DE202016008300U1

DE202016008300U1 - Zusammensetzungen zur Kombinationstherapie mit Denguevirus und dendritischen Zellen

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Publication number: DE202016008300U1
Application number: DE202016008300.8U
Authority: DE
Original assignee: Primevax Immuno-Oncology Inc
Current assignee: Primevax Immuno-Oncology Inc
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2016-07-01
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2026-07-02
Also published as: WO2017004567A1; EP3316897A1; US20170304422A1; US20210187086A1; US20190046622A1; JP2021176862A; US20180050098A1; US20190247479A1; JP2018522880A; CA2991212A1; EP3316897A4; US10357553B2; MX2018000052A; US9849167B2; CN107921063A; US10159727B2; US9730989B2; US20170000868A1; US10946080B2

Abstract

Eine Zusammensetzung zur Verringerung von Tumorzellen, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zum Auslösen einer Immunantwort umfasst, wobei der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 für eine verstärkte Verringerung von Tumorzellen sorgt, wenn dieser vor Verabreichung von mit Tumorantigen geprimeten dendritischen Zellen verabreicht wird, im Vergleich zu der Verabreichung von jedem Mittel allein.

Description

QUERVERWEIS
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der Provisorischen U.S.-Anmeldung Nr. 62/231,351, die am 2. Juli 2015 angemeldet wurde, auf welche hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
SEQUENZPROTOKOLL
Die vorliegende Anmeldung enthält ein Sequenzprotokoll, welches elektronisch im ASCII-Format eingereicht wurde und auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Diese ASCII-Kopie, die am 29. Juni 2016 erzeugt wurde, nennt sich 48253-702_601_SL.txt und weist eine Größe von 1.871 Bytes auf.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem Subjekt, das dessen bedarf, umfassend: Inkubieren dendritischer Zellen (DCs) mit mindestens einem Tumorzellantigen; Verabreichen eines Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 an das Subjekt; und Verabreichen der DCs an das Subjekt. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das mindestens eine Tumorzellantigen aus einer Zelle eines soliden Krebses oder einer Blutkrebszelle aus dem Subjekt stammt. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen der Blutkrebs Leukämie oder ein Lymphom ist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen der solide Krebs ein Melanom, Brust-, Prostata- oder Gehirnkrebs ist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs durch Leukapherese erhalten werden. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs oder das mindestens eine Tumorzellantigen aus dem Subjekt stammen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs und das mindestens eine Tumorzellantigen aus dem Subjekt stammen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das mindestens eine Tumorzellantigen aus dem Subjekt stammt. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das mindestens eine Tumorzellantigen in einer Suspension vorliegt, die einzelne Zellen umfasst. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs mit dem mindestens einen Tumorzellantigen gepulst werden. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das mindestens eine Tumorzellantigen ein Peptid ist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Peptid eine Länge von ca. 9 Aminosäuren aufweist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um eine systemische Infektion hervorzurufen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs verabreicht werden, nachdem die Temperatur des Subjekts 38 Grad Celsius oder höher erreicht. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs verabreicht werden, nachdem die Temperatur des Subjekts 38,5 Grad Celsius erreicht. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen Monozyten des Subjekts prozessiert werden, um die DCs zu erhalten. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs reife DCs sind, die in der Lage sind, Antigen aufzunehmen.
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem Subjekt, das dessen bedarf, umfassend: Lysieren eines Tumorgewebes aus einem Subjekt, um ein Lyseprodukt zu bilden, das apoptotische oder nekrotische Körper umfasst; Inkubieren dendritischer Zellen (DCs) mit dem Lyseprodukt; Verabreichen eines Denguevirus an ein Subjekt; und Verabreichen der DCs an das Subjekt, nachdem die Temperatur des Subjekts 38 Grad Celsius oder höher erreicht. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Tumorgewebe eine Zelle aus einem soliden Krebs oder einem Blutkrebs umfasst. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen der Blutkrebs Leukämie oder ein Lymphom ist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen der solide Krebs ein Melanom, Brust-, Prostata- oder Gehirnkrebs ist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs aus dem Subjekt stammen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs durch Leukapherese erhalten werden. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs nicht aus dem Subjekt stammen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Tumorgewebe vor der Lyse in einer Suspension vorliegt, die einzelne Zellen umfasst. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs mit dem Lyseprodukt gepulst werden. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Denguevirus in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um eine systemische Infektion hervorzurufen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Erhalten von DCs das Prozessieren von Monozyten des Subjekts umfasst, um die dendritischen Zellen zu erzeugen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs reife DCs sind, die in der Lage sind, Antigen aufzunehmen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Tumorgewebe in einer Menge von 0,5 bis 5 Gramm vorliegt. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Tumorgewebe in einer Menge von 1 bis 2 Gramm vorliegt. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Denguevirus zum Serotyp 1, 2, 3, 4 oder 5 gehört. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Denguevirus zum Serotyp 2 gehört. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen das Denguevirus der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 ist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Verfahren, bei welchen die DCs an das Subjekt verabreicht werden, nachdem die Temperatur des Subjekts 38,5 Grad Celsius erreicht.
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zum Targeting von Krebszellen, umfassend: Inkubieren dendritischer Zellen (DCs) mit mindestens einem Tumorzellantigen; Verabreichen eines Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 an ein Subjekt; und Verabreichen der DCs an das Subjekt.
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zum Targeting von Krebszellen, umfassend: Lysieren von Tumorgewebe aus einem Subjekt, um ein Lyseprodukt zu bilden, das apoptotische oder nekrotische Körper umfasst; Inkubieren dendritischer Zellen (DCs) mit dem Lyseprodukt; Verabreichen eines Denguevirus an das Subjekt; und Verabreichen der DCs an das Subjekt, nachdem die Temperatur des Subjekts 38,5 Grad Celsius oder höher erreicht.
Hierin bereitgestellt werden Zusammensetzungen zur Verringerung von Tumorzellen, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zum Auslösen einer Immunantwort umfasst, wobei der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 für eine erhöhte Verringerung von Tumorzellen sorgt, wenn er vor Verabreichung von mit Tumorantigen geprimeten dendritischen Zellen verabreicht wird, im Vergleich zu der Verabreichung von jedem Mittel allein. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Zusammensetzungen, bei welchen die Tumorzellen aus einem soliden Krebs oder einem Blutkrebs stammen. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Zusammensetzungen, bei welchen der Blutkrebs Leukämie oder ein Lymphom ist. Weiterhin bereitgestellt werden hierin Zusammensetzungen, bei welchen der solide Krebs ein Melanom, Brust-, Prostata- oder Gehirnkrebs ist.
Hierin bereitgestellt wird die Verwendung einer wirksamen Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs. Hierin bereitgestellt wird die Verwendung einer wirksamen Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zur Behandlung von Krebs. Hierin bereitgestellt wird eine wirksame Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs.
HINTERGRUND
Die Immuntherapie, anders als zytotoxische Arzneimittel, Bestrahlung und Operation, stimuliert das Immunsystem, um Tumorzellen zu erkennen und abzutöten. Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden, um das Immunsystem zu stimulieren, um Tumorzellen zu erkennen und zu zerstören. Diese hatten nur begrenzten Erfolg aufgrund der Selbstidentität von Peptiden, die als Target für die Immuntherapie ausgewählt wurden, dem Fehlen einer Immunaktivierung, unerwünschten Ereignissen und/oder Tumorimmunumgehungsmechanismen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt beispielhaft ein Verfahren der Behandlung mit Denguevirus und geprimeten dendritischen Zellen dar.
2 zeigt ein Diagramm, das der Anzahl von Lungenmetastasen aus Melanomzellen in Mäusen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen entspricht. Die gemusterten Balken stellen die mittlere Anzahl von Lungenmetastasen für jede Bedingung dar.
3 zeigt ein Diagramm, das der Anzahl von Lungenmetastasen aus Melanomzellen in Mäusen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen entspricht. Die gemusterten Balken stellen die mittlere Anzahl von Lungenmetastasen für jede Bedingung dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Definitionen
Über die gesamte Offenbarung hinweg werden verschiedene Ausführungsformen in einem Bereichsformat dargestellt. Man sollte verstehen, dass die Beschreibung im Bereichsformat lediglich der Bequemlichkeit und Kürze dient und nicht als eine unflexible Beschränkung des Umfangs irgendwelcher Ausführungsformen ausgelegt werden sollte. Dementsprechend sollte die Beschreibung eines Bereichs so betrachtet werden, dass sie spezifisch all die möglichen Unterbereiche wie auch einzelnen numerischen Werte innerhalb dieses Bereichs offenbart, bis zu dem Zehntel der Einheit der Untergrenze, sofern nicht der Zusammenhang klar etwas anderes bestimmt. Beispielsweise sollte die Beschreibung eines Bereichs wie z. B. von 1 bis 6 so verstanden werden, dass diese spezifisch Unterbereiche wie z. B. von 1 bis 3, von 1 bis 4, von 1 bis 5, von 2 bis 4, von 2 bis 6, von 3 bis 6 usw. offenbart, wie auch einzelne Werte innerhalb dieses Bereichs, beispielsweise 1,1, 2, 2,3, 5 und 5,9. Dieses gilt unabhängig von der Breite des Bereichs. Die Ober- und Untergrenzen dieser überlappenden Bereiche können unabhängig in den kleineren Bereichen eingeschlossen sein und sind ebenfalls innerhalb der Erfindung umfasst, außer irgendeinem spezifisch ausgeschlossenen Grenzwert in dem angegebenen Bereich. Wo der angegebene Bereich einen oder beide der Grenzwerte einschließt, sind Bereiche, die entweder einen oder beide dieser eingeschlossenen Grenzwerte ausschließen, ebenfalls von der Erfindung umfasst, sofern der Zusammenhang nicht klar etwas anderes bestimmt.
Die hierin verwendete Terminologie dient nur dem Zweck, bestimmte Ausführungsformen zu beschreiben, und ist nicht dazu gedacht, irgendeine Ausführungsform zu beschränken. Wie hierin verwendet sollen die Singularformen „ein”, „eine” und „der/die/das” ebenfalls die Pluralformen einschließen, sofern der Zusammenhang nicht klar etwas anderes angibt. Man wird weiterhin verstehen, dass die Ausdrücke „umfasst” und/oder „umfassend”, wenn sie in dieser Beschreibung verwendet werden, das Vorliegen von angegebenen Merkmalen, Zahlen, Schritten, Arbeitsvorgängen, Elementen und/oder Komponenten spezifizieren, aber nicht das Vorliegen oder die Zugabe von einem oder mehreren anderen Merkmalen, Zahlen, Schritten, Arbeitsvorgängen, Elementen, Komponenten und/oder Gruppen davon ausschließen. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Ausdruck „und/oder” jegliche und alle Kombinationen von einem oder mehreren der zusammen aufgeführten Objekte.
Wenn nicht speziell angegeben oder aus dem Zusammenhang ersichtlich, wird der Ausdruck „ca.” in Bezug auf eine Zahl oder einen Bereich von Zahlen, wie er hierin verwendet wird, so verstanden, dass dieser die angegeben Zahl und Zahlen +/–10% davon oder 10% unter dem unteren aufgelisteten Grenzwert und 10% über dem höchsten aufgelisteten Grenzwert für die Werte, die für einen Bereich aufgelistet werden, bedeutet.
Der Ausdruck „Subjekt”, wie er hierin verwendet wird, schließt Säuger ein. Säuger schließen Ratten, Mäuse, nicht menschliche Primaten und Primaten, einschließlich Menschen, ein.
Kombinationsabgabe
Hierin beschrieben werden Zusammensetzungen und Verfahren, bei welchen eine Impfung mit dendritischen Zellen mit einer unterstützenden Wirkung eines Stamms des Denguevirus (DV) kombiniert wird, um Tumorimmunumgehungsmechanismen zu überwinden und Tumorzellen zu dezimieren. Hier beschriebene Verfahren können verwendet werden, um ein Subjekt 101 im Hinblick auf Krebs zu behandeln, indem 101 dendritische Zellen 102 und Tumorzellen 104 von dem Subjekt erhalten werden, die dendritischen Zellen an die Tumorzellen oder das Tumorzelllysat 105 ausgesetzt werden, was ebenfalls als „Pulsen” der dendritischen Zellen zu geprimeten (oder „aktivierten”) dendritischen Zellen bezeichnet wird, 107 die resultierenden geprimeten und auf den Tumor abzielenden dendritischen Zellen an das Subjekt abgegeben werden, nachdem das Immunsystem des Subjekts mit DV 108 stimuliert wurde (siehe z. B. 1). Wahlweise stammt das Tumorantigen nicht von dem Subjekt und kann verwendet werden, um die dendritischen Zellen zu pulsen.
Tumorimmunumgehungsmechanismen sind für das Fehlen einer Wirksamkeit verantwortlich, die bei den meisten Immuntherapieprogrammen beobachtet wird. Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren liefern einen mehrgleisigen Ansatz, indem sie physiologische (hyperthermische Reduktion der Tumorperfusion), immunologische (Aktivierung von Effektorzellen des adaptiven und immanenten Immunsystems) und Apoptose-induzierende Wege (sTRAIL) kombinieren, um Tumorzellen zu zerstören. Die Verwendung von DV als einem Hilfsmittel, um viele Wege zu aktivieren, die in Synergie arbeiten, kann die Ausrottung von mutierten Tumorzellen unterstützen, was die klinische Wirksamkeit der Krebsimmuntherapie verbessert. Hierin beschriebene Verfahren stellen Krebsimmuntherapien bereit, die auf multiplen Wirkungsmechanismen, welche zusammenarbeiten, basieren und zu einer Abnahme bei der Fähigkeit von Tumorzellen führen, Methoden des Widerstands einzusetzen, im Vergleich zu der Abgabe von irgendeinem einzelnen Verfahren allein.
Hierin offenbart werden Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem Subjekt, das dessen bedarf, umfassend: Erhalten von dendritischen Zellen (DCs); Inkubieren der DCs mit mindestens einem Tumorzellantigen; Verabreichen eines Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms an das Subjekt; und Verabreichen der DCs an das Subjekt. In manchen Fällen ist der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710. In manchen Fällen sind die dendritischen Zellen autologe dendritische Zellen. In manchen Fällen sind die dendritischen Zellen allogene dendritische Zellen. In manchen Fällen umfasst das Inkubieren der DCs mit mindestens einem Tumorantigen das Inkubieren der DCs mit einer Tumorzelle. In manchen Fällen umfasst das Inkubieren der DCs mit mindestens einem Tumorantigen das Inkubieren der DCs mit einem Tumorzelllysat.
Verfahren des Isolieren und Lysieren von Tumorzellen
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zur Kombinationstherapie mit einem DV und aktivierten DCs, um auf Tumorzellen abzuzielen. In manchen Fällen werden DCs mit Tumorzellen aus einem Subjekt geprimet. In manchen Fällen werden die Tumorzellen aus Zellen aus einer Tumormikroumgebung des Subjekts isoliert, welche hierin als Tumor unterstützende Zellen bezeichnet werden. In manchen Fällen werden dendritische Zellen an Tumorzellen, Tumor unterstützende Zellen und/oder Peptide von diesen ausgesetzt/mit diesen gepulst, so dass die dendritischen Zellen auf Tumorzellen und/oder Tumor unterstützende Zellen, die das Tumorwachstum und die Metastase unterstützen (z. B. Endothelzellen, vaskuläre Zellen, Immunzellen usw.) abzielen. In manchen Fällen induzieren Peptide/Antigene aus Tumorzellen und Tumor unterstützenden Zellen dendritische Zellen oder zytotoxische Lymphozyten mit Rezeptoren für Peptide/Antigene sowohl auf Tumorzellen als auch Tumor unterstützenden Zellen, was zu dem Targeting der dendritischen Zellen oder zytotoxischen Lymphozyten auf die Mikroumgebung des Tumors statt nur auf die Tumorzellen führt. In manchen Fällen werden Tumorzellen und/oder Tumor unterstützende Zellen aus einer Biopsie von Tumorgewebe erhalten. In manchen Fällen umfasst die Biopsie Zellen, die ausgewählt sind aus Tumorzellen, Adipozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, infiltrierenden Immunzellen und Kombinationen von diesen.
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zur Kombinationstherapie mit einem DV und aktivierten DCs, um auf Tumorzellen abzuzielen, wobei die DCs mit lysierten Tumorzellen und/oder Tumor unterstützenden Zellen und umgebender extrazellulärer Matrix aktiviert werden. In manchen Fällen umfasst das Lysieren das Kontaktieren der Tumorzellen und/oder Tumor unterstützenden Zellen mit einer NH₄Cl-Enzymlösung, um rote Blutzellen zu eliminieren. In manchen Fällen umfasst das Lysieren das Kontaktieren der Tumorzellen und/oder Tumor unterstützenden Zellen mit hypochloriger Säurelösung, um einen immunogenen Zelltod zu induzieren. In manchen Fällen werden die Zellen schonend genug lysiert, um Peptide nicht zu zerstören. In manchen Fällen werden die Zellen lysiert, um apoptotische oder nekrotische Körper zu erzeugen. In manchen Fällen umfassen die Verfahren das Lysieren der Tumorzellen und/oder Tumor unterstützenden Zellen mit einer enzymatischen Lösung. In manchen Fällen umfassen die Verfahren das Lysieren der Tumorzellen und/oder Tumor. unterstützenden Zellen mit einer Peroxid-freien Lösung oder einer wenig Peroxid enthaltenden Lösung. In manchen Fällen umfassen die Verfahren das Lysieren der Tumorzellen und/oder Tumor unterstützenden Zellen mit einer Detergenslösung. In manchen Fällen wird das Detergens ausgewählt aus Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween 20, Tween 80, Octylglucosid, Octylthioglucosid, SDS, CHAPS und CHAPSO, ist aber nicht darauf beschränkt. In manchen Fällen ist die Detergenslösung von Peroxiden und anderen Verunreinigungen gereinigt. In manchen Fällen macht das Detergens ca. 0,1% bis ca. 10% Vol./Vol. der Detergenslösung aus. In manchen Fällen macht das Detergens ca. 0,1% bis ca. 5% Vol./Vol. der Detergenslösung aus. in manchen Fällen macht das Detergens ca. 0,5% bis ca. 5% Vol./Vol. der Detergenslösung aus. In manchen Fällen macht das Detergens ca. 1% bis ca. 10% Vol./Vol. der Detergenslösung aus. In manchen Fällen macht das Detergens ca. 1% bis ca. 5% Vol./Vol. der Detergenslösung aus. In manchen Fällen umfassen die Verfahren das Lysieren der Zellen ohne Schütteln, Vortexen, Einfrieren, Auftauen, Scherungsdruck, Beschallen und/oder Erwärmen der Zellen.
Verfahren des Isolieren und Primens von dendritischen Zellen (DCs)
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zur Kombinationstherapie mit einem DV und aktivierten DCs, um auf Tumorzellen abzuzielen, wobei die DCs allogene oder autologe dendritische Zellen umfassen. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Verabreichen allogener geprimeter dendritischer Zellen an ein Subjekt. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Verabreichen autologer geprimeter dendritischer Zellen an ein Subjekt.
In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Erhalten dendritischer Zellen aus CD34⁺-Progenitorzellen im Knochenmark. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Erhalten dendritischer Zellen aus CD1⁺CD14⁺ immaturen Monozyten im peripheren Blut. In manchen Fällen umfasst das Erhalten der dendritischen Zellen Leukapherese. In manchen Fällen umfasst Leukapherese das Entnehmen einer Bluteinheit aus dem Subjekt oder einem Spender, wobei eine Reihe von Blutbestandteilen abgetrennt wird: rote Zellen, Blutplättchen und der Großteil der Plasmafaktoren, welche zu dem Subjekt zurückgeführt werden, wobei die weißen Blutzellen zurückbleiben. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Testen der weißen Blutzellen auf Sterilität, das Versenden oder Lagern von diesen in der Kälte (4°C) und oder das Prozessieren der DC aus dem Aphäreseprodukt.
In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen von DCs mit einem Peptid. In manchen Fällen umfassen die Verfahren das Pulsen von DCs mit einem Peptid, das MHC-Klasse I-Moleküle bindet („MHC-Klasse I-Peptid”). In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen von DCs mit einem Peptid, das MHC-Klasse II-Moleküle bindet („MHC-Klasse II-Peptide”). In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen von DCs mit MHC-Klasse I-Peptiden und MHC-Klasse II-Peptiden. In manchen Fällen macht das Pulsen die DCs kompetent, um CTL zu primen und CTL gezielt auf Tumore zu lenken. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen von DCs mit hergestellten/synthetischen Klasse I- und/oder Klasse II-Peptiden. In manchen Fällen werden die Klasse I- und/oder Klasse II-Peptide hergestellt, dann zu dem DC-Medium, wahlweise in Mikrogrammmengen oder weniger, zugegeben. In manchen Fällen beinhalten hierin beschriebene Verfahren Klasse II-Peptide für eine anhaltende Immunantwort. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren eine DNA- oder RNA-Sequenzierung des Peptids (d. h. Tumorantigens) und/oder das Verwenden einer Elektroporation, um die DNA oder RNA in die DC einzuführen, um die Antigenprozessierung zu triggern. In manchen Fällen benötigen hierin beschriebene Verfahren kein HLA-Matching der DCs. In manchen Fällen wird das Peptid oder ein Teil davon durch eine Aminosäuresequenz dargestellt, die ausgewählt ist aus EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 1), (TAYRYHLL) (SEQ ID NO: 2) oder Kombinationen von diesen.
In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Kontaktieren der dendritischen Zellen mit autologen Tumorzellen oder Lysaten von diesen. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Kontaktieren der dendritischen Zellen mit autologen Zellen des gesamten Tumors (z. B. Tumorzellen und Tumor unterstützende Zellen) oder Lysaten von diesen, welche die volle Anzahl an potentiellen Antigenen für eine breite und tiefe Immunantwort enthalten. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Kontaktieren der dendritischen Zellen mit Tumorzelllysat, das apoptotische oder nekrotische Körper umfasst. In weiteren Fällen umfasst das Tumorzelllysat Tumorantigene aus der die Tumorzellen umgebenden Mikroumgebung, wie z. B. extrazelluläre Matrixproteine. In manchen Fällen umfasst das Kontaktieren ein Pulsen, wobei das Pulsen das Kontaktieren der dendritischen Zellen mehr als einmal in einem oder mehreren Intervallen umfasst. In manchen Fällen umfasst das „Pulsen” von DCs das Kontaktieren von DCs mit Peptiden/Antigenen, Tumorzellen, Tumor unterstützenden Zellen, Tumorzelllysat und/oder Lysat von Tumor unterstützenden Zellen. In manchen Fällen umfasst das Lysieren der Tumorzellen keinen Trypsin-Enzymverdau und Einfrier-Auftau-Zyklen, welche einfach und schnell sind, aber die empfindlichen Peptide innerhalb schädigen können. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Verwenden eines automatisierten Zellprozessors, wie dem Miltenyi GentleMACS-System, als ein nicht beschränkendes Beispiel, um die Probe manuell zu zerkleinern; Zellen in PBS-Lösung zu suspendieren; und/oder die Tumorzellen mit einem vorher ausgewählten gewebespezifischen Software-gesteuertem Rotorsystem abzutrennen. In manchen Fällen wird die Suspension von einzelnen Zellen membranlysiert, bei minimalem Schaden für die Tumorpeptide. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen der DCs für ca. 1 Stunde bis ca. 24 Stunden. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen der DCs für ca. 12 Stunden bis ca. 48 Stunden. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen der DCs für ca. 8 Stunden bis ca. 24 Stunden. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Pulsen der DCs für ca. 18 Stunden.
Dengueviren
Hierin bereitgestellt werden Verfahren zur Kombinationstherapie mit einem Denguevirus (DV) und aktivierten DCs, um auf Tumorzellen abzuzielen, wobei das DV einem Subjekt verabreicht wird. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Ausdruck „Denguevirus” jeglichen Serotyp der Denguevirus-Serotypen 1, 2, 3, 4 oder 5.
Dengueviren sind Arboviren und werden ausschließlich durch Mücken der Spezies Aedes aegypti und albopictus übertragen. Das Virus weist einen komplexen Lebenszyklus auf, welcher ein nicht identifiziertes waldbewohnendes Säugerreservoir (möglicherweise Primaten) und menschliche Wirte beinhaltet. Die weibliche Mücke nimmt eine Blutmahlzeit von einer infizierten Person ein, das Virus repliziert sich bis auf eine hohen infektiösen Titer (105/ml) in Darmepithelzellen, wird dann auf eine andere Person übertragen, wenn die Mücke ihren Saugrüssel (stylet) nach einer weiteren Blutmahlzeit unter Verwendung von Gegendruck herauszieht. Dengue-Epidemien infizieren 50 Millionen Personen jährlich, mit mehreren tausend Toten, gewöhnlich Kinder mit einer unzureichenden Behandlung des sekundären mit der Infektion zusammenhängenden Schocks.
Das Denguevirusgenom kodiert Strukturproteine, Capsidprotein C, Membranprotein M, Hüllprotein E und Nichtstrukturproteine NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b und NS5. In manchen Fällen ist das Denguevirus ein lebender Stamm des Denguevirus. In manchen Fällen ist das Denguevirus ein abgeschwächter (attenuated) Stamm des Denguevirus. In manchen Fällen ist das Denguevirus ein geschwächter (weakened) Stamm des Denguevirus. In manchen Fällen ist das Denguevirus ausgewählt aus den folgenden Serotypen des Denguevirus: DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 und DENV-5 und Kombinationen von diesen.
Dengueviren sind Viren mit positivem RNA-Strang der Togavirusfamilie, Unterfamilie Flaviviridae (Gruppe B). Das Virus weist eine ikosaedrische Geometrie auf und weist ungefähr 40–45 Nanometern im Durchmesser auf. Das Genom mit 11.000 Basen kodiert für ein Nukleocapsid(NC)-Protein, ein prM Membranfusionsprotein, ein Hüllglycoprotein (E) und 5 Nichtstrukturproteine NS1–NS5. Das NC-Protein bildet den Viruskern, wobei die Hüllenspikes über den prM-Komplex befestigt sind. Das E-Glycoprotein ist das Hauptziel neutralisierender Antikörper, und die NS-3- und NS-4-Proteine bilden die Hauptziele für CD4+ und CD8+CTL.
Die Dengueviren setzen sich aus fünf individuellen Serotypen, DENV-1 bis DENV-5, zusammen. Die Serotypen 2 und 4 sind kreuzneutralisierend für IgG, und die Typen 1 und 3 sind ebenfalls kreuzneutralisierend. Die Immunität ist nicht vollständig, jedoch ist Dengue unter den viralen Infektionen darin einzigartig, dass eine nachfolgende Infektion durch einen nicht kreuzneutralisierenden Serotyp aufgrund des Schocksyndroms durch Immunhyperaktivierung ein erhöhtes Sterberisiko mit sich bringt.
Hierin bereitgestellt werden Zusammensetzungen und ein Verfahren unter Verwendung solcher Zusammensetzungen, wobei die Zusammensetzung Denguevirus-Serotyp 1, 2, 3, 4 oder 5 umfasst. In manchen Fällen ist das DV Serotyp 2. In manchen Fällen ist das DV Serotyp 2 der DENV-2-Stamm #1710. Der Stamm stammt aus einer Probe, die in 1985 in Puerto Rico genommen wurde, und wurde aus einer restriktionsstellenspezifischen RT-PCR-Analyse unter Verwendung von 4 Primern (siehe Tabelle 1) als Typ A charakterisiert, welcher für die Hüllengenregion spezifisch ist. Siehe Harris et al., Virology 253, 86–95 (1999). Eine restriktionsstellenspezifische RT-PCR mit diesen Primern erzeugt Amplifikationsprodukte von 582 Basenpaaren, 754 Basenpaaren und möglicherweise 676 Basenpaaren. Der DENV-2-Stamm #1710 ist in einer CDC-Datenbank als Eintrag Nummer 555 verzeichnet. Siehe Harris (1999). Der DEN V-2-Stamm #1710 wurde während einer Epidemie in Puerto Rico isoliert. Dieser Ausbruch wies 9.540 vermutete Fälle von DV auf, mit einem vermuteten, aber nicht bestätigten Toten aufgrund des Virus, was anzeigt, dass die Toxizität des DEN-2-Stamms #1710 sehr gering ist und dieser daher für die hierin offenbarten Verfahren geeignet ist.
Tabelle 1. Sequenz und Position von Primern, um DENV-2-Viren zu amplifizieren

DV weist viele Charakteristika auf, die dessen Verwendung als ein potentes Immunstimulans in der Krebsimmuntherapie unterstützen. DV weist Affinität für immature B-Lymphozyten und Antigen-präsentierende Zellen (APC) von Monozyten/Makrophagen- und DC-Abstammung auf. Ein einzigartiges Merkmal von DV ist, dass primäre Infektionen zu einer Aktivierung einer T_H1-Typ-Antwort auf CD4+ und CD8+ Helfer-Induktor- und zytotoxische Effektor-CTL führen. Durch ein Infizieren aber nicht Abtöten der APC reguliert DV deren CD80- und CD83-Expression nach oben, war zu einem proentzündlichen T_H1-Zytokinprofil führt. Primäre DV-Infektionen induzieren eine T_H1-Typ-Antwort mit aktivierten CD4+- und CD8+-Effektor-T-Zellen wie auch LAK-Zellen. Dieser Typ von Antwort wird bei Patienten beobachtet, die vollständige Antworten auf Krebsimmuntherapien aufweisen (siehe Tabelle 2). Tabelle 2. Tumorimmunumgehungsmechanismen und DV-Infektion

Immunumgehung	Dengue-Gegenangriff
Niedrige Spiegel an MHC auf Tumorzelle verhindern CTL-Erkennung	Hi Interferon-γ erhöht MHC-Spiegel durch Regulieren der MHC-Genexpression nach oben
Punktmutationen in Tumorpeptiden verhindern TCR-Bindung	LAK/CIK-Zellen zielen auf ”entkommene” Tumorzellen ab, die anomale Peptide oder MHC exprimieren
Tumorgefäßen fehlen Faktoren für CTL-Befestigung und Trafficking	Hi [TNF-α] stellt Lücken wieder her durch ein Verändern von PECAM-1, stellt ICAM-1/VCAM-1 Expression und P- und E-Selectine wieder her
FasL kann Fas⁺ CTL durch Triggern von Apoptose töten	Hi [IL-6, 15] schützt Fas⁺ CTL durch Regulieren des FLIP-Liganden nach oben
HLA-G schützt vor NK-Zellen	Hi [I1-2, 7, 12, 15] steigern Aktivierung von NK
Stromabarrieren inhibieren CTL	Hi [IFN-γ] aktiviert Makrophagen gegenüber M₁
Myeloid-abgeleitete Suppressor-Zellen (MDSC)	iNKT-Zellen können MDSC verringern
CTL inaktiviert durch TGF-β	T_H1-Zytokine reaktivieren tolerante CTL
Tumor PI-9 blockiert Abtöten von CTL	Hi [CD8] & ICAM-1 Expression kann Erkennung und Lyse von CTL mit niedriger Avidität wieder herstellen, indem schwache Wechselwirkungen zwischen TCR und MHC + Selbst-Peptid stabilisiert werden
T-regulatorische Zellen blockieren CTL	Hi CD4^Helfer-Zellen überwinden CD4^Reg-Zellen

Bei primären Infektionen ist die Sterberate durch DV sehr niedrig (1 von 61.000 bei Manson's Tropenkrankheiten). Das Virus infiziert APC der Monozyten-Makrophagen- und dendritischen Zell-Abstammung, tötet diese aber nicht. Diese infizierten APC beginnen dann mit einer Zytokinkaskade der proentzündlichen (TFN-alpha und IL-1-beta) und T_H1(IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 und IL-21)-Typen. Diese Zytokine führen zu einer starken Aktivierung von sowohl den adaptiven (CTL) als auch immanenten (NK) Immunsystemen. Nach einem Inkubationszeitraum von 3–5 Tagen steigt das Fieber auf 39,5–40,5°C und bleibt für 4–5 Tage erhöht. Der Patient erlebt starken Kopfschmerz, Gelenkschmerz, Unwohlsein und Empfindlichkeit gegenüber Licht. Ein Ausschlag, welcher die Brustkorbhinterseite und manchmal Beine und Arme bedeckt, entwickelt sich ab Tag 3 des Fiebers. Klinisch führen Dengue-Infektionen zu erniedrigten Blutplättchenzahlen, was zu Hämorrhagie führt, welche von geringfügig bis zu lebensbedrohlich im Fall eines Schocksyndroms reicht. Mit der richtigen unterstützenden Pflege auf der Basis eines vernünftigen Flüssigkeitsmanagements ist die Gesundung in 99% der Fälle vollständig.
Die Expression von Genen in Zellen des Subjekts kann durch eine DV-Infektion erhöht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, IL-1 beta, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN-alpha, IFN-gamma, TNF-alpha, TNF-beta, GM-CSF, CD8-Antigen, ICOSLG, CCL3, CCL5, TRAIL, IP10, GNLY, GZMA, HLA-DRA, HLA-DP alphal, HLA-DP beta 1 und ZAP70. Erhöhte Spiegel von Proteinen, die diesen Genen entsprechen, können in zirkulierenden Flüssigkeiten des Subjekts beobachtet werden. Die Spiegel können mindestens 2-fach erhöht sein. Die Spiegel können zwischen 2-fach und 1000-fach erhöht sein. Die Spiegel können zwischen 2-fach und 100-fach erhöht sein. Die Spiegel können zwischen 2-fach und 10-fach erhöht sein. Zelltypen eines Subjekts, dem DV verabreicht wurde, können durch die DV-Infektion erhöht sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CD8+CD44+62L-Zellen, CD4+CD44+CD62L^|o-Zellen, HLA-DR+CD8+-Zellen, Tia-1 CD8+-Zellen, VLA-4 CD8+-Zellen, ICAM-1 CD8+-Zellen und LFA-1 CD8+-Zellen. In manchen Fällen wird TNF-α während der DV-Infektion durch das Immunsystem freigesetzt. TNFα ist ein entzündliches Zytokin mit pleiotropen Wirkungen, einschließlich dem direkten Abtöten von Tumorzellen über TRAIL (TNF-Apoptose-Induzierender-Ligand).
In manchen Fällen induziert DV hohe Spiegel von löslichem TRAIL (sTRAIL) aus einer Vielzahl von Zellen, einschließlich γδCTL, aktivierten M1-Makrophagen und Plasmacytoid DC (pDC). In manchen Fällen aktiviert DV IFNβ, ein multifunktionales Zytokin mit einer 10-fach höheren Affinität für denselben Rezeptor wie IFNα. IFNβ weist ähnliche antivirale Eigenschaften auf beim Unterdrücken der Transkription von viraler RNA, ist aber viel wirksamer als IFNα beim Induzieren von Apoptose in Tumorzellen. Stickoxid und IFNβ könnten während einer Dengue-Infektion in einer synergistischen Weise wirken. Diese Moleküle können hintereinander arbeiten, um die Resistenz gegenüber Apoptose zu überwinden, welche durch die hohen Spiegel von sTRAIL vermittelt wird, die durch M₁-Makrophagen, pDC und δγCTL induziert werden.
Krebs
Hierin beschriebene Verfahren sorgen für die Behandlung eines Subjekts im Hinblick auf Krebs. Hierin beschriebene Verfahren sorgen ebenfalls für das Beseitigen von Krebszellen. In manchen Fällen induziert das Verabreichen von DV an das Subjekt eine Immunantwort. In manchen Fällen ist die Immunantwort stark, im Vergleich zu einem gewöhnlichen Virus, wie z. B. einem gewöhnlichen Erkältungsvirus. In manchen Fällen führt die Immunantwort zu einer Tumorregression.
DNA-Mikroarrayanalysen haben gezeigt, dass Hunderte von genetisch verschiedenen Tumorklonen in einem einzigen Patienten mit vorgeschrittenem Tumor vorliegen können. Es gibt ein Muster einer negativen Korrelation zwischen O₂-Versorgung und genetischen Mutationsraten. Die Mehrzahl der Mittel wie z. B. zytotoxische Arzneimittel, Antikörper und kleine Moleküle werden nahezu immer über das Blut übertragen, was einen Darwinschen Selektionsdruck auf Tumorklone ausübt, die therapeutische Mechanismen umgehen. Klone mit den niedrigsten Perfusionsraten weisen sowohl eine niedrige Exposition an das Arzneimittel als auch eine hohe Kapazität, eine Detektion durch das Immunsystem zu umgehen, auf, was diese gegenüber herkömmlichen Therapien resistent macht. Hierin bereitgestellt werden Verfahren zum Targeting von Krebszellen, umfassend das Induzieren von Fieber-Hyperthermie durch das Verabreichen von DV an das Subjekt mit Krebs, das Aushungern von resistenten Klonen mit niedriger Flussrate mit mutierten Phänotypen, was mehr genetisch stabile Klone zurücklässt, um durch aktvierte Lymphozyten und andere Arme des Immunsystems eliminiert zu werden. In manchen Fällen umfassen die Verfahren das Kombinieren von Fieber mit einer Aktivierung von CTL und Lymphokin-aktivierten Killer-Zellen (LAK) durch das Verabreichen von gepulsten DCs, und führen zu höheren Antwortraten als bei herkömmlichen Krebstherapien (z. B. Antikörper-Arzneimittel-Konjugaten, Kinaseinhibitoren, kleinen Molekülen usw.) oder CTLs allein. Die Immunsuppression, die man bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs beobachtet, ist ein komplexer und dynamischer Prozess. Sie beinhaltet eine Toleranz gegenüber den Tumorantigenen selbst, welche gewöhnlich von CTL als „selbst” erkannt werden. In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das Aufbrechen dieser Toleranz und das Erreichen hoher Spiegel von T_H1-Zytokinen, welche eine DV-Infektion induziert.
Krebsarten, auf die hierin abgezielt wird, können ein wiederkehrender und/oder ein refraktorischer Krebs sein. In manchen Fällen ist der Krebs ein akuter Krebs oder ein chronischer Krebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein beschleunigter refraktorischer Krebs. In manchen Fällen befindet sich der Krebs in Remission. In manchen Fällen ist der Krebs ein Krebs in einem Stadium I, Stadium II, Stadium III oder Stadium IV. In manchen Fällen ist der Krebs ein juveniler Krebs oder ein adulter Krebs. Beispiele für Krebsarten beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Sarkome, Karzinome, Lymphome oder Leukämien. In manchen Fällen ist der Krebs ein solider Tumor oder ein Liposarkom.
In manchen Fällen ist der Krebs ein Sarkom. Die Sarkome können ein Krebs des Knochens, Knorpels, Fetts, Muskels, der Blutgefäße oder eines anderen Binde- oder Stützgewebes sein. In manchen Fällen beinhalten Sarkome, sind aber nicht beschränkt auf Knochenkrebs, Fibrosarkom, Chondrosarkom, Ewing's Sarkom, malignes Hämangioendotheliom, malignes Schwannom, bilaterales vestibuläres Schwannom, Osteosarkom, Weichteilsarkome (z. B. alveolares Weichteilsarkom, Angiosarkom, Cystosarkoma phylloides, Dermatofibrosarkom, Desmoid-Tumor, epithelioides Sarkom, extraskelletales Osteosarkom, Fibrosarkom, Hämangioperizytom, Hämangiosarkom, Kaposi's Sarkom, Leiomyosarkom, Liposarkom, Lymphangiosarkom, Lymphosarkom, malignes Fibrohistiozytom, Neurofibrosarkom, Rhabdomyosarkom und Synovialsarkom). Das Sarkom kann ein Ewing's Sarkom umfassen.
In manchen Fällen ist der Krebs ein Karzinom. Karzinome sind Krebsarten, die in den Epithelzellen beginnen, welches Zellen sind, die die Oberfläche des Körpers bedecken, Hormone produzieren und Drüsen bilden. Anhand eines nicht beschränkenden Beispiels beinhalten Karzinome Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Lungenkrebs, Darmkrebs, Kolorektalkrebs, Rektalkrebs, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Magenkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs, Eierstockkrebs, Gehirnkrebs, Vaginalkrebs, Vulvakrebs, Gebärmutterkrebs, Mundkrebs, Peniskrebs, Hodenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Hautkrebs, Krebs der Eileiter, Kopf- und Halskrebs, gastrointestinalen Stromakrebs, Adenokarzinom, Haut- oder intraokulares Melanom, Krebs des Analbereichs, Krebs des Dünndarms, Krebs des endokrinen Systems, Krebs der Schilddrüse, Krebs der Nebenschilddrüse, Krebs der Nebenniere, Krebs der Harnröhre, Krebs des Nierenbeckens, Krebs des Harnleiters, Krebs des Endometriums, Krebs des Gebärmutterhalses, Krebs der Hirnanhangdrüse, Neoplasmen des zentralen Nervensystems (ZNS), primäres ZNS-Lymphom, Stammhirngliom und Spinalachsentumore. In manchen Fällen ist der Krebs ein Hautkrebs wie z. B. ein Basalzellkarzinom, Plattenepithel[karzinom], Melanom, Nonmelanom oder aktinische (solare) Keratose.
In manchen Fällen ist der Krebs ein neuroendokriner Krebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein Bauchspeicheldrüsenkrebs, Schilddrüsenkrebs oder ein Prostatakrebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein Epithelkrebs, Brustkrebs, Endometrialkrebs, Eierstockkrebs, Stromaovarialkrebs oder Gebärmutterhalskrebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein Hautkrebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein neoangiogener Hautkrebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein Melanom. In manchen Fällen ist der Krebs ein Nierenkrebs, ein Lungenkrebs. Beispielhafte Lungenkrebse beinhalten, ohne Beschränkung, einen kleinzelligen Lungenkrebs oder einen nicht kleinzelligen Lungenkrebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein Kolorektalkrebs, z. B. ein Magenkrebs oder ein Darmkrebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein Gehirnkrebs. In manchen Fällen ist der Krebs ein Gehirntumor. In manchen Fällen ist der Krebs ein Glioblastom oder ein Astrozytom.
In manchen Fällen ist der Krebs ein Lungenkrebs. In manchen Fällen ist der Lungenkrebs ein nicht kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC), kleinzelliges Lungenkarzinom oder Mesotheliom. Beispiele für NSCLC beinhalten Plattenepithelkarzinom, Adenokarzinom und Großzellenkarzinom. In manchen Fällen ist das Mesotheliom ein krebsartiger Tumor der Auskleidung (lining) der Lunge und des Brustraums (Pleura) oder der Auskleidung des Abdomens (Peritoneum). In manchen Fällen beruht das Mesotheliom auf einer Exposition an Asbest.
In manchen Fällen ist der Krebs ein Tumor des zentralen Nervensystems (ZNS). In manchen Fällen wird der ZNS-Tumor als ein Gliom oder Nongliom klassifiziert. In manchen Fällen ist das Gliom ein malignes Gliom, hochgradiges Gliom, diffuses intrinsisches Ponsgliom. Beispiele für Gliome beinhalten Astrozytome, Oligodendrogliome (oder Mischungen von Oligodendrogliom- und Astozytomelementen) und Ependymome. Astrozytome beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf schwache Astrozytome, anaplastische Astrozytome, Glioblastoma multiforme, pilozytisches Astrozytom, pleomorphes Xanthoastrozytom und subependymales Riesenzellastrozytom. Oligodendrogliome beinhalten schwache Oligodendrogliome (oder Oligoastrozytome) und anaplastische Oligodendriogliome. Nongliome beinhalten Meningiome, Hypophysenadenome, primäre ZNS-Lymphome und Medulloblastome. In manchen Fällen ist der Krebs ein Meningiom.
In manchen Fällen ist der Krebs ein Blutkrebs. In manchen Fällen ist der Krebs Leukämie. In manchen Fällen ist der Krebs eine myeloische Leukämie. In manchen Fällen ist der Krebs ein Lymphom. In manchen Fällen ist der Krebs ein Non-Hodgkin-Lymphom. In manchen Fällen ist der Krebs ausgewählt aus myelogener Leukämie, lymphoblastischer Leukämie, myeloischer Leukämie, einer akuten myeloischen Leukämie, myelomonozytischer Leukämie, neurophiler Leukämie, myelodysplastischem Syndrom, B-Zell-Lymphom, Burkitt-Lymphom, großzelligem Lymphom, gemischtzelligem Lymphom, folikulärem Lymphom, Mantelzell-Lymphom, Hodgkin-Lymphom, wiederkehrendem kleinem lymphozytischem Lymphom, Haarzellenleukämie, multiplem Myelom, basophiler Leukämie, eosinophiler Leukämie, megakaryoblastischer Leukämie, monoblastischer Leukämie, monozytischer Leukämie, Erythroleukämie, erythroider Leukämie und hepatozellulärem Karzinom. In manchen Fällen ist der Krebs eine hämatologische maligne Erkrankung. In manchen Fällen ist die hämatologische maligne Erkrankung eine maligne B-Zell-Erkrankung. In manchen Fällen ist der Krebs eine chronische lymphozytische Leukämie. In manchen Fällen ist der Krebs eine akute lymphoblastische Leukämie. In manchen Fällen ist der Krebs ein CD19-positives Burkitt-Lymphom. In manchen Fällen ist die Leukämie eine akute lymphozytische Leukämie, akute myelozytische Leukämie, chronische lymphozytische Leukämie oder chronische myelozytische Leukämie. Zusätzliche Typen von Leukämien beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Haarzellenleukämie, chronische myelomonozytische Leukämie und juvenile myelomonozytische Leukämie.
In manchen Fällen entwickelt sich das Lymphom aus einem B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten. Zwei Haupttypen von Lymphom sind das Hodgkin-Lymphom, früher bekannt als Hodgkin-Krankheit, und das Non-Hodgkin-Lymphom. In manchen Fällen ist das Non-Hodgkin-Lymphom indolent. In manchen Fällen ist das Non-Hodgkin-Lymphom aggressiv. Non-Hodgkin-Lymphome beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom, follikuläres Lymphom, schleimhaut-assoziiertes lymphatisches Gewebelymphom (MALT), kleinzelliges lymphozytisches Lymphom, Mantelzelllymphom, Burkitt-Lymphom, mediastinales großzelliges B-Zell-Lymphom, Waldenström-Makroglobulinämie, nodales Marginalzonen-B-Zell-Lymphom (NMZL), Milzmarginalzonenlymphom (SMZL), extranodales Marginalzonen-B-Zell-Lymphom, intravaskuläres großzelliges B-Zell-Lymphom, primäres Effusionslymphom und lymphomatoide Granulomatose.
Verabreichungsverfahren
Hierin bereitgestellt werden Verfahren, umfassend das Verabreichen von Denguevirus und dendritischen Zellen an ein Subjekt, das dessen bedarf. In manchen Fällen wird das Virus in einer wässrigen Form bereitgestellt. In manchen Fällen wird das Virus lyophilisiert und in einer wässrigen Lösung (z. B. Salzlösung) rekonstituiert. In manchen Fällen wird das Virus über einen Weg verabreicht, der ausgewählt ist aus subkutaner Injektion, intramuskulärer Injektion, intradermaler Injektion, perkutaner Verabreichung, intravenöser („i. v.”) Verabreichung, intranasaler Verabreichung, intralymphatischer Injektion und oraler Verabreichung. In manchen Fällen wird das Virus durch einen intralymphatischen Mikrokatheter in das Subjekt infundiert.
In manchen Fällen wird das Denguevirus anfangs mindestens 24 Stunden vor der Verabreichung der dendritischen Zellen verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus anfangs zwischen ca. 12 Stunden und ca. 96 Stunden vor der Verabreichung der dendritischen Zellen verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus anfangs zwischen ca. 24 Stunden und ca. 72 Stunden vor der Verabreichung der geprimeten dendritischen Zellen verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus anfangs zwischen 1 Tag und 4 Tagen vor der Verabreichung der geprimeten dendritischen Zellen verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus nur einmal verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus mehr als einmal verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus nur vor dem Erhalt der dendritischen Zellen verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus nach Erhalt der geprimeten dendritischen Zellen verabreicht. In manchen Fällen wird das Denguevirus vor und nach dem Erhalt der geprimeten dendritischen Zellen verabreicht.
In manchen Fällen umfassen die Verfahren das Verabreichen des Denguevirus in einer Dosis von ca. 0,5 ml mit 10⁶ pfu/ml. In manchen Fällen liegt die Dosis zwischen ca. 10³ pfu/ml und ca. 10⁶ pfu/ml. In manchen Fällen liegt die Dosis zwischen ca. 10³ pfu/ml und ca. 10⁶ pfu/ml.
In manchen Fällen wird eine erfolgreiche Infektion oder Inokulation des Subjekts mit dem Denguevirus durch die Entwicklung von Hyperthermie oder Fieber bestätigt. In manchen Fällen wird eine erfolgreiche Infektion oder Inokulation des Subjekts mit dem Denguevirus durch das Vorliegen oder die Zunahme von zirkulierenden Zytokinen in dem Blut/Plasma des Subjekts bestätigt. Zytokine können Interleukin-2 und Interferon-gamma enthalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
In manchen Fällen umfassen hierin beschriebene Verfahren das nur einmalige Verabreichen von geprimeten dendritischen Zellen an ein Subjekt, das dessen bedarf. In manchen Fällen werden die geprimeten dendritischen Zellen mehr als einmal verabreicht. In manchen Fällen werden die geprimeten dendritischen Zellen ein erstes Mal und ein zweites Mal verabreicht, wobei das erste Mal und das zweite Mal durch ca. 1 Tag, ca. 2 Tage, ca. 3 Tage, ca. 4 Tage, ca. 5 Tage oder ca. 6 Tage, ca. 8 Tage, ca. 10 Tage, ca. 12 Tage oder ca. 18 Tage getrennt sind. In manchen Fällen sind das erste Mal und das zweite Mal durch ca. 1 Woche, ca. 2 Wochen, ca. 3 Wochen oder ca. einen Monat getrennt. In manchen Fällen sind das erste Mal und das zweite Mal durch mehr als einen Monat getrennt. In manchen Fällen sind das erste Mal und das zweite Mal durch weniger als 12 Monate getrennt. In manchen Fällen sind das erste Mal und das zweite Mal durch mehr als 12 Monate getrennt.
In manchen Fällen sorgen hierin beschriebene Verfahren für eine Verabreichung von geprimeten dendritischen Zellen an ein Subjekt, wenn das Subjekt hyperthermisch ist. In manchen Fällen werden geprimete dendritische Zellen verabreicht, nachdem das Subjekt einen Fieberanfall hat (has spike a fever). In manchen Fällen werden geprimete dendritische Zellen verabreicht, nachdem die Temperatur des Subjekts auf zwischen ca. 37,5°C und ca. 42°C gestiegen ist. In manchen Fällen werden die geprimeten dendritischen Zellen verabreicht, nachdem die Temperatur des Subjekts auf zwischen ca. 38°C und ca. 42°C gestiegen ist. In manchen Fällen werden die geprimeten dendritischen Zellen verabreicht, nachdem die Temperatur des Subjekts auf mindestens ca. 38,5°C gestiegen ist. In manchen Fällen werden die geprimeten dendritischen Zellen verabreicht, nachdem die Temperatur des Subjekts auf 38,5°C gestiegen ist. In manchen Fällen werden die geprimeten dendritischen Zellen verabreicht, nachdem die Temperatur des Subjekts 38 Grad Celsius oder höher erreicht. In manchen Fällen wird die Temperatur des Subjekts durch ein Mittelohr- oder orales Verfahren gemessen.
BEISPIELE
Beispiel 1. Erzeugung und Pulsen von Dendritischen Zellen (DC)
Ein Verfahren, das von Lutz M. et. al. (J. Immunol. Methods 223: 77–92, 1999) beschrieben wird, wurde eingesetzt, um reife DC aus dem Knochenmark von Mäusen zu bilden. Knochenmarkssuspensionen wurden in Petrischalen für 10 Tage in Medium inkubiert, das mit rekombinantem Mäuse GM-CSF ergänzt war. Nicht adhärente Zellen wurden gesammelt, zentrifugiert und in Medium resuspendiert, das GM-CSF und Lipopolysaccharid enthielt. Zwei Tage später wurden die DCs geerntet, und deren Lebensfähigkeit wurde durch Ausschluss von Trypanblau bestimmt. Die Reinheit der DC wurde durch Flusszytometrieanalyse bestimmt. DCs wurden mit den synthetischen Peptiden bei 10 μg/ml für 18 Stunden gepulst. Nach 18 Stunden Inkubation wurden die DCs geerntet, zweimal in HBSS gewaschen und für weitere Untersuchungen (siehe Beispiel 2 und 3) in HESS resuspendiert.
Beispiel 2. Denguevirus und dendritische Zellen zur Melanom-Behandlung in einem ersten Mausmodell

Ein Mausmodelltest wurde durchgeführt, um Ergebnisse aus einem Kombinations-Targeting von Krebszellen unter Verwendung eines Denguevirus(DV)-Stamms und mit Tumorantigen geprimeten dendritischen Zellen (DCs) zu beobachten. DV C57BL/6-Mäuse wurden durch Injektion in die Schwanzbasis mit 0,05 ml Denguevirus (DEN-2-Stamm #1710) bei 1 × 10⁶ oder 1 × 10⁷ pfu/ml inokuliert. Rekombinantes Maus IL-2 (Genzyme) und IFN-gamma (Sigma Pharmaceuticals) wurden durch intravenöse Infusion mit 2.000 (rIL-2) und 500 IU (rIFN-gamma) an den Tagen 5, 10, 15 und 20 verabreicht, folgend auf eine Verabreichung von Denguevirus (DEN-2-Stamm #1710, CDC Datenbankeintragsnummer 555, bereitgestellt von Dr. Duane Gubler). Sieben Tage nach der Denguevirus-Verabreichung wurden C57BL/6-Mäuse mit Mäuse-DC immunisiert, die separat mit den 2 Peptiden inkubiert und intravenös injiziert wurden. Die Peptide wurden synthetisiert. Das H-2b-restringierte Peptid aus Ovalbumin (OVA-8), SIINFEKL (SEQ ID NO: 7), wurde als eine Kontrolle verwendet. B16-Melanom-assoziierte H-2b-restringierte Peptide, die von den Antigenen gp100/pme117 (EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 1)) und von TRP-1/75 (TAYRYHLL (SEQ ID NO: 2)) abgeleitet waren, wurden verwendet, um Mäuse-DC zu pulsen (siehe Beispiel 1 für Einzelheiten). Zwei zusätzliche Immunisierungen mit DC wurden in Abständen von 14 Tagen gegeben. Drei Tage nach der letzten DC-Infusion wurden die Mäuse mit 5 × 10⁴ lebensfähigen B16-Melanomzellen intravenös in die lateral Schwanzvene herausgefordert und dann im Hinblick auf das Überleben verfolgt, welches als der Prozentsatz der überlebenden Tiere über die Zeit hinweg (in Tagen) nach der Tumorinjektion aufgezeichnet wurde. Daten wurden aufgezeichnet von fünf oder mehr Mäusen/Gruppe (siehe Tabelle 3 und 2). Tabelle 3.

Bedingung	Gruppe	MAUS _ID	ANZAHL AN LUNGENMETASTASEN	Mittel
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	2	II-2-1	55
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	2	II-2-2	68
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	2	II-2-3	57
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	2	II-2-4	62
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	2	II-2-5	52
				58,8
Kein DV + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	1	II-1-1	58
Kein DV + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	1	II-1-2	62
Kein DV + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	1	II-1-3	66
Kein DV + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	1	II-1-4	72
Kein DV + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	1	II-1-5	60	63,6

Die Anzahl an Lungenmetastasen, die bei Mäusen beobachtet wurde, die in Gruppe 2 Verabreichungen erhielten (Denguevirus-Serotyp 2-Stamm #1710 und Tumorpeptidgeprimete DCs), war 7,5% niedriger als bei den Kontrollmäusen in Gruppe 1, denen die Tumorpeptid-geprimeten DCs ohne das Denguevirus verabreicht wurden.
Beispiel 3. Denguevirus und dendritische Zellen für die Melanombehandlung in einem zweiten Mausmodell
Ein Mausmodelltest wurde durchgeführt, um Ergebnisse aus einem Kombinations-Targeting von Krebszellen unter Verwendung eines Denguevirus(DV)-Stamms und mit Tumorantigen geprimeten dendritischen Zellen (DCs) zu beobachten. Mäusen wurden Zytokine verabreicht, um die Antwort auf DC nachzuahmen, die bei Menschen beobachtet wurde.
Tumore wurden in Mäusen etabliert, indem die H²b-restringierte B16-Maus-Melanomzelllinie (ATCC #CRL-6322) verwendet wurde. Peptide (B16-Melanom-assoziierte H²b-restringierte Peptide, die von den Antigenen gp100/pme117 und von TRP-1/gp75 abgeleitet waren), die zum Pulsen der dendritischen Zellen verwendet wurden, wurden synthetisiert. Dendritische Zellen wurden gemäß dem in Lutz et al. (J. Immunol. Methods 223: 77–92, 1999) beschriebenen Verfahren aus Mausknochenmark erzeugt.
Am Tag 0 erhielten Mäuse 5 × 10⁴ lebensfähige B16-Melanomzellen intravenös in die laterale Schwanzvene, um Lungenmetastasen zu etablieren. Am Tag 7 wurden die Mäuse mit 0,05 ml Denguevirus (DEN-2-Stamm #1710, CDC Datenbankeintragsnummer 555) bei 1 × 10⁶ oder 1 × 10⁷ pfu/ml durch Injektion in die Schwanzbasis inokuliert. Rekombinantes Mäuse-IL-2 (Genzyme) und IFN-gamma (Sigma Pharmaceuticals) wurden durch intravenöse Infusion bei 2.000 IU (rIL-2) und 500 IU (rIFN-gamma) in Abständen von 5 Tagen verabreicht, folgend auf die Verabreichung von Denguevirus (DEN-2-Stamm #1710). An den Tagen 21, 35 und 49 wurden die Mäuse-DC getrennt mit den 2 Peptiden inkubiert und intravenös in 2 aufeinander folgenden Verabreichungen am selben Tag injiziert, um mit dem Weg und dem Schema der Verabreichung bei Patienten übereinzustimmen (siehe Beispiel 2 für zusätzliche Einzelheiten). Kontrollgruppen von Mäusen erhielten kein Denguevirus oder dendritische Zellen, die mit H-²b-restringiertem Peptid aus Ovalbumin (OVA-8), SIINFKEL, gepulst waren. Behandlung und Kontrollgruppen sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4.

Am Tag 90 wurden Tiere geopfert, und Lungentumorkolonien wurden gezählt. Lungenmetastasen wurden in einer mit Blindwert versehenen kodierten Weise nach Insufflation und Fixierung der Lungen mit Fekette-Lösung ausgezählt. Daten wurden als die mittlere Anzahl von Metastasen berichtet; vier Mäuse/Gruppe (siehe Tabelle 5 und 3). Eine Histopathologie der folgenden Hauptorgansysteme wurde durchgeführt: Gehirn, Herz, Lungen, Leber, Nieren, Milz und Gonaden (Daten nicht gezeigt). Tabelle 5.

Bedingung	Gruppe	MAUS ID	ANZAHL AN LUNGENMETASTASEN	Mittel
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	A	III-1-1	82
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	A	III-1-2	87
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	A	III-1-3	78
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	A	III-1-4	72
				79,75
DV 10⁷pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	B	III-2-1	87
DV 10⁷pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	B	III-2-2	77
DV 10⁷pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	B	III-2-3	92
DV 10⁷pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	B	III-2-4	85
				85,25
Kein Denguevirus + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	C	III-3-1	97
Kein Denguevirus + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	C	III-3-2	94
Kein Denguevirus + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	C	III-3-3	88
Kein Denguevirus + 2 × 10⁶ DC gepulst mit gp100/TRP2	C	III-3-4	91
				92,5
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit OV	D	III-4-1	180
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit OV	D	III-4-2	174
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit OV	D	III-4-3	165
DV 10⁶pfu/ml + 2 × 10⁶ DC gepulst mit OV	D	III-4-4	177
				174

Die Anzahl an Lungenmetastasen, die bei Mäusen in Gruppe C (verabreichte Tumorantigen-geprimete DCs und kein Virus) beobachtet wurde, war 47% niedriger als bei Kontrollgruppe D (verabreicht DENV-2 #1710 und DCs, die an ein Kontrollpeptid ausgesetzt waren). Die Anzahl an Lungenmetastasen, die bei Mäusen in Gruppe A (verabreicht DENV-2 #1710 und Tumorantigen-geprimete DCs) beobachtet wurde, war 54% niedriger als bei Kontrollgruppe D (verabreicht DENV-2 #1710 und DCs, die an ein Kontrollpeptid ausgesetzt waren). Die Anzahl an Lungenmetastasen, die bei Mäusen in Gruppe B (verabreicht DENV-2 #1710 und Tumorantigen-geprimete DCs) beobachtet wurde, war 51% niedriger als bei Kontrollgruppe D (verabreicht DENV-2 #1710 und DCs, die an ein Kontrollpeptid ausgesetzt waren). Die durchschnittliche Verringerung in Gruppe A und B im Vergleich zu Gruppe D betrug 52,8%.
Beispiel 4. Herstellung und Verwendung von Denguevirus.
Eine Masterzellbank mit validierten und zertifizierten Zelllinien von Vero (Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze) wird aufgebaut und auf das Fehlen von irgendwelchen Kontaminanten und Fremdorganismen (adventitious organisms) getestet. Verolinien werden von der Weltgesundheitsorganisation verwendet, um eine Vielzahl von viralen Impfstoffen herzustellen. Denguevirus wird in einer validierten Verolinie, die von der Masterzellbank abgeleitet ist, passagiert und gemäß den Richtlinien, die von dem FDA Center for Biologies (CBER) aufgestellt wurden, als eine Arbeitszellbank etabliert. Denguevirus Typ 1, 2, 3 oder 4 aus der anfänglichen Stammkultur wurde zu den Verozellen der WCB bei einer MOI von 10^–5 zugegeben.
Das erste 4 ml-Überschichtungsmedium – enthaltend 1% SeaKem LE Agarose (FMC BioProducts, Rockland, Maine) in Nährmedium (0,165% Lactalbuminhydrolysat [Difco Laborstories, Detroit, Mich.]), 0,033% Hefeextrakt [Difco], Earle's ausgewogene Salzlösung, 25 mg Gentamicinsulfat [BioWhittaker, Walkersville, Md.] und 1,0 mg Amphotericin B [Fungizone; E. R. Squibb & Sons, Princeton, N. J.], pro Liter und 2% FBS) – wird nach Adsorption des 200 ml-Virusinokulums für 1,5 h bei 37°C zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für 7 Tage wird eine zweite 2-ml-Überschicht, enthaltend 80 mg Neutralrot-Vitalfärbemittel (GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.) pro ml, zugegeben. Plaques werden 8 bis 11 Tage nach der Infektion gezählt.
Es wird ein Plaquetest mit den endgültigen Viruskulturen durchgeführt, mit einem Ziel von 10⁶ pfu/ml als einer Standarddosis. Ultrazentrifugation wird verwendet, um das Virus zu konzentrieren, wenn das Ziel nicht erreicht wird. Nach der Bestätigung des Virustiters wird das Endprodukt filtriert, um jegliche Zelltrümmer zu entfernen, auf das Fehlen von irgendwelchen Fremdorganismen getestet und, wenn die endgültige Charge (lot) freigesetzt ist, in 5 ml-Flaschen abgefüllt, mit einem Etikett als ein BSL-Stufe 2-Erreger, und bei 4°C gelagert, bis es zum Versand und zur Verabreichung bereit ist.
Beispiel 5. Herstellung von Verwendung von mit Tumorantigenen gepulsten dendritischen Zellen.
Monozyten werden von anderen weißen Blutzellen (z. B. T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Eosinophile und Basophile) getrennt. Dieses wird durch eine immuno-magnetische Selektion oder alternativ durch Adhäsionseigenschaften erreicht. Die Immuno-magnetische Selektion beinhaltet das Gießen der weißen Blutzellen in eine sterile Plastiksäule mit Plastikkügelchen, die mit Antikörpern für Immunzellen-CD-Oberflächenproteine beschichtet sind: (CD4/CD8/CD56 usw.). Die unerwünschten Zellen haften an den Kügelchen, was die Monozyten durchlaufen lässt und ermöglicht, dass sie gesammelt werden. Bei der positiven Selektion fangen magnetische Kügelchen, die mit CD1+/CD14+ beschichtet sind, die Monozyten ein, ein Magnet wird gegenüber der Säule platziert, und unerwünschte Zellen werden mit PBS-Lösung aus der Säule herausgespült. Die Monozyten werden dann für den nächsten Schritt von den Kügelchen abgewaschen. Bei der Adhärensselektion werden die Eigenschaften von Monozyten, an gewissen Oberflächen zu haften, verwendet, um diese abzutrennen, indem das Aphäreseprodukt über eine schräge Säule nach unten laufen gelassen wird.
Alternativ werden Knochenmarkszellen im Hinblick auf Lymphozyten und MHC-Klasse-positive Zellen durch Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit monoklonalen Antikörpern für CD3, CD4 und CD8 abgereichert. Verbleibende Zellen werden über Nacht in Iscove's modfiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), das mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS), 2-ME und 100 IU/ml Penicillin, 1 mM Natriumpyruvat und 10 uM nichtessentiellen Aminosäuren ergänzt ist, bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Platten mit 24 Vertiefungen mit ungefähr 1 Million Zellen in 1 ml Kulturmedium/Vertiefung kultiviert. Nach 24 Stunden werden die Zellen replattiert und in der Gegenwart von Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) und rekombinantem IL-4 bei 900 U/ml kultiviert. Nach 3 bis 4 Tagen werden die Medien gegen frische Zytokinmedien ausgetauscht.
Alternativ werden dermale dendritische Zellen (DDC) unter Verwendung der folgenden Verfahren hergestellt: Keratome aus gesunden menschlichen Freiwilligen werden in einer Lösung der bakteriellen Proteasen Dispase Typ 2 bei einer Endkonzentration von 1,2 U/ml in RPMI 1640 für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubationsperiode werden Epidermis und Dermis leicht getrennt. Epidermale und dermale Blätter werden dann zu kleinen (1–10 mm) Stücken geschnitten, nach mehrfachem Waschen mit PBS, und in RPMI 1640, ergänzt mit 10% Fötalem Rinderserum (FBS), gegeben und in 10-cm-Gewebekulturplatten gegeben. Nach 2–3 Tagen werden Gewebestücke entfernt und das Medium gesammelt. Zellen, die aus dem Gewebeabschnitt heraus in das Medium wandern, werden abzentrifugiert, in 1–2 ml frischem Medium resuspendiert und mit Trypanblau angefärbt. Eine weitere Anreicherung wird durch Abtrennung auf einem Metrizamid-Gradienten erreicht. Zellen werden auf 3 ml-Säulen mit hypertonischem 14,5% Metrizamid geschichtet und bei 650 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur sedimentiert. Zwischenphasenzellen mit geringer Dichte werden gesammelt und in zwei aufeinander folgenden weniger hypertonischen Wäschen (RPMI 1640 mit 10% FBS und 40 mM NaCl) gewaschen, um die Zellen zur Isotonozität zurück zu bringen.
Wenn die Monozyten gesammelt werden, können sie nur einige wenige Tausend in der Zahl ausmachen. Die rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren, rhuInterleukin-4 (IL-4) und rhuGranulozyten-Makrophagen-Koloniestimulationsfaktor (GM-CSF), werden in einem Mehrschrittprotokoll verwendet, um die Ausweitung der DC-Zahlen in den Bereich von 50 Millionen zu erreichen. Die Zugabe von IL-4 und GM-CSF erweitert die Zahlen und die Entwicklung von Markern reifer DCs: (CD11⁺, CD80⁺, CD83⁺) wie auch einer erhöhten Expression von sowohl Klasse I- (zur Präsentation von kurzen Peptiden an CD8⁺) als auch Klasse II-MHC-Komplexen (zur Präsentation von längeren Peptiden an CD4⁺-Helfer-Induktor-T-Lymphozyten). Nach ungefähr 4 Tagen wird die Anzahl an reifen DCs gemessen.
Pulsen der dendritischen Zellen
Lysat von ganzen autologen Tumorzellen wird durch mehrere Verfahren hergestellt. Die Entwicklung von automatischen Zellprozessoren wie dem Miltenyi GentleMACS-System erlaubt, dass die Probe manuell zerkleinert wird, in PBS-Lösung suspendiert wird, dann ein vorausgewähltes gewebespezifisches softwaregesteuertes Rotorsystem die Tumorzellen trennt. Die Einzelzellsuspension kann bei minimaler Schädigung der Tumorpeptide membranlysiert werden. Alternativ trennt die Probe die Tumorzellen nicht auf. Stattdessen wird die Probe so belassen, dass sie Tumorzellen und unterstützende Zellen (z. B. Zellen aus der Tumormikroumgebung) enthält. Zellen werden mit NH₄Cl lysiert, um rote Blutzellen zu elminieren und apoptotische und nekrotische Körper zu erzeugen, ohne Peptide zu zerstören, die zur CTL-Induktion benötigt werden.
Nach der Zugabe des Lysats nehmen die DCs die Peptide zur Präsentation an die CTL auf und prozessieren diese. Der letzte Schritt ist die Reifung mit einem Entzündungssignal. Ein bevorzugtes Mittel ist Lipopolysaccharid (LPS) aus bakteriellen Zellwänden. Nach Aussetzen an LPS regulieren die DC ihre CD80/CD83⁺-Aktivierungsmarker nach oben, erhöhen die Produktion von IL-12p70, um eine Typ 1-CTL-Antwort zu induzieren, und werden resistent gegenüber einer weiteren Antigenaufnahme und -prozessierung.
Nach abschließendem Testen von Sterilität, Spezifität und Lebensfähigkeit werden die DC auf Polymerbeutel überführt, die zum Einfrieren bei –70°C in flüssigem N₂, Lagerung bis zu 1 Jahr und Versenden zu der Klinik zur Anwendung geeignet sind. Die Beutel werden über Nacht kalt versandt, dann wieder in einem Warmwasserbad auf 37°C erwärmt, bevor sie gleichzeitig mit einer 0,9% NaCl-Lösung intravenös verabreicht werden. Die i. v. DCs wandern zu den Lungen, wo einige eingefangen werden, aber die Mehrheit wird zu den sekundären lymphatischen Organen wie z. B. Leber und weißen Pulpa-T-Zellzonen der Milz durchkommen, um die CTL zu primen.
Beispiel 6. Kombinationsabgabe zur Behandlung von Krebs
Die Verabreichung des Denguevirus ähnelt der von anderen Virusimpfstoffinjektionen. Einem Subjekt wird ein Hautbereich in dem Schulter(Deitoidus)-Bereich mit Alkohol gereinigt, dann werden 0,5 ml des Virus unter die Haut injiziert, um einen Mückenbiss nachzuahmen. Wenn das Subjekt ein Fieber aufweist, das 38,5°C erreicht, 2–3 Tage nach der DV-Injektion, werden dem Patienten über einen intralymphatischen Mikrokatheter gepulste (geprimete) dendritische Zellen infundiert. Die Injektionen werden wiederholt, bis der Patient im Hinblick auf die Krankheit negativ ist. Die DC-Infusionen benutzen Zellen, die in Beispiel 5 hergestellt wurden.
Während bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hierin gezeigt und beschrieben wurden, wird es den Fachleuten klar sein, dass solche Ausführungsformen nur als Beispiel angegeben werden. Zahlreiche Variationen, Veränderungen und Substitutionen werden nun für die Fachleute ersichtlich sein, ohne von der Erfindung abzuweichen. Man sollte verstehen, dass verschiedene Alternativen zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung beim Ausführen der Erfindung eingesetzt werden können. Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Ansprüche den Umfang der Erfindung definieren und dass Verfahren und Strukturen innerhalb des Umfangs dieser Ansprüche und deren Äquivalente dadurch abgedeckt werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Harris et al., Virology 253, 86–95 (1999) [0031]
J. Immunol. Methods 223: 77–92, 1999 [0052]
J. Immunol. Methods 223: 77–92, 1999 [0056]

Claims

Eine Zusammensetzung zur Verringerung von Tumorzellen, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zum Auslösen einer Immunantwort umfasst, wobei der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 für eine verstärkte Verringerung von Tumorzellen sorgt, wenn dieser vor Verabreichung von mit Tumorantigen geprimeten dendritischen Zellen verabreicht wird, im Vergleich zu der Verabreichung von jedem Mittel allein.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Tumorzellen aus einem soliden Krebs oder einem Blutkrebs stammen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Blutkrebs Leukämie oder ein Lymphom ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der solide Krebs Blasenkrebs, Gehirnkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Gastrointestinalkrebs, Nierenkrebs, Leberkrebs, Lungenkrebs, ein Melanom, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, ein Sarkom, Hautkrebs oder Gebärmutterkrebs ist.
Eine wirksame Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Behandlung von Krebs weiterhin die Verabreichung von dendritischen Zellen (DCs), welche mit mindestens einem Tumorzellantigen inkubiert wurden, an das Subjekt umfasst.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine Tumorzellantigen aus einer Zelle eines soliden Krebses oder einer Blutkrebszelle aus dem Subjekt stammt.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Blutkrebs Leukämie oder ein Lymphom ist.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 7, wobei der solide Krebs Blasenkrebs, Gehirnkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Gastrointestinalkrebs, Nierenkrebs, Leberkrebs, Lungenkrebs, ein Melanom, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, ein Sarkom, Hautkrebs oder Gebärmutterkrebs ist.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs durch Leukapherese erhalten wurden.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs oder das mindestens eine Tumorzellantigen aus dem Subjekt stammen.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs und das mindestens eine Tumorzellantigen aus dem Subjekt stammen.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine Tumorzellantigen aus dem Subjekt stammt.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine Tumorzellantigen in einer Suspension vorlag, die einzelne Zellen umfasst.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs mit dem mindestens einen Tumorzellantigen gepulst wurden.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine Tumorzellantigen ein Peptid ist.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Peptid eine Länge von ca. 9 Aminosäuren aufweist.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um eine systemische Infektion hervorzurufen.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs verabreicht werden, nachdem die Temperatur des Subjekts 38 Grad Celsius oder höher erreicht.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs verabreicht werden, nachdem die Temperatur des Subjekts 38,5 Grad Celsius erreicht.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs durch Prozessieren von Monozyten des Subjekts erhalten wurden.
Der Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamm DENV-2 #1710 zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DCs reife DCs sind, die in der Lage sind, Antigen aufzunehmen.
Verwendung einer wirksamen Menge des Denguevirus-Typ 2-Serotyp-Stamms DENV-2 #1710 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.