composition of exosomes obtained from umbilical cord mesenchymal cells (UC-MSC) which contain miRNA and/or specific surface markers, for the treatment of osteoarticular and autoimmune diseases.
  • U-MSC umbilical cord mesenchymal cells
  • Figure 1 Treatment with the composition of the invention allows to reduce the severity of the lesion, in a murine model of osteoarthritis, Study 1.
  • A) OA histology score (or OA score) shows a healthy joint (Sham , or placebo), the joint with osteoarthritis, and the joint with osteoarthritis treated with the composition of the invention (Exosome).
  • FIG. 1 Treatment with the composition of the invention shows positive results in bone mineral density in a mouse model of osteoarthritis, Study 2.
  • Figure 3 Treatment with the composition of the invention shows positive results in bone mineral density in a mouse model of osteoarthritis, Study 3.
  • composition of the invention results in less proliferation than the control at both times.
  • Treatment with the composition of the invention increases the proliferation of Tregs cells; characterized by having the markers CD4, FOXP3 and CD25.
  • Peripheral blood mononuclear cells, activated with PHA (20pg/mL), treated with PBS control and with the composition of the invention the proliferation of Treg cells is shown on the third day of culture.
  • the composition of the invention allows a greater proliferation than the control.
  • FIG. 6 Treatment with the composition of the invention positively polarizes macrophage differentiation.
  • Monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells, which were cultured and differentiated into macrophages by the factors M-CSF and GM-CSF, after 6 days they were treated with PBS control and with the composition of the invention, A) proliferation of MI or pro-inflammatory macrophages 24 hours after the stimulus, is seen decreased by the composition of the invention sEV, B) proliferation of M2 macrophages or anti-inflammatory 24 hours after the stimulus, is seen increased by the composition of the invention sEV.
  • the invention refers to a composition enriched in extracellular vesicles (EV) of mesenchymal cells of the umbilical cord, with specific markers and miRNA, where this composition is useful in the treatment of osteoarticular and autoimmune diseases, especially when injected into the sites of the injury to treat.
  • EV extracellular vesicles
  • the invention aims at a composition enriched in extracellular vesicles (EV) from umbilical cord mesenchymal cells, which consists of a set of EVs containing the miRNAs: hsa-miR-6126, hsa-miR-149-3p and hsa -miR-6780b-5p, among the 10 most abundant miRNAs, and additionally contain at least 5 of the following miRNAs: hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR -21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-miR-1307-5p and/or hsa-miR-6782-5p. and they have the surface markers CD63, CD81 and CD9
  • the vesicles or exosomes contain the following miRNAs: hsa-miR-8078; hsa-miR-7150; hsa-miR-6750-5p; hsa-miR-6727-5p; hsa-miR-5585-3p; hsa-miR-4459; hsa-miR-4449; hsa-miR-3687; hsa-miR-3197; hsa-miR-1915-3p; hsa-miR-1285-5p; hsa-miR-1275; hsa-miR-1273h-5p; hsa-miR-1273d; hsa-miR-1237-5p; hsa-miR-874-3p; hsa-miR-671-5p; hsa-miR-424-5p; hsa-miR-3
  • the EV contain a huge variety of miRNAs, in very different proportions, for the person skilled in the art it is evident that the subgroup of the 100 most abundant miRNAs is small, since they are usually sequenced and calculated. concentrations of about 2,000 to 3,000 miRNAs.
  • the inventors have obtained cultures of specific umbilical cord mesenchymal cells (UC-MSC), from different donors, from which they have obtained the compositions of the invention, those that replicate the presence of specific markers, and the relative concentrations of miRNA indicated. These compositions of the invention have proven to be useful in the treatment of osteoarticular injuries and have a positive effect in models correlated with the treatment of autoimmune diseases, as will be demonstrated in the examples.
  • U-MSC umbilical cord mesenchymal cells
  • the vesicles of the composition of the invention contain at least 8 of the following miRNAs: hsa-m ⁇ R-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-m ⁇ R-6741-5p, hsa -m ⁇ R-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-m ⁇ R-1307-5p and/or hsa-m ⁇ R -6782-5p, among the 100 most abundant miRNAs.
  • the vesicles may contain the surface markers N-cadherin and/or CD90 and/or CD44.
  • the vesicles are in a concentration of between 5xl0 7 to lxlO 13 total particles per mL, and have a size between 30 to 300 nm.
  • the invention relates to the method for obtaining the composition of the invention, in which the EVs are isolated from the culture supernatant of the umbilical cord mesenchymal cells expanded in vitro, where said cells express at least 2 of the surface markers N-cadherin, CD44, RANKL, CD105, CD56 and/or CD90 and are resuspended in a medium or vehicle free of animal components and proteins, with an osmolality between 250 and 310 mOsmol/L and a pH between 6 .0 and 8.0.
  • the EVs are isolated from the culture supernatant of the umbilical cord mesenchymal cells expanded in vitro, where said cells express at least 2 of the surface markers N-cadherin, CD44, RANKL, CD105, CD56 and/or CD90 and are resuspended in a medium or vehicle free of animal components and proteins, with an osmolality between 250 and 310 mOsmol/L and a pH between 6 .0
  • phosphate buffer or PBS Ringer's lactate
  • Hypotemerosol ® Hypotemerosol ®
  • Plasmalyte ® the essential thing is the osmolality and the pH, already indicated.
  • the EVs are isolated from the supernatant by filtering and/or centrifugation, washed at least twice with a medium or vehicle free of animal components and proteins, with an osmolality between 250 and 310 mOsmol/L and a pH between 6.0 and 8.0, and finally they are resuspended in a medium or vehicle free of animal components and proteins, with an osmolality between 250 and 310 mOsmol/L and a pH between 6.0 and 8.0. It will be apparent to one skilled in the art that there may be different protocols for isolating extracellular vesicles from mesenchymal cell culture supernatant.
  • the process of the invention does not depend on the protocol or system used for this separation, as long as it is efficient in separating vesicles with a size between 30 to 300 nm, so this separation can be carried out by any technique or instrument available at the time of preparation. carry out the invention.
  • the umbilical cord mesenchymal cells, from which the EVs are obtained express at least 3 of the N-cadherin surface markers, CD44, RANKL, CD105, CD56 and/or CD90.
  • the composition of the invention has specific activities, which make it useful for preparing a medicament for the treatment of osteoarticular and autoimmune diseases.
  • the composition has been shown to promote cartilage regeneration; as well as the increase in bone mineral density in clinical pictures of osteoarthritis in vivo.
  • the composition is useful for decreasing the proliferation of CD4+ T cells, and at the same time increasing the proliferation of T regs cells.
  • the composition makes it possible to increase M2 macrophages, or anti-inflammatory CD206+ HLA-DR+ macrophages, and/or decrease MI macrophages, or pro-inflammatory macrophages or CD86+ HLA-DR+.
  • composition is useful for the treatment of osteoarthritis, arthritis, osteoarthritis, for example.
  • it is useful for the treatment of rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, type 1 diabetes mellitus, guillain-barre syndrome, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, psoriasis, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, myasthenia severe, vasculitis, Sjogren's syndrome, Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, celiac disease, or graft-versus-host disease.
  • Example 1 Obtaining the composition of the invention.
  • Mesenchymal cells from the umbilical cord were obtained and it was verified that they had the markers N-cadherin, CD44, RANKL, CD105, CD56 and/or CD90. 3 batches of cells were obtained, in Table 1, below, the mesenchymal cell markers are shown, and of the selection condition of the invention, for each one of them.
  • the cells thus validated were cultivated under the usual conditions of any mesenchymal cell culture, until confluence in a total volume of 650 mL, with a commercial medium (DMEM high in glucose; supplemented with 5% hPL, 1% L-Glut, 1% Pen/Strep). Subsequently, the cells were washed twice with PBS (Phosphate buffer, pH7.2; 290mOsm/L) and 650mL of induction medium (DMEM high in glucose; supplemented only with 1% L-Glut) was added.
  • PBS Phosphate buffer, pH7.2; 290mOsm/L
  • 650mL of induction medium DMEM high in glucose; supplemented only with 1% L-Glut
  • the supernatant collected after each incubation 1 or 2 was centrifuged at 600 g at 4°C for 10 minutes to remove impurities.
  • the supernatants from the previous centrifugation were processed in an ultracentrifuge at 100,000 g for 1 hour and 10 minutes at 4°C, this step was repeated until the total volume of the supernatant was processed.
  • the supernatant was removed and the pellets were loosened using a vortex.
  • the pellets were subjected to two washes in order to eliminate possible contaminants. For this, the pellets were resuspended in PBS. filtrate reaching a final volume of 10 ml, and centrifuged at 100,000 g at 4°C over night.
  • hsa-miR-8078 hsa-miR-7150; hsa-m ⁇ R-6750-5p; hsa-m ⁇ R-6727-5p; hsa-m ⁇ R-5585-3p; hsa-miR-4459; hsa-miR-4449; hsa-miR-3687; hsa-miR-3197; hsa-m ⁇ R-1915-3p; hsa-m ⁇ R-1285-5p; hsa-miR-1275; hsa-miR-1273h-5p; hsa-m ⁇ R-1273d; hsa-m ⁇ R-1237-5p; hsa-m ⁇ R-874-3p; hsa-m ⁇ R-671-5p; hsa-m ⁇ R-
  • Example 2 Application of the composition of the invention for the treatment of osteoarthritis.
  • the compositions obtained in example 1 were used indistinctly, in a murine osteoarthritis model.
  • the disease is induced by injecting collagenase into the joint, in this case the knee, on days 0 and 2, and then on days 7 and 14 the respective treatment is applied, also by injection into the joint. Then, on day 40, euthanasia is performed, and the intervened joint is analyzed.
  • Each group was subdivided into 3, a first control group, which received placebo (PBS, 5mI_), a second control group in which the lesion is induced, but the treatment is not applied, so they maintain the osteoarthritis disease (OA) , and finally the group to which the injury is induced and the treatment of the invention is applied.
  • PBS placebo
  • 5ml_ Type VII Collagenase 1 U/5 m ⁇ , was applied to the joint by injection at the beginning of the experiment and on day 2 of the same, this for the lesion-only groups (OA) and for those subsequently treated.
  • the animals of the third group received as treatment the composition of the invention adjusted so as to apply an amount of 2xl0 8 exosomes, the treatment was applied 2 times, on days 7 and 14 from the beginning of the experiment, in a volume of 5mI_
  • OA score OA histology score
  • Example 3 Immunosuppression test with the composition of the invention.
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated, activated with PHA (20pg/mL) and stained with CTV (1:1000) to assess proliferation.
  • Two experimental groups were considered: a) 10 pi ⁇ of PBS control and b) treated with a single dose of the composition of the invention (sEV's) with a quantity of total particles of 2xl0 8 , dissolved in 10pL of vehicle.
  • sEV's composition of the invention
  • the proliferation of helper T cells abbreviated as Th; CD4+
  • Tregs CD4+FOXP3+CD25+
  • Figure 4 shows the percentages of proliferation of Th lymphocyte cells on the third day of culture (Fig.
  • FIG. 4a shows the fifth day of culture (Fig. 4b), where it is observed that treatment with the composition of the invention produced less proliferation.
  • Figure 5 shows the percentage of Tregs cells, where it is observed that treatment with the composition of the invention (sEV's) increased the percentage of this population, on the third day of culture.
  • Th cells correspond to a cell population with an important role in the adaptive immune response. These cells divide into Thl, Th2, and Thl7; all of them secrete cytokines to stimulate the proliferation and differentiation of cells involved in the immune response. There is evidence that T cells are present in greater numbers in organs with OA than in healthy controls.
  • Treg cells are a subpopulation of CD4+ T cells that maintain homeostasis and tolerance within the immune system, regulating or suppressing other CD4+ and CD8+ T cells, and perhaps also B lymphocytes and dendritic cells. Treg cells can produce molecules with an immunosuppressive function such as TGF-b, IL-10 and adenosine.
  • Example 4 Macrophage polarization assay with the composition of the invention
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated and then, using a negative selection kit, the monocytes present were obtained. These monocytes were cultured and differentiated into macrophages using the factors M-CSF and GM-CSF. After six days of culture, two groups were established Experimental: a) control and b) treated with a single dose of the composition of sEV's of the invention, with a quantity of total particles of lxlO 9 .
  • MI proinflammatory
  • M2 CD206+ HLA-DR+

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Abstract

Composición enriquecida en vesículas extracelulares (VE) de células mesenquimales de cordón umbilical, con marcadores y miRNA específicos, donde esta composición es útil en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes. Específicamente, se protege una composición enriquecida en vesículas extracelulares (VE) de células mesenquimales de cordón umbilical, la que consiste en un conjunto de VE que contienen los miRNA: hsa-miR-6126, hsa-miR-149-3p y hsa-miR-6780b-5p, entre los 10 miRNA más abundantes, y adicionalmente contienen al menos 5 de los siguientes miRNA: hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa- miR-6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa- miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-miR- 1307-5p y/o hsa-miR-6782-5p, y tienen los marcadores de superficie CD63, CD81 y CD9; y un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0. Método De obtención de la composición y su uso en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes.

Description

Vesículas extracelulares de células mesenquimales de cordón Umbilical para el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes.
Memoria descriptiva
Campo técnico.
La invención se relaciona al campo general de la biotecnología, y específicamente se relaciona al campo de la medicina regenerativa y a la manufactura de productos para terapia basados en células mesenquimales humanas, específicamente de vesículas extracelulares, para el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes.
Estado del Arte
Actualmente, la terapia celular conforma un puente entre la investigación y la aplicación clínica y constituye un avance respecto a la ingeniería de tejidos con el fin de reemplazar, regenerar y/o modificar células humanas, tejidos u órganos con el fin de recuperar la funcionalidad. Esta traslación está acompañada y fomentada por un número creciente de ensayos clínicos utilizando células madre, principalmente células madre mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés). Si bien el campo de la terapia celular ha avanzado vertiginosamente en diversas aplicaciones médicas, en su desarrollo existen diversos problemas técnicos que requieren mejores soluciones, que permitan por un lado abaratar los costos de estas tecnologías, y hacerla además más eficiente y segura, de modo de poder ayudar a más personas y en nuevas aplicaciones.
Un reciente enfoque en este sentido, de mayor seguridad y menor costo, es emplear las vesículas secretadas naturalmente por las células durante el cultivo celular, ya que se ha visto que tienen un gran potencial para constituir terapias libres de células. Los investigadores han estudiado la función de estas vesículas en diversos ámbitos, entre ellos se ha encontrado que cumplen un rol importante en la comunicación intercelular, que tienen un efecto en la formación y/o modulación de enfermedades a través del contenido de estas, que corresponde esencialmente a proteínas y RNA. Se ha encontrado especialmente que estas vesículas contienen una alta cantidad y variedad, de entre 2000 a 3000 tipos de microRNA o miRNA. Estás moléculas son cadenas de RNA no codificantes, que juegan un importante rol en la regulación de la expresión génica. Un subconjunto de las vesículas extracelulares son los exosomas (de 30 a 200 nm), los que ya se han utilizado como vehículos para la entrega de diferentes drogas.
Actualmente el desarrollo de terapias basadas en vesículas extracelulares, incluyendo exosomas o pequeñas vesículas extracelulares (sEV), cuenta con avances en estudios preclínicos y gran potencial de aplicación clínica, como los que se proponen en esta invención.
En el estado del arte se encuentra diferentes aplicaciones diagnósticas y algunas de tratamiento con exosomas aislados, por ejemplo, la publicación W02019038660A1 (Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst, 2019-02-28), protege un método de diagnóstico de la enfermedad de Kawasaki examinando los exosomas presentes en los fluidos biológicos del paciente.
Existen algunas solicitudes de patente en las que se emplean exosomas de células mesenquimales, para el tratamiento de algunas enfermedades, como por ejemplo glaucoma, US20190224242A1 (Tomarev et al, 2019-07-25), pero la composición empleada y las propiedades observadas en ese documento distan mucho de la composición de la invención, por ejemplo en la solicitud los exosomas tienen los marcadores CDllc + y CD63 + , mientras que en la invención se requieren los marcadores CD63, CD81 y CD9, por nombrar sólo una diferencia.
Los inventores no han encontrado en el arte previo ningún documento que anticipe la invención. De este modo la invención apunta a una composición de exosomas obtenidos de células mesenquimales de cordón umbilical (UC-MSC) los cuales contienen miRNA y/o marcadores de superficie específicos, para el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes.
Descripción de las figuras.
Figura 1. El tratamiento con la composición de la invención permite disminuir la gravedad de la lesión, en un modelo murino de osteoartritis, Estudio 1. A) Puntuación de la histología de la OA (o OA score) se muestra una articulación sana (Sham, o placebo), la articulación con Osteoartritis, y la articulación con osteoartitis tratada con la composición de la invención (Exosoma). B) Imagen representativa en la que se muestra cortes histológicos de rodilla del control "sham" (izquierda), de rodilla con inducción de OA (centro) y de rodilla con tratamiento con la composición de la invención, exosomas (derecha). Se observa mayor proporción de hueso subcondral en la rodilla tratada con exosomas p < 0,05 en comparación con el grupo OA.
Figura 2. El tratamiento con la composición de la invención muestra resultados positivos en densidad mineral ósea en modelo murino de osteoartritis, Estudio 2. A) Análisis de la densidad mineral ósea del cóndilo tibial medial de la rodilla el cual corresponde a un Análisis histomorfométrico de las imágenes 3D. B) Imagen representativa en la que se muestra imágenes de cóndilo tibial medial observado mediante pCT de rodilla del control "sham" (izquierda), de rodilla con inducción de OA (centro) y de rodilla con tratamiento con exosomas (derecha), junto con una escala en colores que representa la mineralización, siendo el extremo izquierdo la valoración con menor mineralización y el extremo derecho la valoración con mayor mineralización. Se observa que el tratamiento con exosomas previene una mayor mineralización ósea ya que los colores observados acerca del grado de mineralización son similares a los colores obtenidos en el control "sham", esto es, colores que están a la izquierda de la escala antes descrita.
Figura 3. El tratamiento con la composición de la invención muestra resultados positivos en densidad mineral ósea en modelo murino de osteoartritis, Estudio 3. A) Análisis de la densidad mineral ósea del cóndilo tibial medial de la rodilla el cual corresponde a un Análisis histomorfométrico de las imágenes 3D. B) Imagen representativa en la que se muestra imágenes de cóndilo tibial medial observado mediante pCT de rodilla del control "sham" (izquierda), de rodilla con inducción de OA (centro) y de rodilla con tratamiento con exosomas (derecha), junto con una escala en colores que representa la mineralización, siendo el extremo izquierdo la valoración con menor mineralización y el extremo derecho la valoración con mayor mineralización. Se observa que el tratamiento con exosomas previene una mayor mineralización ósea ya que los colores observados acerca del grado de mineralización son similares a los colores obtenidos en el control "sham", esto es, colores que están a la izquierda de la escala antes descrita. Figura 4. El tratamiento con la composición de la invención disminuye la proliferación de células Th CD4+.
A) células mononucleares de sangre periférica, activadas con PHA (20pg/mL), tratadas con control PBS y con la composición de la invención, se muestra la proliferación de células Th CD4+ al tercer día de cultivo.
B) proliferación al quinto día. La composición de la invención resulta en una proliferación menor que el control en ambos momentos.
Figura 5. El tratamiento con la composición de la invención aumenta la proliferación de células Tregs; caracterizadas por poseer los marcadores CD4, FOXP3 y CD25. Células mononucleares de sangre periférica, activadas con PHA (20pg/mL), tratadas con control PBS y con la composición de la invención, se muestra la proliferación de célulasTregs al tercer día de cultivo. La composición de la invención permite una proliferación mayor que el control.
Figura 6. El tratamiento con la composición de la invención polariza positivamente la diferenciación de macrófagos. Se aislaron monocitos de células mononucleares de sangre periférica, los que fueron cultivados y diferenciados a macrófagos por los factores M-CSF y GM-CSF, a los 6 días se trataron con control PBS y con la composición de la invención, A) proliferación de macrófagos MI o proinflamatorios 24 horas después del estímulo, se ve disminuida por la composición de la invención sEV, B) proliferación de macrófagos M2 o antiinflamatorios 24 horas después del estímulo, se ve aumentada por la composición de la invención sEV.
Figura 7. Gráfico que muestra las concentraciones relativas de los hsa-miRNA en las vesículas extracelulares presentes en la composición de la invención, por razones
Descripción de la invención
La invención se refiere a una composición enriquecida en vesículas extracelulares (VE) de células mesenquimales de cordón umbilical, con marcadores y miRNA específicos, donde esta composición es útil en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes, especialmente al ser inyectados en los sitios de la lesión a tratar.
Específicamente, la invención apunta a una composición enriquecida en vesículas extracelulares (VE) de células mesenquimales de cordón umbilical, la que consiste en un conjunto de VE que contienen los miRNA: hsa-miR-6126, hsa-miR-149-3p y hsa-miR-6780b-5p, entre los 10 miRNA más abundantes, y adicionalmente contienen al menos 5 de los siguientes miRNA: hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR- 6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa- miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-miR-1307-5p y/o hsa-miR-6782-5p. y tienen los marcadores de superficie CD63, CD81 y CD9;
- y un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0.
Adicionalmente, las vesículas o exosomas contienen los siguientes miRNA: hsa-miR-8078; hsa- miR-7150; hsa-miR-6750-5p; hsa-miR-6727-5p; hsa-miR-5585-3p; hsa-miR-4459; hsa-miR-4449; hsa-miR-3687; hsa- miR-3197; hsa-miR-1915-3p; hsa-miR-1285-5p; hsa-miR-1275; hsa-miR-1273h-5p; hsa-miR-1273d; hsa- miR-1237-5p; hsa-miR-874-3p; hsa-miR-671-5p; hsa-miR-424-5p; hsa-miR-376c-3p; hsa-miR-339-3p; hsa- miR-222-3p; hsa-miR-221-3p; hsa-miR-199a-3p; hsa-miR-193a-3p; hsa-miR-181a-5p; hsa-miR-146a-5p; hsa-miR-145-5p; hsa-miR-143-3p; hsa-miR-130a-3p; hsa-miR-125b-5p; hsa-miR-125a-5p; hsa-miR-100- 5p; hsa-miR-99a-5p; hsa-miR-92a-3p; hsa-miR-31-5p; hsa-miR-29b-3p; hsa-miR-29a-3p; hsa-miR-27b-3p; hsa-miR-27a-3p; hsa-miR-26a-5p; hsa-miR-24-3p; hsa-miR-23b-3p; hsa-miR-23a-3p; hsa-miR-22-3p; hsa- miR-19b-3p; hsa-miR-16-5p y/o hsa-let-7i-5p, entre los 100 miRNA más abundantes.
Como se mencionó anteriormente, se sabe que la VE contienen una enorme variedad de miRNA, en proporciones muy dispares, para el experto en la técnica es evidente que el subgrupo de los 100 miRNA más abundantes es pequeño, dado que habitualmente se secuencian y calculan las concentraciones de alrededor de 2000 a 3000 miRNA. Los inventores han obtenido cultivos de células mesenquimales de cordón umbilical (UC-MSC) específicas, de distintos donantes, de las que han obtenido las composiciones de la invención las que replican la presencia de marcadores específicos, y las concentraciones relativas de miRNA indicadas. Estas composiciones de la invención han demostrado ser útiles en el tratamiento de lesiones osteoarticulares y tener un efecto positivo en modelos correlacionados con el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tal como se demostrará en los ejemplos.
En una segunda realización las vesículas de la composición de la invención contienen al menos 8 de los de los siguientes miRNA: hsa-m¡R-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-m¡R-6741-5p, hsa-m¡R-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa- miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-m¡R-1307-5p y/o hsa-m¡R-6782-5p, entre los 100 miRNA más abundantes.
Adicionalmente, las vesículas pueden contener los marcadores de superficie N-cadherina y/o CD90 y/o CD44.
En la composición de la invención, las vesículas están en una concentración de entre 5xl07 a lxlO13 partículas totales por mL, y tienen un tamaño entre 30 a 300 nm.
En un segundo aspecto, la invención se refiere al método de obtención de la composición de la invención, en el que las VE se aíslan del sobrenadante del cultivo de células mesenquimales de cordón umbilical expandidas in vitro, donde dichas células expresan al menos 2 de los marcadores de superficie N- cadherina, CD44, RANKL, CD105, CD56 y/o CD90 y se resuspenden en un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0. En el estado de la técnica hay muchos medios que cumplen estas condiciones, tanto medios comerciales como posibles de preparar en el laboratorio. Por ejemplo, podemos nombrar tampón fosfato o PBS, Ringer lactato, Hipotemerosol ®, Plasmalyte ®, por nombrar algunos. Como se indica lo esencial es la osmolalidad y el pH, ya indicados.
Adicionalmente, las VE se aíslan desde el sobrenadante por filtrado y/o centrifugación, se lavan, al menos 2 veces con un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0, y finalmente se resuspenden en un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0. Para el experto en la técnica será evidente que pueden haber diferentes protocolos para aislar la vesículas extracelulares del sobrenadante del cultivo de las células mesenquimales. El proceso de la invención no depende del protocolo o sistema empleado para esta separación, siempre que sea eficiente en separar las vesículas de un tamaño entre 30 a 300 nm, por lo que esta separación se puede realizar por cualquier técnica o instrumento disponible al momento de realizar la invención. Las células mesenquimales de cordón umbilical, de las que se obtienen las VE expresan al menos 3 de los marcadores de superficie N-cadherina, CD44, RANKL, CD105, CD56 y/o CD90.
La composición de la invención tiene actividades específicas, que la hacen útil para preparar un medicamento para el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes. Por ejemplo, se ha demostrado que la composición promueve la regeneración de cartílago; así como el aumento de la densidad mineral ósea en cuadros clínicos de osteoartritis in vivo.
Por otra parte, la composición es útil para disminuir la proliferación de células T CD4+, y al mismo tiempo aumentar la proliferación de células T regs. La composición permite aumentar los macrófagos M2, o macrófagos antiinflamatorios CD206+ HLA-DR+, y/o disminuir los macrófagos MI, o proinflamatorios o CD86+HLA-DR+.
Todas estas facultades, además de la demostración incluida en los ejemplos, hacen evidente que la composición es útil para el tratamiento de artrosis, artritis, osteoartritis, por ejemplo. Y adicionalmente, es útil para el tratamiento de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de guillain-barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, psoriasis, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, vasculitis, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad perniciosa anemia, enfermedad celíaca o enfermedad de injerto contra huésped.
Ejemplos
Ejemplo 1: Obtención de la composición de la invención.
Se obtuvieron células mesenquimales de cordón umbilical y se comprobó que tuviesen los marcadores N- cadherina, CD44, RANKL, CD105, CD56 y/o CD90. Se obtuvieron 3 lotes de células, en la Tabla 1, a continuación, se muestran los marcadores de células mesenquimales, y de la condición de selección de la invención, para cada uno de ellos.
Figure imgf000010_0001
Tabla 1. Células mesenquimales de cordón umbilical empleadas.
Las células así validadas, se cultivaron en las condiciones habituales de cualquier cultivo de células mesenquimales, hasta confluencia en un volumen total de 650 mL, con un medio comercial (DMEM alto en glucosa; suplementado con 5% hPL, 1% L-Glut, 1% Pen/Strep). Posteriormente, las células se lavaron 2 veces con PBS (Tampón fosfato, pH7,2; 290mOsm/L) y procedió a agregar 650mL de medio de inducción (DMEM alto en glucosa; suplementado solo con 1% L-Glut).
Transcurridas 48 horas de incubación se recolectó todo el medio sobrenadante de las células, y se agregó nuevamente 650mL de medio de inducción al cultivo para una segunda incubación de 48 horas.
El sobrenadante recolectado después de cada incubación 1 ó 2 se centrifugó 600 g 4°C por 10 minutos para eliminar impurezas.
Los sobrenadantes de la centrifugación anterior se procesaron en ultracentrífuga a 100.000 g durante 1 hora y 10 minutos a 4°C, esta etapa se repitió hasta procesar el volumen total del sobrenadante. Se eliminó el sobrenadante y los pellets se soltaron utilizando un vórtex. Posteriormente los pellets fueron sometidos a dos lavados con tal de eliminar posibles contaminantes. Para ello, se resuspendieron los pellets en PBS filtrado alcanzando un volumen final de 10 mi, y se centrifugaron a lOO.OOOg a 4°C over night. Posteriormente se procedió a realizar el último lavado, para lo cual se eliminaron los sobrenadantes y se resuspendieron los pellets en un volumen final de 10ml Ringer Lactato (pH 6,5, 273mOsm/L) y se procesaron por 1 hora y 10 minutos a 4°C en ultracentrífuga a 100.000 g. Finalmente se elimina el sobrenadante, los pellets se pasaron por un vortex y se alicuotaron para su almacenamiento.
A continuación, se cuantificaron las partículas alicuotadas. La cuantificación de partículas se hizo utilizando una dilución del pellet en PBS filtrado (1:100), utilizando NanoSight NS300.
De los 3 cultivos iniciales se obtuvieron 4 lotes de partículas alicuotadas o composición de la invención. La Tabla 2, a continuación, muestra la caracterización de estas partículas en cuanto a la concentración obtenida y a la presencia de los marcadores de validación.
Figure imgf000011_0001
Tabla2. Caracterización de composiciones de acuerdo a a invención.
Los 4 lotes obtenidos se analizaron adicionalmente respecto a identidad y concentración relativa de los miRNA que contenían, se secuenciaron aproximadamente 2500 miRNA, en cada uno de ellos. A continuación en la Tabla 3, se muestran las concentraciones de los miRNA más relevantes en la invención. La Figura 7 gráfica las concentraciones del Lote A.
Figure imgf000011_0002
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Tabla 3. miRNA presentes en las EVs de la composición de la invención.
Entre los otros miR secuenciados se encontraron los siguientes en concentraciones menores o iguales a 0,02%, en todos los lotes analizados: hsa-miR-8078; hsa-miR-7150; hsa-m¡R-6750-5p; hsa-m¡R-6727-5p; hsa-m¡R-5585-3p; hsa-miR-4459; hsa- miR-4449; hsa-miR-3687; hsa-miR-3197; hsa-m¡R-1915-3p; hsa-m¡R-1285-5p; hsa-miR-1275; hsa-miR- 1273h-5p; hsa-m¡R-1273d; hsa-m¡R-1237-5p; hsa-m¡R-874-3p; hsa-m¡R-671-5p; hsa-m¡R-424-5p; hsa-miR- 376c-3p; hsa-m¡R-339-3p; hsa-m¡R-222-3p; hsa-m¡R-221-3p; hsa-m¡R-199a-3p; hsa-m¡R-193a-3p; hsa- m¡R-181a-5p; hsa-m¡R-146a-5p; hsa-m¡R-145-5p; hsa-m¡R-143-3p; hsa-m¡R-130a-3p; hsa-m¡R-125b-5p; hsa-m¡R-125a-5p; hsa-m¡R-100-5p; hsa-m¡R-99a-5p; hsa-m¡R-92a-3p; hsa-m¡R-31-5p; hsa-m¡R-29b-3p; hsa-m¡R-29a-3p; hsa-m¡R-27b-3p; hsa-m¡R-27a-3p; hsa-m¡R-26a-5p; hsa-m¡R-24-3p; hsa-m¡R-23b-3p; hsa- m¡R-23a-3p; hsa-m¡R-22-3p; hsa-m¡R-19b-3p; hsa-m¡R-16-5p y hsa-let-7i-5p.
Ejemplo 2: Aplicación de la composición de la invención para el tratamiento de osteoartritis.
Para evaluar el efecto de la composición de la invención en enfermedades osteoarticulares (OA), se emplearon indistintamente las composiciones obtenidas en el ejemplo 1, en un modelo de osteoartritis murino. En este modelo, se induce la enfermedad inyectando colagenasa en la articulación, en este caso rodilla, a los días 0 y 2, y luego a los días 7 y 14 se aplica en tratamiento respectivo, también por inyección a la articulación. Luego, al día 40 se practica eutanasia, y se analiza la articulación intervenida.
En este caso se realizaron 3 estudios independientes, en donde se trataron 65 animales en total (Estudio 1: 17 animales, Estudio 2: 20 animales, Estudio 3: 28 animales).
Cada grupo se subdividió en 3, un primer grupo control, que recibió placebo (PBS, 5mI_), un segundo grupo control al que se le induce la lesión, pero no se aplica el tratamiento, por lo que mantienen la enfermedad osteoartritis (OA), y finalmente el grupo al que se le induce la lesión y se aplica el tratamiento de la invención. Para inducir la lesión, se aplicó en la articulación, por inyección, 5 mI_ Colagenasa tipo Vil, 1 U/5 mί, al inicio del experimento y al día 2 del mismo, esto para los grupos de solo lesión (OA) y a los posteriormente tratados. Posteriormente, los animales del tercer grupo recibieron como tratamiento la composición de la invención ajustada de modo de aplicar una cantidad de 2xl08 exosomas, el tratamiento fue aplicado 2 veces, en los días 7 y 14 desde el inicio del experimento, en un volumen de 5mI_
Una vez finalizado los estudios in vivo, se realizó un análisis de la articulación tratada, ya sea con placebo, solo la lesión o con tratamiento. Para analizar el estado de la articulación se emplearon 2 técnicas, la primera, el estudio de imágenes por medio de un equipo microCT, el cual entrega el resultado de la densidad mineral ósea. Una segunda opción empleada fue realizar un análisis histológico de las rodillas tratadas, en donde se establece una Puntuación de la histología de la OA ("OA score") que corresponde a un indicador de los signos clínicos del modelo murino de osteoartritis (Cosenza, 5., Ruiz, M., Maumus, M., Jorgensen, C. &amp; Noel, D. Pathogenic or Therapeutic Extracellular Vesicles in Rheumatic Diseases: Role of Mesenchymal Stem Cell-Derived Vesicles. Int. J. Mol. Sci. 18, (2017).
Como indicamos los inventores realizaron 3 estudios in vivo, el resumen de los experimentos se presenta en la tabla 4, a continuación. Se hace notar que en el In vivo N°1 los resultados se analizaron por medio de análisis histológico y los in vivos 2 y 3 los resultados se evaluaron empleando el análisis a través de microCT.
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Tabla 4 Resumen de los estudios In vivo OA para los grupos estudiados
Resultados
Con respecto al Estudio in vivo N°1 los resultados se muestran en la Figura 1. Se pudo observar que el tratamiento con la composición de la invención tuvo un efecto sobre la lesión, es decir disminuyó el OA score de la articulación respecto al control sin tratamiento (Figura 1A), mostrando un recambio de cartílago y/o regeneración del cartílago respectivamente, lo que validaría tanto, que el modelo in vivo está funcionando, como que los exosomas presentan actividad preventiva y/o regenerativa.
Entendiendo que este Estudio in vivo corresponde a un experimento aislado, se procedió a reafirmar estos datos con otros estudios, cuyos resultados se analizaron por microCT.
Con respecto al Estudio in vivo N°2 (Figura 2), según lo que muestra el análisis de microCT se puede apreciar que la composición de la invención, o exosomas, producida por los inventores logró prevenir el daño generado por la artrosis, debido a que presentan un número menor de densidad mineral ósea BMD (Figura 2A) que en el control con sólo la lesión, obteniéndose un valor similar al del a articulación sana tratada con placebo. Específicamente, el análisis imagenológico de densidad mineral ósea (Figura 2B) evidenció que el modelo de inducción usado generó una lesión significativa, a pesar de esto los exosomas serían capaces de generar un efecto regenerativo.
Para el último estudio in vivo, Estudio 3, como se puede apreciar en la Figura 3, se puede observar que hay un efecto significativo entre la composición de la invención o sEVs, obtenidos de acuerdo al ejemplo 1 de células UC-MSC, respecto a la lesión (OA). Al igual que in vivos anteriores, se ratifica que las composiciones de acuerdo a la invención tienen efectos preventivos y/o regenerativos para la enfermedad de osteoartritis. Estos resultados demuestran que la aplicación de la composición de la invención en una lesión osteoarticular, tal como osteoartritis tiene un efecto positivo tanto el grado de la lesión, como se ve en los estudios histológicos y en el OA score, así como en la densidad mineral ósea de la articulación.
Ejemplo 3: Ensayo de inmunosupresión con la composición de la invención.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica, las que fueron activadas con PHA (20pg/mL) y teñidas con CTV (1:1000) para evaluar proliferación. Se consideraron dos grupos experimentales: a) 10 pi¬ de control PBS y b) tratadas con una dosis única de la composición de la invención (sEV's) con una cantidad de partículas totales de 2xl08, disueltas en 10pL de vehículo. En ambos grupos se realizó, durante 5 días, el seguimiento de la proliferación de células linfocitos T colaboradoras (abreviado como Th; CD4+) y el porcentaje de células T reguladoras (abreviado como Tregs; CD4+FOXP3+CD25+). En la Figura 4 se muestran los porcentajes de proliferación de las células linfocitos Th al tercer día de cultivo (Fig. 4a) y al quinto día de cultivo (Fig. 4b), en donde se observa que el tratamiento con la composición de la invención produjo una menor proliferación. En la Figura 5 se muestra el porcentaje de células Tregs, en donde se observa que el tratamiento con la composición de la invención (sEV's) aumentó el porcentaje de esta población, al tercer día de cultivo.
Las células Th corresponden a una población celular con un importante papel en la respuesta inmunitaria adaptativa. Estas células se dividen en Thl, Th2 y Thl7; todas ellas secretan citoquinas para estimular la proliferación y diferenciación de células implicadas en la respuesta inmune. Existe evidencia de que las células T están presentes en mayor número en órganos con OA que en controles sanos. Por otro lado, las células Tregs son una subpoblación de células T CD4+ que mantienen la homeostasis y tolerancia dentro del sistema inmune, regulando o suprimiendo a otras células T CD4+ y T CD8+, y puede que también a los linfocitos B y células dendríticas. Las células Tregs pueden producir moléculas con función inmunosupresora como TFG-b, IL-10 y adenosina.
Ejemplo 4: Ensayo de polarización de macrófagos con la composición de la invención
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica y luego, mediante un kit de selección negativa, se obtuvieron los monocitos presentes. Estos monocitos fueron cultivados y diferenciados a macrófagos mediante el uso de los factores M-CSF y GM-CSF. Luego de seis días de cultivo, se establecieron dos grupos experimentales: a) control y b) tratados con dosis única de la composición de sEV's de la invención, con una cantidad de partículas totales de lxlO9.
Tras 24 horas post estimulación, mediante citometría de flujo se evaluó los porcentajes de macrófagos proinflamatorios (denominados MI; CD86+HLA-DR+) y antiinflamatorios (denominados M2; CD206+ HLA- DR+). En la Figura 6 se muestran los porcentajes de células doble positivas para los marcadores MI (Figura 6a) y M2 (Figura 6b).
Los resultados muestran que el tratamiento con sEV disminuye la población de macrófagos MI y aumenta la población de macrófagos M2.

Claims

Reivindicaciones.
1.- Composición enriquecida en vesículas extracelulares (VE) de células mesenquimales de cordón umbilical, CARACTERIZADA porque la composición consiste
- en un conjunto de VE que contienen los miRNA: hsa-miR-6126, hsa-miR-149-3p y/o hsa-miR- 6780b-5p, entre los 10 miRNA más abundantes, y adicionalmente contienen al menos 5 de los siguientes miRNA: hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-miR- 1307-5p y/o hsa-miR-6782-5p entre los 100 miRNA más abundantes, y tienen los marcadores de superficie CD63, CD81 y CD9;
- y un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0.
2.- Composición de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque las vesículas contienen al menos 8 de los de los siguientes miRNA: hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR-21- 5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-miR-1307-5p y/o hsa-miR-6782-5p entre los 100 miRNA más abundantes.
3.- Composición de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque las vesículas tienen adicionalmente los marcadores de superficie N-cadherina y/o CD90 y/o CD44.
4.- Composición de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque las vesículas están en una concentración de entre 5xl07 a lxlO13 partículas totales por mL.
5.- Composición de acuerdo con la reivindicación 4 CARACTERIZADA porque las vesículas tienen un tamaño de entre 30 a 300 nm.
6.- Método de obtención de la composición de la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque las VE de entre 30 a 300 nm se aíslan del sobrenadante del cultivo de células mesenquimales de cordón umbilical expandidas in Mitro, donde dichas células expresan al menos 2 de los marcadores de superficie N- cadherina, CD44, RANKL, CD105, CD56 y/o CD90 y se resuspenden en un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre
6,0 y 8,0.
7- Método de acuerdo con la reivindicación 6 CARACTERIZADO porque se las VE se aíslan desde el sobrenadante por ultrafiltración filtración, ultracentrifugación y/o centrifugación, se lavan, al menos 2 veces con un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0, y finalmente se resuspenden en un medio o vehículo libre de componentes animales y de proteínas, con una osmolalidad de entre 250 y 310 mOsmol/L y un pH entre 6,0 y 8,0.
8.- Método de acuerdo con la reivindicación 7 CARACTERIZADO porque las células mesenquimales de cordón umbilical expresan al menos 3 de los marcadores de superficie N-cadherina, CD44, RANKL, CD105, CD56 y/o CD90.
9.- Uso de la composición de la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque se emplea para preparar un medicamento útil en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares y autoinmunes.
10.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil en la promoción de la regeneración de cartílago.
11.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil en la prevención de la degradación de cartílago.
12.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil en la disminución de la densidad mineral ósea en enfermedades osteoarticulares.
13.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil para disminuir la proliferación de células T CD4+.
14.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil para aumentar la proliferación de células T regs.
15.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil para aumentar los macrófagos M2, o macrófagos antiinflamatorios CD206+ HLA-DR+, y/o disminuir los macrófagos MI, o proinflamatorios o CD86+HLA-DR+.
16.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil para el tratamiento de artrosis, artritis, osteoartritis,
17.- Uso, de acuerdo con la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la composición es útil para el tratamiento de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de guillain-barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, psoriasis, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, vasculitis, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad perniciosa anemia, enfermedad celíaca o enfermedad de injerto contra huésped.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023240069A1 (en) * 2022-06-06 2023-12-14 The University Of Vermont And State Agricultural College Extracellular vesicle micrornas and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160002597A1 (en) * 2013-02-12 2016-01-07 Reneuron Limited Method of producing microparticles
WO2019038660A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) EXOSOMAL PROFILING FOR THE DIAGNOSIS AND MONITORING OF VASCULITE AND VASCULOPATHIES, INCLUDING KAWASAKI'S DISEASE
US20190224242A1 (en) 2018-01-25 2019-07-25 The U.S. of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Exosomes and mirna to treat glaucoma

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160002597A1 (en) * 2013-02-12 2016-01-07 Reneuron Limited Method of producing microparticles
WO2019038660A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) EXOSOMAL PROFILING FOR THE DIAGNOSIS AND MONITORING OF VASCULITE AND VASCULOPATHIES, INCLUDING KAWASAKI'S DISEASE
US20190224242A1 (en) 2018-01-25 2019-07-25 The U.S. of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Exosomes and mirna to treat glaucoma

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALONSO, M.L. ET AL.: "Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells: A Review of Common Cargos", STEM CELL REVIEWS AND REPORTS, vol. 18, no. 3, 26 April 2021 (2021-04-26), pages 854 - 901, XP037746100, DOI: 10.1007/s1 2015-021-10155-5 *
ASGARPOUR KASRA, SHOJAEI ZAHRA, AMIRI FATEMEH, AI JAFAR, MAHJOUBIN-TEHRAN MARYAM, GHASEMI FAEZEH, AREFNEZHAD REZA, HAMBLIN MICHAEL: "Exosomal microRNAs derived from mesenchymal stem cells: cell-to-cell messages", CELL COMMUNICATION AND SIGNALING, vol. 18, no. 1, 1 December 2020 (2020-12-01), XP093003100, DOI: 10.1186/s12964-020-00650-6 *
COSENZA, S.RUIZ, M.MAUMUS, M.JORGENSEN, C.NOEL, D.: "Pathogenic or Therapeutic Extracellular Vesicles in Rheumatic Diseases: Role of Mesenchymal Stem Cell-Derived Vesicles", INT. J. MOL. SCI., vol. 18, 2017, XP055583118, DOI: 10.3390/ijms18040889
HUANG BO, HUANG LIN-FENG, ZHAO LING, ZENG ZONGYUE, WANG XI, CAO DAIGUI, YANG LIJUAN, YE ZHENYU, CHEN XIAN, LIU BIN, HE TONG-CHUAN,: "Microvesicles (MIVs) secreted from adipose-derived stem cells (ADSCs) contain multiple microRNAs and promote the migration and invasion of endothelial cells", GENES & DISEASES, ELSEVIER BV, NL, vol. 7, no. 2, 1 June 2020 (2020-06-01), NL , pages 225 - 234, XP093003089, ISSN: 2352-3042, DOI: 10.1016/j.gendis.2019.04.005 *
LIANG CHENYU, LIU YANG, XU HUIFENG, HUANG JUNLING, SHEN YI, CHEN FAXIU, LUO MING: "Exosomes of Human Umbilical Cord MSCs Protect Against Hypoxia/Reoxygenation-Induced Pyroptosis of Cardiomyocytes via the miRNA-100-5p/FOXO3/NLRP3 Pathway", FRONTIERS IN BIOENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, vol. 8, XP093003093, DOI: 10.3389/fbioe.2020.615850 *
MATAS JOSE, ORREGO MARIO, AMENABAR DIEGO, INFANTE CATALINA, TAPIA-LIMONCHI RAFAEL, CADIZ MARIA IGNACIA, ALCAYAGA-MIRANDA FRANCISCA: "Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for Knee Osteoarthritis: Repeated MSC Dosing Is Superior to a Single MSC Dose and to Hyaluronic Acid in a Controlled Randomized Phase I/II Trial", STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE, ALPHAMED PRESS, INC., US, vol. 8, no. 3, 1 March 2019 (2019-03-01), US , pages 215 - 224, XP093003107, ISSN: 2157-6564, DOI: 10.1002/sctm.18-0053 *
MIANEHSAZ, E. ET AL.: "Mesenchymal stem cell -derived exosomes: a new therapeutic approach to osteoarthritis?", STEM CELL RESEARCH & THERAPY, vol. 10, no. 1, 2019, pages 1 - 13, XP055965127, DOI: 10.1186/s13287-019-1445-0 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023240069A1 (en) * 2022-06-06 2023-12-14 The University Of Vermont And State Agricultural College Extracellular vesicle micrornas and uses thereof

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