MXPA01009683A - Vacuna multivalente del virus del dengue. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona composiciones de virus atenuados del dengue. Mas especificamente, el virus atenuado se produce por el paso en serie en celulas PDK. La invencion proporciona metodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para producir proteccion contra cuatro serotipos del virus del dengue mediante la administracion del virus atenuado del dengue-1, dengue-2 dengue-3 y dengue-4.

Description

VACUNA MULTIVALENTE DE VIRUS DEL DENGUE Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de acuerdo con 35 U.S.C. §119 (e) de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de serie 60/126,313 presentada el 26 de Marzo de 1999, aun pendiente, y la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 60/181,724 presentada el 11 de Febrero del 2000, aun pendiente.

INTRODUCCIÓN La fiebre del dengue se provoca por cualquiera de los cuatro serotipos del virus del dengue-1, dengue-2, dengue-3 y dengue-4, que se transmiten a los humanos por los mosquitos. En loe adultos, las infecciones por dengue provocan típicamente una enfermedad aguda autolimi tada , pero inhabilitante, con fiebre, dolores musculares, jaqueca y un salpullido ocasional. La enfermedad se puede complicar por fiebre hemorrágica, que se puede manifestar por una prueba de torniquete positiva, petequia espontánea, sangrado franco y/o choque. La fiebre hemorrágica del dengue es fatal en aproximadamente 0.5 % de los casos. Los pacientes quienes tienen anticuerpos de una infección temprana del dengue quienes se infectaron subsecuentemente por otra cepa del dengue han mostrado ser de mayor riesgo para la fiebre hemorrágica del dengue. Los vectores del mosquito de los virus del dengue . se encuentran en todas las áreas tropicales y sub- tropicales del mundo y en algunas áreas templadas de los Estados Unidos de América, Europa, África y el Oriente Medio. En años recientes, se han presentado infecciones endémicas y epidémicas del dengue en América Central y Sur América, Sureste Asiático, India, África, las Regiones del Caribe, y Pacífico. Es impráctico el control del vector. Se necesita una vacuna efectiva que deba de conferir protección contra los cuatro serotipos del dengue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención satisface la necesidad analizada anteriormente. La presente invención se refiere a composiciones de vacuna que comprenden virus atenuados del dengue de los cuatro serotipos. El virus atenuado se proporciona en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en un hospedador humano, en unión con un vehículo fisiológicamente aceptable y puede incluir opcionalmente un adyuvante para mejorar la respuesta inmunitaria del hospedador. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición de virus atenuado de dengue que comprende un virus de dengue atenuado de más de uno, seleccionado del grupo que consiste de dengue-1, dengue-2 , dengue-3 y dengue-4, en cualquier combinación. Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para inducir protección contra el virus del dengue. Estos métodos comprenden administrar al individuo una cantidad inmunológicamente suficiente del virus del dengue a partir de los cuatro serotipos que se han atenuado por paso en serie.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Ocurrencia de síntomas >Grado 1 como resultado de la administración de la vacuna. Figura 2 : Frecuencia de distribución ' de índice de reactogenicidad por serotipo. Figura 3 : Tabla que muestra resultados de los estudios de la vacuna tetravalente del dengue variando la dosis .

Figura 4 : Tabla que muestra inmunogenicidad de vacuna tetravalente de dengue de dosis completa en 10 su etos . Figura 5: Tabla que muestra detalles de formulaciones seleccionadas de estudios con vacunas tetravalentes . Figura 6, A-H : Producción de interferón ? por PBMC recolectados de voluntarios con vacuna y estimulados con virus específico del serotipo. Todos los voluntarios recibieron sólo un serotipo de la vacuna. Las gráficas a la izquierda (A-D) muestran resultados de voluntarios que se les dio una segunda dosis alrededor del día 32. Las gráficas en la derecha (E-H) muestran los resultados de los voluntarios que recibieron la segunda dosis alrededor del día 92. Se vio una respuesta de más de 1000 pg/ml antes de la segunda dosis en la mayoría de los voluntarios. Sólo cuatro voluntarios tuvieron una respuesta de más de 1000 pg/ml dentro de los primeros 15 días de la recepción de la primera dosis de vacuna. Figura 7, A-D: Producción de Inferieron ? de PBMC recolectados de voluntarios con vacuna que recibieron vacuna tetravalente. Los PBMC se estimularon individualmente con cada serotipo de virus. Las líneas individuales en cada gráfica representan las respuestas de los PBMC de un voluntario a los serotipos individuales del virus. Como con los receptores de la vacuna monovalente, se señalaron las respuestas tardías . Figura 8, A y B: Producción de ARNm de Granzima B de PBMC recolectados de voluntarios con vacuna monovalente y tetravalente. Las células se recolectaron de todos los individuos cuyos PBMC segregaron > 1000 pg de IFN?/ml en cualquier momento. Es^ es una representación semicuantitativa de la cantidad del ARNm detectado por RTPCR. La gráfica superior (A) describe la intensidad de las bandas vistas para todas las muestras. El gel inferior (B) es de voluntarios seleccionados para mostrar los ejemplos de los ensayos de RTPCR positivos y negativos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona virus atenuados del dengue de los cuatro serotipos adecuados para el uso como vacunas en humanos. Los virus del dengue descritos en la presente se produjeron por el paso en serie de un virus infeccioso del dengue aislado en una línea de células hospedadoras, adecuadas tal como células primarias de riñon de perro de modo que el acumulado de las mutaciones confiere atenuación en el producto aislado. El paso en serie se refiere a la infección de una línea celular con un aislado de virus, la recuperación de la progenie viral de las células hospedadoras, y la infección subsiguiente de las células hospedadoras con la progenie viral para generar el nuevo paso o pasaje. De manera preferente, los siguientes virus atenuados se usan en las composiciones de la presente invención aunque se pueden usar otras composiciones de virus de cualquiera de los serotipos, ya sea atenuados o inactivados, en combinación con las cepas atenuadas descritas en la presente invención. El virus atenuado del dengue- 1, derivado del producto aislado 45AZ5, depositado de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivo de Especies (ATCC)) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, E.U.A., y otorgado con el número de acceso de VR-2648. El virus atenuado de dengue-2 derivado del producto aislado S16803, depositado de acuerdo con los Términos del Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivo de Especies (ATCC) de 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209, E.U.A., y se le otorgó el número de acceso de VR-2653. El virus atenuado del dengue-3 derivado del producto aislado CH53489, depositado de acuerdo con los Términos del Tratado de Budapest con la Colección Americana del Cultivo de Especies (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, E.U.A., y se le otorgó el número de acceso de VR-2647. El virus atenuado del dengue-4 derivado del producto aislado 341750, depositado de acuerdo con los Términos del Tratado de Budapest con la Colección Americana del Cultivo de Especies (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, E.U.A., y se le otorgó el número de acceso de VR-2652. El paso en serie de una cepa virulenta (que provoca enfermedad) del dengue da por resultado el aislamiento del virus modificado que se puede atenuar, es decir, es infeccioso, aun que no es capaz de provocar enfermedad. Estos virus modificados se prueban en monos para la efectividad reducida. Aquellos que tienen infectividad reducida se prueban subsecuentemente en humanos. Los humanos son los únicos primates que exhibirán signos de enfermedad clínica. Los virus que muestran una mínima reactividad o ninguna reactividad clínica pero aun infectan e inducen una respuesta inmunitaria, se atenúan. En una modalidad de la invención, un producto aislado virulento del dengue de los cuatro serotipos se pasó en serie en células primarias de riñon de perro (PDK) para derivar las cepas atenuadas. El paso en serie se realizó al infectar células PDK con la cepa virulenta, incubando las células infectadas durante varios días y recolectando los fluidos de cultivo de sobrenadante que contienen el virus. El virus recolectado entonces se aplicó a células PDK frescas para genera el próximo paso o pasaje. Se probaron varios pasos o pasajes en la serie para el efecto clínico después del paso final en células de pulmón de mono Rhesus fetal (FRhL) . Se usaron células FRhL para optimizar los títulos de virus en donde, en general, el paso 1 se consideró la semilla principal, el paso 2 se consideró la semilla de producción, el paso 3 se consideró el lote de vacuna. Se prepararon vacunas a varios niveles de paso de PDK, y los productos de vacuna se probaron para la atenuación en monos y humanos. La virulencia de un virus pasado, es decir, la capacidad para provocar enfermedad, se valoró al monitorear diariamente los síntomas tal como la temperatura (fiebre), jaqueca, salpullido, por nombrar unos pocos. El paso se consideró atenuado, como se juzga por la incapacidad de este virus para producir signos clínicos en la enfermedad del dengue en las vacunas.

La propagación de los virus atenuados de la invención puede ser en varias líneas celulares que permitan el crecimiento del virus del dengue. El virus del dengue crece en una variedad de células humanas y animales. Las líneas celulares preferidas para la propagación de los virus atenuados del dengue para el uso como vacuna incluyen células DBS-FRhL-2, y otras células de mono. Se logran usualmente mayores rendimientos de virus con líneas de células heteroploides tal como células Vero. Las células inoculan típicamente a una multiplicidad de infección que varía desde aproximadamente 0.01 a 0.005, que se cultivan bajo condiciones permisivas para la replicación del virus, por ejemplo, a aproximadamente 30-37°C y durante aproximadamente 3-5 días, o mientras que sea necesario para que el virus alcance un título adecuado. El virus se remueve del cultivo celular y se separa de los componentes celulares, típicamente por procedimientos de clarificación bien conocidos, por ejemplo, centrifugación, y se puede purificar adicionalmente como se "esee usando procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El aislamiento de un virus atenuado se puede seguir por un análisis de secuencia de su genoma para determinar la base para el fenotipo atenuado. Esto se logra al secuenciar el ADN viral y al identificar los cambios de nucleótidos en el producto aislado atenuado con relación a la secuencia genómica de un virus de control. Por lo tanto, los cambios moleculares que confieren atenuación en una cepa virulenta se pueden caracterizar . Una modalidad de la invención proporcionada en la presente, incluye la introducción de cambios de secuencia en cualquiera de las posiciones listadas en la tabla anterior, solas o en combinación, a fin de generar una progenie de virus atenuados. Los genomas virales con estas alteraciones se pueden producir por cualquier técnica de ADN recombinante, normal conocida por aquellos expertos en la técnica (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience , New York, 1989) para la introducción de cambios de nucleótidos en el ADN clonado. Luego, se puede ligar un genoma en un vector apropiado para la transfección en células hospedadoras para la producción de progenie viral. La capacidad para generar progenie viral a través de la introducción mediada por plásmidos de un genoma viral también se puede usar para producir virus con cambios moleculares definidos. En esta modalidad de la invención, se pueden producir mater. ales concentrados de virus, estables que contienen secuencias .:- Iteradas que confieren propiedades deseadas en los virus, por ejemplo, virulencia reducida. Este planteamiento también se puede usar para valorar el efecto de los cambios moleculares en las varias propiedades del virus, es decir, tipo antigénico, virulencia o atenuación al introducir cambios deseados de secuencia en el genoma viral, produciendo progenie del virus del genoma, y recuperando la progenie del virus para la caracterización. Además, este planteamiento se puede usar para construir un virus con secuencias heterólogas insertadas en el genoma viral que se distribuyan concurrentemente por el virus para generar una respuesta inmunitaria contra otras enfermedades . En la construcción de genomas virales con cambios moleculares definidos se pueden lograr usando técnicas normales tal como exploración con ligadores dirigida por oligonucleótidos o técnicas de mutagénesis basadas en la reacción en cadena de la polimerasa, conocidas por aquellos expertos en la técnica (Zoller y Smith, 1984, DNA 3,479-488; Botstein y Shortle, 1985, Science 229, 1193) . La ligación del genoma en un vector adecuado para la transferencia se puede lograr a través de técnicas normales conocidas por aquellos expertos en la técnica. La transfección del vector en células huésped para la producción de progenie viral se puede usar usando cualquiera de las técnicas normales tal como transfección mediada por fosfato de calcio DEAE-dextrano, electroporación, fusión de protoplasto, y otras técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Para el uso en vacunas, los virus atenuados de la invención se pueden usar directamente en formulaciones de vacuna, o se liofilizan, de manera preferente en un estabilizador (Hoke, 1990, Am J Trop Med Hyg 43, 219-226), como se desee, usando protocolos de liofilización bien conocidos por los expertos. Los virus liofilizados se mantendrán típicamente a aproximadamente 4°C. Cuando estén listos para el uso, el virus liofilizado se reconstituye en agua, o si es necesario, en una solución de estabilización, por ejemplo, solución salina o que comprende MG++ y HEPES, con o sin adyuvante, como se describe adicionalmente de manera posterior. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan de este modo en su totalidad por referencia a la presente. De esta manera, las vacunas de virus de dengue de la invención contiene como un ingrediente activo una cantidad inmunogénicamente efectiva de más de un virus atenuado de dengue elegidos del grupo que consiste de dengue-1, dengue-2, dengue-3 y dengue-4 como se describe en la presente. La composición de virus atenuado pueden producir en un sujeto, particularmente humanos, con un vehículo fisiológicamente aceptable y/o adyuvante. Los vehículos útiles son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al 0.4 %, glicina al 0.3 %, ácido hialurónico y similares. Las soluciones acuosas resultantes se pueden empacar para el uso como están, o se liofilizan, la preparación liofilizada que se rehidrata antes de la administración, como se menciona anteriormente. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como - se requiera a las condiciones fisiológicas aproximadas, tal como agentes de amortiguamiento y ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina y similares . La administración de 'los virus atenuados vivos descritos en la presente se puede llevar a cabo por cualquier medio adecuado, incluyendo tanto inyección parenteral (tal como inyección intraperitoneal, subcutánea o intramuscular) , o por inyección ovo en pájaros, oralmente y por aplicación tópica del virus, (portado típicamente en la formulación farmacéutica) a cualquier superficie de las vías aéreas. La aplicación tópica del virus a una superficie de las vías aéreas se pueden llevar a cabo por administración intranasal (por ejemplo mediante el uso de un gotero, algodón o inhalador que deposite de forma intranasal una formulación farmacéutica) . La aplicación tópica del virus a una superficie de las vías aéreas también se puede llevar a cabo por administración por inhalación, tal como al crear partículas respirables de una formulación farmacéutica (incluyendo tanto partículas sólidas como partículas líquidas) que contienen el virus como una suspensión de aerosol y luego provocando que al sujeto inhale las partículas respirables. Los métodos y aparatos para administrar partículas respirables de formulaciones farmacéuticas son bien conocidos, y se puede emplear cualquier técnica convencional. Como resultado de la vacunación, el hospedador llega a ser al menos parcial o completamente inmune a la infección del virus del dengue de los serotipos administrados, o resistente al desarrollo de la infección moderada o severa del virus del dengue. La composición de vacuna que contiene los virus atenuados de dengue de la invención se administra a una persona susceptible o de otro el riesgo de infección del virus del dengue para mejorar las capacidades propias de la respuesta inmunitaria del individuo. Esta cantidad se define que es una "dosis inmunológicamente efectiva". En este uso, la cantidad precisa depende nuevamente del estado de salud y el peso del sujeto, del modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc, pero varía en general desde aproximadamente 102 a 106 pfu de cada serotipo del virus del dengue por sujeto. La cantidad de vacuna del virus de cada serotipo se puede ajustar, es decir, incrementar o disminuir, para dar por resultado una formulación que proporcione suficiente protección de la infección con el virus deseado de dengue. Cuando se combinan los cuatro serotipos, una composición preferida comprende una cantidad igual de cada serotipo del dengue. En cualquier caso, las formulaciones de vacuna deben proporcionar una cantidad de virus atenuado de dengue de cada uno de los serotipos suficiente para proteger de forma efectiva al paciente contra la infección seria o amenazadora de vida el virus del dengue de un serotipo en la formulación de vacuna, y posiblemente otros serotipos, si se presenta una protección cruzada. Los virus atenuados del dengue de la invención de un serotipo particular se pueden combinar con virus atenuados de otros serotipos del virus del dengue para lograr protección contra múltiples virus del dengue. De manera típica, los diferentes virus modificados estarán en mezcla y se administraran de forma simultánea, pero también se pueden administrar de manera separada. En algunos casos, puede ser deseable combinar las vacunas de los virus atenuados del dengue de la invención con vacunas que incluyan respuestas protectoras a otros agentes. Se puede llevar a cabo la administración individual o múltiple de las composiciones de vacuna de la invención. La administración múltiple se puede requerir para producir niveles suficientes de inmunidad. Los niveles de inmunidad inducidas se pueden monitorear al medir la cantidad de anticuerpos séricos y secretorios de neutralización, y las dosis se ajustan o las vacunaciones se repiten conforme sea necesario para mantener los niveles deseados de protección.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a manera de ilustración, y no de limitación. Los siguientes MATERIALES Y MÉTODOS se usaron en los ejemplos que siguen.

Materiales y Métodos para la producción de la vacuna Cepas de Virus. Los virus DEN se pasaron en cultivos de células primarias de riñon de perro (PDK) después del aislamiento de las fuentes humanas y de mosquito. En la Tabla 1 listas las cepas que se adaptaron y pasaron en células PDK. Después del paso en células PDK, las cepas de virus se adaptaron adicionalmente a células FRhL para la producción de la semilla y vacuna. Esto consistió de 3-4 pasos adicionales para la preparación final del lote de vacuna. Las cepas parenterales de virus, también listadas en la Tabla 1, se derivan de pasos de bajo cultivo celular en células que son permisivas para la replicación del virus de DEN. Producción de Vacuna. Las vacunas DEN para los cuatro serotipos se prepararon en un cultivo de células FRhL usando un procedimiento similar. Se removieron células FRhl , depositadas y pre-probadas (ver Tabla 2 para resultados de prueba) del almacenamiento en nitrógeno líquido y se colocaron en placa en matraces de 150 cm2 en el medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (Biowhittaker, Waldersville , MD) medio celular complementado con aminoácidos no esenciales, suero bovino fetal, FBS (2 %) (Biowhittaker, Waldersville, MD), y antibióticos. Después de que los matraces alcanzaron la confluencia, se removió el medio y los matraces de inocularon con una semilla de producción de DEN diluida para una entrada de 0.01 de MOI, y se dejó adsorber a 32°C durante 1 hora. Después de la adsorción y el sembrado - con el medio EMEM fresco, los matraces se retornaron a 32°C durante 4 días. En el día 4 después de la inoculación, se descartó el medio de todos los matraces y las monocapas celulares se lavaron 3 veces con 100 ml de BSS de Hanks (Biowhittaker, Waldersville, MD) . Después del lavado, los matraces se alimentaron con el medio EMEM que contiene albúmina de suero humano al 0.25 % (HSA, Alpha Therapeutic Corp, Los Ángeles, CA) reemplazando el FBS. Después de dos días adicionales de incubación a 32°C, se removieron los fluidos de cultivo de sobrenadante de todos los frascos y se mezclaron. Después del muestreo para las pruebas de seguridad, los fluidos restantes del cultivo se mezclaron y se pusieron en claro por filtración a través de un filtro de membrana de unión a no-proteína, de 0.45 mieras. Los fluidos filtrados se mezclaron y conjuntaron con un volumen igual de estabilizador que contiene lactosa al 15 % y HSA al 5 %. Los fluidos estabilizados, volumétricos se almacenaron a menos 70°C hasta que se liofilizaron. Para la puesta en frasco final, los fluidos estabilizados, volumétricos se descongelaron rápidamente a 41°C y se tomaron en alícuotas en volúmenes de 3 ml en frascos de suero. Las bandejas de los frascos se congelaron a una temperatura de -40°C en un liofilizador Hull seguido por secado durante 1 día. Después de la puesta de las tapas, los frascos se almacenaron a -20°C en un congelador monitoreado . Prueba de la Vacuna. Todos los bancos celulares usados para las preparaciones de virus así como los lotes de semillas y vacunas se probaron para la presencia de agentes contaminantes. Los artículos y resultados de prueba se alistan en la Tabla 2. No se encontraron contaminantes detectables en ninguno de los productos . Inoculación del Mono Rhesus. Monos rhesus machos y hembras, adultos (6-15 kg) se inmunizaron con lotes de vacuna de DEN o virus de origen por inoculación subcutánea de 0.5 ml en el brazo superior. Se retiró sangre para las pruebas de anticuerpos y aislamiento de virus de la vena femoral antes de la inoculación y cada día durante 14 días después de la inoculación. También se retiró sangre a los 30 y 60 días después de la inmunización. Se realizaron de manera similar estimulaciones con el virus. Aislamiento del virus por amplificación en células C6 / 36. El aislamiento del virus por la amplificación en cultivo en células C6/36 se ha descrito en Putnak et al, 1996 (J. Infect Dis 174, 1176-1184) . De manera breve, después de la inoculación de los monos, se obtuvieron especímenes sanguíneos diarios desde los días 1 a 14. El suero se separó y se congeló a menos 80°C. Para la recuperación del virus de los sueros, los sueros descongelados se diluyeron 1:3 en el medio de cultivo de células y se usaron para inocular matraces de 25 cm2 que contienen monocapas de células de mosquito C6/36. Después de la adsorción el virus, los matraces se mantuvieron a 28°C en el medio de mantenimiento EMEM. Después de 7 días, se cambio el medio y los matraces se incubaron durante 7 días adicionales. En el día 14 después de la inoculación, los fluidos de cultivo de sobrenadante se decantaron y se congelaron a -80°C después de la mezcla con un volumen igual de suero bovino fetal inactivado con calor (FBS) . Los especímenes congelados se valoran posteriormente para virus infeccioso por ensayo en placa .

Tabla 1. Cepas de virus de dengue usadas para el desarrollo de vacunas atenuadas en vivo.

Tabla 1 ( Continuac i ón ,' DEN- 3 Producto 4 x PGMK; 5 x 10, 20, 30 1 : semilla 4 X PGMK (CH53489) aislado C6/36 principal humano , 2 : semilla Tailandia , de 1973 producción 3 : lote de vacuna DEN-4 Producto 1 x mosquito 6, 10, 15, 20 1 : semilla 1 x mosq; 5 (341750) aislado pre- x PGMK ; 4 X humano , principal FRhL Colombia , (PDK-20 1982 úni amente) 2 : semilla principal 3 : semilla de producción 4 : lote de vacuna Tabla 2. Prueba . -clínica de bancos de células FRhl y semillas de DEN LAV y lotes de vacuna.

Tabla 2 (continuación) Tabla 2 (continuación) Tabla 3. Conjuntos de Cepas de virus de DEN adaptados a célul as PDK , usados para inoculación de monos rhesus Cepa de Virus Inoc : monos virémicos/Totales Monos virus de PFU/0 5 (viremia Días Promedio) seroconvertidos/ DEN ml Total (GMT PRNT0 a 1-2 mo post inoc) DEN-1, PDK-0 3.3 X 4/4 (6.8) 4/4 (760) 45AZ5 (origen) 104 PDK-10 7.0 X 4/4 (4.75) 4/4 (1030) (semilla de 104 prod) * PDK-20 1.7 X 4/4 (4.5) 4/4 (640) (semilla de 104 prod) Tabla 3 ( continuación ) Tabla 3 (continuación) PDK-10 (se il. de prod) 2.5 x 10fa@ 2/3 (1.3 3/3 (150) PDK-20 (semilla de prod) 1.0 x 106@ 0/3 3/3 (130) PDK-30 (semilla de prod) 9.3 x 105@ 0/3 0/3 (<10) DEN-4, 341750 PDK-0 (origen) 1.0 x 103 3/3 (4.7) 3/3 (420) PDK-6 (semilla de prod) 1.7 x 105 1/4 (0.5) 4/4 (250) PDK-10 (semilla de prod) 2.9 x 105 1/4 (1.3) 2/4 (90) PDK-15 (semilla de prod) 5.5 x 104 1/4 (0.25) 2/4 (40) PDK-20 (semilla de prod) 5.5 x 104 1/4 (0.25) 2/4 (70) PDK-20 1.2 x 105 1/3 (0.3) 3/3 (50) (vacuna) 1,2 Dos grupos experimentales separados de monos. @ Ensayo en placa realizado en células C6/36) .

Ensayos en placa. El virus infeccioso se tituló de los productos aislados de viremia, amplificados o directamente de los sueros de mono por ensayo en placa en células de riñon de mono Rhesus (LLC-Mk2, ATCC CCL7 ) siguiendo el procedimiento de Sukhavachana et al. 1996 (Bull WHO 35, 65-66). Los ensayos en células C6/36 se realizaron como se describe en Putnak et al, 1996, supra. Pruebas de neutralización. Los anticuerpos de neutralización DEN se midieron de sueros de mono usando una prueba de neutralización de reducción de placa similar a aquella usada por Russell et al, 1967 J. Immunol 99, 285-290). Los virus de origen enlistados en la Tabla 1 se usaron para medir el punto final de reducción de placa al 50 % (PRNT50) en los especímenes de suero .

Ejemplo 1 Modificación de virus DEN en células PDK y producción de lote de vacuna. Las cepas de virus DEN seleccionadas para el desarrollo de vacunas tienen una variedad de historias de pasada antes de la pasada de PDK. En el caso de DEN-4 341750 sólo hubo una pasada de mosquito antes de la inoculación del cultivo de células PDK, en tanto que la cepa DEN-1 West Pac 74 tiene una historia de veinte pasadas por células FRhL antes de la pasada por PDK (Tabla 1) . Con la excepción de DEN-3, todas las cepas se adaptaron después de un pequeño número de pasadas de PDK. Para DEN-3 se requirieron esfuerzos adicionales para incrementar la entrada viral en las pasadas tempranas a fin de adaptar esta cepa a las células PDK. Como un caso general después de la adaptación a las células PDK, los títulos del virus DEN se encontraron que estaban en el intervalo de 104-105 PFU/ml. No fueron exitosos los intentos para incrementar los títulos y se buscaron sustratos celulares alternativos para la producción de vacunas. Se seleccionaron las células DBS-FRhL-2 (FRhL) para este propósito por varias razones: 1) los virus DEN se replican a títulos de aproximadamente 10d PFU/ml permitiendo la elaboración de vacunas de DEN en estas células; 2) las células se han usado para la preparación de varias vacunas de DEN que se han probado en ensayos clínicos de Fase I sin reacciones adversas que se pudieran relacionar al sustrato celular de la vacuna, 3) las células FRhL son células diploide de pulmón de mono rhesus, normales que no tienen potencial tumorígeno y están libres de la actividad de transcriptaza invertida y agentes contaminantes; 4) puesto que las células son células diploides "normales" no hay norma u otro requisito para purificar las vacunas; 5) se pueden establecer bancos de células FRhL en generaciones de células útiles para la elaboración de vacunas iniciando con células de pocas pasadas, disponibles. Por lo tanto, la pasada de PDK proporciona un excelente modelo para aquellos quienes desean estudiar el proceso empírico de la atenuación selectiva. Pero, puesto que la pasada en serie de PDK ejerce un proceso de selección acumulativa, la pasada adicional en otro sustrato celular proporciona su propia presión selectiva . No se conoce si la pasada de FRhL, o no, incremente o disminuye la violencia del virus para humanos. El uso de líneas de células estables que se deben caracterizar completamente solamente una vez es atractivo. Sin embargo, la experiencia publicada con células FRhL sugiere que estas células pueden invertir o destabilizar las propiedades biológicas adquiridas durante la pasada en serie en PDK (Halstead et al., 1984, Am J. Trop Med Hyg 33, 654-665; Halstead et al., 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 666-671; Halstead et al., 1984, Am J. Trop Med Hyg 33, 672-678; Halstead et al., 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 679-683; Eckels et al, 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 679-683) .

La adaptación de los virus pasados por PDK a FRhL fue uniformemente exitosa para todas las cepas de virus DEN y no fue dependiente de la pasada de PDK. Los títulos virales de las recolecciones de las pasadas 1-4 de FRhL variaron desde 105-106 PFU/ml. Para la pasada de FRhL de tres cuartos, los lotes de vacuna de todos los virus establecidos de la cepa DEN se prepararon y probaron como se enlista en la Tabla 2. También se proporcionan datos en la Tabla 2 para la prueba de banco de células FRhL así como la prueba de semilla de producción y principal. Los resultados de estas pruebas, requeridos para asegurar la seguridad en la libertad de contaminación fueron negativos, o cayeron dentro de las especificaciones permisibles. Para la semilla de producción DEN-4 341750 PDK-20, se realizaron las pruebas de neurovirulencia de monos. Los resultados de estos estudios se pueden encontrar en Hoke, 1990 (Am J Trop Med Hyg 43, 219-226). La semilla de producción de DEN-4 así como el virus de origen de DEN-4 que se usó para la comparación, no fueron neuropatógenos . Si las vacunas de DEN candidatas, restantes necesitan ser evaluadas para la neurovirulencia, permanece cuestionable en base a los datos de esta experiencia así como otras pruebas de neurovirulencia en monos de DEN (comunicación personal ) .

Ej em lo 2 Monos Rhesus inoculados con virus de DEN de pasada en PDK. La infectividad de los virus de DEN pasados en células PDK y designados como "conjuntos de cepas" se comparó a los virus no modificados, de origen para cada serotipo. La Tabla 3 lista los resultados de estos estudios donde el grado de infectividad para los monos se midió por el número de días de viremia que se puede encontrar en suero secuencialmente retirado, dos semanas después de la inoculación. La inoculación del virus parenteral de monos dio por resultado 6.8, 5, 3, y 4.7 días por medio de viremia en los grupos de 3-4 nonos inoculados con DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4, respectivamente. Para el origen DEN-2, los datos adicionales (no mostrados) han consolidado que la infección con la viremia medible es muy reproducible durante el tiempo usando monos similares y técnicas de aislamiento similares. Desdichadamente, sólo existen datos parciales con respecto a los títulos virales en los sueros de monos. La mayoría de los datos que existen vienen de la experiencia con el virus de origen de DEN-2 donde la sangre virémica de monos se tituló en el cultivo de células de mosquito. Los títulos virales máximos a 4-8 días después de la inoculación dieron por resultado títulos que varían de 105 PFU/ml de suero (Putnak et al, 1996, supra) . Para cada conjunto de cepa, la pasada de PDK da por resultado la modificación del virus de DEN como se muestra por la capacidad reducida del virus para infectar los monos. Para varios de los conjuntos de cepas esto fue claramente evidente por la carencia completa de viremia en la mayor pasada de PDK. La inoculación de monos con DEN-1 en la pasada 27 de PDK dio por resultado 0 días de viremia en los 4 monos. Esto se traduce a 0 aislamiento de un total de 56 sangrados probados. Se encontró un resultado similar para PDK-20 y PDK-3'' de DEN-3. En PDK-30 para este virus, se perdió toda evidencia de infectividad del mono, es decir, no viremia y no hay evidencia de la seroconversión en los monos inoculados con 106 PFU de virus . La cepa de DEN-2 requirió el número más grande de pasadas de PDK para lograr la modificación de la infectividad en monos. Con este virus, se requirieron al menos 40 pasadas en el cultivo de células PDK para la viremia reducida. Para contrastar esta experiencia, la cepa 341750 de DEN-4 sólo requirió seis pasadas de células PDK para una infección modificada en monos. Para otra cepa de DEN-1, la 1009, aun después de 50 pasadas de PDK no hubo evidencia de infección modificada en monos en comparación al virus de origen (datos no mostrados) . En conclusión, la pasada en células PDK parece ser un método empírico efectivo para la modificación y atenuación de varios productos aislados de DEN. Este es un hospedador no natural para DEN que coloca probablemente una presión de selección para las poblaciones de virus que son adecuadas para la aplicación de PDK pero no necesariamente para la replicación en las células objetivo en monos y humanos.

Materiales y Métodos para Estudios de Vacunas Candidatas en Humanos Voluntarios . - Voluntarios masculinos y femeninos, saludables con edades de 18-45 años se examinaron y seleccionaron por un panel de pruebas, incluyendo química sanguínea, hematología, tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial, urinálisis, anticuerpo de reagina plásmica rápida, y serología para el antígeno de superficie de hepatitis B y el anticuerpo al HIV. Se excluyeron los voluntarios en base a la anormalidad significativa, persistente o la prueba positiva. Los voluntarios femeninos se eligieron para participar si han tenido una prueba de embarazo negativa en el periodo de 48 horas de vacunación y estaban gustosas de firmar una forma de consentimiento que indica que evita la concepción usando anticoncepción convencional para los 3 meses después de la vacunación. Después, se excluyeron a los voluntarios si tuvieron inmunidad previa flavivirus, que puede afectar las respuestas a las vacunas del dengue [Scott, 1983, J. Infect Dis 148, 1055-1060] o una historia de alergia a neomicina, estreptomicina o gentamicina. La inmunidad anterior a flavivirus se definió como que no tiene anticuerpos de inhibición de hemoaglutinación detectables (a una dilución sérica de 1:10) contra los tipos 1-4 del dengue, encefalitis Japonesa, o fiebre amarilla y no hay historia de vacuna de fiebre amarilla o infección con flavivirus. Los voluntarios con puntuación > 70 % en un examen descrito diseñado para probar el conocimiento de todos los aspectos del ensayo clínico. Se obtuvo subsecuentemente un consentimiento descrito de cada voluntario de acuerdo con la Protección de Sujetos Humanos US-21 CFR Parte 50. El protocolo clínico confirmó todos los requisitos reguladores pertinentes, incluyendo la Declaración de Helsinki (Protocolo), y las Regulaciones de la Armada 70-25-Uso de Voluntarios como Sujetos de Investigación, y 40-7-Uso de Fármacos de Investigación en Humanos y el Uso de las Sustancias Controladas Del Programa I. Los estudios se aprobaron por el Buró de Revisión de Investigación en Sujetos Humanos, Oficina General de Cirujanos, Armada Norteamericana y el Comité de Investigación de Uso en Humanos WRAIR y el Buró de Revisión Institucional, Universidad de Maryland en Baltimore. Vacunas de Estudio. Las vacunas de estudio se listan en la tabla 4. Se hicieron pasar repetidamente virus de vacuna en células de riñon de perro primarias y luego en un cultivo de células diploides, continuas, de pulmón de mono rhesus (FRhL) fetal como tres pasadas terminales para preparar la semilla y la vacuna. Cada candidato, antes del ensayo en los voluntarios, se confirmó que produce una viremia sustancialmente producida en comparación a su virus de origen tipo silvestre en monos rhesus vacunados. La atenuación adecuada medida por la infección de los monos rhesus indicó que las cepas de vacuna de dengue fueron vacunas apropiadas para la prueba en humanos . Inmediatamente antes de la inmunización, se reconstituyó un frasco de vacuna liofilizada con agua estéril para inyección (USP) . Después de la inmunización, las porciones no usadas de vacuna rehidratada se mantuvieron en hielo y titularon en el espacio de 4 horas en monocapas de células LLC-MK2 (Sukhavachana et al. 1966, Bull WHO 35, 65-66). Cada voluntario recibió entre 1.0 x 105 y 4.5 x 106 pfu de virus, dependiendo de la vacuna candidata inyectada (Tabla 4) . La historia de las pasadas de las vacunas de estudio individuales se resume a continuación.

* Nivel de pasada en riñon de perro primario # Centro para el Desarrollo de Vacunas, Universidad de Meryland Baltimore ## Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas de la Armada de los Estados Unidos, Frederick, MD Vacuna 45AZ5 de Dengue 1: La cepa de DEN-1 West Pac 74 se aisló de un caso humano de fiebre con DEN en Nairu Island (Pacifico Occidental) en 1974. El aislado se pasó 20 vces en un cultivo de células FrhL y se preparó un lote de vacuna. Las pasadas incluyeron mutagenización y selección de placa para recuperar un virus que estaba atenuado y era adecuado para la vacunación en humanos. Después de la vacunación de dos voluntarios humanos, se tomó la decisión de descontinuar el uso de la vacuna debido a la enfermedad con DEN en uno de los voluntarios. La vacuna se atenúa adicionalmente por la pasada en cultivos celulares de PDK y FrhL. La vacuna candidato, corriente es DEN-1 45AZ5 PDK-20. Vacuna S16803 de Dengue 2: El virus S16803 de la cepa de dengue 2 se derivó de un aislado de virus Thai de un paciente con fiebre de dengue. El virus se sometió a un total de 50 pasadas de PDK, con una pasada terminal en células diploides de pulmón de mono rhesus fetal (DBS-FRhL-2) para la reproducción de semilla y vacuna. Se prepararon inicialmente dos candidatos de vacuna a los niveles de 30 y 50 pasadas de PDK y se seleccionaron para la prueba. Se desarrolló otro candidato de vacuna en la WRAIR del mismo virus S16803 de la cepa de origen de dengue 2 y se produjo al nivel de 40 pasadas por el Salk Intitute (Swiftwater, PA) . Vacuna CH53489 de Tipo-3 de Dengue: El virus CH53489 de la cepa de tipo 3 de dengue se derivó de una cepa Thai, se pasó 30 veces en células de riñon de perro primarias (PDK) después de la pasada inicial en células de insecto C6/36 y de riñon de mono verde primarias (PGMK) . El virus de las pasadas 10, 20, y 30 de PDK se usó para inocular cultivos de células diploide de pulmón de mono rhesus, fetal. Vacuna Caribe 341750 de Dengue 4: El candidato de vacuna de dengue 4 se derivó de la cepa Caribeña de Dengue 4 (Columbia, 1982), pasada en la Universidad de Hawai, y elaborada en la WRAIR [Marchette, 1990, Am J Trop Med Hyg 43, 212-218]. El anticuerpo al virus de origen neutraliza otras cepas de virus de dengue 4 que incluyen H-241, la cepa prototipo. La atenuación de producto aislado humano se logró por 20 pasadas en cultivos de células de riñon caninas, primarias (PDK) . Diseño de Estudio. Se usó un protocolo clínico, en paciente, de testigo único, aleatorizado, estándar, para todos los estudios piloto. La mayoría de los estudios se llevaron a cabo en el Center for Vaccine Development, University of Maryland, Baltimore MD. Los estudios piloto de la vacuna de S16803 PDK 40 de dengue 2 y la vacuna CH341750 PDK 20 de dengue 4 se realizaron en la Medical División, United States Army Medical Research Institute of infectious Diseases (USAMRIID) , Ft Detrick, MD . En los estudios clínicos iniciales de una vacuna, la pasada disponible más alta para una cepa particular se probó primero en tres voluntarios. Se monitorearon cercanamente los síntomas durante tres semanas, y si los tres voluntarios permanecieron bien, se prueba la próxima pasada menor. Si uno o más de los voluntarios llegará a enfermar, la prueba de la cepa de vacuna no se realiza, puesto que se presume que las menores pasadas probablemente estén menos atenuadas . Después de la prueba de todos los niveles aceptables de pasadas en los tres voluntarios, el nivel más bajo que no provocó enfermedad se seleccionó para la prueba adicional en hasta siete voluntarios adicionales. Para permitir la observación cuidadosa, e impedir la exposición a enfermedades infecciosas extrañas, y para prevenir la posible infección de mosquitos de vector, los voluntarios se confinaron al pabellón de investigación desde tres días antes de la inoculación hasta 20 días después de la inmunización. Todas las experiencias adversas que se presentan dentro de este período después de la administración de cada vacuna se registraron, a pesar de la severidad o si o no se consideran relacionadas a la vacuna. Se definió una seguridad aceptable de una vacuna por adelantado como la ausencia de los siguientes eventos adversos serios: cualquier enfermedad clínica severa no explicada por una diagnosis no relacionada a la vacunación; fiebre persistente (temperatura oral de > 38.5°C durante 4 determinaciones durante 24 horas, una temperatura oral diaria máxima de >38.5°C en tres días sucesivos, o la temperatura excede 40°C en cualquier determinación individual); trombocitopenia (menor de 100,000 plaquetas/mm3 ) o leucopenia (cuenta absoluta de neutrófilos menor a 1000) en dos determinaciones consecutivas; o un nivel de amino-alanina- transferasa sérica (ALT) de más de cuatro veces lo normal en tres o más días sucesivos que no se explique de otro modo. Además, cualquier experiencia que sugiriera cualquier efecto lateral significativo que se pueda asociar con el uso de la vacuna se documentaron como un evento serio. Los voluntarios se inocularon subcutáneamente con 0.5 ml de vacuna no diluida en el día 0. Después de la inmunización, se registraron los signos vitales cada 6 horas. El sitio de inyección se examinó y el diámetro máximo de la eritema e induración se midió y se registró diariamente. Los signos Clínicos (fiebre [>37.8°C], salpullido, vómito, petequias, y agrandamiento esplénico y del hígado) y los síntomas (malestar, jaqueca, miralgia, artralgia, nausea y dolor de ojo o fotofobia) se valoraron diariamente durante los primeros 20 días después de la inmunización. Los síntomas se clasificaron como suaves (síntoma percibido paro continuo la actividad en el pabellón) o severos (se forzó a la cama por síntomas) . Se pidió por el voluntario, se trataron los síntomas dolorosos con cloruro de propoxifeno; no se usaron antipiréticos. Las observaciones se registraron en una lista de verificación estándar de síntomas y hallazgos físicos. Se descartaron los voluntarios del pabellón de estudios en el día 21, y se les pidió que regresaran para los estudios serológicos, a los 1, 6, 12 y 24 meses después de la inoculación. Dos voluntarios saludables inmunes a flavivirus se inmunizaron en USAMRIID con la sepa de origen de la vacuna de 45AZ5 de dengue 1 y dos años más tarde con la cepa de origen de la vacuna CH53489 de dengue 3. Los registros médicos del estudio se realizaron para la presencia o ausencia de los siguientes signos y síntomas: fiebre, salpullido, malestar, jaqueca, mialgia, artralgia y dolor de ojo o fotofobia. Se midió diariamente la viremia. En contraste a los presentes ensayos, no se registraron sistemáticamente los síntomas, y no se clasificó la intensidad de los síntomas. Además, la experiencia clínica con el 341750 de Caribe PDK 20 de dengue 4, dada a 8 voluntarios en USAMRIID usando un estudio posterior, se extrajo y resumió para comparar con aquellos de las vacunas actuales [Hoke, 1990, supra] . Evaluación en Laboratorio. Se recolectó sangre de los voluntarios cada día diferente y en el día 31 para las pruebas médicas rutinariamente disponibles para hemoglobina y hematroci tos , la cuenta de las células sanguíneas blancas con cuenta diferencial, cuenta de plaquetas y niveles de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina-aminotransferasa (ALT) . Además, se recolectó sangre cada día diferente hasta el día 20 para el aislamiento de virus y los estudios de anticuerpos. Se permitió que la sangre (20 ml ) se coagulara a 4°C durante = 2 horas, se decantó el suero en alícuotas de 1 ml , se congeló y almacenó a -70°C hasta el estudio. Aislamiento del Virus. Para la determinación de la viremia del dengue, se descongeló el suero y se inoculó en monocapas celulares de mosquito C6/36 y se incubó a 28°C durante 14 días. Se valoraron las recolecciones de fluido del cultivo de sobrenadante para el virus por el ensayo de placa en células LLC-MK2 (Sukhavachana et al. 1966, Bull WHO 35, 65-66). Para cuantificar la cantidad de virus en suero, se realizó un ensayo en placa en el clon C6/36 de las células del mosquito Aedes albopictus [Hoke, 1990, supra]. Se inocularon matraces de cultivos celular con diluciones de plasma y se adsorbieron a 35°C durante 1-2 horas. Un medio de traslape que consiste de la solución Salina Balanceada de Hank ' s y agarosa al 0.75 %, hidrolisato de lactalbúmina al 5 %, NaHC03 0.12 M y antibióticos se adicionó y todos los matraces se incubaron a 35°C. Después de 7 días, los matraces se tiñeron con rojo neutral líquido al 5 % durante 3-5 horas. Se removió la tinsión en exceso y las placas se diluyeron después de 18 horas . Serología . Las pruebas de anticuerpo se incluyeron ELISA, HAI, y las pruebas de neutralización con reducción en placa (PRNT) realizadas usando un virus de dengue del mismo serotipo como la cepa en la vacuna que se prueba. La detección de los anticuerpos IgM de dengue se realizó por modificación de un ELISA, donde valores >0.10 unidades OD fueron considerados positivos [Innis, 1989, supra] . La prueba HAI se realizó por la técnica estándar modificada a microvolúmenes usando 4-8 unidades de antígenos individuales, usando suero extraído con acetona para remover los inhibidores [Clarke y Casáis, 1958, Am J Trop Med Hyg 7, 561-573]. Se realizaron ensayos PRNT por el método descrito por Russell et al. [Russell, 1967 , supra] ] . Análisis Estadístico. La relación entre el nivel de pasadas y la frecuencia y severidad de la reactogenicidad se analizó, para la vacuna S16803 de dengue-2 (PDK 30, 4-0 y 50) y para la vacuna CH53489 de dengue-3 (PDK 10 y 20), usando la prueba de Cochran-Armitage para la tendencia y correlaciones de espermas, respectivamente. Los síntomas y signos analizados independientemente incluyeron la presencia o ausencia, y el número de vías que se experimentan los síntomas de los ojos, jaqueca, malestar, mialgia, artralgia, salpullido y fiebre (temperatura > 37.8°C) . La hipótesis nula, que el mayor nivel de PDK no se asoció con la menor reactogenicidad, se evaluó a una probabilidad de cinco por ciento. Por inspección de los datos, el nivel óptimo de pasadas para cada virus se determinó en base a las respuestas clínicas e inmunológicas de cada voluntario. El nivel de pasadas que no provocó efectos laterales inaceptables pero que inmunizó a aproximadamente 80 % de los voluntarios se seleccionó para el desarrollo adicional por la U.S. Army Medical Research and Development Command ' s Flavivirus Vaccine Steering Committee. Definición de Infección por la Vacuna. La infección por vacuna se define como la replicación del virus del dengue en el voluntario, detectada por la presencia del anticuerpo neutralizante específico del tipo de suero o el anticuerpo anti-dengue de IgM o de la inmunización. No se incluyó la viremia como necesario para la diagnosis de la infección puesto que nunca se detectó en la ausencia de una respuesta de anticuerpos. Se define una falla de la vacuna como una respuesta clínica adversa inaceptable o falla para desarrollar anticuerpos IgM o PRNT convalecientes Ejemplo 3 Respuestas Clínicas a Vacunas de Dengue Atenuado Vacuna S16803 de Dengue 2: El virus de la cepa S16803 de dengue 2 producido de la 50aba pasada en células PDK se probó en tres voluntarios. Los voluntarios se sintieron bien, sin temperaturas orales con > 38.0°C. Dos de los tres voluntarios tuvieron síntomas suaves momentáneos de malestar, jaqueca, y síntomas de ojos (dolor de ojo o fotofobia) . Los hallazgos de laboratorio incluyeron elevaciones suaves de ALT (<2x normal) en 2 de 3 , y leucopenia suave en 1 de 3 voluntarios. Debido al perfil aceptable de seguridad de la vacuna de PDK 50, la próxima pasada disponible, menor, PDK 30, se seleccionó para la evaluación clínica. La vacuna de PD" 30, probada en 10 sujetos, estaba sin sub-atenuar y produjo síntomas compatibles con dengue moderaao a suave. Cuatro voluntarios (40 %) desarrollaron una fiebre de bajo grado, a una Tmax de 38.5°C, durante los días 9-14 después de la vacunación (día medio 12) . Ochenta por ciento desarrollaron un salpullido. La mayoría de los voluntarios experimentaron síntomas de los ojos (10/10), jaquecas (9/10), y malestar (9/10), en tanto que el 70 por ciento tuvieron > 1 síntoma severo de jaqueca, dolor de ojo y fotofobia, malestar o mialgia. Tres voluntarios tuvieron elevación suave de su alanina-aminotransferasa (ALT) , una medida de la patología del hígado. Debido a que la vacuna de PDK 30 se consideró demasiado reactógena para probar adicionalmente en voluntarios, la vacuna de PDK 40 se produjo de la semilla principal. Dos de los tres voluntarios inoculados con PDK 40 desarrollaron un síndrome suave tipo dengue a los 9-10 días después de la vacunación, con temperaturas de ba o grado (<38.1°C), salpullido, mialgias, y jaqueca. Los síntomas se solucionaron espontáneamente durante varios días sin incapacidad o requerimiento de medicamento. Los síntomas acompañantes fueron un aumento no anticipado en las encimas séricas del hígado, a un nivel de ALT máximo de 199 IU/ml en uno (4 veces normal) y 77 IU/ml de ALT máximo para el otro (una elevación de 1.5 veces de lo normal) . El tercer voluntario permaneció asintomático, pero también desarrolló elevaciones de dos veces en ALT (a max 102) . Todas las anormalidades del laboratorio se solucionaron en el espacio de días sin intervención, y todos los voluntarios se despidieron con buena salud a los 21 días después de la recepción de la vacuna. Debido a la frecuencia inusu _ de los eventos de hepatitis asociados con la vacuna de PDK 40, no se planea desarrollo adicional para el producto. La Tabla 5 resume la experiencia clínica inicial con la vacuna de dengue-2 de WRAIR. La frecuencia disminuida de los signos de fiebre y salpullido son evidentes entre las vacunas con un nivel de pasada 30 y 50. Adicionalmente, existe una declinación en la temperatura oral desde Tmax de 38.5°C hacia lo normal con una pasada creciente, pero sin cambio en la duración de fiebre más allá de un día. Para la vacuna de dengue 2 , la frecuencia y duración de los síntomas del ojo, salpullido, jaqueca, malestar y mialgia se asociaron significativamente con el nivel de pasada . 52 Tabla 5. Respuestas Clínicas en Receptores de Vacunas de Virus S16803 de Dengue 2 Tabla 6. Respuestas Clínicas en Receptores de Vacunas de Virus CH53489 de Dengue 3 A: Número de pacientes que tienen respuesta B: Días de síntoma Tabla 7. Viremia y Respuestas Inmunitarias a Vacunas de Dengue Tabla 8 Resultados de Ensayos de Fase I de Candidatos de Vacuna de Dengue de WRAIR a Nivel de pasada en células de riñon de perro, primarias b Definido como positivo a anti-lgM de dengue o seroconversión de PRNT50 c Definido como título de anticuerpos de neutralización >1:10 (PRNT50) [ ] cepa propuesta para el estudio clínico expandido.

Vacuna CH53489 de Dengue 3. Una vacuna de dengue 3 (CH53489, PDK 0) desarrollada en WRAIR se administró a dos voluntarios masculinos saludables, inmunes a fiebre amarilla, como una inoculación subcutánea de 0.5 ml de 2 x 104 pfu de virus. El transcurso de la post-inmunización inmediata transcurrió sin acontecimientos. Por el día 6, ambos voluntarios estuvieron enfermos con una fiebre de dengue moderadamente severa caracterizada por alta fiebre, escalofríos, mialgias, jaqueca, malestar y un salpullido eritematoso difuso. Ambos voluntarios desarrollaron trombocitopenia y leucopenia, pero no había signos de fiebre hemorrágica. Después de un periodo febril que duró cinco días, ambos hombres se recuperaron rápidamente y estuvieron bien por el día 21. Debido a la enfermedad severa experimentada por ambos sujetos, no se emprendió una prueba adicional de este nivel de pasada. Subsecuentemente, los niveles de pasada PDK 10 y PDK 20 se prepararon como candidatos de vacuna . La vacuna de PDK 20 se dio a 6 voluntarios y dio por resultado reactogenicidad moderada. Un sujeto experimentó una enfermedad febril temprana en el día 3 con fiebre transciente (Tmax 38.2°C), faringitis y limfadenopatía cervical. No se aisló al virus del dengue del suero de los voluntarios. Este sujeto se sintió que tenía una enfermedad intercorriente con fiebre, que no se relacionó directamente a la vacunación. Cuatro de los seis voluntarios desarrollaron síntomas de dengue suave de corto plazo con salpullido; artralgía, dolor de ojo y jaqueca fueron las quejas más frecuentes. Sin embargo, un voluntario tuvo síntomas más severos de jaqueca, malestar y dolor de ojo durante tres días. También desarrolló leucopenia y elevación sostenida de niveles de ALT; estas anormalidades de laboratorio se harían resuelto después del día 31. Otro voluntario tubo una elevación suave y reversible de ALT sola, a menos de 2x de lo normal. Debido a que la vacunación de PDK 20 fue segura con reactogenesidad marginalmente aceptable, se probó el virus de vacuna (PDK 10) de la próxima pasada menor, disponible. El virus de PDK 10 produce demasiado reatogénico en los receptores. Uno de tres voluntarios desarrolló fiebre de bajo grado en los días 10 y 11 (Tmax 38.3°C), y un salpullido florido durante 13 días. Otro voluntario desarrolló prurito persistente asociado con urticaria cerosa y decadente en los días seis y nueve después de la vacunación y nodulos linfáticos auxiliares y cervicales blandos. Ha desarrollado subsecuentemente un salpullido maculopapular con malestar, jaqueca y mialgia en los días 10-12. Este voluntario puede haber tenido una reacción alérgica idiosincrática a la vacuna, seguida por ur. enfermedad tipo dengue típico. Estos dos voluntarios también tuvieron anormalidades en el laboratorio de leucopenia y elevación de los niveles de ALT a <2x de lo normal, que se resolvió después del día 31. La Tab- 6 resume la respuesta a las vacunas CH53489 de dengue 3. Aunque hubo una tendencia para signos con una duración menos frecuente y más corta y síntomas con pasada, la no pasada alcanzó significados estadístico en cualquier análisis. Vacuna 341750 de Dengue 4. Ocho voluntarios recibieron 105 PFU de la vacuna de PDK 20 [Hoke, 1990 supra] . Cinco voluntarios desarrollaron un salpullido de blanqueo, macular apenas perceptible y mínima elevación de temperatura (max 38.1°C) . La viremia y respuesta de anticuerpos también se desarrolló en estos cinco voluntarios (63 %) . Se preparó una nueva vacuna candidata 341750 de DEN-4 de la pasada 15 de PDK, anticipándose a que la menor pasada puede ser más infectiva. Los tres voluntarios recibieron esta vacuna y dos experimentaron síntomas mínimos. El tercer voluntario llegó a enfermar abruptamente en el día 8 con fiebre, hinchazón edematosa de la cara y extremidades, apatía severa, salpullido, dolor de ojo, fotofobia y artralgias. Durante los siguientes tres días, la fiebre persistió con una Tmax de 39.6°C, pero los signos y síntomas se resolvieron espontáneamente. Debido a esta reacción adversa, seria a la vacunación, el uso adicional de la vacuna de DK-15 se determinó y se eligió PDK-20 para evaluación adicional.

Ej emplo 4 Viremia y Respuestas Inmunitarias a Vacunas de Dengue Atenuado La Tabla 7 describe la viremia y respuestas inmunitarias con las vacunas de dengue de WRAIR. La infectividad de las vacunas individuales se resume posteriormente . Vacuna S16803 de Dengue 2. Ningún receptor de la vacuna de PDK 50 desarrolló viremia, aun dos de los 3 desarrollaron en poco título anticuerpos neutralizantes por el día 60. Estos hallazgos sugieren que el virus de la vacuna estaba disminuido en su infectividad para humanos. En contraste, dos de las 3 vacunas de PDK 40 de dengue 2 tuvieron viremia demostrable, y todas desarrollaron alto título de anticuerpos después de la vacunación. Como se esperaba, la infectividad de la vacuna de PDK 30 de dengue 2 fue más alta; se detectó viremia en los 10 voluntarios y todos los sujetos se seroconvirtieron con títulos de anticuerpo neutralizantes de >1:60 por el día 60. Vacuna CH53489 de Dengue 3. El virus de dengue 3 que retiene la sensibilidad a la temperatura y el fenotipo de placa pequeña del virus de vacuna se recuperó por los días 6 y 7 en los dos receptores inmunes a fiebre amarilla de la vacuna de PDK 0 de dengue 3. Subsecuentemente, se midieron los anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (HAI) y de PRNT50 de alto título con una reactividad cruzada tipo infección secundaria, en el suero recolectado en los días 30 y 60 de ambos voluntarios. La infectividad fue similar a sujetos quienes recibieron la vacuna atenuada de PDK 10 de dengue 3; 2 de 3 desarrollaron viremia y la vacunación indujo anticuerpos neutrali ntes en todos. En contraste, 2 de 6 vacunas de PDK 20 de dengue 3 tuvieron viremia detectable y tres voluntarios se seroconvirtieron subsecuentemente, reflejando una infectividad disminuida. Vacuna 341750 de Dengue 4. Ocho voluntarios recibieron 105 PFU de la vacuna de PDK 20, y la viremia y respuesta de anticuerpos se desarrollaron en cinco (63 %) . La vacuna preparada de una menor pasada de este candidato, el PDK 15, fue más infectiva. El virus se aisló de un voluntario individual, en los días 8 y 10 después de la vacunación, con un título máximo de 15 pfu/ml. Este voluntario desarrolló subsecuentemente un título de anticuerpos neutralizantes de 450 con una respuesta secundaria de HAI, y se encontró que se ha expuesto previamente al virus de encefalitis de San Luis (título 1:20 de PRNT antes de la vacunación) . Los dos voluntarios sin viremia detectable desarrollaron títulos de neutralización de 1:10 y 1:40 por el día 30 después de la vacunación.

Ejemplo 5 Selección de Vacunas Candidatas El programa extendido de prueba de seguridad de las vacunas atenuadas con PDK, de WRAIR se muestra en la Tabla 8, que enlista las características sobresalientes de las vacunas para cada serotipo. El paso en PDK creciente dio por resultado una puntuación de enfermedad, media, de creciente, que valora la duración y el número de síntomas por voluntario. Además, también se asoció el paso de PDK creciente con días medios disminuidos de viremia, con la excepción de las vacunas de dengue 4. De las vacunas probadas de dengue 2, 3 y 4, sólo un nivel de pasadas se juzgó seguro y aceptablemente reactogénico y adecuado para el estudio clínico expandido: PDK 50 de dengue 2, PDK 20 de dengue 3 y P'DK 20 de dengue 4. Sin embargo, el porcentaje de receptores infectados declinó con un nivel creciente de pasada de PDK. La seroconversión, definida como el porcentaje con un título de anticuerpos neutralizantes > a 1:10 disminuyó de manera similar con intervalos de confianza amplios.

Análisis : La WRAIR ha tenido implicación por muchos años en el desarrollo de vacunas de dengue atenuadas en vivo. Tanto los programas de vacunas de dengue WRAIR y Mahidol han desarrollado varias vacunas vivas para la atenuación a través de varias pasadas (crecimiento repetido en cultivo de tejidos) en células de riñon de perro (PDK) . Los resultados de la prueba piloto en números pequeños de voluntarios estableció la seguridad de las vacunas candidatas de la WRAIR. Ningún voluntario entre los 65 receptores requirieron tratamiento emergente de lesión seria sostenida. Tres voluntarios sufrieron reacciones indiosincráticas momentáneas asociadas con la vacunación del dengue, dando por resultado el retiro de las vacunas que recibieron del desarrollo clínico adicional. La infección experimental con vacunas sub-atenuadas , en tanto que no fue agradable, fue tolerable. La experiencia clínica mostró que la pasada de PDK creciente en los virus de vacuna incrementó la atenuación para los voluntarios. Este efecto se ve mejor con los virus de dengue 1 y dengue 3, donde los virus no pasados de origen dieron por resultado una fiebre de dengue no modificada y las 20 pasadas de PDK subsecuentes una reactogenicidad aceptable. Sin embargo, la pasada creciente de PDK disminuyó la infectividad de los virus de vacuna, dando por resultado inmunogenicidad disminuida. Adicionalmente, la viremia disminuida con virus de vacuna en humanos parece correlacionase con aquellas en los monos rhesus (con la excepción de PDK 15 de dengue 4) . Estos hallazgos sugieren que la capacidad de infección de una vacuna de virus de dengue atenuado en voluntarios prueba ser equivalente a la inmunogenicidad. La relación entre el nivel de pasada y la reactogenicidad se debe interpretar con precaución, debido a que los sujetos quienes experimentaron un síntoma probablemente experimentaron varios síntomas. Puesto que en nuestros métodos analíticos asumen independencia de estos síntomas, las interpretaciones en base a los valores p independientes pueden ser tenues. Aun, se cree que el salpullido mostró una asociación fuerte con el nivel de pasada (p independiente = 0.009 para la presencia, p = 0.01 para la duración) . Esto se refuerza por una carencia de correlación significativa entre el salpullido y otros síntomas, ya sea para la vacuna de Dengue 2 o 3 (pruebas de Spearman) . Únicamente las vacunas con perfiles de seguridad aceptables se seleccionaron para la prueba clínica extendida: 45AZ5 PDK 20 de dengue 1, S16803 PDK 50, de dengue 2, CH53489 PDK 20 de dengue 3 y 341750 PDK 20 de dengue 4. Debido a los intervalos de confianza amplios en la seroconversión debido a los pequeños números de voluntarios, los estudios subsecuentes buscan incrementar el número de receptores de cada una de las cuatro vacunas seleccionadas. Además, las pruebas adicionales buscaran determinar si se puede reforzar la inmunogenicidad de estas vacunas atenuadas a través de la administración de dos dosis en lugar de la dosis individual usadas para estos estudios .

Ejemplo 6 Estudio expandido de vacunas monovalentes; vacunas monovalentes dadas como dos dosis; y vacunas monovalentes mezcladas como una formulación tetravalente dada como una y dos dosis Diseño de Estudio: Los objetivos de estos fueron evaluar la seguridad e inmunogenicidad de las cuatro vacunas monovalentes dadas como una dosis individual y luego por programas de vacunación de dos dosis. Subsecuentemente, se evaluaron la seguridad e inmunogenicidad de la vacuna tetravalente de combinación. Los sujetos se reclutaron de manera separada de dos sitios, la Universidad de Maryland en Baltimore y la WRAIR, Washington DC . El primer grupo de 22 sujetos se dividió en 4 grupos de 4 o 5 personas cada uno recibieron ya sea una dosis individual de virus 17D de fiebre amarilla o dengue, monovalente (Connaught) . Las vacunas de fiebre amarilla 17D sirvieron como control y punto de referencia para la reactogenicidad. Otros 31 sujetos se dividieron en 4 grupos de 7-8 personas a quienes se les dio dos dosis y una vacuna monovalente, la mitad en un mes y la otra mitad en 3 meses. Finalmente, a 10 voluntarios se les dieron dos o tres dosis de la vacuna tetravalente. Los primeros cuatro receptores tetravalente recibieron la vacunación en el mes O y 1. Los últimos 6 receptores tetravalentes se vacunaron en los meses 0, 1 y 4. Todos los sujetos excepto os 10 receptores de vacuna tetravalente se les dio un serotipo de vacuna al azar y de una manera de doble anonimato. Sujetos: Los sujetos fueron adultos saludables normales de una edad de 18-50. Todos los sujetos fueron seronegativos para la hepatitis B, C y HIV. Todos los sujetos fueron seronegativos para dengue 1-4, JE, SLE e YF por ensayo de inhibición de hemoaglutinación antes de la entrada en el estudio. Vacunas: Los candidatos de vacuna de los cuatro serotipos se dejaron adicionalmente de humanos con enfermedad clínica. Cada uno luego se modificó por pasada en serie en células de riñon de perro, primarias (PDK) y luego por células de pulmón de rhesus, fetal, como se describe anteriormente. Estos candidatos se seleccionaron en base a un estudio piloto pequeño, previo en voluntarios humanos . Cada vacuna monovalente liofilizada se reconstituyó con agua esterilizada y se dio en un volumen de 0.5 c . Las dosis de los serotipos 1-4 fueron 106, 106, 105 y 105 pfu de dengue 1, 2, 3, y 4, respectivamente. La dosis de vacuna tetravalente se preparó al mezclar 0.25 ce de cada monovalente reconstituida y se dio en un volumen final de Ice. La dosis de la vacuna tetravalente fue de 1.1-28 x 106 pfu. Todas las vacunas se dieron subcutáneamente en el brazo superior. Seguridad clínica: Se valoraron las reacciones a las • vacunaciones por combinación de agendas de síntomas diarios y evaluaciones periódicas del facultativo durante las 3 semanas después de cada vacunación. Los sujetos se alojaron en cuartos de estudio para la observación cercana durante 5-7 días más allá del periodo de incubación de una semana después de la vacunación, un periodo de tiempo durante el cual fueron más probables las reacciones y la viremia. Los sujetos se examinaron y se les preguntó específicamente de los síntomas de febrilidad, escalofríos, jaqueca, dolor retroorbi tal , mialgia, artralgia, salpullido y otros. Cada síntoma se gradúa en una escala de 0 (ninguno) 1 (no afectó la actividad normal; no requiere medicamentos), 2 (requiere medicamento o cambio de actividad) , o 3 (requiere reposo en cama o no se alivió por el medicamento) . La mayoría de los síntomas comunes se agruparon en cuatro categorías. Estas categorías fueron: 1) fiebre y escalofríos subjetivos, 2) jaqueca y dolor retroorbi tal , 3) mialgia y artralgia y 4) quejas gastrointestinales que incluyen nausea, vómito y dolor abdominal . Se calculó un índice de síntomas de cada categoría por el producto del grado de síntoma más alto por cada día y la duración del síntoma expresada en días. Si el síntoma ocurrió durante la 24 horas, se asigna la duración de 1 día. El índice de reactogenicidad (Rl) es simplemente la suma de los índices de síntomas para cada categoría. Los índices de categoría de síntomas y el Rl permiten la comparación semicuantitativa de las reacciones de vacuna entre los sujetos y los serotipos de vacuna. Los sujetos se monitorearon para las toxicidades hematológicas y hepáticas por CBC en serie, cuenta de plaquetas, AST y ALT durante el estudio. Se definieron eventos adversos serios como enfermedad seria que carece de otras causas probables, >38.5°C continuamente durante 24 horas o Tmax >38.5°C durante 3 días consecutivos una temperatura oral individual de >104°C, neutropenia de <l,000/ml o trombocitopenia de <90,000/ml en 2 determinaciones consecutivas, o ALT o AST séricos > 5 veces normal. Inmunogenicidad: El método del ensayo de inhibición de hemoaglutinación se hizo por el método de Clarke y Cassals, 1958 (Am J. Trop Hyg 7, 561-573). Se midieron la IgM e IgG del dengue por ELISA en captura en todos menos los últimos 6 sujetos tetravalentes. Los anticuerpos neutra1 izantes de dengue y fiebre amarilla se midieron en el día 0 y 30 después de cada vacunación por una prueba de neutralización con reducción en placa. La determinación del punto final del estudio se midió de cualquier anticuerpo 30 días después de la ultima vacunación. La seroconversión de los anticuerpos neutralizantes se define como reducción del 50 % en placas a un mínimo de dilución sérica de 1:5. Se determinó la viremia en los sueros de los días 7-14 después de la vacunación inicial y la segunda vacunación. El método usado para el aislamiento del virus fue un método de placa retrazado adaptado de Yuill, 1968 (Am J Trop Med Hyg 17, 441-448) usando células LLC-MK2 o C6/36 para la amplificación y Vero para la formación de placa. Los datos de los estudios de dosis individual o de dos dosis se combinaron para este informe. Las características de los sujetos se muestran en la Tabla 9. Al total de los cincuenta y nueve sujetos normales se les dio las vacunas del virus del dengue; cuarenta y nueve recibieron artículos de prueba monovalente y diez recibieron vacuna tetravalente. Cuatro recibieron la vacunación de fiebre amarilla 17D, autorizada (Connaught ) .

Tabla 9 Características de los Sujetos Ejemplo 7 REACTOGENICIDAD Reacción local. Diecinueve de 59 (32 %) de receptores de vacuna de dengue reportaron dolor suave de brazo en el sitio de inyección. De estos, siete recibieron DEN-1. 4 recibieron DEN-2, 1 recibió DEN-3 1 recibió DEN-4 y 5 recibieron la tetravalente. Sólo 5 reportaron algún dolor en el sitio de inyección después de 24 horas. Ninguno se afectó por el uso del brazo. Reacciones sistémicas. 20 % de los 59 recibidores de dengue no reportaron síntomas en todos con su primera vacunación en tanto que el 70 % de los sujetos fueron asintomáticos con la segunda vacunación. Los cuatro sujetos quienes recibieron una tercera dosis no reportaron síntomas asociados con esta. Las reacciones más comúnmente reportadas de la vacunación del dengue fueron jaqueca y mialgia. Se presentaron con severidad variable. La Figura 1 muestra la ocurrencia de los síntomas > Grado 1 de la primera vacunación que provoca cambio en las actividades diarias o la toma de medicamentos para el alivio. Después de la primera dosis de vacuna, cinco (8 % de los sujetos, uno serotipo 1, uno serotipo 4, y tres tetravalentes, reportaron algún síntoma grado 3 severo de ya sea escalofrío, mialgia, jaqueca o nausea durante una duración de menos de un día. Ningún sujeto reportó ningún síntoma grado 3 con la re-vacunación. El Rl varió de 0 a 35. La Tabla 10 compara la reactogenicidad reportada de cada vacuna. Las vacunas monovalentes y tetravalentes de DEN-1 se asociaron con más reactogenicidad. La segunda o tercera dosis de todas las vacunas de dengue provocaron uniformemente pocas reacciones, aun en aquellos sujetos con síntomas moderados a severos de la vacunación inicial .

Tabla 2.

Media de índice de Reactogenicidad - = no realizado La Figura 2 muestra la distribución por frecuencia de Rl por serotipo. Ocho sujetos (14 %) desarrollaron fiebre (>100.4° F) . De los ocho 4 recibieron DEN-1. 1 recibió DEN-2, 1 recibió DEN-3 y 2 la tetravalente. La fiebre más alta y más prolongada se presentó en un receptor de DEN-1 con una Tmax de 103.3° F y fiebre durante 3 días. Sólo otro sujeto, quien también recibió DEN-1, tuvo más de un día de fiebre. Siete de los ocho episodios de fiebre se presentaron después de la primera vacunación. Dieciséis sujetos (27 %) desarrollaron un salpullido generalizado, que comprende el tronco y extremidades desde su primer vacunación. El salpullido fue usualmente eritematoso, macular papular y suavemente prurítico. Sólo 7 de los 16 con salpullido generalizado tuvieron fiebre. De los 16 sujetos con salpullido cinco recibieron DEN-1, dos recibieron DEN-2 y uno recibió DEN-3, tres recibieron DEN-4 y cinco la tetravalente. El salpullido llega a ser típicamente perceptible por el día 8-10 después de la vacunación y se resolvió en los 3-4 días. Ningún sujeto desarrolló petequias, púrpuras o cicatrización. Ningún sujeto desarrolló salpullido después de la re-vacunación. Los síntomas gastrointestinales fueron relativamente comunes, presentándose en un tercio de los sujetos, pero fueron moderados y breves, durando menos de 24 horas. Un receptor de DEN-4 desarrolló nausea severa asociada con dolor abdominal con calambres durante un día. Seis sujetos (10 %), 5 receptores de dengue y 1 receptor de fiebre amarilla 17D, desarrollaron neutropenia momentánea con cuenta absoluta de neutrófilos menor de 1000/ml. La menor fue 288 en un sujeto de DEN-1. La neutropenia se resolvió a los 2-3 días. Ningún sujeto desarrolló trombocitopenia. No hubo elevaciones clínicamente significativas en AST o ALT. Como se espera en este grupo de adultos no inmunitarios que reciben su primera exposición al virus de dengue, ninguno desarrolló alguna evidencia clínica de fiebre hemorrágica de dengue.

Ej emplo 8 INMUNOGENICIDAD Se detectó la viremia en 10 sujetos (17 %) , uno recibió DEN-2, cuatro DEN-3, uno DEN-4 y cuatro la tetravalente. No se detectó la viremia de DEN-1. El (los) serotipo(s) del virus aislado de los sujetos tetravalentes aun no se ha identificado. Todas las viremias detectadas se presentaron después de la primera dosis del virus. Curiosamente, la fiebre se presentó con viremia solo en tres receptores de tetravalente. Todos los sujetos virémicos desarrollaron anticuerpos neutralizantes. No se desarrollaron respuestas a IgM o IgG aun con la viremia. La Tabla 11 resume la respuesta de anticuerpos a vacunación monovalente. Los anticuerpos neutralizantes se detectaron más f ecuentemente que la IgM e IgG. No se detectó seroconversión por IgM o IgG que también no se encontró por la PRNT50 de dilución sérica 1:10. Cuando está presente, la IgM fueron positivas en 41 % por 14 días después de la vacunación, en 17 % por 21 días y 42 % por 30 días. La IgM llegó a su pico máximo típicamente por el día 30 después de la primera vacunación. Una excepción única fue en un receptor de tetravalente cuya IgM llegó al máximo tres días después de su segunda vacunación. La IgM puede persistir durante más de 3 meses. Las proporciones de seroconversión por el anticuerpo neutralizante fueron de 100 %, 92 %, 54 % y 58 % para los serotipos monovalentes 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Cuando está presente, el anticuerpo neutralizante se detectó típicamente por el día 30 después de la primera vacunación. No se valoraron los puntos de tiempo entre el día 0 y 30 para el anticuerpo de neutralización. La segunda dosis de vacuna reforzó GMT de DEN-2 por más de cuatro veces, que no se vio con los otros serotipos. Los dos sujetos de DEN-3 se seroconvirtieron después de una segunda dosis de vacuna, uno en el mes 1 y el otro a los 3 meses. No habían desarrollado anticuerpos neutralizantes después de una dosis. De manera interesante, los patrones de IgM/IgG de estos dos sujetos sugirieron una respuesta secundaria después de su segunda dosis, sugiriendo que estuvieron inmunológicamente sensibilizados por la primera dosis. A pesar del ensayo de inhibición de hemoaglutinación, negativo de pre-entrada para el dengue, SLE, JE e YF 5 de los 53 (9 %) de los sujetos probados desarrollaron un patrón de respuesta de anticuerpos secundarios con una relación de IgM a IgG de <1.8. Los 5 fueron negativos para el anticuerpo de neutralización de dengue, homólogo antes de la vacunación. Esto sugiere una exposición oculta previa a flavivirus. No se encontró diferencia significativa entre los Ris promedio de la respuesta de anticuerpos secundarios y primarios (de 9.6 contra 5.8, p=0.19). Hubo 12 sujetos monovalentes quienes no desarrollaron IgM/IgG o anticuerpo neutralizante. Uno recibió DEN-2, seis recibieron DEN-3 y cinco recibieron DEN-4. El índice de reactogenicidad promedio para este grupo de no respondedores de anticuerpo de menos de 1 que fue significativamente diferente del Rl promedio de los respondedores de anticuerpos neutralizantes tipo 2, 3 y 4 (0.9 contra 4.9, p<0.003). Los estudios incluyeron 25 sujetos negros y 31 blancos. No hubo diferencia significativa entre los Rl promedio de estos dos grupos raciales. Esto es de interés debido a que existe alguna evidencia epidemiológica que sugiere una severidad más suave de la enfermedad del dengue entre los sujetos negros.

Tabla 11. Proporciones de seroconversión de vacuna monovalente por IgM y PRNT50 * Título usado 30 días después de la vacunación; valor usado de 1 para título negativo en el cálculo - = no realizado Tabla 12. Reactogenicidad e Inmunogenicidad de Receptores de Vacuna Tetravalente Tabla 13. Proporciones de Seroconversión de Dosis Múltiples y Monovalentes de vacuna Tetravalente Edad, Sexo La Tabla 12 muestra los resultados de la seroconversiones de PRNT de los diez sujetos con vacuna tetravalente. Los primeros cuatro sujetos recibieron dos vacunaciones en el mes 0 y 1. Un sujeto estaba ausente en su segunda vacunación del día 30 y se vacunó el día 60. Seis sujetos más se vacunaron en el mes 0 y 1 y si la respuesta fue incompleta, se administró una tercera vacunación en el mes 4. Los dos sujetos desarrollaron anticuerpos neutralizantes a los 4 serotipos después de una dosis individual. Otros dos receptores de tetravalente se seroconvirtieron a los cuatro serotipos después de la vacunación (4 meses) . Otros dos desarrollaron respuestas trivalentes. Una segunda dosis de la tetravalente dada a los 1 o 2 meses no incrementó significativamente las seroconversiones. Las proporciones de seroconversión completas en estos 10 sujetos tetravalentes fueron de 100%, 80 %, 80 % y 40% para DEN-1,2,3 y 4, respectivamente.

E emplo 9 Se diseñó un estudio para evaluar la interacción de cada componente de serotipo en la vacuna tetravalente por un diseño factorial 2 de 24 niveles. Cincuenta y cuatro sujetos recibieron 15 permutaciones de 2 niveles de dosis de cada serotipo. Los resultados se muestran en la Figura 3. H, alta dosis, indica vacuna no diluida, que varía entre 105-106 pfu/ml; L, dosis baja, indica una dilución 1:30 de la vacuna no diluida que da por resultado aproximadamente 103'5-104'5 pfu/ml. A seis sujetos se les dio la vacuna tetravalente de dosis completa en el mes 0 y 1. Si el sujeto no produce una respuesta de anticuerpos neutralizantes tetravalente, se le da una tercera dosis en el mes 4. El resultado se muestra en la Figura 4. Cuatro sujetos humanos se les dio la vacuna tetravalente de dosis completa, mezclada en jeringa en el tiempo de 0 y 1 meses. Los puntos finales fueron la seguridad clínica y el anticuerpo de neutralización en el mes 1 después de la segunda vacunación. Las respuestas de células T se midieron en los primeros 4 sujetos. Los resultados se muestran en la Figura 5. Los resultados indican que la vacuna tetravalente (16 formulaciones) se encontró que es segura en 64 voluntarios Americanos no inmuni tarios . La reactogenicidad varió. Cuatro formulaciones produjeron respuestas de anticuerpos neutralizantes trivalentes y tetravalentes en todos los voluntarios . De acuerdo con la experiencia monovalente, una segunda dosis de la vacuna tetravalente en el mes 1 no induce reactogenicidad significativa, pero tampoco aumenta las respuestas de los anticuerpos neutralizantes. El título final de las respuestas de anticuerpos neutralizantes esta en progreso. _;as respuestas de interferón-gamma de memoria en células T se puede medir en ausencia del anticuerpo neutralizante. Los intervalos de dosis > 4 meses pueden dar por resultado una seroconversión tetravalente mejorada.

Análisis : Estas vacunas parecen atenuadas en humanos en comparación con las descripciones históricas de infecciones experimentales con dengue tipo silvestre (Simmons et al., 1931, Manila Bureau of Printing). Se usó una escala numérica en base a una duración de síntoma autoreportada y la severidad para cuantificar la reactogenicidad. Este método tiende a sobreestimar las reacciones relacionadas con la vacuna. Idealmente, se debe validar con casos de infección de dengue natural. Sin embargo, impreciso el Rl permite comparar de forma razonable síntomas entre individuos y grupos. Los resultados de la prueba de las vacunas monovalentes mostró el grado de atenuación como que es variable entre los cuatro candidatos de vacuna de dengue. 45AZ5 PDK20 es la menos atenuada, de título más alto y dio por resultado una seroconversión uniforme. El candidato de DEN-2, S16803 PDK50, de manera similar, dio por resultado casi 100 % de seroconversión con un perfil de reactogenicidad benigno. El Den-3 y Den-4 tuvieron bajos perfiles de reactogenicidad pero las velocidades de seroconversión fueron de sólo 50-60 %. Se debe señalar que la dosis del tipo 3 y 4, las cepas menos inmunógenas, son diez veces menor que las de los tipos 1 y 2. La segunda dosis de virus se asoció con notablemente pocas reacciones. Sin embargo, el beneficio de una segunda dosis de vacuna monovalente en los meses 1 o 3 es pequeño. Den-1 y 2 fueron casi de una manera uniformemente cercana inmunogénicos tal que puede ser superflúa a una dosis adicional. Sin embargo, el GMT de Den-2 se reforzó cuatro veces. Esto puede ser evidencia de una replicación viral de bajo nivel después de la segunda dosis o la dosis contiene suficiente masa antigénica para producir una respuesta de progreso. Este patrón de la -espuesta de anticuerpos de neutralización también se ha ^-isto con la segunda vacunación con 17D YF . (Wisseman, 1962, Am J Trop Med Hyg 11, 570-575) . La primera dosis de Den-3 puede haber sensibilizado los dos sujetos monovalentes quienes se seroconvirtieron después de la segunda dosis con un patrón de respuesta de anticuerpos, secundaria. Esto sugiere que el presente ensayo de anticuerpo neutralizantes no puede ser suficientemente sensible para detectar la respuesta inmunitaria apropiada a los candidatos de vacuna del tipo 3. La segunda dosis no adiciona ningún nuevo seroconvertido del tipo 4. No hubo beneficio adicional obvio en el dar una segunda dosis de DEN-1 o DEN-4 monovalente con la dosis y el problema probado. Doce sujetos monovalentes quienes no elaboraron una respuesta de anticuerpos neutralizantes a las vacunas monovalentes también no respondieron con IgM o IgG de dengue medible. Todos estos no respondedores recibieron virus viable del mismo frasco que se replicó claramente en los otros sujetos. No desarrollaron reacciones a las vacunaciones. De esta manera, por todas estas indicaciones, no hay evidencia de replicación de virus en estos sujetos. El mecanismo para esta insensibilidad es desconocido. Puede ser el resultado de la carencia del sustrato del hospedador necesario para la infección o una inmunidad innata efectiva . El valor de la dosificación múltiple puede ser más evidente en combinación con vacunas atenuadas en vivo como una estrategia para evadir la interferencia viral. Aquí la dosis de cada componente así como el intervalo de dosificación puede ser importante. La interferencia y mejoramiento pueden presentarse potencialmente cuando se dan virus de dengue en combinación. Cuatro sujetos desarrollaron anticuerpo neutralizante a los cuatro serotipos, dos después déla primera dosis y dos después de una tercera dosis a los 4 meses. Cuatro de cinco voluntarios quienes recibieron re-vacunación a los 4 meses se seroconvirtieron a 3 o más serotipos. La explicación de esta diferencia puede ser que en un mes después de la vacunación existe suficientes anticuerpos neutralizantes Interreactivos para suprimir la replicación de los virus heterotípicos en la vacuna. Sabin encontró que hubo una protección cruzada momentánea que dura hasta 3 meses cuando a los sujetos humanos se les dio un virus de un serotipo. (Sabin, 1959, Viral and Rickettsial Infections of Man. Philadelphia: JB Lippincott Company) . Nuestros estudios tetravalentes futuros usaran un programa de vacunación de 0 , 6 meses . La pobre inmunogenicidad del DEN-3 y 4 puede ser que a 105 pfu/ml, las dosis de DEN-3 y DEN-4 están en desventaja replicativa en comparación a DEN-1 y 2, ambas de las cuales están a 106 pfu en la formulación tetravalente. Estamos explorando estrategias de producción alternativas para incrementar los títulos de DEN-3 y DEN-4. Sin detectar la viremia de los 4 virus en los respondedores tetravalentes, no se puede estar seguro que la presencia del anticuerpo neutralizante implique necesariamente la replicación de los 4 serotipos. Los anticuerpos neutralizantes medidos pueden ser de reactividad cruzada y de baja avidez. Este problema se debe afrontar al buscar una persistencia a largo plazo del anticuerpo contra cada serotipo. Un ensayo RT-PCR específico al serotipo y sensible será útil par • determinar la viremia polivalente como es evidencia de la replicación viral. Sólo dos de las vacunas tetravalentes desarrollaron anticuerpos neutralizantes a los 4 serotipos después de una vacunación. Esta respuesta incompleta a la vacuna tetravalente formula cuestiones acerca del riesgo de la fiebre hemorrágica del dengue en el establecimiento de la exposición a serotipos heterólogos virulentos. Si la mejora dependiente del anticuerpo es el mecanismo patofisiológico para DHF, puede estar presente un riesgo aun cuando los cuatro anticuerpos de los serotipos se formulen por vacunación pero uno o más anticuerpos de serotipos disminuye diferencialmente por debajo del umbral de neutralización. Se reporta posteriormente que la respuesta de células T THl se pueden medir en estas vacunas tetravalentes aun en la ausencia del anticuerpo neutralizante. ¿Será suficiente protegerlo?. Estas cuestiones sólo se podrían contestar por la prueba en campo, cuidadosa a largo plazo de las vacunas tetravalentes en áreas endémicas . En conclusión, nuestros resultados indican que los cuatro serotipos fueron variablemente reactogénicos como vacunas monovalentes con el tipo 1 más que los serotipos 2, 3 y 4. Los serotipos 1 y 2 produjeron Anticuerpo neutralizante en >90 % en tanto que los serotipos 3 y 4 son menos inmunogénico. La combinación tetravalente segura, es razonablemente bien tolerada e indujo anticuerpos neutralizantes a los 4 serotipos en cuatro de diez sujetos. Dos dosis de vacuna tetravalente no mejoran las proporciones de seroconversión en los intervalos de dosificación de uno o dos meses, probados. Un intervalo de dosificación más prolongado de más de 4 meses puede mejorar la proporción de seroconversión.

Ejemplo 10 Material y Métodos para la respuesta de células T a vacunas del dengue Sujetos : Treinta y cinco voluntarios adultos saludables de una edad de 18-50 (21 hombres, 14 mujeres) participaron en un ensayo clínico de fase I, llevado a cabo por Walter Reed Army Institute of Research, que comprende las vacunas candidatas de virus de dengue. Los participantes se seleccionaron a partir de un grupo de voluntarios en base a la ausencia del anticuerpo anti-flavivirus en circulación. Los criterios adicionales de selección fueron estado negativo del HIV y buena salud en base a un examén físico y respuestas a un cuestionario. Grupos de vacunas . Treinta individuos recibieron aleatoriamente dos dosis de una vacuna monovalente viva atenuada; cuatro recibieron dos dosis de una vacuna tetravalente, viva, atenuada. Un receptor de monovalente (voluntario ID 1) salió del estudio después de solo recibir la primera dosis. Antes de la vacunación, no hubo anticuerpo sérico de inhibición de hemoaglutinación, detectable a los tipos 1-4 del virus del dengue, virus de encefalitis Japonesa, Virus de encefalitis de San Louis, o virus de fiebre amarilla, en cualquiera de los voluntarios. Cada dosis se dio como una inyección subcutánea de 0.5 mL de los virus no diluidos.

Recolección de PBMC. Se recolectó sangre periférica (8 ml ) de cada voluntario por pinchazo en la vena en Tubos de Preparación Celular Vacutainer (CPT) [Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ] en el día 0 y en cinco puntos de tiempo • después de la primera dosis, pero antes de la segunda dosis (días 3, 7, 9, 14, 28/ 30/ 31/ 60 o 91) . También se recolectó sangre en el día de la segunda dosis y en cuatro puntos de tiempo posteriormente (días 3, 7, 9 y 14 después de la segunda dosis) . El tiempo de administración de la segunda dosis, dependiendo del voluntario, esta manera fue de aproximadamente 1-3 meses después de la primera dosis. La variación en los tiempos de recolección alrededor de 1 mes se presentó debido a la variación de la programación de los voluntarios . Las células se separaron de la sangre entera por centrifugación a 1000 xg durante 30 minutos. Se recolectaron las PBMC (la capa celular por arriba del gel en el tubo de CPT) y se lavaron dos veces en solución salina equilibrada de Hank (Life Technologies, Rockville, MD) con centrifugaciones a 500 xg . Las PBMC aisladas se redispersaron en 4 ml (por tubo de CPT) del Medio de Congelación Celular/DMSO (Sigma, St. Louis, MO ) se congelaron en alícuotas de 1 ml durante la noche a -70°C. Las PBMC luego se transfirieron a nitrógeno líquido de fase a vapor para el almacenamiento a largo plazo . Virus de vacuna. Las siguientes cepas de virus de dengue, atenuadas, vivas, descritas anteriormente se usaron en las vacunas monovalentes : 45AZ5PDK20 (DEN 1), S16803PDK50 (DEN 2), CH53489 (DEN 3) y 341750PDK20 (DEN 4). La vacuna tetravalente es una mezcla igual de las cuatro de estas sepas. Virus de cultivo celular. Los siguientes virus de dengue, propagados a células Vero, se usaron para la estimulación de PBMC en cultivo: Westpac 74 (DEN 1), S16803) (DEN 2), CH53489 (DEN 3), y TVP360 (DEN 4) . Los cuatro serotipos se proporcionaron por el doctor Robert Putnak en alícuotas de 1 ml y se almacenaron a -70°C hasta el uso. Los títulos de virus variaron desde .30- 2.4 x 10 6 pfu/ml. Cultivo en volumen de PBMC y estimulación con virus vivo. Se removieron frascos congelados de PBMC del almacenamiento de nitrógeno líquido que se descongelaron suavemente a 37°C. Las PBMC se lavaron dos veces con medio 1640 de RPMI (Life Technologies, Rockville, MD) y se dispersaron en el medio completo que contiene suero AB de hombre masculino al 10 % (Sigma) más complementos [penicilina (100 U/ml)-estreptomicina (0.1 mg/ml )- fungisona (0.25 mg/ml) [Sigma], L-glutamina 2 mM (Life Technologies), y 2-mercaptoetanol 0.5 mM (Sigma)]. Las células se redispersaron a una concentración de 2.5 millones de células/ml. Algunos ensayos requieren 3.25 millones de células/ml. Las PBMC (100 ml ) se adicionaron a cavidades individuales y una placa de fondo en V de 96 cavidades (Costar, Acton, MA) . Un volumen igual de virus 1, 2, 3, ó 4 de dengue se diluyó en el medio completo al 10 % a una concentración de 3000 a 24000 pfu/100 ml se adicionó a cada cavidad. Las cavidades de control recibieron un volumen igual del medio sin virus. Las células luego se cultivaron a 37°C en C02 al 5 % durante 4 días .

Inmunoensayo Se realizó un inmunoensayo quimioluminiscente para determinar la cantidad de linfocina segregada en el sobrenadante de cultivo de tejido al final de los cuatro días de cultivo. Una placa de inmunoensayo de 96 cavidades, Microlite 2 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, Virginia) se revistió durante la noche con 50 ul/cavidad de 10 mg/ml de anticuerpo anti-linfocina (IL-4, IL-10, o interferón ?) de marcado (Pharmingin San Diego, CA) en un amortiguador de bicarbonato de potasio 0.1 M. Las placas se lavaron y se adicionaron 100 ul de amortiguador I-bloque (Tropix, Bedford, MA) . Se pre-diluyeron los estándares o normas (IL-4 recombinante IL-10 e Inferieron ?, Pharmingen, San Diego, CA) en I-bloque empezando con una concentración de 10 ng/ml. Se hicieron diluciones de ocho-tres veces de la norma. Las muestras, controles y normas se diluyeron en un volumen igual de amortiguador I-bloque. Se adicionaron alícuotas de 50 ul a cada placa de ensayo. Las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron. El anticuerpo biotinilado "secundario se diluyó 1:1000 en I-bloque y se adicionaron 50 ul/cavidad a las placas de ensayo. Las placas se lavaron y se adicionaron 50 ul/cavidad de avidina-fosfotasa alcalina (Avidix AP , Tropix, Bedford, MA) a las placas de ensayo. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Las placas lavadas se incubaron dos veces durante un minuto con amortiguador de ensayo (Tropix) . Se adicionó el sustrato CDP-Star (Tropix) a cada cavidad (100 ul/well) . Después de 10 minutos, las placas se diluyeron en un luminómetro MD2250 (Dyatech, Chantilly, VA) . Los primeros especímenes se valoraron usando un protocolo modificado. En lugar de un paso de detector usando avidina-fosfotasa alcalina, se usó avidina-aecuorina (Sealite Sciences, Atlanta, GA) . Este material llegó a estar no disponible durante el estudio de modo que se modificó el protocolo. Los resultados usando la norma y los especímenes de control fueron idénticos para los dos formatos de ensayo. Reactividad cruzada del serotipo. Para examinar la especificidad del serotipo, las PBMC recolectadas en los días 42, 45 o 105 de los receptores seleccionado de las vacunas atenuadas monovalentes (ver resultados) se simularon durante cuatro días a 250,000 células /cavidad con cada serotipo de virus en cultivos independientes. Los sobrenadantes de cultivos luego se analizaron usando un ELISA de linfocina quimioluminiscente . Agotamientos de sub-conjuntos de células T. Para examinar la fuente celular específica de la producción de linfocinas, se agotaron las PBMC de los linfocitos T CD3+ o CD8+ antes de la estimulación. Las PBMC seleccionadas se lavaron dos veces con el medio 1640 de RPMI y se dispersaron a 3.25 millones de células/ml en medio completo al 5 % (se usaron 30 % más de PBMC como entrada para compensar las pérdidas celulares durante el procedimiento de agotamiento) . Para el agotamiento negativo, se incubaron células (650,000 PBMC) con cuentas magnéticas revestidas con el anticuerpo lavado. Los dos tipos de cuentas se usaron, ? 1 las cuentas anti CD3 y anti CD8 de M-450 (Dynal, Oslo, Noruega) Las cuentas anti CD3 se usaron a una concentración de 5.2 millones de partículas/ tubo dando una relación aproximada de cuenta a célula objetiva de 20:1. Las cuentas anti CD8 se usaron a una concentración de 4.0 millones de partículas p"'r tubo dando una relación aproximada de cuenta a célula objetivo de 31:1). DYNABEADSMR (Dynal) en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml . Las células se incubaron a 4°C durante 30 minutos con agitación moderada. Se usaron PBMC no agotadas como controles . Usando un concentrador de partículas magnéticas MPC-2 (Dynal), las células marcadas se removieron de la mezcla celular. Las PBMC negativamente seleccionadas CD3+ y CD8+ se transfirieron a tubos de microcentrífuga, recientes. Para remover cualquier célula no unida, residual, las cuentas Dynabeads concentradas se lavaron una vez con 200 ul de medio completo. Después de la transferencia, el volumen final (400 ul) -se dividió igualmente en dos cavidades -de una placa de cultivo de fondo V de 96 cavidades. Los sobrenadantes de cultivo de PBMC agotados y de control se analizaron después de cuatro días usando el ELISA de linfocinas, quimioluminiscente. Además, las PBMC cultivadas se valoraron para el ARNm de la granzima B intracelular (ver, posteriormente). El agotamiento de CD4+ se realizó de manera similar pero la separación se realizó después de la estimulación usando las cuentas dynabeads de CD4+ M-450 (28.6 ml/4.004 millones de partículas, una relación aproximada de cuenta a célula objetivo de 31:1). Las PBMC negativamente seleccionadas, de CD4+ se valoraron únicamente para el ARNm de la granzima B intracelular . Citometría de flujo. Se determinó la eficiencia de agotamiento (medido como % de agotamiento) usando el análisis FACS después de la tinción dual de una población PBMC, no estimulada, previamente estimulada, aleatoriamente seleccionada (tanto los conjuntos de control no agotados como los agotados de CD3+ o CD8+ ) . Las células se incubaron con los anticuerpos anti-CD4+ o anti-CD8+ marcados con PE y los anti-CD3 marcados con FITC (Becton-Dickinson) durante 30 minutos a 4°C. Las PBMC marcadas luego se lavaron tres veces con amortiguador fluorescente [PBS (Sigma), Azida sódica al 0.05 %, Suero bovino Fetal al 1 % (Summit Biotechnology, Boulder, CO) y se conservó en fijador de fluorescencia [PBS, Formalina al 1%, Azida sódica al 0.05 %] antes del análisis. No se midió la eficiencia de agotamiento, usando las cuentas Dynabeads CD4+.

Ensayo de Granzyma B. Se valoraron las PBMC de control no agotadas y las PBMC agotadas con subconjunto de células T para el ARNm de la granzima B intracelular, después de cuatro días de estimulación con virus tipo silvestre. usó un Ensayo con Reacción en Cadena de la Transcriptasa-Polimerasa (RT-PCR) en un formato de placa de 96 cavidades. La purificación de ARNm se realizó usando el sistema de aislamiento de ARNm "Straight A's" (Novagen Madison, Wl ) . Después de la centrifugación y remoción de los sobrenadantes del cultivo de PBMC para el análisis de ELISA de linfocinas, las PBMC agotadas se lisaron usando 200 ul/ cavidad de amortiguador de lisis que contiene ditiotreitol 10 mM y luego se incubaron con 200 mg/cavidad de cuentas magnéticas de oligo dT lavadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado completo, las cuentas con ocho volúmenes de amortiguador de lavado usando un concentrador de partículas magnéticas MPC-96 (Dynal) para remover el ADN, proteínas y desechos celulares, se eluyó el ARNm a 70°C durante 20 minutos con 200 ul/cavidad de H20. El producto eluído se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y se realizó una elusión de segundo ciclo con 200 ml adicionales/cavidad de H20. Los 400 ul del producto eluído se precipitaron luego usando 50 ul de acetato de sodio 3M (pH 5.2), 20 mg de glicogen (Novagen) y 300 ul de isopropanol. Después de un lavado final con etanol frío al 70 %, se redispersó el sedimento de ARNm en 30 ul de H20. Los pasos- de RT-PCR se realizaron en placas de 96 cavidades. Los cebadores de oligonucleótidos (22 pb) , que corresponden a los exones de la granzima B humana (CTLA-1) y amplifican una región de 120 pb, se sintetizaron por Dr . Stuart Cohén at the Walter Reed Army Institute of Research. Los cebadores tienen las siguientes secuencias: grb2a /homosentido) 5 ' GC CGA CCC AGT TTA TCC C (SEQ IN NO . : 1 ) , grb2b ( anti sentido ) 5'C TCT GGT CCG CTT GGC CTT TCT (SEQ ID NO : 2 ) . Para cada reacción de cada reacción de transcriptasa invertida, el volumen total de reacción fue de 40 ul e incluyó lo siguiente: MgCl2 (5 mM) , amortiguador II 10X (Tris-HCL 10 mM, HCL, 50 mM, KCL pH 8.3), dNTPs (1 mM cada uno), e inhibidor de NRasa (40 Unidades) [Perkin Elmer, Norwalk, CT] transcriptasa invertida AMV (10 unidades) [Siekagaku], cebador grb2b (3 pmoles), sH20, y 4 ml de la plantilla de ARNm. Los pasos de incubación de RT se realizaron en un termociclo de 9600 (Perkin Elmer) con los parámetros ajustados a 42°C (90 minutos), 99°C) (5 minutos), 4°C (de manera indefinida) . Para cada PCR, el volumen total de reacción fue de 50 ul e incluyó lo siguiente: MgCl2 (2 mM) , amortiguador II 10X (igual como antes) , dNTPs (.4 mM cada uno), oro amplitaq (1.25 Unidades), cebadores grb2a y grb2b (1 pmol cada uno) , sH20, y 5 ul de la plantilla de ADNc. Los pasos de incubación de PCR también se realizaron en un termociclador 9600 con los parámetros establecidos a 95°C desnaturalización inicial /activación de encima (10 minutos), 30 ciclos: [95°C desnaturalización (30 segundos con un aumento de 10 segundos )/ 60°C fijado (30 segundos) con un aumento de 30 segundos) /72°C extensión (30 segundos con un aumento de 30 segundos)], 72°C extensión final (7 minutos) , 4°C (de manera indefinida) . Usando electroforesis, se separaron los productos de PCR amplificados, finales (10 ul) en geles de agarosa al 2 % teñida con bromuro de etidio (SeaKem)/TAE IX (Tris-Acetato-EDTA) y se analizaron usando una cámara digital (Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) . Se razonó que si una respuesta de refuerzo a una dosis de refuerzo de vacuna de hígado se puede demostrar, se podría usar una vacuna de virus vivo más atenuado. La respuesta de refuerzo buscada fue tanto un anticuerpo como una respuesta de células T. En tanto que las respuestas y células T a las vacunas de dengue se han medido, se han hecho pocas mediciones de respuestas de células T que en comparación a las respuestas de anticuerpos. Por lo tanto, la respuesta de las células T a la administración de la vacuna de dengue vivo esta menos bien caracterizada. Un objetivo de este estudio fue determinar la naturaleza de la respuesta de células T a las vacunas en términos de la respuesta de células auxiliares T, especificidad del serotipo y potencial citotóxico. La respuesta de células T predominante a estas vacunas una respuesta de Thl. Esto se determinó por la secreción de la interferón ? por las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas por el virus de dengue vivo en un cultivo de cuatro días. El interferón ? se segregó por células T CD3+CD8-. La respuesta de células T fue específica del serotipo del virus de dengue con alguna respuesta interreactiva. Se señaló una respuesta anamnéstica en alguno de los individuos y en otros no.

Secreción de linfocinas por células estimuladas con dengue. Se usó el virus de dengue vivo para estimular cultivos de PBMC. El serotipo de los virus estimulantes usados en cultivo fue el nismo como el serotipo del virus de la vacuna. Después de cuatro días, los sobrenadantes del cultivo de tejidos se analizaron para la presencia de interferón ?, IL-4 e IL-10. En todos los cultivos, IL-4 e IL-10 fueron consistentemente negativos. Se usaron dos controles de ensayo para asegurar que el ensayo estaba trabajando apropiadamente. Primero la curva normal usó linfocina recombinante y segundo, se usó una muestra de control para asegurar que las linfocinas puede detectar la presencia del sobrenadante de cultivo del tejido. En contraste a la expresión negativa de IL-4 e IL-10, se detectaron altos niveles de interferón ? en varios de los sobrenadantes de cultivo. La Figura 6 muestra la cinética de la expresión de la interferón ? de las células recolectadas a partir de voluntarios que reciben vacunas monovalentes. En resumen, las respuestas más altas del interferón ? fueron por las PBMC recolectadas de receptores de vacunas candidatas de dengue 1 y dengue 2, aunque hubo unas pocas respuestas altas en los receptores de dengue 3 y 4. El interferón ? se detectó ocasionalmente por el 14° día después de la primera inoculación, pero frecuentemente no se detectó la expresión hasta justo antes o justo después de la administración de la segunda base. La cinética de secreción por lo tanto fue mucho más lenta que lo esperado. Con respecto a las respuestas de refuerzo para los receptores monovalentes en este estudio, no hubo patrones consistentes. Dependiendo del individuo, los niveles de interferón ? ya sea incrementaron o disminuyeron después de la administración de la segunda dosis. Las PBMC no estimuladas de todos los voluntarios en todos los puntos de recolección mostraron niveles indetectables de interferón ?. La expresión media de las células del día cero, estimulados fue de 127 pg/ml con una desviación estándar de 230 pg/ml. Para los receptores de /'acuna monovalente, hubo 16 respondedores positivos y 14 negativos de interferón ? (media ± 3 desviaciones estándar) . Dieciséis de treinta receptores de vacuna monovalente tuvieron cultivos de PBMC con resultados de interferón g mayor a 1000 pg/ml durante al menos un punto de tiempo. Doce tuvieron secreción sostenida de interferón g en >1000 pg/ml para dos o más puntos de tiempo consecutivos. También, doce de treinta tuvieron secreción >1000 pg/ml en el último punto de tiempo. Cuatro voluntarios recibieron vacunas tetravalentes (una mezcla igual de las cuatro cepas monovalentes) . La Figura 7 muestra la producción de interferón ? por las PBMC recolectadas de estos receptores tetravalentes. Las PBMC se estimularon en cultivos separados usando uno de los cuatro serotipos de virus de dengue.- Las PBMC de los voluntarios #33 y #36 segregaron cantidades significativas de interferón >1000 pg/ml, durante al menos un punto de tiempo después de la estimulación con cada uno de los cuatro serotipos. Las PBMC del voluntario #35 segregaron cantidades significativas de interferón ? en respuesta a tres de los cuatro serotipos (no el dengue 3) . Las PBMC del voluntario #34 segregaron interferón-gamma significativo sólo en respuesta al virus del dengue 2. Las respuestas más altas fueron predominantemente a DEN 1 y 2. La cinéticas de la producción de interferón ? se retrasó en los voluntarios de vacuna tetravalente como fue en los voluntarios de la monovalente. Los altos niveles de interferón ? se detectaron sólo antes de y después de la inoculación de la segunda dosis. A pesar de las dosis de refuerzo, como con los receptores de la monovalente, no hubo patrones consistentes de secreción de interferón ? después de la administración de la segunda dosis. En resumen, estos resultados indican que la respuesta predominante de linfocitos T en ambos receptores de vacuna monovalente y tetravalente fue una respuesta de Thl específica del antigeno.

Ej emplo 11 Reactividad cruzada de serotipo. Las PBMC de doce de los receptores de vacuna monovalente se examinaron para la presencia de respuestas interreactivas y específicas del serotipo de dengue. En base a la cinética, aquellos individuos quienes segregaron >1000 pg/ml de interferón ? en los sobrenadantes de cultivo de las PBMC en el último punto de tiempo (segundo a último día de recolección) se eligieron. Las PBMC del último día de recolección, se estimularon en cultivos independientes durante cuatro días con cada serotipo del dengue seguido por análisis del interferón ? segregado en los sobrenadantes de cultivo. Aunque hubo alguna reactividad cruzada de serotipos, la respuesta más alta se vio siempre en las PBMC estimuladas con el virus del mismo serotipo como la vacunación original (Tabla 14) . De esta manera, las respuestas de la interferón ? vistas en PBMC de estos receptores de vacuna monovalente, seleccionados, fueron específicas del serotipo del dengue. Las respuestas interreactivas fueron la mitad (o menos) de la respuesta específica del serotipo. Para los receptores de la vacuna de Dengue 2, la respuesta interreactiva más alta fue con el virus dengue 4. Para receptores de vacunas de dengue 4, la respuesta interreactiva más alta fue con virus de dengue 2. Para los receptores de vacuna de dengue 1, las respuestas interreactivas variaron. Solo hubo un receptor de vacuna de dengue 3 en este grupo y esa respuesta fue específica del serotipo.

Tabla 14. Expresión de interferón ? interreactiva y específica del serotipo por las PBMC recolectadas de receptores de vacuna monovalente. Las PBMC recolectadas de individuos que reciben vacunas monovalentes de dengue atenuado se estimularon de manera separada en cultivo con cada uno de los cuatro serotipos de virus de dengue. Se seleccionó un subgrupo de células en base a la producción de interferón ? de al menos 1000 pg/ml en otros ensayos. Las respuestas específicas del serotipo siempre fueron las más altas, sin embargo, también se señalaron respuestas interreactivas o de reactividad cruzada. Los resultados se muestran como el interferón ? de sobrenadante en picogramos/ml.

Ejemplo 12 Agotamientos de subconjuntos de células T. Para verificar que esto fue una respuesta de Thl, se determinó la identidad de las células que segregan el interferón ?. Esto se realizó al agotar células T o subconjuntos de células T antes del cultivo. Las células usadas en este estudio fueron PBMC mezcladas, separadas de la sangre entera usando una centrifugación con gradiente de densidad. Las células predominantes en las poblaciones de PBMC incluyen células T, células B, monocitos y células NK . Para esta valoración, se eligió el punto de tiempo de la respuesta más alta de interferón ? en base a la cinética en 13 voluntarios con monovalente y 3 con tetravalente. Se removieron células de las PBMC usando separación celular inmunomagnética . La eficiencia de agotamiento se valoró usando citometría de flujo en agotamientos de prueba. El análisis de las PBMC cultivadas no se realizó debido al pequeño número disponible. En los agotamientos de prueba, la remoción de células CD3+ usando el anticuerpo monoclonal CD3 dio por resultado una reducción de 92 % de células CD3 + positivo con relación a los controles de PBMC no agotados. El agotamiento de CD3 se monitoreo usando marcas duales para CD3 y CD4 , marcas duales para CD3 y CD8 y marca individual para CD3. El agotamiento de CD3 fue más minucioso para células CD4+ que para células CD8+ con 98 % de las células T CD3/CD4 que se agotan en 90 % de las células • CD3 /CD8 que se agotan en los grupos agotados de CD3. La remoción de células CD8+ usando el anticuerpo monoclonal de CD8 dio por resultado una reducción de 99.9 % de células CD8+. Las PBMC seleccionadas se agotaron de los linfocitos T de CD3+ o CD8+, estimulados en cultivo con virus de dengue durante cuatro días, y luego se examinaron para el interferón ? segregado. Los resultados se compararon a aquellos obtenidos a partir de los controles de PBMC no agotados, cultivados al mismo tiempo. Los linfocitos T de CD4+ no se agotaron antes de la estimulación debido a que otras poblaciones celulares necesitan el auxiliar T de CD4+ para la producción de interferón ?. La remoción de células CD3+ antes del cultivo redujo sustancialmente la producción de interferón ? como se muestra en la Tabla 15. El intervalo para la reducción en el interferón ? después del agotamiento de CD3+ fue de 59-100 %. Se vio una producción de interferón ? reducida, pero significativa, en algunos cultivos agotados de CD3+. Esta producción residual indica que ya sea la pequeña cantidad de células CD3 + residuales que permanecen después de la separación celular inmunomagnética están segregando interferón ? y/o otra población de células también esta segregando interferón ?.

Tabla 15. Linfocitos que segregan (o que inducen la secreción de) interferón ? son células T CD3+, CD8-. Los subconjuntos seleccionados de linfocitos se agotaron negativamente usando técnicas de separación celular inmunomagné^ ;.ca . Las células restantes se estimularon con virus de dengue vivo durante cuatro días y el sobrenadante de cultivo se valoró para interferón ?. El agotamiento de linfocitos CD3+ antes del cultivo influenció negativamente la producción de interferón ?.

Excepto en un individuo, la remoción de células CD8+ antes del cultivo no redujo la producción de inferieron ?. En 9 de los 16 cultivos, la remoción de células CD8+ incrementó realmente su producción, posiblemente debido a la remoción de la supresión por estas células o al reducir la aniquilación de las células infectadas que presentan el antígeno por linfocitos citotóxicos CD8+. Conjuntamente, estos resultados indican que la interferón ? visto en estos cultivos de PBMC ya sea se segrega por linfocitos T CD4+ y/o por células influenciadas por linfocitos T CD4+. Esto soporta el hallazgo de una respuesta de Thl.

Ejemplo 13 Granzima B. Se asocia una respuesta de Thl con, entre otras cosas una respuesta de linfocitos citotóxicos. En un esfuerzo para ver si las células capaces de la aniquilación mediada por células estaban presentes en estos voluntarios de vacuna, se midió el ARNm de la granzima B en las PBMC cultivadas para los experimentos de agotamiento. Después de la remoción de los sobrenadantes de cultivo para el análisis de linfocinas, las células se sedimentaron y lisaron para la extracción de ARNm. Los cebadores específicos de la granzima B se usaron para RT-PCR. El producto de la PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa. La intensidad de la banda de gel se convirtió en una escala de +, - usando una fotografía de referencia (Figura 8) para la comparación. Las células extra de siete de los voluntarios se cultivaron sin virus. Las PBMC no estimuladas, estos siete voluntarios, tuvieron poca expresión del ARNm de la granzima B (- o +) . Con la estimulación específica del antígeno, sustancialmente, se reguló ascendentemente la expresión en los 16 restores seleccionados de vacuna (Figura 8) . El agotamiento de subconjunto de células T usando el anticuerpo monoclonal de CD8 no redujo significativamente la expresión de la granzima B con relación a las PBMC de control. Hubo 3 individuos (ID 16, 22 y 33) cuya expresión de granzima B se redujo en el grupo agotado de CD8. En uno (ID 33) , la disminución fue sustancial. En contraste, el agotamiento de los subconjuntos de las células T usando el anticuerpo monoclonal de CD3 redujo la expresión en 14 de los voluntarios. En 8 de los voluntarios monovalentes y en los 3 voluntarios de la tetravalente, la disminución fue sustancial . Cuatro de los no respondedores a interferón ? se examinaron para el ARNm de la granzima B. Todos mostraron bajos niveles de expresión (datos no mostrados ) . En las células de siete de los voluntarios, el agotamiento de los subconjuntos de células T usando el anticuerpo mono'clonal CD4 se realizó después de los cuatro días de cultivo. El agotamiento se realizó usando cultivo a fin de proporcionar actividad de células auxiliares T a todas las células que necesitan ayuda durante el cultivo. La remoción de células CD4+ después de la estimulación no afectó la expresión de la granzima B con relación a los controles no agotados en los siete voluntarios analizados. De esta manera, aunque existe una producción de la granzima B dependiente del antígeno, mediada por células Thl CD4+, las células actuales que producen la granzima B, parecen ser células diferentes de las células T. Si esta es la producción por células NK o macrófagos, se desconoce.

Análisis Dos objetivos de este estudio fueron determinar si hubo una respuesta medible de células T en los receptores de vacuna y si se puede ver una respuesta mediada por células a la segunda dosis de la vacuna. Para estos objetivos, se midió la cinética de respuesta de células T al re-estimular las células recolectadas a intervalos alrededor de lc.3 dos dosis. La re-estimulación se realizó con virus vivo en cultivos volumétricos de PBMC recolectados durante el estudio . Un tercer objeto de este estudio fue determinar la naturaleza de la respuesta de células T en términos de 1. Tipo celular definido por repertorio de linfocinas, 2. Respuestas interreactivas y específicas del serotipo del dengue, y 3. Una medición de la producción de granzima B, potencial, citotóxica. Estas respuestas se midieron en las PBMC de receptores de vacuna tanto monovalente como tetravalente. A pesar que los receptores de vacuna tetravalente, fue importante determinar si se puede detectar una respuesta a los cuatro serotipos del virus del dengue. Las respuestas de células auxiliares T humanas y de ratón se pueden dividir en dos grupos en base a su patrón de expresión 5 de linfocinas. Las células T auxiliares 1 (Thl) se caracterizan por la secreción de IL-2 e interferón ?. De estas dos linfocinas, el interferón ? es el más importante en términos de la identificación de células Thl . Las células T auxiliares 2 (Th2) se caracterizan por la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. En las poblaciones mezcladas de células o cultivo volumétrico de PBMC, uno de los dos patrones de secreción predomina usualmente . Un factor que tiene influencia en la respuesta de Thl o Th2 es la naturaleza de la infección asaltante. Las infecciones virales y algunas infecciones bacterianas tal como Listeria y Mycrobacteriu (Peters, 1996, Hepa tol ogy 23, 909-916) inducen frecuentemente una respuesta de Thl en tanto que algunas infecciones parásitas inducirán una respuesta de Th2 (Conrad et al., 1999, J Exp Med 171, 1497-1508) . La proporción de las dos respuestas puede variar durante el transcurso de la infección. Por ejemplo, aunque las infecciones virales usualmente empiezan con una respuesta de Thl, se puede producir una respuesta de Th2 después en la infección. La respuesta inicial de Thl puede incrementar las respuestas de CTL y el cambio directo del isotipo de inmunoglobulina en tanto que la siguiente respuesta de Th2 puede aumentar la producción de anticuerpos por células B. En la infección natural del dengue, un estudio mostró una respuesta de Thl en la mayoría de los individuos. La respuesta de Thl se asoció con una respuesta in."unitaria efectiva sin patogénesis severa asociada. En contraste, algunos individuos desarrollaron una respuesta de Th2 que se asoció con mayor patogénesis. A pesar de la asociación de una respuesta de Thl con una respuesta inmunitaria anti-dengue, efectiva, la linfocina clave de una respuesta de Thl, el interferón ?, tiene influencias tanto positivas como negativas en la respuesta inmunitaria. En Tailandia, Kurane encontró altos niveles de interferón ? en el suero de pacientes de DHF en comparación a menores niveles en el suero de pacientes de DF (Kurane et al., 1991, J Cl in Inves t 88, 1473-1480) . El interferón ? incrementado puede ser una medida de la activación inmunitaria. El interferón ? se necesita para activar y mantener la activación de células citotóxicas (células T CD4+, células T CD8+ y células NK) . En tanto que este mecanismo puede contribuir a la patogénesis en infecciones severas, la misma respuesta puede ser benéfica en infecciones más suaves al reducir el número de células viralmente infectadas a través de la cistolisis específica del antígeno. El papel positivo del interferón ? en el control de la infección del virus del dengue se demuestra en un modelo reciente con una característica de eliminación en ratones, eficiente en interferones a, ß y ?. Los ratones con una característica suprimida fueron susceptibles a la infección letal por los virus de dengue en contraste a los controles normales de adultos que fueron resistentes a la infección (Johnson y Roehrig, 1999, J" Virol 73, 783-786). Alternativamente, la interferón ? puede contribuir a la patogénesis de la infección del virus de dengue. Un mecanismo para la patogénesis puede ser por mejoramiento inmunitario debido al incremento de la infección de una célula objetivo principal, el macrófago. En el cultivo, el interferón ? incrementó la infección mediada por el tiempo de una línea celular de macrófagos U937 al incrementar el número de receptores Fc en la superficie de las células (Kontny et al., 1988, J Virol 62, 3928-3933). Aunque otro estudio usando macrófagos cultivados normales mostró el efecto opuesto de la disminución de la infección (Sittisombut et al., 1995, J" Med Virol 45, 43-49) . Dado estos resultados conflictivos , no es claro si la interferón ? contribuya a la infección incrementada de los macrófagos . En este estudio, una respuesta de Thl fue la respuesta predominante. Los ensayos para IL-4 e IL-10 fueron consistentemente negativos indicando una carencia de respuesta de Th2. Los altos niveles de interferón ? se detectaron en los sobrenadantes de muchos de los cultivos, indicando la presencia de una respuesta de Thl en estos cultivos. Puesto que las células estimuladas fueron PBMC enteras, las células responsables de la secreción de la interferón ? necesitan ser determinadas. Esto se hizo al agotar subconjuntos de células T usando un procedimiento inmunomagnético . El agotamiento negativo se realizó antes del cultivo con anticuerpos que reconocen ya sea CD3 o CD8. Puesto que el agotamiento de CD3 dio por resultado la abolición de la secreción del interferón ? y el agotamiento de CD8 no lo hizo, se concluyó que los linfocitos CD3+, CD8- fueron la población celular que segrega al interferón ? o al menos que controla la secreción del inferieron ?. Esto confirma que el interferón ? fue resultado de una respuesta de Thl. El interferón ? resiaual en algunos cultivos después del agotamiento puede haber sido debido a algunos linfocitos T CD4+ restante después del agotamiento u otras células en el cultivo, posiblemente células aniquiladoras naturales o macrófagos. La respuesta máxima de interferón ? fue específica del serotipo. Cuando las células de receptores de vacunas monovalentes se estimularon de manera separada por cada uno de los cuatro serotipos de virus de dengue, la producción máxima de interferón ? fue en respuesta a la estimulación por el virus de dengue homólogo al virus de la vacuna. Menos, se notaron i apuestas interactivas a otros virus de dengue en varios de los cultivos. Esto es similar a los resultados obtenidos por otros usando una diferente medición de la proliferación de linfocitos. En un estudio, las células de individuos que reciben una vacuna de dengue 2 exhibieron la respuesta más grande al virus de dengue 2, pero se notaron respuestas interreactivas o de reactividad cruzada (Dharakul, J Infec t Di s 170, 27-33) . Esto se confirmó al nivel clonal donde la mayoría de los clones obtenidos de un receptor de vacuna de dengue 3 respondieron mejor al antígeno de dengue 3 pero tuvieron respuestas de reactividad cruzada a los otros tres antígenos de dengue (Kurane et al., 1989, J Exp Med 170, 763-775). La conclusión de este último estudio fue que la infección primaria de virus de dengue produce respuestas de linfocitos CD4+ predominantemente de reactividad cruzada (proliferación y producción de interferón ?) . En este estudio, las respuestas de reactividad cruzada de las PBMC de los receptores de la vacuna monovalente usualmente fueron la mitad o menos de la respuesta específica del serotipo. En los receptores de la vacuna tetravalente, la secreción del inferieron ? en respuesta a los serotipos individuales de virus de dengue íue signiíicativa en tres de los cuatro receptores de vacuna tetravalente. Las respuestas variaron dentro de los receptores individuales de vacuna aunque no íue posible determinar si las respuestas menores íueron respuestas especíiicas al serotipo o respuestas de reactividad cruzada. La cinética de la activación de células T como se indica por la secreción de inferieron ? iue más lenta que lo esperada. En pocos casos, se pueden detectar respuestas por el día 14. Sin embargo, la mayoría de los casos, las respuestas no se detectaron hasta justo antes de la administración de la segunda dosis de vacuna. No es claro cual es la razón para la cinética retrazada. Una explicación podría ser que la producción del antígeno por las células iníectadas con el virus de la vacuna es más lenta y persistente. Sin embargo, igualmente es posible que los métodos detectaron preíerencialmente respuestas de memoria más que respuestas agudas. Por ejemplo, si las células CD8+ activas íueron inhibidoras de una respuesta de CD4+ en las PBMC recolectadas durante la infección temprana se puede atenuar una respuesta medible. En los cultivos donde los linfocitos CD8+ se agotaron, la secreción de inferieron ? por los liníocitos restantes se incrementó en más de la mitad de los cultivos. Esta inhibición puede haber sido mayor durante la infección temprana. Otros han observado cinéticas de producción de linfocinas, más agudas. Algunas linfocinas, incluyendo el interferón ? de suero se midieron durante 17 días después de la inoculación con la vacuna de dengue atenuado. Una respuesta aguda se notó en este estudio, que fue máxima durante el tiempo de la viremia. (Kurane et al., 1995, J Cl in Lab Im unol 46, 35-40) . La respuesta a la segunda dosis se mezcló. Algunos individuos mostraron un incremento en la producción de interferón ? en tanto que otros mostraron una disminución. La producción de interferón ? por células recolectadas de receptores de vacuna, justo antes de la segunda dosis fue suficientemente alta tal que puede haber enmascarado cualquier respuesta a la anamnéstica a la segunda dosis. Además, la respuesta a interferón ? tardía puede haber hecho más difícil la medición de una respuesta anamnéstica de células T. Es claro que algunos individuos respondieron a la segunda dosis. Esto puede indicar que existe algún crecimiento localizado del virus en la presencia cte una respuesta inmunitaria activa. En resumen, la respuesta de células T predominantes a la administración de estos virus de dengue atenuados, virus, una respuesta de Thl. Esto se demostró por la secreción de interferón ? por las PBMC re-estimuladas recolectadas de receptores de vacuna. Ninguno de los cultivos de PBMC de las células en los receptores de vacuna tiene secreción significativa de IL-4 o IL-10 en el sobrenadante de cultivo después de la re-estimulación. La respuesta de Thl se verificó al mostrar que los linfocitos CD3+, CD8-estuvieron segregando el interferón ?. La respuesta de Thl fue predominantemente específica del serotipo del dengue pero se notaron respuestas de reactividad cruzada, más pequeñas.

Ejemplo 14 Evaluaciones clínicas e inmunológicas de cuatro virus de dengue como cepas de estimulación en voluntarios inmunitarios y susceptibles El objetivo principal de este estudio es caracterizar las respuestas clínicas a cada . uno de los cuatro virus candidatos de estimulación de dengue en voluntarios susceptibles e inmunitarios para juzgar su adecuabi lidad como cepas de estimulación para estudios de eficiencia de vacuna en humanos. El objetivo secundario del estudio es generar hipótesis con respecto a las correlaciones inmunitarias de protección para la fiebre del dengue. Dosis, Programa y Ruta: Todos los voluntarios recibieron ya sea uno de cuatro virus de estimulación de dengue o placebo en una dosis individual de 0.5 ml , subcutáneamente, en la región deltoide en el día 0 del estudio .

Grupos de Estudio: Conjunto #1 de Voluntarios (susceptible): para recibir ya sea DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 o placebo, Conjunto #2 de Voluntario (inmunitario) : para recibir ya sea virus de DEN (e.rotipo que corresponde a vacuna previamente recibida) o placebo.

Criterios Generales de Elegibilidad: Edad 18-35, excelente salud sin ninguna condición médica crónica, puntuación >75 % en examen de compresión de estudio escrito, consentimiento escrito, disponibilidad para el periodo de estudio, carta de aprobación para participación de cadena de comando (militar únicamente), conversión serológica en respuesta a una previa vacunación de dengue (conjunto #2 de voluntarios únicamente) . Estadísticas: El análisis de datos será principalmente descriptivo en este estudio piloto dado el pequeño número de voluntarios en cada grupo de artículo de prueba. El interés primario será documentar la írecuencia de los eventos clínicos (pre-especiíicados y no esperado) dentro de los cuatro grupos de estudio en comparación al placebo. Las mediciones inmunitarias pre-estimulación y las respuestas inmunitarias post-estimulación de todos los voluntarios estimulados quienes desarrollaron íiebre de dengue se comparará a aquellos voluntarios estimulados quienes permanecieron bien, para desarrollar la hipótesis acerca de las correlaciones inmunitarias de protección. Aplicación del Modelo de Estimulación de Dengue Humano: En contraste a los experimentos históricos de estimulación con dengue en humanos que se diseñaron ya sea para caracterizar la eníermedad del dengue o para evaluar la atenuación de candidatos vivos de vacuna, este estudio de estimulación ayudará a 1) validar 4 virus de dengue como cepas de estimulación en voluntarios sin aiección de ilavivirus (conjunto #1), y 2) para identiíicar correlaciones de inmunidad en receptores de la vacuna monotípica de dengue cuando se estimula subsecuentemente con virus de dengue homotípico (conjunto #2 de voluntario) . Si la respuesta clínica en el conjunto #1 de voluntarios sugiere que estas cepas son adecuadas para la estimulación, entonces en experimentos íuturos controlados, estas cepas de estimulación se administrarán a receptores de candidatos de vacuna de dengue o placebo para seleccionar los candidatos de vacuna más prominentes para el desarrollo adicional. Si la respuesta inmunológica en el conjunto #2 de voluntarios sugiere que algún aspecto de la inmunidad pre-estimulación (anticuerpos y/o memoria de células T) correlaciona con la protección, estas correlaciones de protección podrían simpliíicar el desarrollo de las vacunas de dengue. Criterios de Definición para Virus de Dengue que se van a Probar como Cepas de Estimulación: Un virus de estimulación de dengue, adecuado 1) provocará de fbrma reproducible fiebre de dengue no complicada que dura 3-7 días en el conjunto #1 de voluntarios, 2) se producirá de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación (GMP) y estará libre de agentes inesperados o componentes no virales reactogénicos , y 3) estará disponible como virus liofilizado en cantidad suficiente (dosis >100) . Los Virus de Estimulación incluyen DEN-1 45AZ5 (PDK-O) inactivado, DEN-2 S16803 (PDK-10), DEN-3 cl 24/28 (PDK-O), DEN-4 341750 (PDK-6) (PDK - células de riñon de perro, primarias) . La dosis de cada virus de estimulación en unidades de formación de placa (pfu.) será un título de 0.5 x. Los virus de estimulación de estudio cumplen con los últimos dos criterios. Este estudio tiene como finalidad demostrar que las cepas de estimulación, candidatas, de estudio cumplen con el primer criterio. Se tiene alguna evidencia que los 4 virus de estimulación se van a probar en este estudio son apropiadamente patógenos. Los virus de estimulación DEN-1 y DEN-3 se han mostrado ya que provocan enfermedad febril no complicada en los voluntarios. Aunque los virus de estimulación de DEN-2 y DEN-4 que se van a administrar en estos estudios están sin probar en voluntarios, se cree que son patógenos, puesto que son los precursores de los candidatos de la vacuna de virus de dengue, que se rechazaron debido a que provocaron enfermedad febril en voluntarios. La única razón para el rechazo de cualquiera de los cuatro virus de estimulación de dengue, candidatos, de estudio es que provocan ya sea no enfermedad en voluntarios sin afectación de flavivirus (conjunto #1 de voluntario) o enfermedad excesiva en cualquier voluntario (conjuntos #1 y #2 de voluntario) . Conjunto #1 de Voluntarios: Diez voluntarios saludables sin afectación de ílavivirus se repartieron al azar para recibir la estimulación con virus de dengue con uno de cuatro serotipos (2 voluntarios por serotipo) o placebo. Los voluntarios e investigadores permanecerán sin saber el inoculo. Se esperará que los 8 voluntarios quienes recibieron el virus de estimulación de dengue llegarán a estar eniermos moderadamente con 3-7 días de íiebre, jaqueca severa y mialgias. La recuperación completa puede tomar unos 14 días desde el comienzo de la enfermedad. Cada virus de estimulación parecerá adecuado en base a las respuestas clínicas de los dos receptores y debe cumplir con la definición del estudio de la fiebre de dengue. La fiebre de dengue se define como: una enfermedad con: 2 ó más de los siguientes: jaqueca, mialgia, salpullido eritematoso, dolor retroorbital , artralgias, y fiebre sostenida durante 48 horas o más permitiendo periodos de temperatura disminuida debido al uso de acetominofen y respuesta del tejido durante el periodo de fiebre y días posteriormente se manifiesta por neutropenia o trombocitopenia o lesión hepática, y evidencia de viremia de dengue durante el periodo de fiebre.

Conjunto #2 de Voluntarios: Hasta doce voluntarios jóvenes, inmun tarios , saludables recibirán virus de estimulación de dengue, homotipicos (N=10, a pesar del serotipo) o placebo (N=2) . Los voluntarios mmunitapos son receptores previos de la vacuna de dengue, atenuada, viva, monovalente, quienes tienen una respuesta de anticuerpos neutralizantes primarios. Los voluntarios mmunitapos se esperan que se mantengan bien. Las mediciones de su estado mmunitapo pre-estimulado o mtra-estimulacion de activación mmunitaria puede identificar las correlaciones de protección .

LISTADO DE SECUENCIAS ' AGC CGA AGC AGT TTA TCC C (SEQ ID NO : 1 ) grb2b (anti-sentido) 5'C TCT GGT CCG CTT GGC CTT TCT (SEQ ID NO:2)

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición inmunogénica que comprende, en un vehículo fisiológicamente aceptable, más de un virus de dengue atenuado elegido del grupo que consiste de dengue-1, dengue-2, dengue-3, dengue-4.
2. 2. La composición inmunogénica según la reivindicación 1, que comprende -además un adyuvante para mejorar la respuesta mmunitapa.
3. 3. La composición inmunogénica según la reivindicación 1, formulada en una dosis de 102 a 106 píu de virus atenuado.
4. 4. Uso de un virus atenuado elegido del grupo que consiste de dengue 1, dengue 2, dengue 3 y dengue 4, en un portador fisiológicamente aceptable, para estimular la respuesta mmunitapa especííica del virus de dengue.
5. 5. Uso según la reivindicación 4, en donde el virus atenuado se proporciona para aplicación parenteral .
6. 6. Uso según la reivindicación 4, en donde el virus atenuado se proporciona para aplicación mt ranasal .
7. 7. Una vacuna de virus de dengue, atenuado, vivo, multivalente que comprende cualquier combinación de serotipos de virus de dengue seleccionada del grupo que consiste de: dengue 1, dengue 2, dengue 3, y dengue 4.
8. 8. La vacuna según la reivindicación 7, en donde el dengue 1 es 45AZ5 PDK20 con ATCC No. VR-2648.
9. 9. La vacuna según la reivindicación 7, en donde el dengue 2 es S16803 PDK50 con ATCC No. VR-2653.
10. 10. La vacuna según la reivindicación 7, en donde el dengue 3 es CH5389 PDK20 con ATCC No. VR-2647.
11. 11. La vacuna según la reivindicación 7, en donde el dengue 4 es 341750 PDK20 con ATCC No. VR-2652.
12. 12. La vacuna según la reivindicación 7, en donde el dengue 1 es 45AZ5 PDK20 con ATCC No. VR2648, dengue 2 es S16803 PDK50 con ATCC No. VR-2653, dengue 3 es CH5389 PDK20 con ATCC No. VR2647, y dengue 4 es 341750 PDK20 con ATCC No. VR-2652.
13. 13. La vacuna de virus de dengue según la reivindicación 7, en donde el virus de dengue se produce en células vertebradas.
14. 14. La vacuna de virus de dengue según la reivindicación 13, en donde las células son células Vero .
15. 15. La vacuna de virus de dengue según la reivindicación 7, en donde el virus de dengue esta en la cantidad de 102 a 107 pfu/ml, él virus de dengue-2 esta en la cantidad de 102 a 107 pfu, el virus de dengue-3 esta en la cantidad de 102 a 107 pfu, y el virus de dengue-4 esta en la cantidad de 102 a 107 píu/ml .
16. 16. La vacuna de virus de dengue según la reivindicación 15, en donde la vacuna se proporciona para aplicación subcutánea.