ES2322327T3 - Vacuna multivalente contra el virus del dengue. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende, en un vehículo fisiológicamente aceptable, la cepa atenuada del dengue-3 CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647 y al menos otro virus atenuado del dengue seleccionado entre dengue-1 45AZ5 PDK 20 con ATCC Nº VR2648, dengue-2 S 16803 PDK50 con ATCC Nº VR2653, y dengue 4 341750 PDK20 con ATCC Nº VR265

Description

Vacuna multivalente contra el virus del dengue.

Introducción

La fiebre del dengue está causada por cualquiera de los cuatro serotipos del virus del dengue, dengue-1, dengue-2, dengue-3, y dengue-4, que se transmiten a los seres humanos por los mosquitos. En adultos, las infecciones por dengue típicamente causan enfermedad aguda auto-limitada pero incapacitante con fiebre, dolores musculares, jaquecas y erupción ocasional. La enfermedad puede complicarse por fiebre hemorrágica, que puede manifestarse por un ensayo de torniquete positivo, petequias espontáneas, sangrado evidente, y/o choque. La fiebre hemorrágica del dengue es fatal en aproximadamente el 0,5% de los casos. Los pacientes que tienen anticuerpos de una infección por dengue anterior que se infectaron posteriormente por otra cepa de dengue han mostrado estar en mayor riesgo de fiebre hemorrágica del dengue.

Los mosquitos vectores de virus del dengue se encuentran en todas las áreas tropicales y sub-tropicales del mundo y en algunas áreas templadas de los Estados Unidos, Europa, África, y Oriente Medio. En los últimos años, han existido infecciones por dengue endémicas y epidémicas en América Central y del Sur, el Sudeste asiático, India, África, las regiones del Caribe y el Pacífico. El control del vector es poco práctico.

Se necesita una vacuna eficaz que debe conferir protección contra los cuatro serotipos del dengue.

BHAMARAPRAVATI N, YOKOSAN S: "Live attenuated tetravalent dengue vaccine" en: Gubler DJ, Kuno G, editors. DENGUE AND DENGUE HEMORRHAGIC FEVER. Capítulo 17, 1997, páginas 367-377, Londres, RU describe vacunas tetravalentes atenuadas vivas contra el dengue.

Sumario de la invención

La presente invención satisface la necesidad analizada anteriormente. La presente invención se refiere a composiciones de vacuna que comprenden virus del dengue atenuado de los cuatro serotipos. El virus atenuado se proporciona en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en un huésped humano, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable y puede incluir opcionalmente un adyuvante para potenciar la respuesta inmune del huésped.

De acuerdo con la presente invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende, en un vehículo fisiológicamente aceptable, la cepa del dengue-3 atenuada CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647 y al menos otro virus del dengue atenuado seleccionado entre dengue-1 45AZ5 PDK 20 con ATCC Nº VR2648, dengue-2 S16803 PDK50 con ATCC Nº VR2653, y dengue-4 341750 PDK20 con ATCC Nº VR2652.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Aparición de síntomas de >Grado 1 como resultado de la administración de la vacuna.

Figura 2: Frecuencia de distribución del índice de reactogenicidad por serotipo.

Figura 3: Tabla que muestra los resultados de estudios de vacuna tetravalente contra el dengue de dosis escalonada.

Figura 4: Tabla que muestra la inmunogenicidad de la vacuna tetravalente contra el dengue de dosis completa en 10 sujetos.

Figura 5: Tabla que muestra detalles de formulaciones seleccionadas de estudios de vacuna tetravalente.

Figura 6, A-H: Producción de interferón \gamma por PBMC recogidas de voluntarios de vacuna y estimulados con virus de serotipo específico. Todos los voluntarios recibieron solamente un serotipo de vacuna. Los gráficos a la izquierda (A-D) muestran los resultados de voluntarios a los que se dio la segunda dosis aproximadamente en el día 32. Los gráficos a la derecha (E-H) muestran los resultados de voluntarios que recibieron la segunda dosis aproximadamente en el día 92. Se observó una respuesta sobre 1000 pg/ml justo antes de la segunda dosis en la mayoría de los voluntarios. Solamente cuatro voluntarios tuvieron una respuesta sobre 1000 pg/ml en los primeros 15 días de recibir la primera dosis de vacuna.

Figura 7, A-D: Producción de interferón \gamma de PBMC recogidas de voluntarios de vacuna que recibieron vacuna tetravalente. Las PBMC se estimularon individualmente con cada serotipo de virus. Las líneas individuales en cada gráfico representan respuestas de las PBMC de un voluntario para serotipos individuales de virus. Como con los destinatarios de la vacuna monovalente, se anotaron las últimas respuestas.

Figura 8, A y B: Producción de ARNm de granzima B de PBMC recogidas de voluntarios de vacuna monovalente y tetravalente. Las células se recogieron de todos los individuos cuyas PBMC secretaban \geq 1000 pg IFN\gamma/ml en todo momento. Ésta es una representación semicuantitativa de la cantidad de ARNm detectada por RTPCR. El diagrama superior (A) describe la intensidad de las bandas observadas para todas las muestras. El gel inferior (B) es de voluntarios seleccionados para mostrar ejemplos de ensayos de RTPCR positivos y negativos.

Descripción detallada

La presente invención proporciona virus del dengue atenuado de los cuatro serotipos adecuado para su uso en vacunas en seres humanos. Los virus del dengue descritos en este documento se produjeron por pases seriados de un asilado de virus del dengue infeccioso en una línea celular huésped adecuada tal como células de riñón de perro primarias de modo que se acumulen mutaciones que confieren atenuación en el aislado. El pase seriado se refiere a la infección de una línea celular con un aislado viral, la recuperación de la descendencia viral a partir de las células huésped, y la posterior infección de células huésped con la descendencia viral para generar el siguiente pase.

Los siguientes virus atenuados se usan en las composiciones de la presente invención aunque puedan usarse otras composiciones de virus, de cualquier serotipo, esté atenuado o inactivado, en combinación con las cepas atenuadas descritas en la presente invención. El virus del dengue-1 atenuado, derivado del aislado 45AZ5, se depositó según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de acceso VR-2648.

El virus del dengue-2 atenuado derivado del aislado S16803, se depositó según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de acceso VR-2653.

El virus del dengue-3 atenuado derivado del aislado CH53489, se depositó según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de acceso VR-2647.

El virus del dengue-4 atenuado derivado del aislado 341750, se depositó según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de acceso VR-2652.

El pase seriado de una cepa virulenta (que causa enfermedad) del dengue provoca el aislamiento de virus modificado que puede estar atenuado, es decir, infeccioso, aunque incapaz de causar enfermedad. Estos virus modificados se ensayan en monos para la infectividad reducida. Aquellos que tienen infectividad reducida se ensayan posteriormente en seres humanos. Los seres humanos son el único primate que mostrará signos de enfermedad clínica. Los virus que muestran reactividad de mínima a no clínica aunque aún infectan e inducen una respuesta inmune están ate-
nuados.

En una realización de la invención, se pasó de forma seriada un aislado del dengue virulento de los cuatros serotipos del dengue en células de riñón de perro primarias (PDK) para obtener las cepas atenuadas. El pase seriado se realizó infectando células PDK con la cepa virulenta, incubando las células infectadas durante varios días, y recogiendo los fluidos de cultivo sobrenadantes que contenían virus. El virus recogido después se aplicó a células PDK frescas para generar el siguiente pase.

Se ensayaron diversos pases en las series para el efecto clínico después del pase final en células pulmonares de mono rhesus fetal (FRhL). Se usaron células FRhL para optimizar los títulos virales en los que, en general, el pase 1 se consideró la semilla maestra, el pase 2 se consideró la semilla de producción, y el pase 3 se consideró el lote de vacuna. Las vacunas se prepararon a diversos niveles de pase en PDK, y los productos de vacuna se ensayaron para la atenuación en monos y seres humanos. La virulencia de un virus pasado, es decir, la capacidad de causar enfermedad, se evaluó por control diario de los síntomas tales como temperatura (fiebre), jaqueca, sarpullido, por nombrar unos pocos. El pase se consideró atenuado, juzgado por la incapacidad de este virus de provocar signos clínicos de enfermedad dengue en vacunados.

La propagación de los virus atenuados de la invención puede ser en varias líneas celulares que permitan el crecimiento del virus del dengue. El virus del dengue crece en una diversidad de células humanas y animales. Las líneas celulares preferidas para la propagación de virus del dengue atenuados para su uso en vacuna incluyen DBS-FRhL-2, células Vero y otras células de mono. Las producciones más elevadas de virus habitualmente se consiguen con líneas celulares heteroploides tales como células Vero. Las células típicamente se inoculan a una multiplicidad de infección que varía de aproximadamente 0,01 a 0,005, y se cultivan en condiciones permisivas para la replicación del virus, por ejemplo, a aproximadamente 30-37ºC y durante aproximadamente 3-5 días, o todo el tiempo necesario para que el virus alcance un título adecuado. El virus se retira del cultivo celular y se separa de los componentes celulares, típicamente por procedimientos de aclarado bien conocidos, por ejemplo, centrifugación, y puede purificarse adicionalmente según se desee usando procedimientos bien conocidos para los especialistas en la técnica.

El aislamiento de un virus atenuado puede estar seguido de un análisis de secuencia de su genoma para determinar la base para el fenotipo atenuado. Esto se consigue secuenciando el ADN viral e identificando los cambios de nucleótidos en el aislado atenuado con relación a la secuencia genómica de un virus de control. Por lo tanto, pueden caracterizarse los cambios moleculares que confieren atenuación en una cepa virulenta.

Para su uso en vacuna, los virus atenuados de la invención pueden usarse directamente en formulaciones de vacuna, o liofilizarse, preferiblemente en un estabilizador (Hoke, 1990, Am J Trop Med Hyg 43, 219-226), según se desee, usando protocolos de liofilización bien conocidos para los especialistas. El virus liofilizado típicamente se mantendrá a aproximadamente 4ºC. Cuando esté listo para su uso, el virus liofilizado se reconstituye en agua, o si es necesario, en una solución estabilizante, por ejemplo, solución salina o que comprenda Mg^{++} y HEPES, con o sin adyuvante, como se describirá adicionalmente a continuación.

Por tanto, las vacunas contra el virus del dengue de la invención contienen como ingrediente activo una cantidad inmunogenéticamente eficaz de más de un virus del dengue atenuado elegidos entre el grupo constituido por dengue-1, dengue-2, dengue-3, y dengue-4 como se describe en este documento. La composición de virus atenuado puede introducirse en un sujeto, particularmente seres humanos, con un vehículo fisiológicamente aceptable y/o adyuvante. Los vehículos útiles son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso como tales, o liofilizadas, rehidratándose la preparación liofilizada antes de la administración, como se ha mencionado anteriormente. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para ajustar y tamponar el pH, agentes para ajustar la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, y
similares.

La administración de los virus atenuados vivos descrita en este documento puede realizarse por cualquier medio adecuado, incluyendo tanto inyección parenteral (tal como inyección intraperitoneal, subcutánea, o intramuscular), por inyección in ovo en pájaros, por vía oral como por aplicación tópica del virus (típicamente transportada en la formulación farmacéutica) a una superficie de las vías respiratorias. La aplicación tópica del virus a una superficie de las vías respiratorias puede realizarse por administración intranasal (por ejemplo, por el uso de un cuentagotas, hisopo, o inhalador que deposita una formulación farmacéutica por vía intranasal). La aplicación tópica del virus a una superficie de las vías respiratorias también puede realizarse por administración por inhalación, tal como creando partículas respirables de una formulación farmacéutica (incluyendo tanto partículas sólidas como partículas líquidas) que contiene el virus en forma de una suspensión de aerosol, y después provocando que el sujeto inhale las partículas respirables. Los procedimientos y aparato para administrar partículas respirables de formulaciones farmacéuticas son bien conocidos, y puede emplearse cualquier técnica convencional. Como resultado de la vacunación el huésped llega a ser parcial o completamente inmune a infección por virus del dengue de los serotipos administrados, o resistente a desarrollar infección viral por dengue moderada o grave.

La composición de vacuna que contiene los virus del dengue atenuados de la invención se administra a una persona susceptible a o de otro modo en riesgo de infección por el virus del dengue para potenciar las capacidades de respuesta inmune del propio individuo. Dicha cantidad se define como una "dosis inmunogenéticamente eficaz". En este uso, la cantidad precisa depende de nuevo del estado de salud y peso del sujeto, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc., pero generalmente varía de aproximadamente 10^{2} a 10^{6} pfu de cada serotipo de virus del dengue pos sujeto. La cantidad de vacuna contra el virus de cada serotipo puede ajustarse, es decir aumentarse o disminuirse, para producir una formulación que proporcione suficiente protección de la infección con el virus del dengue deseado. Cuando se combinan los cuatro serotipos, una composición preferida comprende una cantidad igual de cada serotipo del dengue. En cualquier caso, las formulaciones de vacuna deben proporcionar una cantidad de virus del dengue atenuado de cada uno de los serotipos suficientes para proteger de forma eficaz al paciente contra infección por el virus del dengue grave o amenazante de la vida de un serotipo en la formulación de vacuna, y posiblemente otros serotipos su sucede protección cruzada.

Los virus del dengue atenuados de la invención de un serotipo particular pueden combinarse con virus atenuados de otros serotipos de virus del dengue para conseguir protección contra múltiples virus del dengue. Típicamente los diferentes virus modificados estarán en mezcla y se administrarán simultáneamente, pero también pueden administrarse por separado.

En algunos casos puede ser deseable combinar las vacunas contra el virus del dengue atenuado de la invención con vacunas que inducen respuestas protectoras contra otros agentes.

Puede realizarse la administración sencilla o múltiple de las composiciones de vacuna de la invención. Puede requerirse la administración múltiple para provocar suficientes niveles de inmunidad. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse midiendo la cantidad de anticuerpos secretados o séricos neutralizantes, y pueden ajustarse las dosificaciones o repetirse las vacunaciones según sea necesario para mantener los niveles deseados de pro-
tección.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, no limitación.

Los siguientes Materiales y procedimientos se usaron en los siguientes ejemplos.

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Materiales y Procedimientos para la producción de vacuna

Cepas virales. Los virus DEN se pasaron en cultivos celulares de riñón de perro primarios (PDK) después del aislamiento de fuentes humanas y mosquitos. La Tabla 1 enumera las capas que se adaptaron y pasaron en células PDK. Después del pase en células PDK, las cepas virales se adaptaron adicionalmente a células FRhL para la producción de semilla y vacuna. Esto constaba de 3-4 pases adicionales para la preparación del lote de vacuna final. Las cepas virales precursoras, también enumeradas en la Tabla 1, se obtuvieron de pases en cultivo celulares, inferiores en células que eran permisivas para la replicación del virus DEN.

Producción de vacuna. Las vacunas DEN para los cuatro serotipos se prepararon en cultivo celular FRhL usando un procedimiento similar. Las células FRhl, depositadas y pre-ensayadas (véase la Tabla 2 para los resultados de ensayo) se retiraron de almacenamiento en nitrógeno líquido y se sembraron en matraces de 150 cm^{2} en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (Biowhittaker, Waldersville, MD) celular suplementado con aminoácidos no esenciales, suero bovino fetal, FBS (2%) (Biowhittaker, Waldersville, MD), y antibióticos. Después de que los matraces alcanzaran confluencia, se retiró el medio y los matraces se inocularon con la semilla de producción DEN diluida para una aportación de 0,01 MOI, y se dejó que adsorbiera a 32ºC durante 1 h. Después de la adsorción y el suministro de medio EMEM fresco, los matraces se devolvieron a 32ºC durante 4 días. En el día 4 después de la inoculación, se desechó el medio de todos los matraces y las monocapas celulares se lavaron 3 veces con 100 ml de Hank BSS (Biowhittaker, Waldersville, MD). Después del lavado, se suministró a los matraces medio EMEM que contenía albúmina sérica humana al 0,25% (HSA, Alpha Therapeutic Corp, Los Angeles, CA) remplazando el FBS. Después de dos días adicionales de incubación a 32ºC, se retiraron los fluidos de cultivo sobrenadantes de todos los matraces y se combinaron. Después del muestreo para los ensayos de seguridad, los fluidos de cultivo restantes se combinaron y aclararon por filtración a través de un filtro de membrana de 0,45 micrómetros, que con se une a proteínas. Los fluidos filtrados se combinaron y se mezclaron con un volumen igual de estabilizador que contenía lactosa al 15% y HSA al 5%. Los fluidos estabilizados a granel se almacenaron a -70ºC hasta que se secaron por congelación. Para la introducción en viales final, los fluidos estabilizados a granel se descongelaron rápidamente a 41ºC y se hicieron en alícuotas en volúmenes de 3 ml en viales séricos. Las bandejas de viales se congelaron a una temperatura de -40ºC en un liofilizador Hull, seguido de secado durante 1 día. Después de taparlos, los viales se almacenaron a -20ºC en un congelador controlado.

Ensayo de vacuna. Todos los depósitos celulares usados para las preparaciones virales así como la semilla y lotes de vacuna se ensayaron para la presencia de agentes contaminantes. Los artículos de ensayo y los resultados se enumeran en la Tabla 2. No se encontraron contaminantes detectables en ninguno de los productos.

Inoculación en mono rhesus. Se inmunizaron monos rhesus macho y hembra adultos (6-15 kg) con los lotes de vacuna DEN o virus precursores por inoculación subcutánea de 0,5 ml en el antebrazo. Se extrajo sangre para el aislamiento de virus y los ensayos de anticuerpo de la vena femoral antes de la inoculación y cada día durante 14 días después de la inoculación. También se extrajo sangre a los 30 y 60 días después de la inmunización. Se realizaron exposiciones al virus de forma similar.

Asilamiento de virus por amplificación en células C6/36

El aislamiento de virus por amplificación en cultivo celular C6/36 se ha descrito en Putnak y col., 1996 (J. Infect Dis 174, 1176-1184). En resumen, después de la inoculación de los monos, se obtuvieron muestras sanguíneas diarias del día 1 a 14. El suero se separó y se congeló a -80ºC. Para la recuperación del virus de los sueros, los sueros descongelados se diluyeron 1:3 en medio de cultivo celular y se usaron para inocular matraces de 25 cm^{2} que contenían monocapas de células de mosquito C6/36. Después de la adsorción del virus, los matraces se mantuvieron a 28ºC en medio de mantenimiento EMEM. Después de 7 días, se cambió el medio y los matraces se incubaron 7 días adicionales. En el día 14 después de la inoculación, se decantaron los fluidos de cultivo sobrenadantes y se congelaron a -80ºC después de mezclar con un volumen igual de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor. Las muestras congeladas después se ensayaron para virus infeccioso por ensayo de placa.

TABLA 1 Cepas del virus del dengue para el desarrollo de vacunas atenuadas vivas

1

TABLA 2 Ensayo pre-clínico de depósitos de células FRhl y semillas DEN LAV y lotes de vacuna

3

TABLA 3 Series de cepas de virus DEN adaptadas a células PDK, usadas para inoculación de monos rhesus

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TABLA 3 (continuación)

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Ensayos de placa. Se tituló el virus infeccioso a partir de aislados de viremia amplificados o directamente de sueros de mono por ensayo de placa en células de riñón de mono rhesus (LLC-Mk_{2}, ATCC CCL7) siguiendo el procedimiento de Sukhavachana y col. 1966 (Bull WHO 35, 65-66). Los ensayos en células C6/36 se realizaron como se describe en Putnak y col. 1996, supra.

Ensayos de neutralización. Los anticuerpos neutralizantes DEN se midieron a partir de sueros de mono usando un ensayo de neutralización de reducción de placa similar al usado por Russell y col. 1967 (J Immunol 99, 285-290). Se usaron los virus precursores enumerados en la Tabla 1 para medir el punto final de reducción de placa al 50% (PRNT50) en muestras de suero.

Ejemplo 1 Modificación del virus DEN en células PDK y producción del lote de vacuna

Las cepas de virus DEN seleccionadas para el desarrollo de vacuna tenían una diversidad de historias de pases antes del pase en PDK. En el caso de DEN-4 341750 tenía solamente un pase en mosquito antes de la inoculación del cultivo celular PDK, mientras que la cepa DEN-1 West Pac 74 tenía una historia de veinte pases en células FRhL antes del pase en PDK (Tabla 1). Con la excepción de DEN-3, todas las cepas se adaptaron después de una pequeña cantidad de pases en PDK. Para DEN-3, se requirieron esfuerzos adicionales para aumentar la aportación viral en los primeros pases para adaptar esta cepa a células PDK. Como caso general después de la adaptación a células PDK, se descubrió que los títulos de virus DEN estaban en el intervalo de 10^{4}-10^{5} PFU/ml. Los intentos por aumentar los títulos no fueron satisfactorios y se buscaron sustratos celulares alternativos para la producción de vacuna. Se seleccionaron células DBS-FRhL-2 (FRhL) para este propósito por varias razones: 1) los virus DEN se replican a títulos de aprox.10^{6} PFU/ml permitiendo la fabricación de vacunas DEN en estas células; 2) las células se han usado para la preparación de varias vacunas DEN que se han ensayado en ensayos clínicos en Fase I sin reacciones adversas que puedan relacionarse al sustrato celular de la vacuna; 3) las células FRhL son células diploides pulmonares de mono rhesus, normales que no tienen potencial tumorigénico y están libres de actividad transcriptasa inversa y agentes contaminantes; 4) como las células son células diploides "normales" no existen requisitos reguladores u otros requisitos para purificar las vacunas; 5) pueden establecerse depósitos de células FRhL a generaciones celulares utilizables para la fabricación de vacunas partiendo con células de pase inferior, disponibles. Por lo tanto el pase en PDK proporciona un modelo excelente para aquellos que desean estudiar el proceso empírico de la atenuación selectiva. Pero, como el pase seriado en PDK ejerce un proceso de selección cumulativo, el pase adicional en otro sustrato celular proporciona su propia presión selectiva. No se sabe si el pase en FRhL aumenta o no o disminuye o no la virulencia del virus para seres humanos. Es interesante el uso de líneas celulares estables que deban caracterizarse completamente sólo una vez. Sin embargo, la experiencia publicada con células FRhL sugiere que estas células pueden revertir o desestabilizar las propiedades biológicas adquiridas durante el pase seriado en PDK (Halstead y col., 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 654-665; Halstead y col., 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 666-671; Halstead y col., 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 672-678; Halstead y col., 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 679-683; Eckels y col. 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 679-683).

La adaptación de virus pasado en PDK a FRhL fue uniformemente satisfactoria para todas las cepas de virus DEN y no fue dependiente del pase en PDK. Los títulos virales de recolecciones de pases 1-4 en FRhL variaban de 10^{5}-10^{6} PFU/ml. En el tercer-cuatro pase en FRhL, se prepararon lotes de vacuna de todos los virus de la serie de cepas DEN y se ensayaron como se enumera en la Tabla 2. También se proporcionan datos en la Tabla 2 para el ensayo del depósito de células FRhL así como el ensayo de la semilla maestra y de producción. Los resultados de estos ensayos, necesarios para asegurar la seguridad y la ausencia de contaminación, fueron negativos, o estaban dentro de las especificaciones permisibles. Para la semilla de producción DEN-4 341750 PDK-20, se realizaron ensayos de neurovirulencia en monos. Los resultados de este estudio pueden encontrarse en Hoke, 1990 (Am J Trop Med Hyg 43, 219-226). La semilla de producción DEN-4 así como el virus precursor DEN-4 que se usó para la comparación no eran neuropatogénicos. Que las vacunas DEN candidatas restantes necesiten evaluación para la neurovirulencia sigue siendo cuestionable en base a los datos de esta experiencia así como otros ensayos de neurovirulencia DEN en mono (comunicación personal).

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Ejemplo 2 Monos rhesus inoculados con virus DEN pasados en PDK

Se comparó la infectividad de virus DEN pasados en células PDK y denominados "series de cepas" con virus no modificados precursores para cada serotipo. La Tabla 3 enumera los resultados de estos estudios donde se midió el grado de infectividad para los monos por la cantidad de días de viremia que podía encontrarse en suero extraído secuencialmente dos semanas después de la inoculación. La inoculación de virus precursor en los monos provocó 6,8, 5, 3, y 4,7 días de media de viremia en grupos de 3-4 monos inoculados con DEN-1, DEN-2, DEN-3, y DEN-4, respectivamente. Para DEN-2 precursor, datos adicionales (no mostrados) han corroborado que la infección con viremia medible es muy reproducible en el tiempo usando monos y técnicas de aislamiento similares. Desafortunadamente, existen solamente datos parciales sobre títulos virales en sueros de mono. La mayoría de los datos que existen provienen de la experiencia con el virus DEN-2 precursor donde se tituló sangre viremia de mono en cultivo celular de mosquito. Los picos de los títulos virales 4-8 días después de la inoculación produjeron títulos que alcanzaban 10^{5} PFU/ml de suero (Putnak y col. 1996, supra).

Para cada serie de cepas, el pase en PDK provoca la modificación del virus DEN como se muestra por la capacidad reducida del virus de infectar monos. Para varias de las series de cepas esto se evidenciaba claramente por la ausencia completa de viremia en el pase en PDK más elevado. La inoculación de monos con DEN-1 en el pase 27 en PDK provocó 0 días de viremia en 4 monos. Esto se traduce en 0 aislados de un total de 56 exanguinaciones ensayadas. Se halló un resultado similar para DEN-3 PDK-20 y PDK-30. En PDK-30 para este virus, se perdieron todas las evidencias de infectividad en mono, es decir, sin viremia y sin evidencias de seroconversión en los monos inoculados con 10^{6} PFU de virus. La cepa DEN-2 requería la mayor cantidad de pases en PDK para obtener modificación de la infectividad en mono. Con este virus, se requirieron al menos 40 pases en cultivo celular PDK para viremia reducida. Para contrastar esta experiencia, la cepa DEN-4 341750 solamente requería 6 pases en células PDK para una infección en mono modificada. Para otra cepa DEN-1, 1009, incluso después de 50 pases en PDK no había evidencias de infección modificada en mono cuando se comparaba con el virus precursor (datos no mostrados). En conclusión, parece que los pases en células PDK es un procedimiento empírico eficaz para la modificación y atenuación de diversos aislados DEN. Éste es un huésped no natural para DEN que probablemente establece una presión de selección para las poblaciones virales que son adecuadas para la replicación en PDK pero no necesariamente para la replicación en células diana en monos y seres humanos.

Materiales y Procedimiento para Estudios de Vacunas Candidatas en Seres Humanos

Voluntarios. Se examinaron voluntarios masculinos y femeninos sanos con edades de 18-45 y se seleccionar por un panel de ensayos, incluyendo química sanguínea, hematología, tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial, análisis de orina, anticuerpos por reaginas plasmáticas rápidas, y serología para el antígeno superficial de la hepatitis B y anticuerpos contra VIH. Los voluntarios se excluían en base a una anormalidad significativa persistente o ensayo positivo. Las mujeres voluntarias eran elegibles de participar si tenían una prueba de embarazo negativa dentro de las 48 horas de vacunación y deseaban formar un formulario de consentimiento que establece que evitan la concepción usando anticonceptivos convencionales durante los 3 meses después de la vacunación. Además, los voluntarios se excluían si tenían inmunidad a flavivirus previa, que puede afectar a las respuestas a las vacunas contra el dengue [Scott, 1983, J Infect Dis 148, 1055-1060] o una historia de alergia a la neomicina, estreptomicina, o gentamicina. La inmunidad a flavivirus previa se definió como la no existencia de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación detectables (a una dilución sérica de 1:10) contra los tipos 1-4 del dengue, la encefalitis japonesa, o la fiebre amarilla y sin historia de vacuna contra la fiebre amarilla o infección por flavivirus.

Los voluntarios puntuaron \geq 70% en un examen escrito diseñado para probar el conocimiento de todos los aspectos del ensayo clínico. Posteriormente se obtuvo el consentimiento informado de cada voluntario en cumplimiento con el US 21 CFR Parte 50-Protección de Sujetos Humanos. El protocolo clínico cumplía todos los requisitos reguladores relevantes, incluyendo la Declaración de Helsinki (Protocolo), y las Regulaciones de la Armada 70-25-Uso de Voluntarios como Sujetos de Investigación, y 40-7-Uso de Fármacos en Investigación en Seres Humanos y el Uso de Sustancias Controladas de Programa I. Los estudios se aprobaron por la Comisión de Revisión de Investigaciones en Sujetos Humanos (Human Subject Research Review Board), la Oficina del Inspector General de Sanidad (Office of the Surgeon General), la Armada de EEUU, el Comité de Investigación con Uso en Seres Humanos del WRAIR (WRAIR Human Use Research Commitee), y la Comisión de Revisión Institucional (Institutional Review Board), University of Mariland en Baltimore.

Vacunas en Estudio. Las vacunas en estudio se enumeran en la tabla 4. Los virus de vacuna se pasaron repetidamente en células de riñón de perro primarias y después en cultivo de células diploides continuas de pulmón de mono rhesus fetal (FRhL) como res pases terminal para preparar la semilla y la vacuna. Cada candidata, antes den ensayo en voluntarios, se confirmó que provocaba viremia sustancialmente reducida en comparación con su virus precursor de tipo silvestre en monos rhesus vacunados. La atenuación adecuada medida por infección de monos rhesus indicaba que las cepas de vacunas contra el dengue eran vacunas apropiadas para ensayo en seres humanos.

Inmediatamente antes de la inmunización, se reconstituyó un vial de vacuna liofilizada con agua estéril para inyección (USP). Después de la inmunización, las partes no usadas de vacuna rehidratada se mantuvieron en hielo y se titularon en 4 horas en monocapas celulares LLC-MK_{2} (Sukhavachana y col. 1966, Bull WHO 35, 65-66). Cada voluntario recibió entre 1,0 x 10^{5} y 4,5 x 10^{6} pfu de virus, dependiendo de la vacuna candidata inyectada (Tabla 4). La historia de pases de las vacunas en estudio individuales se resume a continuación.

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TABLA 4 Vacunas atenuadas vivas contra el dengue del WRAIR

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Vacuna Dengue 1 45AZ5: La cepa DEN-1 West Pac 74 se aisló de un caso humano de fiebre DEN en la isla de Nairu (Pacífico Occidental) en 1974. El aislado se pasó 20 veces en cultivo celular FrhL y se preparó un lote de vacuna. Los pases incluyeron mutagenización y selección de placa para recuperar un virus que estaba atenuado y era adecuado para la vacunación de seres humanos. Después de la vacunación de dos voluntarios humanos, se tomó la decisión de interrumpir el uso de la vacuna debido a la enfermedad DEN en uno de los voluntarios. La vacuna se atenuó adicionalmente por pase en cultivos celulares PDK y FrhL. La vacuna candidata actual es DEN-1 45AZ5 PDK-20.

Vacuna Dengue 2 S16803: La cepa del virus del dengue 2 S16803 se obtuvo de un aislado de virus Thai de un paciente con fiebre del dengue. El virus se sometió a un total de 50 pases en PDK, con pase terminal en células diploides de pulmón de mono rhesus fetal (DBS-FRhL-2) para la producción de semilla y vacuna. Inicialmente se prepararon dos vacunas candidatas en los niveles del pase 30 y 50 en PDK y se seleccionaron para el ensayo. Se desarrolló otra vacuna candidata en el WRAIR de la misma cepa precursora del virus del dengue 2 S16803 y se produjo en el nivel del pase 40 por el Salk Institute (Swiftwater, PA).

Vacuna Dengue Tipo-3 CH53489: La cepa del virus del dengue tipo-3 CH53489 se obtuvo de una cepa Thai, pasada 30 veces en células de riñón de perro primarias (PDK) después de un pase inicial en células de riñón de mono verde primarias (PGMK) y de insecto C6/36. Se usó el virus de los pases 10, 20, y 30 en PDK para inocular cultivos de células diploides de pulmón de mono rhesus fetal.

Vacuna Dengue 4 341750 Carib: La vacuna candidata contra el dengue 4 se obtuvo de una cepa del Caribe de Dengue 4 (Colombia, 1982), pasada en la University of Hawaii, y fabricada en el WRAIR [Marchette, 1990, Am J Trop Med Hyg 43, 212-218]. El anticuerpo contra el virus precursor neutraliza otras cepas de virus del dengue 4 incluyendo H-241, la cepa prototipo. La atenuación del aislado humano se consiguió por pases 20 veces en cultivos celulares de riñón canino primario (PDK).

Diseño del Estudio. Se usó un protocolo clínico en pacientes hospitalizados, simple ciego, aleatorizado para todos los estudios piloto. La mayoría de los estudios se realizó en el Center for Vaccine Development, University of Mariland, Baltimore MD. Los estudios piloto de la vacuna dengue 2 S16803 PDK 40 y la vacuna dengue 4 CH341750 PDK 20 se realizaron en la Medical Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), Ft Detrick, MD.

En los estudios clínicos iniciales de una vacuna, se ensayó primero el pase más elevado disponible para una cepa particular en tres voluntarios. Los síntomas se controlaron muy bien durante tres semanas, y si los voluntarios seguían bien, se ensayaba el siguiente pase inferior. Si uno o más de los voluntarios se ponía enfermo, no se realizaba el ensayo de pases inferiores de la cepa de la vacuna, ya que se suponía que pases inferiores probablemente estarían menos atenuados. Después de ensayar todos los niveles de pases aceptables en tres voluntarios, se seleccionó el nivel más bajo que no causaba enfermedad para ensayo adicional en hasta siete voluntarios adicionales.

Para permitir una observación cuidadosa, evitar la exposición a enfermedades infecciosas extrañas, y para evitar la posible infección de mosquitos portadores, los voluntarios se confinaron en la sala de investigación desde tres días antes de la inoculación hasta 20 días después de la inmunización. Se registraron todas las experiencias adversas que sucedieron en este periodo después de la administración de cada vacuna, independientemente de la gravedad o si se consideraban relacionadas o no con la vacunación. La seguridad aceptable de una vacuna se definió con antelación como la ausencia de los siguientes acontecimientos adversos graves: cualquier enfermedad clínica grave no explicada por un diagnóstico no relacionado con la vacunación; fiebre persistente (temperatura oral de \geq 38,5ºC para 4 determinaciones en 24 horas, una temperatura oral diaria máxima de \geq 38,5ºC en tres días sucesivos, o temperatura que excede 40ºC en cualquier determinación individual); trombocitopenia (menos de 100.000 plaquetas/mm^{3}) o leucopenia (recuento absoluto de neutrófilos <1000) en 2 determinaciones consecutivas; o nivel de amino alanina transferasa (ALT) sérica de más de 4 veces lo normal en 3 o más días sucesivos que no se explica de otro modo. Además, cualquier experiencia que sugiriera cualquier efecto secundario significativo que pueda estar asociado con el uso de la vacuna se documentó como un acontecimiento grave.

A los voluntarios se les inoculó por vía subcutánea 0,5 ml de vacuna no diluida en el día 0. Después de la inmunización, se registraron los signos vitales cada 6 horas. Se examinó el sitio de la inyección y el diámetro máximo de eritema y la induración se midieron y registraron diariamente. Los signos clínicos (fiebre [>37,8ºC], sarpullido, vómitos, petequias, y aumento del hígado y el bazo) y los síntomas (malestar, jaqueca, mialgia, artralgia, náuseas, y dolor ocular o fotofobia) se evaluaron diariamente durante los primeros 20 días después de la inmunización. Los síntomas se clasificaron como leves (síntoma apreciado pero continúa la actividad en la sala) o graves (forzado a estar en cama por el síntoma). Si lo solicitaba el voluntario, se trataban los síntomas dolorosos con clorhidrato de propoxifeno; no se usaron antipiréticos. Se registraron las observaciones en una lista de control convencional de síntomas y hallazgos físicos. Se dio el alta a los voluntarios de la sala de estudio en el día 21, y les pidió que volvieran para los estudios serológicos 1, 6, 12, y 24 meses después de la inoculación.

Dos voluntarios inmunes a flavivirus sanos se inmunizaron en USAMRIID con la cepa precursora de la vacuna dengue 1 45AZ5 y dos años después con la cepa precursora de la vacuna dengue 3 CH53489. Los registros médicos del estudio se revisaron para la presencia o ausencia de los siguientes signos y síntomas: fiebre, sarpullido, malestar, jaqueca, mialgia, artralgia, y dolor ocular o fotofobia. La viremia se midió diariamente. En contraste con los presentes ensayos, los síntomas no se registraron sistemáticamente, y no se clasificó la intensidad de los síntomas. Además, se extrajo y se resumió la experiencia clínica con la vacuna dengue 4 341750 Carib PDK 20, dada a 8 voluntarios en USAMRIID durante un último estudio, para compararla con la de los vacunados actuales [Hoke, 1990, supra].

Evaluación de Laboratorio. Se recogió sangre de voluntarios en días alternos y en el día 31 para ensayos médicos disponibles de forma rutinaria para la hemoglobina y el hematocrito, recuento de glóbulos blancos con recuento diferencial, recuento de plaquetas, y niveles de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT). Además, se recogió sangre en días alternos hasta el día 20 para estudios de aislamiento de virus y anticuerpos. Se dejó que la sangre (20 ml) coagulara a 4ºC durante \leq 2 horas, se decantaron los sueros en alícuotas de 1 ml, se congelaron y se almacenaron a -70ºC hasta el estudio.

Aislamiento de Virus. Para la determinación de viremia por dengue, se descongeló el suero y se inoculó en monocapas de células de mosquito C6/36 y se incubaron a 28ºC durante 14 días. Las recolecciones de fluido de cultivo sobrenadante se ensayaron para el virus por ensayo de placa en células LLC-MK_{2} (Sukhavachana y col. 1966, Bull WHO 35, 65-66). Para cuantificar la cantidad de virus en el suero, se realizó un ensayo de placa en el clon C6/36 de células del mosquito Aedes albopictus [Hoke, 1990, supra]. Los matraces de cultivo celular se inocularon con diluciones de plasma y adsorbieron a 35ºC durante 1-2 horas. Se añadieron un medio de cubrimiento que consta de Solución Salina Equilibrada de Hank y agarosa al 0,75%, hidrolizado de lactoalbúmina al 5%, NaHCO_{3} 0,12 M, y antibióticos y todos los matraces se incubaron a 35ºC. Después de 7 días, los matraces se tiñeron con rojo neutro líquido al 5% durante 3-5 horas. Se retiró el exceso de tinte y las placas se leyeron después de 18 horas.

Serología. Los ensayos de anticuerpo incluyeron ELISA, HAI, y ensayos de neutralización de reducción de placas (PRNT) realizados usando un virus del dengue del mismo serotipo que la cepa de la vacuna que se está ensayando. La detección de anticuerpos IgM anti-dengue se realizó por modificación de un ELISA, donde valores >0,10 unidades DO se consideraron positivos [Innis, 1989, supra]. El ensayo HAI se realizó por la técnica convencional modificada para microvolúmenes usando 4-8 unidades de antígenos individuales, usando suero extraído con acetona para retirar los inhibidores [Clarke y Casals, 1958, Am J Trop Med Hyg 7, 561-573]. Los ensayos PRNT se realizaron por el procedimiento descrito por Russell y col. [Russell, 1967, supra].

Análisis Estadístico. Se analizó la relación entre el nivel de pase y la frecuencia y gravedad de la reactogenicidad, para la vacuna dengue 2 S16803 (PDK 30, 40 y 50) y para la vacuna dengue 3 CH53489 (PDK 10 y 20), usando el ensayo de Cochran-Armitage para la tendencia y las correlaciones de Spearman, respectivamente. Los síntomas y signos analizados independientemente incluían la presencia o ausencia, y la cantidad de días experimentando síntomas oculares, jaqueca, malestar, mialgia, artralgia, sarpullido y fiebre (temperatura > 37,8ºC). La hipótesis nula, que un mayor nivel de PDK no estaba asociado con menor reactogenicidad, se evaluó a una probabilidad del cinco por ciento. Por inspección de los datos, se determinó el nivel del pase óptimo para cada virus en base a las respuestas clínicas e inmunológicas de cada voluntario. Se seleccionó el nivel de pase que causaba efectos secundarios no inaceptable pero que inmunizaba aproximadamente el 80% de los voluntarios para desarrollo adicional por el U.S. Army Medical Research and Development Command's Flavivirus Vaccine Steering Committee.

Definición de Infección por la Vacuna

La infección por la vacuna se define como la replicación del virus del dengue en el voluntario, detectada por la presencia de anticuerpo neutralizante específico del tipo sérico o anticuerpo IgM anti-dengue después de la inmunización. La viremia no se incluyó como necesaria para el diagnóstico de infección ya que nunca se detectaba en ausencia de una respuesta de anticuerpos. Un fallo de la vacuna se define como una respuesta clínica adversa inaceptable o fallo para desarrollar anticuerpos IgM o PRNT convalecientes.

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Ejemplo 3 Respuestas Clínicas contra Vacunas Atenuadas contra el Dengue Vacuna Dengue 2 S16803

Se ensayó la cepa del virus del dengue 2 S16803 producida a partir del pase 50 en células PDK en tres voluntarios. Los voluntarios estuvieron bien, con temperaturas no orales > 38,0ºC. Dos de los 3 voluntarios tuvieron síntomas leves transitorios de malestar, jaqueca, y síntomas oculares (dolor ocular o fotofobia). Los hallazgos de laboratorio incluyeron elevaciones leves de ALT (<2x normal) en 2 de 3, y leucopenia leve en 1 de 3 voluntarios. A causa del perfil de seguridad aceptable de la vacuna PDK 50, se seleccionó el siguiente pase disponible inferior, PDK 30, para evaluación clínica.

La vacuna PDK 30, ensayada en 10 sujetos, estaba subatenuada y producía síntomas compatibles con dengue de leve a moderado. Cuatro voluntarios (40%) desarrollaron fiebre de bajo grado, hasta Tmáx 38,5ºC, durante días 9 -14 después de la vacunación (media de días 12). El ochenta por ciento desarrolló sarpullido. La mayoría de los voluntarios experimentó síntomas oculares (10/10), jaquecas (9/10), y malestar (9/10), mientras que el 70 por ciento tubo \geq 1 síntoma grave de jaqueca, dolor ocular y fotofobia, malestar, o mialgia. Tres voluntarios tuvieron elevación leve de su nivel de alanina aminotransferasa (ALT), una medida de la patología hepática.

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Como la vacuna PDK 30 se consideró demasiado reactogénica para ensayo adicional en voluntarios, se produjo la vacuna PDK 40 a partir de la semilla maestra. Dos de tres voluntarios inoculados con PDK 40 desarrollaron un síndrome tipo dengue leve 9-10 días después de la vacunación, con temperaturas de bajo grado (<38,1ºC), sarpullido, mialgias, y jaqueca. Los síntomas se resolvieron espontáneamente en varios días sin discapacidad o requerimiento de medicación. Los síntomas acompañantes eran una elevación imprevista en las enzimas hepáticas séricas, hasta un nivel máximo de ALT de 199 IU/ml en uno (4 veces lo normal) y 77 IU/ml de ALT máxima para el otro (elevación de 1,5 veces de lo normal). El tercer voluntario permaneció asintomático pero también desarrolló elevaciones de factor dos en ALT (hasta un máx. de 10^{2}). Todas las anormalidades de laboratorio se resolvieron en días sin intervención, y se dio el alta a todos los voluntarios en buena salud 21 días después de recibir la vacuna. A causa de la frecuencia inusual de acontecimientos de hepatitis asociados con la vacuna PDK 40, no se planea desarrollo adicional para el producto.

La Tabla 5 resume la experiencia clínica inicial con la vacuna del WRAIR dengue 2. La frecuencia disminuida de signos de fiebre y sarpullido es evidente entre las vacunas de nivel de pase 30 y 50. Además, hay una disminución en la temperatura oral desde la Tmáx 38,5ºC hacia la normal con pase creciente, pero no hay cambio en la duración de la fiebre más allá de un día. Para la vacuna contra el dengue 2, la frecuencia y duración de los síntomas oculares, sarpullido, jaqueca, malestar y mialgia se asociaron significativamente con el nivel de pase.

TABLA 5 Respuestas clínicas en receptores de vacunas contra el virus del dengue 2 S16803

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TABLA 6 Respuestas clínicas en receptores de vacunas contra el virus del dengue 3 CH53489

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TABLA 7 Viremia y respuestas inmunes frente a vacunas contra el dengue

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Vacuna Dengue 3 CH53489. Se administró una vacuna contra el dengue 3 (CH53489, PDK 0) desarrollada en el WRAIR a dos hombres voluntarios inmunes a la fiebre amarilla sanos en forma de una inoculación subcutánea de 0,5 ml de 2 x 10^{4} pfu de virus. El transcurso inmediato después de la inmunización fue sin incidentes. En el día 6, ambos voluntarios estaban enfermos con fiebre del dengue moderadamente grave caracterizada por fiebre alta, escalofríos, mialgias, jaqueca, malestar, y un sarpullido eritematoso difuso. Ambos voluntarios desarrollaron trombocitopenia y leucopenia pero no hubo signos de fiebre hemorrágica. Después de un periodo febril que duró cinco días, ambos hombre se recuperaron rápidamente y estuvieron en el día 21. A causa de la enfermedad grave experimentada por ambos sujetos, no se emprendió ensayo adicional de este nivel de pase. Posteriormente, se prepararon los niveles de pase PDK 10 y PDK 20 como vacunas candidatas.

La vacuna PDK 20 se dio a 6 voluntarios y provocó reactogenicidad leve. Un sujeto experimentó una enfermedad febril temprana el día 3 con fiebre transitoria (Tmáx. 38,2ºC), faringitis, y linfadenopatía cervical. No se aisló virus del dengue del suero del voluntario. Parece que este sujeto ha tenido una enfermedad recurrente con fiebre, que no estaba directamente relacionada con la vacunación. Cuatro de los 6 voluntarios desarrollaron síntomas de dengue leves de corta duración sin sarpullido; la artralgia, el dolor ocular, y la jaqueca fueron las dolencias más frecuentes. Sin embargo, un voluntario tuvo síntomas más graves de jaqueca, malestar, y dolor ocular durante tres días. También desarrolló leucopenia y elevación sostenida de los niveles de ALT; estas anormalidades de laboratorio se habían resuelto en el seguimiento del día 31. Otro voluntario tuvo elevación leve y reversible de ALT solo, a menos de 2x lo normal. Como la vacuna PDK 20 era segura con reactogenicidad marginalmente aceptable, se ensayó el siguiente virus de vacuna de pase disponible más bajo (PDK 10).

El virus PDK 10 demostró ser demasiado reactogénica en los destinatarios. Uno de los tres voluntarios desarrolló fiebre de bajo grado en los días 10 y 11 (Tmáx. 38,3ºC), y un sarpullido rojizo durante 13 días. Otro voluntario desarrolló pruritus asociada con urticaria creciente y decreciente en los días 6 a 9 después de la vacunación, y ganglios linfáticos cervical y axilar sensibles. Posteriormente desarrolló un sarpullido maculopapular con malestar, jaqueca, y mialgia en los días 10-12. Este voluntario puede haber tenido una reacción alérgica idiosincrásica a la vacuna, seguido de una enfermedad tipo dengue típica. Estos dos voluntarios también tuvieron anormalidades de laboratorio de leucopenia y elevación de los niveles de ALT hasta <2x lo normal, que estuvieron resueltos en el seguimiento del día 31.

La Tabla 6 resume la respuesta a las vacunas dengue 3 CH53489. Aunque hubo una tendencia a signos y síntomas menos frecuentes y de duración más corta con el pase, ningún pase alcanzó significado estadístico en ningún análisis.

Vacuna Dengue 4 341750. Ocho voluntarios recibieron 10^{5} PFU de vacuna PDK 20 [Hoke, 1990 supra]. Cinco voluntarios desarrollaron un sarpullido palidecido, macular apenas apreciable y elevación mínima de la temperatura (máx. 38,1ºC). También se desarrollaron viremia y respuesta de anticuerpos en estos cinco voluntarios (63%).

Se preparó una nueva vacuna candidata DEN-4 341750 a partir del pase 15 en PDK, previendo que el pase inferior podría ser más infectivo. Tres voluntarios recibieron esta vacuna y dos experimentaron síntomas mínimos. El tercer voluntario enfermó bruscamente en el día 8 con fiebre, hinchazón edematosa de la cara y las extremidades, lasitud severa, sarpullido, dolor ocular, fotofobia, y artralgias. Durante los siguientes tres días, persistió la fiebre con Tmáx. de 39,6ºC, pero los signos y síntomas se resolvieron espontáneamente. A causa de esta grave reacción adversa a la vacunación, se terminó el uso adicional de la vacuna PDK-15 y se eligió PDK-20 para evaluación adicional.

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Ejemplo 4 Viremia y Respuestas Inmunes a Vacunas Atenuadas contra el Dengue

La Tabla 7 describe la viremia y las respuestas inmunes con las vacunas contra el dengue del WRAIR. La infectividad de las vacunas individuales se resume a continuación.

Vacuna Dengue 2 S16803. Ningún destinatario de la vacuna PDK 50 desarrolló viremia, aunque dos de los 3 desarrollaron anticuerpo neutralizante de bajo título en el día 60. Estos hallazgos sugirieron que el virus de vacuna era de infectividad disminuida para seres humanos. Por el contrario, dos de los 3 vacunados con dengue 2 PDK 40 tuvieron viremia demostrable, y todos desarrollaron anticuerpos de elevado título después de la vacunación. Como se esperaba, la infectividad de la vacuna dengue 2 PDK 30 fue la más elevada: se detectó viremia en los 10 voluntarios y todos los sujetos ser seroconvirtieron con títulos de anticuerpos neutralizantes de >1:60 en el día 60.

Vacuna Dengue 3 CH53489. Se recuperó el virus del dengue-3 que retiene sensibilidad a la temperatura y fenotipo de placa pequeña del virus de vacuna durante 6 y 7 días en los 2 destinatarios de la vacuna dengue 3 PDK 0 inmunes a fiebre amarilla. Posteriormente, se midieron los anticuerpos PRNT50 y de inhibición de hemaglutinación (HAI) de título elevado con una reactividad cruzada tipo infección secundaria en el suero recogido en los días 30 y 60 de ambos voluntarios. La infectividad fue similar en sujetos que recibieron la vacuna atenuada dengue 3 PDK 10: 2 de los 3 desarrollaron viremia y la vacunación indujo anticuerpos neutralizantes en todos. En contraste, 2 de los 6 vacunados con dengue 3 PDK 20 tuvieron viremia detectable y tres voluntarios se seroconvirtieron posteriormente, reflejando la infectividad disminuida.

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Vacuna Dengue 4 341750. Ocho voluntarios recibieron 10^{5} PFU de la vacuna PDK 20, y desarrollaron viremia y respuesta de anticuerpos en cinco (63%). La vacuna preparada a partir de un pase inferior de esta candidata, PDK 15, fue más infectiva. Se aisló el virus de un único voluntario, en los días 8 y 10 después de la vacunación, con un título máximo de 15 pfu/ml. Este voluntario desarrolló posteriormente un título de anticuerpo neutralizante de 450 con una respuesta HAI secundaria, y se descubrió que había estado expuesto previamente al virus de la encefalitis de St. Louis (título PRNT 1:20 antes de la vacunación). Los dos voluntarios sin viremia detectable desarrollaron títulos neutralizantes de 1:10 y 1:40 en el día 30 después de la vacunación.

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Ejemplo 5 Selección de Vacunas Candidatas

El programa ampliado de ensayo de seguridad de vacunas atenuadas PDK del WRAIR se muestra en la Tabla 8, que enumera las características principales de las vacunas para cada serotipo. El pase creciente en PDK produjo un valor medio de enfermedad decreciente, que evalúa la duración y cantidad de síntomas por voluntario. Además, la elevación del pase en PDK también se asoció con la media disminuida de días de viremia, con la excepción de las vacunas contra el dengue 4. De las vacunas contra el dengue 2, 3, y 4 ensayadas, solamente un nivel de pase se consideró seguro y aceptablemente reactogénico, y adecuado para estudio clínico ampliado: dengue 2 PDK 50, dengue 3 PDK 20, y dengue 4 PDK 20. Sin embargo, el porcentaje de destinatarios infectados disminuyó con un nivel de pase en PDK creciente. La seroconversión, definida como el porcentaje con un título de anticuerpo neutralizante \geq 1:10 disminuyó de forma similar dentro de amplios intervalos de confianza.

Discusión

El WRAIR tiene una implicación desde hace tiempo en el desarrollo de vacunas vivas atenuadas contra el dengue. Los programas de vacuna contra el dengue tanto del WRAIR como de Mahidol han desarrollado varias vacunas vivas por atenuación a través de varios pases (cultivo repetido en cultivo tisular) en células de riñón de perro (PDK). Los resultados del ensayo piloto en cantidades pequeñas de voluntarios establecieron la seguridad de las vacunas candidatas del WRAIR. Ningún voluntario entre los 65 destinatarios requirió tratamiento urgente de una lesión grave sostenida. Tres voluntarios sufrieron reacciones idiosincrásicas transitorias asociadas con la vacunación contra el dengue, que provocaron la retirada de las vacunas que recibieron del desarrollo clínico adicional. La infección experimental con vacunas subatenuadas, aunque incómoda, fue tolerable.

La experiencia clínica mostró que el pase creciente en PDK de virus de vacuna aumentaba la atenuación para los voluntarios. Este efecto se observa mejor con los virus del dengue 1 y dengue 3, donde los virus precursores sin pases provocaban fiebre del dengue no modificada y los posteriores 20 pases en PDK reactogenicidad aceptable. Sin embargo, el aumento de pase en PDK disminuía la infectividad de los virus de vacuna, provocando una inmunogenicidad disminuida. Además, la viremia disminuida con virus de vacuna en seres humanos parece correlacionarse con la de monos rhesus (con la excepción de dengue 4 PDK 15). Estos hallazgos sugieren que la capacidad de infección de una vacuna atenuada contra el virus del dengue en voluntarios demostró ser equivalente a la inmunogenicidad. La relación entre el nivel de pase y la reactogenicidad debe interpretarse con cuidado, porque sujetos que experimentaron un síntoma tenían probabilidad de experimentar varios síntomas. Como estos procedimientos analíticos suponen independencia de estos síntomas, las interpretaciones basadas en valores p independientes pueden ser poco fundadas. Además, se cree que el sarpullido mostraba una fuerte asociación con el nivel de pase (independiente p = 0,009 para la presencia, p = 0,01 para la duración). Esto está reforzado por una ausencia de correlación significativa entre el sarpullido y otros síntomas, para la vacuna contra el dengue 2 ó 3 (ensayos de Spearman).

Solamente las vacunas con perfiles de seguridad aceptables se seleccionaron para ensayo clínico ampliado: dengue 1 45AZ5 PDK 20, dengue 2 S16803 PDK 50, dengue 3 CH53489 PDK 20, y dengue 4 341750 PDK 20. A causa de los amplios intervalos de confianza en la seroconversión debido a las pequeñas cantidades de voluntarios, los estudios posteriores buscaban aumentar la cantidad de destinatarios de cada una de las cuatro vacunas seleccionadas. Además, se buscarán ensayos adicionales para determinar si la inmunogenicidad de estas vacunas atenuadas puede reforzarse a través de la administración de dos dosis en lugar de la única dosis usada para estos estudios.

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Ejemplo 6 Estudio ampliado de vacunas monovalentes; vacunas monovalentes dadas en forma de dos dosis; y vacunas monovalentes mixtas en forma de una formulación tetravalente dada en forma de una y dos dosis

Diseño del Estudio: Los objetivos de esto eran evaluar la seguridad e inmunogenicidad de las cuatro vacunas monovalentes dadas en forma de una única dosis y después por programas de vacunación de dos dosis. Posteriormente se evaluó la seguridad e inmunogenicidad de la vacuna tetravalente de combinación. Los sujetos se reclutaron por separado de dos sitios, University of Mariland en Baltimore y el WRAIR, Washington DC. El primer grupo de 22 sujetos se dividió en 4 grupos de 4 ó 5 personas que recibieron, cada una, una dosis única de virus del dengue monovalente o virus de la fiebre amarilla 17D (Connaught). Los vacunados de fiebre amarilla 17D sirvieron como control y punto de referencia para la reactogenicidad. Otros 31 sujetos se dividieron en 4 grupos de 7-8 personas a las que se dieron dos dosis de una vacuna monovalente, la mitad en el mes 1 y la otra mitad en el mes 3. Finalmente a 10 voluntarios se les dieron 2 ó 3 dosis de la vacuna tetravalente. Los primeros 4 destinatarios de la tetravalente recibieron vacunación en el mes 0 y 1. Los 6 últimos destinatarios de la tetravalente se vacunaron en los meses 0, 1 y 4. A todos los sujetos excepto los 10 destinatarios de vacuna tetravalente se les dio un serotipo de vacuna de un modo aleatorio y doble ciego.

Sujetos: Los sujetos eran adultos sanos normales con edades de 18-50. Todos los sujetos eran seronegativos para hepatitis B, C y VIH. Todos los sujetos eran seronegativos para dengue 1-4, JE, SLE, e YF por ensayo de inhibición de hemaglutinación antes de entrar en el estudio.

Vacunas: Las cuatro vacunas candidatas de serotipo se aislaron originalmente de seres humanos con enfermedad clínica. Cada una se modificó después por pases seriados en células de riñón de perro primarias (PDK) y después en células pulmonares de mono rhesus fetal como se ha descrito anteriormente. Estas candidatas se seleccionaron en base a pequeños estudios piloto previos en voluntarios humanos. Cada vacuna monovalente liofilizada se reconstituyó con agua estéril y se dio en un volumen de 0,5 cc. Las dosis de los serotipos 1-4 fueron 10^{6}, 10^{6}, 10^{5} y 10^{5} pfu de dengue 1, 2, 3, y 4 respectivamente. La dosis de vacuna tetravalente se preparó mezclando 0,25 cc de cada vacuna monovalente reconstituida y se dio en un volumen final de 1 cc. La dosis de la vacuna tetravalente fue 1,1-2,8 x 10^{6} pfu. Todas las vacunaciones se hicieron por vía subcutánea en el antebrazo.

Seguridad clínica: Se evaluaron las reacciones a las vacunaciones por combinación de las agendas de síntomas diarias y las evaluaciones clínicas periódicas durante las 3 semanas después de cada vacunación. Los sujetos se alojaron en cuatros de estudio para la observación cercana durante 5-7 días pasado el periodo de incubación de 1 semana después de la vacunación, un periodo de tiempo durante el cual eran más proclames las reacciones y la viremia. Los sujetos se examinaron y se les preguntó específicamente por los síntomas de febrilidad, escalofríos, jaqueca, dolor retro-orbital, mialgia, artralgia, sarpullido y otros. Cada síntoma se clasificó en una escala de 0 (ninguno), 1 (no afectaba a la actividad normal; no requería medicaciones), 2 (requería medicación o cambio en la actividad), o 3 (requería reposo en capa o no aliviado por la medicación). Los síntomas más comunes se agruparon en cuatro categorías. Estas categorías eran: 1) fiebre subjetiva y escalofríos, 2) jaqueca y dolor retro-orbital, 3) mialgia y artralgia y 4) dolencias gastrointestinales que incluían náuseas, vómitos y dolor abdominal. Se calculó un índice de síntomas de cada categoría por el producto del mayor grado del síntoma para cada día y la duración del síntoma expresada en días. Si el síntoma sucedía en total durante 24 horas se le asignaba la duración de 1 día. El Índice de Reactogenicidad (RI) es simplemente la suma de los índices de sintamos para cada categoría. El RI resumen las reacciones de la vacuna de cada sujeto. Los índices de la categoría de síntomas y el RI permiten la comparación semi-cuantitativa de las reacciones a la vacuna entre sujetos y serotipos de vacuna.

Se controló a los sujetos para las toxicidades hematológicas y hepáticas por CBC seriada, recuentos de plaquetas, AST y ALT durante el estudio.

Los acontecimientos adversos graves se definieron como enfermedad grave que carece de otros causas probables, fiebre >38,5ºC continuamente durante más de 24 horas o Tmáx. >38,5ºC durante 3 días consecutivos o una única temperatura oral >104ºC, neutropenia de <1.000/ml o trombocitopenia de <90.000/ ml en 2 determinaciones consecutivas, o ALT o AST sérico >5 veces lo normal.

Inmunogenicidad: Se hizo el procedimiento de ensayo de inhibición de hemaglutinación por el procedimiento de Clarke y Cassals, 1958 (Am J Trop Hyg 7, 561-573). Se midieron las IgM e IgG contra el dengue por ELISA de captura en todos menos los últimos 6 sujetos tetravalentes. Se midieron los anticuerpos neutralizantes contra el dengue y la fiebre amarilla en el Día 0 y 30 después de cada vacunación por el ensayo de neutralización de reducción de placas. La determinación del criterio de valoración del estudio fue la medición de cualquier anticuerpo neutralizante 30 días después de la última vacunación. La seroconversión de anticuerpos neutralizantes se define como una reducción en las placas del 50% a una dilución sérica mínima de 1:5. La viremia se determinó en los sueros de los días 7-14 después de la vacunación inicial y la segunda vacunación. El procedimiento usado para el aislamiento de virus fue un procedimiento de placa retardada adaptado de Yuill, 1968 (Am J Trop Med Hyg 17, 441-448) usando células LLC-MK_{2} o C6/36 para la amplificación y Vero para la formación de placas.

Se combinaron los datos de los estudios de una dosis y dos dosis para esta memoria. Las características consideradas se muestran en la Tabla 9. A un total de cincuenta y nueve sujetos normales se les dieron vacunas contra el virus del dengue; cuarenta y nueve recibieron artículos de ensayo monovalentes y diez recibieron vacuna tetravalente. Cuatro recibieron vacunación autorizada contra la fiebre amarilla 17D (Connaught).

TABLA 9 Características consideradas

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Ejemplo 7 Reactogenicidad

Reacción local. Diecinueve de 59 (32%) destinatarios de la vacuna contra el dengue presentaron dolor leve del brazo en el sitio de inyección. De éstos 7 recibieron DEN-1, 4 DEN-2, 1 DEN-3, 1 DEN-4 y 5 recibieron la tetravalente. Solamente 5 presentaban algo de dolor en el sitio de inyección después de 24 horas. Ninguno comprometió el uso del brazo.

Reacciones sistémicas. El 20% de los 59 destinatarios del dengue no presentaron síntomas en absoluto con su primera vacunación mientras que el 70% de los sujetos fueron asintomáticos con la segunda vacunación. Los cuatro sujetos que recibieron una tercera dosis no presentaron síntomas asociados con la misma. Las reacciones más habitualmente presentadas de la vacunación contra el dengue fueron jaqueca y mialgias. Sucedieron en gravedad variada. La Figura 1 muestra la existencia de síntomas de > Grado 1 a partir de la primera vacunación causando cambio en las actividades diarias o tomando medicaciones para su alivio. Después de la primera dosis de vacuna, cinco (8%) sujetos, un serotipo 1, un serotipo 4, y tres tetravalentes, presentaron un síntoma de grado de gravedad 3 de escalofríos, mialgia, jaqueca o náuseas durante menos de 1 día de duración. Ningún sujeto presentó ningún síntoma de grado 3 con la revacunación.

El RI varió de 0 a 35. La Tabla 10 compara la reactogenicidad presentada de cada vacuna. Las vacunas DEN-1 monovalente y tetravalente se asociaron con más reactogenicidad. La segunda o tercera dosis de todas las vacunas contra el dengue causaron uniformemente pocas reacciones, incluso en aquellos sujetos con síntomas de moderados a graves a partir de la vacunación inicial.

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TABLA 2 Índice de Reactogenicidad Medio

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La Figura 2 muestra la distribución de frecuencia de RI por serotipo. Ocho sujetos (14%) desarrollaron fiebre (>38ºC (100,4ºF)). De los ocho 4 recibieron DEN-1, 1 DEN-2, 1 DEN-3 y 2 tetravalente. La fiebre más elevada y más larga sucedió en un destinatario de DEN-1 con Tmáx. de 39,61ºC (103,3ºF) y fiebre de 3 días. Solamente un sujeto diferente, que también recibió DEN-1, tuvo más de un día de fiebre. Siete de los ocho episodios de fiebre sucedieron después de la primera vacunación.

Dieciséis sujetos (27%) desarrollaron un sarpullido generalizado, que implicaba el tronco y las extremidades desde su primera vacunación. El sarpullido habitualmente era eritematoso, macular papular y levemente prurítico. Solamente 7 de los 16 con sarpullido generalizado tuvieron fiebre. De los 16 sujetos con sarpullido cinco recibieron DEN-1, dos DEN-2, uno DEN-3, tres DEN-4 y cinco tetravalente. El sarpullido típicamente llegó a ser apreciable en el día 8-10 después de la vacunación y se resolvió en 3-4 días. Ningún sujeto desarrolló ninguna petequia, púrpura o cicatrización. Ningún sujeto desarrolló sarpullido a partir de la revacunación.

Los síntomas gastrointestinales fueron relativamente comunes, sucediendo en un tercio de los sujetos, pero fueron leves y breves, durando menos de 24 horas. Un destinatario de DEN-4 desarrolló náuseas graves asociadas con dolor abdominal en retortijones durante un día.

Seis sujetos (10%), 5 destinatarios de dengue y 1 de fiebre amarilla 17D, desarrollaron neutropenia transitoria con un recuento absoluto de neutrófilos menor de 1000/ml. El inferior fue 288 en un sujeto DEN-1. La neutropenia típicamente se resuelve en 2-3 días. Ningún sujeto desarrolló trombocitopenia. No hubo elevaciones clínicamente significativas en AST o ALT.

Como se esperaba de este grupo de adultos no inmunes que recibieron su primera exposición al virus del dengue ninguno desarrolló ninguna evidencia clínica de fiebre hemorrágica del dengue.

Ejemplo 8 Inmunogenicidad

Se detectó viremia en 10 sujetos (17%), uno recibió DEN-2, cuatro DEN-3, uno DEN-4 y cuatro tetravalente. No se detectó viremia DEN-1. El(los) serotipo(s) del virus aislado de los sujetos tetravalentes aún tiene(n) que identificarse. Todas las viremias detectadas sucedieron después de la primera dosis de virus. Curiosamente sucedió fiebre con viremia solamente en 3 destinatarios de tetravalente. Todos los sujetos virémicos desarrollaron anticuerpos neutralizantes. Uno no desarrolló respuesta IgM o IgG incluso con viremia.

La Tabla 11 resume las respuestas de anticuerpos contra la vacunación monovalente. Se detectaron anticuerpos neutralizantes más frecuentemente que los IgM e IgG. No se detectó seroconversión por IgM o IgG que tampoco se encontró por el PRNT_{50} de dilución sérica 1:10. Cuando estaban presentes, las IgM eran positivas en el 41% en 14 días después de la vacunación, en el 17% en 21 días y el 42% en 30 días. La IgM típicamente era máxima en el día 30 después de la primera vacunación. Hubo una única excepción en un destinatario de tetravalente cuya IgM era máxima tres días después de su segunda vacunación. Las IgM pueden persistir durante más de 3 meses. Los índices de seroconversión por anticuerpos neutralizantes fueron del 100%, 92%, 54% y 58% para los serotipos monovalentes 1, 2, 3 y 4 respectivamente. Cuando estaba presente, el anticuerpo neutralizante era típicamente detectable en el día 30 después de la primera vacunación. No se evaluaron momentos puntuales entre el día 0 y 30 para el anticuerpo neutralizante. La segunda dosis de vacuna reforzó el GMT de DEN-2 en más de cuatro veces, que no se observó con los otros serotipos. Dos sujetos DEN-3 se seroconvirtieron después de una segunda dosis de vacuna, una a 1 mes y la otra a 3 meses. No habían desarrollado anticuerpo neutralizante después de una dosis. Es interesante observar que los patrones de IgM/IgG de estos dos sujetos sugieren una respuesta secundaria después de su segunda dosis que sugiere que estaban inmunológicamente sensibilizados por la primera dosis.

A pesar del ensayo de inhibición de hemaglutinación negativo previo a la entrada para dengue, SLE, JE e YF, 5 de 53 (9%) sujetos ensayados desarrollaron un patrón de respuesta de anticuerpos secundario con una proporción IgM a IgG de <1,8. Los 5 eran negativos para anticuerpo neutralizante contra el dengue homólogo antes de la vacunación. Esto sugiere una exposición oculta previa a flavivirus. No se halló diferencia significativa entre los RI medios de respuestas de anticuerpos secundarias y primarias (9,6 vs 5,8, p=0,19).

Hubo 12 sujetos monovalentes que no desarrollaron IgM/IgG o anticuerpo neutralizante. Uno recibió DEN-2, seis DEN-3 y cinco DEN-4. El índice de reactogenicidad medio para este grupo sin respuesta de anticuerpos era menor de 1 que era significativamente diferente del RI medio de repuestas de anticuerpo neutralizante de tipo 2,3 y 4. (0,9 vs 4,9, p<0,003).

Estos estudios incluyeron 25 sujetos negros y 31 caucásicos. No hubo diferencia significativa entre los RI medios de estos dos grupos raciales. Esto es de interés porque hay algunas evidencias epidemiológicas que sugieren gravedad más leve de la enfermedad del dengue entre los negros.

TABLA 11 Índices de seroconversión de vacuna monovalente por IgM y PRNT_{50}

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TABLA 12 Reactogenicidad e inmunogenicidad de destinatarios de vacuna tetravalente

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TABLA 13 Índices de seroconversión de monovalentes y dosis múltiples de tetravalente

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Edad, Sexo

La Tabla 12 muestra los resultados de seroconversión por PRNT a partir de diez sujetos de vacuna tetravalente. Los 4 primeros sujetos recibieron dos vacunaciones en el mes 0 y 1. Un sujeto perdió su segunda vacunación en el día 30 y se vacunó en el día 60. Seis sujetos más fueron vacunados en el mes 0 y 1 y si la respuesta era incompleta se administraba una tercera vacunación en el mes 4. Dos sujetos desarrollaron anticuerpo neutralizante contra los 4 serotipos después de una única dosis. Otros dos destinatarios de tetravalente se seroconvirtieron a los 4 serotipos después de la vacunación en 4 meses. Otros dos desarrollaron respuestas trivalentes. Una segunda dosis de la tetravalente dada en los meses 1 ó 2 no aumentó significativamente las seroconversiones. Los índices de seroconversión global en estos 10 sujetos tetravalentes fueron del 100%, 80%, 80% y 40% para DEN-1, 2, 3 y 4 respectivamente.

Ejemplo 9

Se diseñó un estudio para evaluar la interacción de cada componente de serotipo en la vacuna tetravalente por un diseño factorial 2^{4} de 2 niveles.

A cincuenta y cuatro sujetos se les dieron 15 permutaciones de 2 niveles de dosis de cada serotipo. Los resultados se muestran en la Figura 3. H, dosis elevada, indica la vacuna sin diluir, que varía entre 10^{5}-10^{6} pfu/ml; L, dosis baja, indica una dilución 1:30 de la vacuna sin diluir que produce aproximadamente 10^{3,5}-10^{4,5} pfu/ml.

A seis sujetos se les dio la vacuna tetravalente de dosis completa en el mes 0 y 1. Si el sujeto no producía una respuesta de anticuerpo neutralizante tetravalente, se daba una tercera dosis a los 4 meses. Los resultados se muestran en la Figura 4.

A cuatro sujetos humanos se les dio vacuna tetravalente de dosis completa mezclada en jeringa a tiempo 0 y 1 mes. Los criterios de valoración fuero seguridad clínica y anticuerpo neutralizante 1 mes después de la segunda vacunación. Las respuestas de células T se midieron en los primeros 4 sujetos. Los resultados se muestran en la Figura 5.

Los resultados indican que la vacuna tetravalente (16 formulaciones) se hallaba segura en 64 voluntarios americanos no inmunes. La reactogenicidad variaba. Cuatro formulaciones provocaban respuestas de anticuerpo neutralizante trivalente o tetravalente en todos los voluntarios. De acuerdo con la experiencia monovalente, una segunda dosis de vacuna tetravalente a 1 mes no inducía reactogenicidad significativa pero tampoco aumentaba las respuestas de anticuerpo neutralizante. La titulación final de respuestas de anticuerpo neutralizante está en progreso. Las respuestas de interferón gamma de memoria en células T pueden medirse en ausencia de anticuerpo neutralizante. Intervalos de dosificación \geq4 meses pueden provocar seroconversión tetravalente mejorada.

Discusión

Estas vacunas parecen atenuadas en seres humanos cuando se comparan con las descripciones históricas de infecciones experimentales con dengue de tipo silvestre. (Simmons y col., 1931, Manila Bureau of Printing) Se usó una escala numérica basada en la duración y la gravedad de los síntomas auto-presentados para cuantificar la reactogenicidad. Dicho procedimiento tiende a sobre-estimar las reacciones relacionadas con la vacuna. De forma ideal debe validarse con casos de infección natural por dengue. Sin embargo, el RI imprecise permitió comparar razonablemente los síntomas entre individuos y grupos. Los resultados del ensayo de las vacunas monovalentes mostraron que el grado de atenuación era variable entre las cuatro vacunas candidatas contra el dengue. 45AZ5 PDK20 es la menos atenuada, de título más elevado y produjo seroconversión uniforme. La candidata DEN-2, S16803 PDK50, provocó de forma similar casi un 100% de seroconversión con un perfil de reactogenicidad benigno. La Den-3 y Den-4 tuvieron perfiles de baja reactogenicidad pero los índices de seroconversión fueron solamente del 50-60%. Debe apreciarse que las dosis de tipo 3 y 4, las cepas menos inmunogénicas, son diez veces menores que las de los tipos 1 y 2.

La segunda dosis de virus se asoció con reacciones remarcadamente pequeñas. Sin embargo, el beneficio de una segunda dosis de vacuna monovalente en el mes 1 ó 3 es pequeño. Den-1 y 2 ya eran casi uniformemente inmunogénicas de modo que una dosis adicional puede ser superflua. No obstante el GMT de Den-2 se reforzó en cuatro veces. Esto puede evidenciar la replicación viral de bajo nivel después de la segunda dosis o la dosis contiene suficiente masa antigénica para provocar una respuesta más reforzada. Este patrón de respuesta de anticuerpo neutralizante también se ha observado con la segunda vacunación con 17D YF. (Wisseman, 1962, Am J Trop Med Hyg 11, 570-575) La primera dosis de Den-3 puede haber sensibilizado a los dos sujetos monovalentes que se seroconvirtieron después de la segunda dosis con un patrón de respuesta de anticuerpos secundaria. Esto sugiere que el presente ensayo de anticuerpo neutralizante puede no ser suficientemente sensible para detectar la respuesta inmune apropiada contra las vacunas candidatas de tipo 3. La segunda dosis no añadió ninguna nueva seroconversión a tipo 4. No hubo beneficio adicional obvio en dar una segunda dosis de DEN-1 o DEN-4 monovalente con la dosis y programa ensayados.

Doce sujetos monovalentes que no produjeron respuesta de anticuerpo neutralizante contra las vacunas monovalentes tampoco respondieron con IgM o IgG medible contra el dengue. Todos estos sujetos sin respuesta recibieron virus viable del mismo vial que se replicaba claramente en otros sujetos. No desarrollaron reacciones a las vacunaciones. Por tanto, por todos los indicios no hubo evidencias de replicación viral en estos sujetos. El mecanismo para esta ausencia de respuesta es desconocido. Puede ser el resultado de la ausencia de sustrato del huésped necesario para la infección o una inmunidad innata eficaz.

El valor de dosificación múltiple puede ser más evidente en vacunas atenuadas vivas de combinación como una estrategia para sortear la interferencia viral. Aquí la dosis de cada componente así como el intervalo de dosificación pueden ser importantes. La interferencia y la potenciación pueden suceder potencialmente cuando se dan virus del dengue en combinación. Cuatro sujetos desarrollaron anticuerpo neutralizante contra los 4 serotipos, dos después de la primera dosis, y dos después de una tercera dosis a los 4 meses. Cuatro de cinco voluntarios que recibieron revacunación a los 4 meses se seroconvirtieron a 3 o más serotipos. La explicación de esta diferencia puede ser que un mes después de la vacunación hay suficientes anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada para suprimir la replicación de virus heterotípicos en la vacuna. Sabin descubrió que existía dicha protección cruzada transitoria que dura hasta 3 meses cuando a los sujetos humanos se les daba un virus de serotipo. (Sabin, 1959, Viral and Rickettsial Infections of Man. Philadelphia: JB Lippincott Company). Los futuros estudios tetravalentes usarán un programa de vacunación de 0,6 meses.

La mala inmunogenicidad de DEN-3 y 4 puede ser que a 10^{5} pfu/ml las dosis de Den-3 y Den-4 están en desventaja replicativa en comparación con DEN-1 y 2, ambas cuales están a 10^{6} pfu en la formulación tetravalente. Se están explorando estrategias de producción alternativa para aumentar los títulos de DEN-3 y DEN-4.

Sin detectar viremia de los 4 virus en los sujetos con respuesta tetravalente no se puede estar seguro de que la presencia de anticuerpo neutralizante implique necesariamente la replicación de los 4 serotipos. Los anticuerpos neutralizantes medidos pueden ser de reactividad cruzada y de baja avidez. Este problema debe abordarse examinando la persistencia a largo plazo de anticuerpo contra cada serotipo. Sería útil un ensayo de RT-PCR sensible y específico de serotipo para determinar viremia polivalente como evidencia de replicación viral.

Solamente dos de los vacunados con tetravalente desarrollaron anticuerpo neutralizante contra los 4 serotipos después de una vacunación. Dicha respuesta incompleta contra la vacuna tetravalente genera preguntas acerca del riesgo de fiebre hemorrágica del dengue en el establecimiento de exposición a serotipos heterólogos virulentos. Si la potenciación dependiente de anticuerpo es el mecanismo patofisiológico para DHF puede estar presente el riesgo incluso cuando se producen anticuerpos de los cuatro serotipos por vacunación pero uno o más anticuerpos de serotipo disminuyen diferencialmente por debajo del umbral neutralizante. A continuación se informa de que la respuesta de células T TH1 puede medirse en estos vacunados con tetravalente incluso en ausencia de anticuerpo neutralizante. ¿Sería suficiente para proteger? Estas preguntas solamente pueden contestarse por ensayo de campo a largo plazo de vacunas tetravalentes en áreas endémicas.

En conclusión, los presentes resultados indican que los cuatro serotipos son reactogénicos de forma variable como vacunas monovalentes con tipo 1 más que los serotipos 2, 3 y 4. Los serotipos 1 y 2 producían anticuerpo neutralizante en >90% mientras que los serotipos 3 y 4 eran menos inmunogénicos. La combinación tetravalente es segura, razonablemente bien tolerada e inducía anticuerpo neutralizante contra los 4 serotipos en cuatro de diez sujetos. Dos dosis de vacuna tetravalente no mejoraban los índices de seroconversión a los intervalos de dosificación de uno o dos meses ensayados. Un intervalo de dosificación mayor de más de 4 meses puede mejorar el índice de seroconversión.

Ejemplo 10 Material y Procedimiento para la respuesta de células T contra vacunas del dengue

Sujetos. Treinta y cinco voluntarios adultos sanos con edades de 18-50 (21 hombres, 14 mujeres) participaron en un ensayo clínico en fase I, realizado por el Walter Reed Army Institute of Research, que implica vacunas candidatas contra el virus del dengue. Los participantes se seleccionaron entre un grupo de voluntarios en base a la ausencia de anticuerpos anti-flavivirus en la circulación. Criterios de selección adicionales fueron el estado VIH negativo y la buena salud en base a un examen físico y las respuestas a un cuestionario.

Grupos de vacuna. Treinta individuos recibieron aleatoriamente dos dosis de una vacuna viva atenuada monovalente; cuatro recibieron dos dosis de una vacuna viva atenuada tetravalente. Un destinatario de la monovalente (voluntario ID 1) abandonó el estudio después de recibir solamente la primera dosis. Antes de la vacunación, no había anticuerpo sérico inhibidor de la hemaglutinación detectable contra el virus del dengue tipos 1-4, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St. Louis, o virus de la fiebre amarilla en ninguno de los voluntarios. Cada dosis se dio en forma de una inyección subcutánea de 0,5 ml de virus sin diluir.

Recogida de PBMC. Se recogió sangre periférica (8 ml) de cada voluntario por venopunción en Tubos de Preparación Celular Vacutainer (CPT) [Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ] en el día 0 y en cinco momentos puntuales después de la primera dosis pero antes de la segunda dosis (días 3, 7, 9, 14, 28/30/31/60 ó 91). También se recogió sangre en el día de la segunda dosis y en cuatro momentos puntuales después de ello (días 3, 7, 9 y 14 después de la segunda dosis). El tiempo de administración de la segunda dosis, dependiendo del voluntario, por tanto fue aproximadamente de 1-3 meses después de la primera dosis. Sucedió una variación en los tiempos de recogida de aproximadamente 1 mes debido a la variación de la programación de los voluntarios. Las células se separaron de la sangre completa por centrifugación a 1000 xg durante 30 minutos. Se recogieron las PBMC (la capa celular por encima del gel en el tubo CPT) y se lavaron dos veces en solución salina equilibrada de Hank (Life Technologies, Rockville, MD) con centrifugaciones a 500 xg. Las PBMC aisladas se resuspendieron en 4 ml (por tubo CPT) de Medio de Congelación Celular/DMSO (Sigma, St. Louis, MO) y se congelaron en alícuotas de 1 ml durante una noche a -70ºC. Después las PBMC se transfirieron a nitrógeno líquido en fase de vapor para almacenamiento a largo plazo.

Virus de vacuna. Se usaron las siguientes cepas de virus vivo atenuado del dengue descritas anteriormente en las vacunas monovalentes: 45AZ5PDK20 (DEN 1), S16803PDK50 (DEN 2), CH53489 (DEN 3), 341750PDK20 (DEN 4). La vacuna tetravalente era una mezcla igualada de estas cuatro cepas.

Virus de cultivo celular. Se usaron los siguientes virus del dengue, propagados en células Vero, para la estimulación de PBMC en cultivo: Westpac 74 (DEN 1), S16803 (DEN 2), CH53489 (DEN 3), y TVP360 (DEN 4). Los cuatro serotipos los proporcionó el Dr. Robert Putnak en alícuotas de 1 ml y se almacenaron a -70ºC hasta su uso. Los títulos virales variaban de 0,30-2,4 x 10^{6} pfu/ml.

Cultivo a granel de PBMC y estimulación con virus vivo. Se retiraron viales congelados de PBMC del almacenamiento en nitrógeno líquido y se descongelaron suavemente a 37ºC. Las PBMC se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 (Life Technologies, Rockville, MD) y se suspendieron en medio completo que contenía suero AB masculino humano al 10% (Sigma) más suplementos [penicilina (100 U/ml)-estreptomicina (0,1 mg/ml)-fungizona (0,25 mg/ml) [Sigma], L-glutamina 2 mM (Life Technologies), y 2-mercaptoetanol 0,5 mM (Sigma)]. Las células se suspendieron a una concentración de 2,5 millones de células/ml. Algunos ensayos requirieron 3,25 millones de células/ml. Las PBMC (100 ml) se añadieron a pocillos individuales de una placa con fondo en V de 96 pocillos (Costar, Acton, MA). Se añadió un volumen igual de virus del dengue 1, 2, 3 ó 4 diluido en medio completo al 10% a una concentración de 3000 a 24000 pfu/100 ml a cada pocillo. Los pocillos de control recibieron un volumen igual de medio sin virus. Las células después se cultivaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante cuatro días.

Inmunoensayo

Se hizo un inmunoensayo quimioluminiscente para determinar la cantidad de linfoquina secretada en el sobrenadante de cultivo tisular al final de 4 días de cultivo. Se revistió una placa de inmunoensayo de 96 pocillos, Microlite 2 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, Virginia) durante una noche con 50 \mul/pocillo de 10 mg/ml de anticuerpo anti-linfoquina (IL-4, IL-10, o Interferón \gamma) no marcado (Pharmingin San Diego, CA) en un tampón bicarbonato potásico 0,1 M. Las placas se lavaron y se añadieron 100 \mul de tampón I-block (Tropix, Bedford, MA) durante una hora. Los patrones (IL-4, IL-10 e Interferón \gamma recombinantes, Pharmingen, San Diego, CA) se pre-diluyeron en I-block comenzando con una concentración de 10 ng/ml. Se hicieron diluciones de factor ocho-tres del patrón. Las muestras, los controles y los patrones se diluyeron en un volumen igual de tampón I-block. Se añadieron alícuotas de 50 \mul a cada placa de ensayo. Las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron. El anticuerpo biotinilidado secundario se diluyó 1:1000 en I-block y se añadieron 50 \mul/pocillo a las placas de ensayo. Las placas se lavaron y se añadieron 50 \mul/pocillo de avidina-fosfatasa alcalina (Avidix AP, Tropix, Bedford, MA) a las placas de ensayo. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Las placas lavadas se incubaron dos veces durante un minuto con tampón de ensayo (Tropix). Se añadió el sustrato CDP-Star (Tropix) a cada pocillo (100 \mul/pocillo). Después de 10 minutos, las placas se leyeron en un luminómetro MD2250 (Dyatech, Chantilly, VA). Las primeras muestras se ensayaron usando un protocolo modificado. En lugar de una etapa de detección usando avidina-fosfatasa alcalina, se usó avidina-aecuorina (Sealite Sciences, Atlanta, GA). Este material quedó no disponible durante el estudio de modo que se modificó el protocolo. Los resultados usando muestras patrón y de control fueron idénticos para los dos formatos de ensayo.

Reactividad cruzada de serotipo. Para examinar la especificidad de serotipo, se estimularon las PBMC recogidas en los días 42, 45, ó 105 de destinatarios seleccionados de las vacunas atenuadas monovalentes (véanse los resultados) durante cuatro días a 250.000 células/pocillo con cada serotipo de virus en cultivos independientes. Después se analizaron los sobrenadantes de cultivo usando el ELISA de linfoquinas quimioluminiscente.

Depleciones de subconjuntos de células T. Para examinar la fuente celular específica de producción de linfoquinas, se eliminaron los linfocitos T CD3+ o CD8+ de las PBMC antes de la estimulación. Las PBMC seleccionadas se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 y se suspendieron a 3,25 millones de células/ml en medio completo al 5% (se usó un 30% más de PBMC como aportación para compensar las pérdidas celulares durante el procedimiento de depleción). Para la depleción negativa, las células (650.000 PBMC) se incubaron con perlas magnéticas revestidas de anticuerpo lavadas. Se usaron dos tipos de perlas, perlas M-450 anti CD3 y anti CD8 (Dynal, Oslo, Noruega). Las pelas anti CD3 se usaron a una concentración de 5,2 millones de partículas/tubo dando una proporción aproximada de perlas a células diana de 20:1. Las pelas anti-CD8 se usaron a una concentración de 4,0 millones de partículas por tubo dando una proporción aproximada de perlas a células diana de 31:1. DYNABEADS^{TM} (Dynal) en tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Las células se incubaron a 4ºC durante 30 minutos con agitación moderada. Se usaron PBMC sin depleción como controles. Usando un concentrador de partículas magnéticas MPC-2 (Dynal) se retiraron las células marcadas de la mezcla celular. Las PBMC seleccionadas negativamente CD3+ y CD8+ se transfirieron a tubos de microcentrífuga frescos. Para retirar cualquier célula no unida residual, las Dynabeads concentradas se lavaron una vez con 200 \mul de medio completo. Después de la transferencia, el volumen final (400 \mul) se dividió por igual en dos pocillos de una placa de cultivo con fondo en V de 96 pocillos. Los sobrenadantes de cultivo de PBMC con depleción y de control se analizaron después de cuatro días usando el ELISA de linfoquinas quimioluminiscente. Además, las PBMC cultivadas se ensayaron para el ARNm de granzima B intracelular (véase a continuación). La depleción CD4+ se realizó de forma simular pero la separación se hizo después de la estimulación usando dynabeads M-450 CD4+ (28,6 ml/4,004 millones de partículas, una proporción aproximada de perlas a células diana de 31:1). Las PBMC seleccionadas negativamente CD4+ se ensayaron solamente para el ARNm de granzima B intracelular.

Citometría de flujo. La eficacia de depleción (medida como % de depleción) se determinó usando análisis FACS después de tinción doble de una población de PBMC no estimulada, seleccionada aleatoriamente (tanto series de control sin depleción como series con depleción CD3+ o CD8+). Las células se incubaron con anticuerpos anti-CD4+ o anti-CD8+ marcados con PE y anti-CD3+ marcados con FITC (Becton-Dickinson) durante 30 minutos a 4ºC. Las PBMC marcadas después se lavaron tres veces con tampón de fluorescencia [PBS (Sigma), Azida Na al 0,05%, Suero Bovino Fetal al 1% (Summit Biotechnology, Boulder, CO) y se conservaron en fijativo de fluorescencia [PBS, Formalina al 1%, Azida Na al 0,05%] antes del análisis. No se midió la eficacia de depleción, usando Dynabeads CD4+.

Ensayo de granzima B. Se ensayaron PBMC de control sin depleción y PBMC con depleción de subconjuntos de células T para el ARNm de granzima B intracelular, después de cuatro días de estimulación con virus de tipo silvestre. Se usó un ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa (RT-PCR) en un formato de placa de 96 pocillos.

La purificación del ARNm se hizo usando el Sistema de Aislamiento de ARNm "Straight A's" (Novagen, Madison, WI). Después de centrifugación y retirada de los sobrenadantes del cultivo de PBMC para el análisis ELISA de linfoquinas, se lisaron las PBMC sedimentadas usando 200 \mul/pocillo de tampón de lisis que contenía ditiotreitol 10 mM y después se incubaron con 200 mg/pocillo de perlas magnéticas oligo dT lavadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavado minucioso de las perlas con ocho volúmenes de tampón de lavado usando un concentrador de partículas magnéticas MPC-96 (Dynal) para retirar el ADN, las proteínas, y los desechos celulares, se eluyó el ARNm a 70ºC durante 20 minutos con 200 \mul/pocillo de H_{2}O. El eluato se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se realizó una segunda ronda de elución con 200 ml/pocillo adicionales de H_{2}O. Los 400 \mul de eluato después se precipitaron usando 50 \mul de acetato sódico 3 M (pH 5,2), 20 mg de glucógeno (Novagen), y 300 \mul de isopropanol. Después de un lavado final con etanol frío al 70%, se suspendió el sedimento de ARNm en 30 \mul de H_{2}O.

Las etapas de RT-PCR se realizaron en placas de 96 pocillos. Los cebadores oligonucleotídicos (22 pb), que corresponden a los exones de la granzima B humana (CTLA-1) y amplifican una región de 120 pb, los sintetizó el Dr. Stuart Cohen en el Walter Reed Army Institute of Research. Los cebadores tenían las siguientes secuencias: grb2a (con sentido) 5'AGC CGA CCC AGC AGT TTA TCC C (SEC ID Nº 1), grb2b (anti-sentido) 5'C TCT GGT CCG CTT GGC CTT TCT (SEC ID Nº 2).

Para cada reacción con transcriptasa inversa, El volumen de reacción total fue 40 \mul e incluía los siguiente: MgCl_{2} (5 mM), tampón II 10X (Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, pH 8,3), dNTP (1 mM cada uno), e inhibidor de RNasa (40 Unidades) [Perkin Elmer, Norwalk, CT], transcriptasa inversa AMV (10 Unidades) [Siekagaku], cebador grb2b (3 pmoles), sH_{2}O, y 4 ml de molde de ARNm. Las etapas de incubación con RT se hicieron en un termociclador 9600 (Perkin Elmer) con parámetros establecidos a 42ºC (90 minutos), 99ºC (5 minutos), 4ºC (indefinidamente). Para cada PCR, el volumen de reacción total era de 50 \mul e incluía lo siguiente: MgCl_{2} (2 mM), tampón II 10X (igual que anteriormente), dNTP (0,4 mM cada uno), oro amplitaq (1,25 Unidades), cebadores grb2a y grb2b (1 pmol cada uno), sH_{2}O, y 5 \mul de molde de ADNc. Las etapas de incubación de PCR también se hicieron en un termociclador 9600 con parámetros establecidos a desnaturalización inicial/activación enzimática a 95ºC (10 minutos), 30 ciclos: [desnaturalización a 95ºC (30 segundos con un desnivel de 10 segundos)/ hibridación a 60ºC (30 segundos con un desnivel de 30 segundos)/extensión a 72ºC (30 segundos con un desnivel de 30 segundos)], extensión final a 72ºC (7 minutos), 4ºC (indefinidamente).

Usando electroforesis, se separaron los productos de PCR amplificados finales (10 \mul) en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio (SeaKem)/1X TAE (Tris-Acetato-EDTA) y se analizaron usando una cámara digital (Scientific Imaging Systems, New Haven, CT).

Se pensó que si podía demostrarse una respuesta más reforzada a una dosis de refuerzo de vacuna viva, podría usarse una vacuna de virus vivo más atenuada. La respuesta más reforzada buscada era una respuesta tanto de anticuerpos como de células T.

Aunque se han medido respuestas de células T contra vacunas del dengue, se han hecho menos mediciones de respuestas de células T que respuestas de anticuerpos. Por lo tanto, la respuesta de células T a la administración de vacuna viva contra el dengue está menos caracterizada. Un objetivo de este estudio fue determinar la naturaleza de la respuesta de células T a las vacunas en términos de respuesta T auxiliar, especificidad de serotipo y potencial citotóxico.

La respuesta de células T predominante a estas vacunas era una respuesta Th1. esto se determinó por la secreción de interferón \gamma por células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) estimuladas por virus vivo del dengue en un cultivo de cuatro días. El interferón \gamma se secretó por células T CD3+CD8-. La respuesta de células T era específica del serotipo del virus del dengue con alguna respuesta de reactividad cruzada. Se apreció una respuesta anamnésica en algunos individuos y otros no.

Secreción de linfoquinas por células estimuladas con dengue

Se usó virus vivo del dengue para estimular cultivos de PBMC. El serotipo del virus estimulante usado en cultivo era el mismo que el serotipo del virus de la vacuna. Después de cuatro días, se ensayaron los sobrenadantes de cultivo tisular para la presencia de interferón \gamma, IL-4 e IL-10. En todos los cultivos, IL-4 e IL-10 eran sistemáticamente negativas. Se usaron dos controles de ensayo para asegurar que el ensayo estaba funcionando apropiadamente. Primero, la curva patrón usaba linfoquina recombinante y segundo, se usó una muestra de control para asegurar que las linfoquinas podían detectarse en presencia de sobrenadante de cultivo tisular.

En contraste con la expresión negativa de IL-4 e IL-10, se detectaron elevados niveles de interferón \gamma en varios sobrenadantes de cultivo. La Figura 6 muestra la cinética de la expresión de interferón \gamma de células recogidas de voluntarios que recibieron vacunas monovalentes. Globalmente, las respuestas más elevadas de interferón \gamma fueron por PBMC recogidas de destinatarios de las vacunas candidatas contra el dengue 1 y dengue 2, aunque hubo unas pocas respuestas elevadas en destinatarios de dengue 3 y 4. Se detectó ocasionalmente interferón \gamma en el día 14 después de la primera inoculación pero a menudo la expresión no se detectaba hasta justo antes de o justo después de la administración de la segunda dosis. La cinética de secreción por lo tanto fue mucho más lenta que la esperada. Con respecto a las respuestas de refuerzo para los destinatarios de las monovalentes en este estudio, no hubo patrones coherentes. Dependiendo del individuo, los niveles de interferón \gamma aumentaban o disminuían después de la administración de la segunda dosis.

Las PBMC no estimuladas de todos voluntarios en los puntos de recogida mostraron niveles indetectables de interferón \gamma. La expresión media de las células del día cero estimuladas era de 127 pg/ml con una desviación típica de 230 pg/ml.

Para los destinatarios de vacuna monovalente, hubo 16 sujetos con respuesta positiva de interferón \gamma y 14 con respuesta negativa (media \pm 3 desviaciones típicas). Dieciséis de treinta destinatarios de vacuna monovalente tuvieron cultivos de PBMC con resultados de interferón \gamma >1000 pg/ml para al menos un momento puntual. Doce tuvieron secreción sostenida de interferón \gamma a >1000 pg/ml para dos o más momentos puntuales consecutivos. Además, doce de treinta tuvieron secreción >1000 pg/ml en el último momento puntual ensayado.

Cuatro voluntarios recibieron vacunas tetravalentes (una mezcla igualada de las cuatro cepas monovalentes). La Figura 7 muestra la producción de interferón \gamma por PBMC recogidas de estos destinatarios de la tetravalente. Las PBMC se estimularon en cultivos diferentes usando uno de cada uno de los cuatro serotipos de virus del dengue. Las PBMC de los voluntarios nº 33 y nº 36 secretaban cantidades significativas de interferón \gamma, >1000 pg/ ml, para al menos un momento puntual después de la estimulación con cada uno de los cuatro serotipos. Las PBMC del voluntario nº 35 secretaban cantidades significativas de interferón \gamma en respuesta a tres de los cuatro serotipos (no dengue 3). Las PBMC del voluntario nº 34 secretaban solamente interferón-gamma significativo en respuesta al virus del dengue 2. Las respuestas más elevadas fueron predominantemente contra DEN 1 y 2. La cinética de la producción de interferón \gamma se retardó en los voluntarios de vacuna tetravalente como en los voluntarios de la monovalente. Se detectaron elevados niveles de interferón \gamma justo antes de y después de la inoculación de la segunda dosis. Con respecto a las respuestas de refuerzo, como con los destinatarios de las monovalentes, no hubo patrones coherentes de secreción de interferón \gamma después de la administración de la segunda dosis.

Además, estos resultados indican que la respuesta de linfocitos T predominante en destinatarios de vacuna tanto monovalente como tetravalente era una respuesta Th1 específica de antígeno.

Ejemplo 11 Reactividad cruzada de serotipo

Se examinaron las PBMC de doce de los destinatarios de vacuna monovalente para la presencia de respuestas específicas de serotipo del dengue y de reactividad cruzada. En base a la cinética, se eligieron aquellos individuos que secretaban >1000 pg/ml de interferón \gamma en sobrenadantes de cultivo PBMC en el último momento puntual (después del último día de recogida). Se estimularon las PBMC del último día de recogida en cultivos independientes durante cuatro días con cada serotipo del dengue seguido de análisis de interferón \gamma secretado en sobrenadantes de cultivo. Aunque había algo de reactividad cruzada de serotipo, la respuesta más elevada se observó siempre en PBMC estimuladas con el mismo serotipo de virus que la vacunación original (Tabla 14). Por tanto las respuestas de interferón \gamma observadas en PBMC de estos destinatarios de vacuna monovalente seleccionados eran específicas de serotipo del dengue.

Las respuestas de reactividad cruzada eran la mitad (o menos) de la respuesta específica de serotipo. Para destinatarios de la vacuna contra el dengue 2, la respuesta de reactividad cruzada más elevada fue con virus del dengue 4. Para destinatarios de la vacuna contra el dengue 4, la respuesta de reactividad cruzada más elevada fue con virus del dengue 2. Para destinatarios de la vacuna contra el dengue 1, las respuestas de reactividad cruzada variaron. Había solamente un destinatario de la vacuna contra el dengue 3 en este grupo y esa respuesta era específica de serotipo.

TABLA 14 Expresión de interferón \gamma específica de serotipo y de reactividad cruzada por PBMC recogidas de destinatarios de vacuna monovalente. Las PBMC recogidas de individuos que recibieron vacunas monovalentes atenuadas contra el dengue se estimularon por separado en cultivo con cada uno de los cuatro serotipos del virus del dengue. Se seleccionó un subgrupo de células en base a la producción de interferón \gamma de al menos 1000 pg/ml en otros ensayos. Las respuestas específicas de serotipo fueron siempre las más elevadas, sin embargo también se apreciaron respuestas de reactividad cruzada. Los resultados se muestran como interferón \gamma en sobrenadante en picogramos/ml

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Ejemplo 12 Depleciones de subconjuntos de células T

Para verificar que ésta era una respuesta Th1, se determinó la identidad de las células que secretaban el interferón \gamma. Esto se hico por depleción de células T o conjuntos de células T antes del cultivo. Las células usadas en este estudio eran PBMC mixtas separadas de sangre completa usando centrifugación en gradiente de densidad. Las células predominantes en las poblaciones de PBMC incluyen células T, células B, monocitos y células NK. Para esta evaluación, se eligió el momento puntual de la respuesta de interferón \gamma más elevada en base a la cinética en 13 voluntarios monovalentes y 3 tetravalentes.

Las células se retiraron de las PBMC usando separación celular inmunomagnética. La eficacia de depleción se evaluó usando citometría de flujo en depleciones de ensayo. No se hizo el análisis de las PBMC cultivadas a causa de la pequeña cantidad disponible. En las depleciones de ensayo, la retirada de células CD3+ usando anticuerpo monoclonal CD3 provocó una reducción del 92% de células CD3+ con relación a controles de PBMC sin depleción. La depleción CD3 se controló usando marcadores dobles para CD3 y CD4, marcadores dobles para CD3 y CD8, y marcador sencillo para CD3. La depleción CD3 fue más rigurosa para células CD4+ que células CD8+ eliminándose un 98% de las células T CD3/CD4 y eliminándose un 90% de las células CD3/CD8 en los grupos de depleción CD3. LA retirada de células CD8+ usando anticuerpo monoclonal CD8 provocó una reducción del 99,9% de células CD8+.

Las PBMC seleccionadas sufrieron depleción de linfocitos T CD3+ o CD8+, se estimularon en cultivo con virus del dengue durante cuatro días, y después se examinaron para interferón \gamma secretado. Los resultados se compararon con los obtenidos de controles de PBMC sin depleción cultivados al mismo tiempo. Los linfocitos T CD4+ no se eliminaba antes de la estimulación porque otras poblaciones celulares necesitan los auxiliares T CD4+ para la producción de interferón \gamma.

La retirada de células CD3+ antes del cultivo reducía sustancialmente la producción de interferón \gamma como se muestra en la Tabla 15. El intervalo para la reducción en interferón \gamma después de la depleción CD3+ era del 59-100%. Se observó producción de interferón \gamma reducida pero significativa en algunos cultivos con depleción CD3+. Esta producción residual indica que la pequeña cantidad de células CD3+ residual que queda después de la separación celular inmunomagnética está secretando interferón \gamma y/u otra población de células también está secretando interferón \gamma.

TABLA 15 Los linfocitos que secretan (o inducen la secreción de) interferón \gamma son células CD3+ CD8-T. Los subconjuntos de linfocitos seleccionados se eliminaron negativamente usando técnicas de separación celular inmunomagnética. Las células restantes se estimularon con virus vivo del dengue durante cuatro días y el sobrenadante de cultivo se ensayó para interferón \gamma. La depleción de linfocitos CD3+ antes del cultivo influyó negativamente en la producción de interferón \gamma

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Excepto en un individuo, la retirada de células CD8+ antes del cultivo no redujo la producción de interferón \gamma. En 9 de los 16 cultivos, la retirada de células CD8+ realmente aumentó su producción, posiblemente debido a la retirada de la supresión por estas células o por la reducción de la eliminación de células presentadoras de antígeno infectadas por linfocitos citotóxicos CD8+.

En conjunto, estos resultados indican que el interferón \gamma observado en estos cultivos de PBMC está secretado por linfocitos T CD4+ y/o por células influidas por los linfocitos T CD4+. Esto apoya el hallazgo de una respuesta Th1.

Ejemplo 13 Granzima B

Una respuesta Th1 está asociada con, entre otras cosas, una respuesta de linfocitos citotóxicos. En un esfuerzo por observar si estaban presentes células capaces de una eliminación mediada por células en estos voluntarios de vacuna, se midió el ARNm de granzima B en las PBMC cultivadas para los experimentos de depleción. Después de la retirada de los sobrenadantes de cultivo para el análisis de linfoquinas, las células se sedimentaron y se lisaron para la extracción de ARNm. Se usaron cebadores específicos de granzima B para RT-PCR. El producto de PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa. La intensidad de bandas del gel se convirtió en una escala +, - usando una fotografía de referencia (Fig. 8) para la comparación. Se cultivaron células adicionales de siete de los voluntarios sin virus. Las PBMC no estimuladas, de estos siete voluntarios, tenían poca expresión (- o +) de ARNm de granzima B. Con estimulación específica de antígeno, la expresión estuvo sustancialmente regulada positivamente en los 16 de los destinatarios de vacuna seleccionados (Figura 8). La depleción de subconjuntos de células T usando anticuerpo monoclonal CD8 no redujo significativamente la expresión de granzima B con relación a las PBMC de control. Había 3 individuos (ID 16, 22, y 33) cuya expresión de granzima B se redujo en el grupo de depleción CD8. En uno (ID 33), la disminución fue sustancial. En contraste, la depleción de subconjuntos de células T usando anticuerpo monoclonal CD3 redujo la expresión en 14 de los voluntarios. En 8 de los voluntarios monovalentes y en los 3 voluntarios tetravalentes, la disminución fue sustancial. También se examinaron cuatro de los sujetos sin respuesta de interferón \gamma para el ARNm de granzima B. Todos mostraron bajos niveles de expresión (datos no mostrados).

En células de siete de los voluntarios, la depleción de subconjuntos de células T usando anticuerpo monoclonal CD4 se hizo después de cuatro días de cultivo. La depleción se hizo después del cultivo para proporcionar actividad auxiliar T a todas las células que necesitan ayuda durante el cultivo. La retirada de células CD4+ después de la estimulación no afectó a la expresión de granzima B con relación a los controles sin depleción en los siete voluntarios analizados. Por tanto, aunque hay una producción dependiente de antígeno de granzima B mediada por células Th1 CD4+, las células reales que producen la granzima B parecen ser células diferentes a células T. Si esta producción es por células NK o macrófagos se desconoce.

Discusión

Dos objetivos de este estudio fueron determinar si había una respuesta de células T medible en los destinatarios de la vacuna y si podía observarse una respuesta mediada por células frente a la segunda dosis de vacuna. Para esos objetivos, se midió la cinética de respuesta de células T reestimulando células recogidas a intervalos entre las dos dosis. La reestimulación se hizo con virus vivo en cultivos a granel de PBMC recogidas durante el estudio.

Un tercer objetivo de este estudio era determinar la naturaleza de la respuesta de células T en términos de 1, tipo celular definido por el repertorio de linfoquinas, 2, respuestas específicas de serotipo del dengue y de reactividad cruzada, y 3, una medida del potencial citotóxico, la producción de granzima B. Estas respuestas se midieron en PBMC de destinatarios de vacunas tanto monovalentes como tetravalentes. Con respecto a los destinatarios de vacuna tetravalente, fue importante determinar si podía detectarse una respuesta contra los cuatro serotipos de virus del dengue.

Las respuestas T auxiliares humanas y de ratón pueden dividirse en dos grupos en base a su patrón de expresión de linfoquinas 5. Las células T auxiliares 1 (Th1) se caracterizan por la secreción de IL-2 e interferón \gamma. De esas dos linfoquinas, el interferón \gamma es la más importante en términos de identificación de células Th1. Las células T auxiliares 2 (Th2) se caracterizan por la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. En poblaciones mixtas de células o cultivo a granel de PBMC, habitualmente predomina uno de los dos patrones de secreción.

Un factor que influye en la respuesta Th1 vs Th2 es la naturaleza de la infección agresora. Las infecciones virales, y algunas infecciones bacterianas tales como Listeria y Mycobacterium (Peters, 1996, Hepatology 23, 909-916) a menudo inducen una respuesta Th1 mientras que algunas infecciones parasitarias inducirán una respuesta Th2 (Conrad y col., 1990, J Exp Med 171, 1497-1508). La proporción de las dos respuestas puede variar dependiendo del transcurso de la infección. Por ejemplo, aunque las infecciones virales habitualmente empiezan con una respuesta Th1, puede producirse una respuesta Th2 posteriormente en la infección. La respuesta Th1 inicial puede aumentar las respuestas CTL y dirigir el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas mientras que la siguiente respuesta Th2 puede aumentar la producción de anticuerpos por células B.

En una infección por dengue natural, un estudio mostró una respuesta Th1 en la mayoría de los individuos. La respuesta Th1 se asoció con una respuesta inmune eficaz sin patogénesis grave asociada. En contraste, algunos individuos desarrollaron una respuesta Th2 que estaba asociada con mayor patogénesis.

A pesar de la asociación de una respuesta Th1 con una respuesta inmune anti-dengue eficaz, la linfoquina clave de una respuesta Th1, el interferón \gamma, tiene influencias tanto positivas como negativas sobre la respuesta inmune. En Tailandia, Kurane encontró elevados niveles de interferón \gamma en el suero de pacientes DHF en comparación con los menores niveles en el suero de pacientes DF (Kurane y col., 1991, J Clin Invest 88, 1473-1480). El interferón \gamma aumentado puede ser una medida de la activación inmune. El interferón \gamma es necesario para activar y mantener la activación de células citotóxicas (células T CD4+, células T CD8+ y células NK). Aunque este mecanismo puede contribuir a la patogénesis en infecciones graves, la misma respuesta puede ser beneficiosa en infecciones más leves por la reducción de la cantidad de células infectadas por virus a través de citólisis específica de antígeno. La función positiva del interferón \gamma en el control de la infección por virus del dengue se demuestra en un modelo knockout de ratón reciente deficiente en interferones \alpha, \beta y \gamma. Los ratones knockout eran susceptibles a infección letal por el virus del dengue en contraste con controles adultos normales que eran resistentes a la infección (Johnson y Roehrig, 1999, J Virol 73, 783-786).

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Como alternativa, el interferón \gamma puede contribuir a la patogénesis de la infección por virus del dengue. Un mecanismo para la patogénesis puede ser por potenciación inmune debido al aumento de la infección de una célula diana principal, el macrófago. En cultivo, el interferón \gamma aumentaba la infección mediada por anticuerpos de una línea celular de macrófagos U937 aumentando la cantidad de receptores Fc en la superficie de las células (Kontny y col., 1988, J Virol 62, 3928-3933). Aunque otro estudio usando macrófagos cultivados normales mostró un efecto opuesto de disminución de la infección (Sittisombut y col., 1995, J Med Virol 45, 43-49). Dados estos resultados conflictivos, no está claro si el interferón \gamma contribuye a una infección aumentada de los macrófagos.

En este estudio, la respuesta Th1 era la respuesta predominante. Los ensayos para IL-4 y IL-10 eran sistemáticamente negativos lo que indica una ausencia de respuesta TH2. Se detectaron elevados niveles de interferón \gamma en los sobrenadantes de muchos de los cultivos, lo que indica la presencia de una respuesta Th1 en esos cultivos.

Como las células estimuladas eran PBMC completas, tenían que determinarse las células responsables de la secreción del interferón \gamma. Esto se hizo eliminando subconjuntos de células T usando un procedimiento inmunomagnético. La depleción negativa se hizo antes del cultivo con anticuerpos que reconocen CD3 o CD8. Como la depleción CD3 produjo la rescisión de la secreción de interferón \gamma y la depleción CD8 no, se concluyó que los linfocitos CD3+ CD8- eran la población celular que secretaba el interferón \gamma o al menos controlaba la secreción de interferón \gamma. Esto confirma que el interferón \gamma era el resultado de una respuesta Th1. Puede haber interferón \gamma residual en algunos cultivos después de la depleción debido a algunos linfocitos T CD4+ restantes después de la depleción u otras células en el cultivo, posiblemente células Natural Killer (asesinas naturales) o macrófagos.

La respuesta máxima de interferón \gamma era específica de serotipo. Cuando se estimulaban células de destinatarios de vacuna monovalente por separado por cada uno de los cuatro serotipos de virus del dengue, la producción máxima de interferón \gamma era en respuesta a estimulación por virus del dengue homólogo al virus de la vacuna. Se observaron respuestas de reactividad cruzada menores contra otros virus del dengue en varios de los cultivos. Esto es similar a los resultados obtenidos por otros usando una medición diferente, la proliferación de linfocitos. En un estudio, las células de individuos que recibieron una vacuna contra el dengue 2 mostraron la mayor respuesta contra el virus del dengue 2 pero se observaron respuestas de reactividad cruzada (Dharakul, J Infect Dis 170, 27-33). Esto se confirmó a nivel clonal donde la mayoría de los clones obtenidos de un destinatario de la vacuna contra el dengue 3 respondían mejor al antígeno del dengue 3 pero tenían respuestas de reactividad cruzada contra los otros tres antígenos (Kurane y col., 1989, J Exp Med 170, 763-775). La conclusión del último estudio fue que la infección primaria por virus del dengue produce predominantemente respuestas de linfocitos CD4+ de reactividad cruzada (proliferación y producción de interferón \gamma).

En este estudio, las respuestas de reactividad cruzada de las PBMC de los destinatarios de la vacuna monovalente eran habitualmente la mitad o menos de la respuesta específica de serotipo. En los destinatarios de la vacuna tetravalente, la secreción de interferón \gamma en respuesta a serotipos individuales de virus del dengue era significativa en tres de los cuatro destinatarios de la vacuna tetravalente. Las respuestas variaban en los destinatarios individuales de la vacuna suficiente para que no fuera posible determinar si las respuestas menores eran respuestas específicas de serotipo o respuestas de reactividad cruzada.

La cinética de la activación de células T indicada por la secreción de interferón \gamma era más lenta que la esperada. En unos pocos casos, las respuestas podían detectarse en el día 14. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las respuestas no se detectaban hasta justa antes de la administración de la segunda dosis de vacuna. No está claro cuál es la razón para la cinética retardada. Una explicación podría ser que la producción de antígeno por las células infectadas por el virus de la vacuna es lenta y persistente. Sin embargo, es igualmente posible que los procedimientos detectaran preferentemente respuestas de memoria en lugar de respuestas agudas. Por ejemplo, si las células CD8+ activas estaban inhibiendo una respuesta CD4+ en las PBMC recogidas durante la infección temprana, puede estar atenuada la respuesta medible. En cultivos en los que estaban eliminados los linfocitos CD8+, la secreción de interferón \gamma por los linfocitos restantes estaba aumentada en más de la mitad de los cultivos. Esta inhibición puede haber sido mayor durante la infección temprana.

Otros han observado una cinética de producción de linfoquinas más aguda. Se midieron las linfoquinas séricas, incluyendo interferón \gamma sérico durante 17 días después de la inoculación con una vacuna atenuada contra el dengue. Se observó una respuesta aguda en ese estudio que tenía su pico durante el tiempo de viremia (Kurane y col., 1995, J Clin Lab Immunol 46, 35-40).

La respuesta a la segunda dosis era mixta. Algunos individuos mostraron un aumento en la producción de interferón \gamma mientras que otros mostraron una disminución. La producción de interferón \gamma por células recogidas de destinatarios de la vacuna justo antes de la segunda dosis era suficientemente elevada para poder enmascarar cualquier respuesta anamnésica contra la segunda dosis. Además, la respuesta de interferón \gamma tardía puede haber hecho que la medición de una respuesta de células T anamnésica sea más difícil. Está claro que algunos individuos respondían a la segunda dosis. Esto puede indicar que hay algo de crecimiento viral localizado en presencia de una respuesta inmune activa.

En resumen, la respuesta de células T predominante contra la administración de estos virus vivos atenuados del dengue era una respuesta Th1. Esto se demostró por la secreción de interferón \gamma por PBMC reestimuladas recogidas de destinatarios de vacuna. Ninguno de los cultivos de PBMC de células de destinatarios de vacuna tenía secreción significativa de IL-4 o IL-10 en el sobrenadante de cultivo después de la reestimulación. La respuesta Th1 se verificó mostrando que linfocitos CD3+ CD8- secretaban interferón \gamma. La respuesta Th1 era predominantemente específica de serotipo del dengue pero se observaron respuestas de reactividad cruzada más pequeñas.

Ejemplo 14 Evaluaciones clínicas e inmunológicas de cuatro virus del dengue como cepas de exposición en voluntarios inmunes y susceptibles

El objetivo principal de este estudio es caracterizar las respuestas clínicas contra cada uno de los 4 virus candidatos de exposición del dengue en voluntarios susceptibles e inmunes para juzgar su idoneidad como cepas de exposición para estudios de eficacia de vacuna en seres humanos. El objetivo secundario del estudio es generar hipótesis con respecto a los equivalentes inmunes de protección para la fiebre del dengue.

Dosis, Programa y Vía: Todos los voluntarios recibirán 1 de 4 virus de exposición del dengue o placebo en una única dosis de 0,5 ml por vía subcutánea en la región deltoide en el día del estudio 0.

Grupos de Estudio:

Serie de Voluntarios nº 1 (susceptible): recibe DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 o placebo. Serie de Voluntarios nº 2 (inmune): recibe virus DEN (serotipo correspondiente a la vacuna previamente recibida) o placebo.

Criterios de Elegibilidad Generales: Edad 18-35, salud excelente sin ninguna afección médica crónica, valor de >75% en el examen de comprensión del estudio por escrito, consentimiento informado, disponibilidad durante el periodo del estudio, carta de aprobación para la participación de la cadena de mando (solamente militares), conversión serológica en respuesta a vacunación previa contra el dengue (serie de voluntarios nº 2 solamente).

Estadística: El análisis de los datos será principalmente descriptivo en este estudio piloto dada la pequeña cantidad de voluntarios en cada grupo de artículo de ensayo. La preocupación principal será documentar la frecuencia de acontecimiento clínicos (pre-especificados e inesperados) dentro de los cuatro grupos de estudio en comparación con el placebo.

Se compararán las medidas inmunes pre-exposición y las respuestas inmunes post-exposición de todos los voluntarios expuestos que desarrollan fiebre del dengue con las de todos los voluntarios expuestos que permanecen bien, para desarrollar hipótesis acerca de los equivalentes inmunes de protección.

Aplicación del Modelo de Exposición al Dengue Humano: En contraste con la mayoría de los experimentos históricos de exposición humana al dengue que se diseñaron para caracterizar la enfermedad del dengue o para evaluar la atenuación de vacunas vivas candidatas, este estudio de exposición se dirigirá a 1) validar 4 virus del dengue como cepas de exposición en voluntarios sin tratamiento previo a flavivirus (serie de voluntarios nº 1), y 2) identificar equivalentes de inmunidad en los destinatarios de vacuna monotípica contra el dengue cuando se exponen posteriormente con virus del dengue homotípico (serie de voluntarios nº 2).

Si la respuesta clínica en la serie de voluntarios nº 1 sugiere que estas cepas son adecuadas para la exposición, entonces en futuros experimentos controlados, se administrarán estas cepas de exposición a los destinatarios de vacunas candidatas contra el dengue o placebo para seleccionar las vacunas candidatas más prometedoras para desarrollo adicional.

Si la respuesta inmunológica en la serie de voluntarios nº 2 sugiere que algún aspecto de la inmunidad pre-exposición (anticuerpos y/o células T de memoria) se correlaciona con protección, dichos equivalentes de protección podrían simplificar el desarrollo de la vacuna contra el dengue.

Criterios de Definición Para Virus del Dengue a Ensayar como Cepas de Exposición: Un virus de exposición del dengue adecuado 1) causará de forma reproducible fiebre del dengue no complicada que dura 3-7 días en la serie de voluntarios nº 1, 2) se producirá en cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) y estará libre de agentes extraños o componentes no virales reactogénicos, y 3) estará disponible en forma de virus liofilizado en cantidad suficiente (>100 dosis). Los Virus de Exposición incluyen DEN-1 45AZ5 (PDK-0) inactivado, DEN-2 S16803 (PDK-10), DEN-3 cl 24/28 (PDK-0), DEN-4 341750 (PDK-6) (PDK = células de riñón de perro
primarias).

La dosis de cada virus de exposición en unidades formadoras de placa (pfu.) será de 0,5 x título.

Los virus de exposición del estudio cumplen los dos últimos criterios. Este estudio está dirigido a demostrar que las cepas de exposición candidatas del estudio cumplen el primer criterio. Se tienen algunas evidencias de que los 4 virus de exposición a ensayar en este estudio son apropiadamente patogénicos. Los virus de exposición DEN-1 y DEN-3 ya han demostrado causar enfermedad febril no complicada en voluntarios. Aunque los virus de exposición DEN-2 y DEN-4 a administrar en este estudio están sin ensayar en voluntarios, se cree que son patogénicos, ya que son los precursores de las vacunas candidatas contra el virus del dengue que se rechazaron porque causaban enfermedad febril en voluntarios. La única razón para rechazar cualquiera de los 4 virus candidatos de exposición del dengue es si no causan enfermedad en voluntarios sin tratamiento previo para flavivirus (serie de voluntarios nº 1) o causan enfermedad excesiva en cualquier voluntario (series de voluntarios nº 1 y nº 2).

Serie de Voluntarios nº 1: Se asignaron aleatoriamente diez voluntarios sin tratamiento previo para flavivirus sanos para recibir exposición al virus del dengue con 1 de 4 serotipos (2 voluntarios por serotipo) o placebo. Los voluntarios y los investigadores permanecerán ciegos al inóculo. Se espera que los 8 voluntarios que reciben virus de exposición del dengue lleguen a estar moderadamente enfermos con 3-7 días de fiebre, jaqueca grave y mialgias. La recuperación completa puede tardar tanto como 14 días desde la aparición de la enfermedad. Cada virus de exposición se considerará adecuado en base a las respuestas clínicas de los 2 destinatarios y debe satisfacer la definición del estudio de fiebre del dengue. La fiebre del dengue se define como: una enfermedad con: 2 o más de lo siguiente: jaqueca, mialgia, sarpullido eritematoso, dolor retro-orbital, artralgias, y fiebre sostenida durante 48 horas o más que permite periodos de temperatura disminuida debido al uso de acetaminofeno, y respuesta tisular durante el periodo de fiebre y los días después de ello manifiesta por neutropenia o trombocitopenia o lesión hepática, y evidencias de viremia del dengue durante el periodo de fiebre.

Serie de Voluntarios nº 2: Hasta doce voluntarios inmunes, sanos y jóvenes recibirán virus de exposición del dengue homotípico (N=10, independientemente del serotipo) o placebo (N=2). Los voluntarios inmunes son destinatarios previos de vacunas monovalentes, atenuadas vivas contra el dengue que tenían una respuesta de anticuerpo neutralizante primaria. Se espera que los voluntarios inmunes permanezcan bien. Las medidas de su estado inmune pre-exposición o activación inmune intra-exposición puede identificar equivalentes de protección.

5'AGC CGA CCC AGC AGT TTA TCC C (SEC ID Nº 1),

\vskip1.000000\baselineskip

grb2b (anti-sentido) 5'C TCT GGT CCG CTT GGC CTT TCT (SEC ID Nº 2).

Claims (8)

1. Una composición inmunogénica que comprende, en un vehículo fisiológicamente aceptable, la cepa atenuada del dengue-3 CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647 y al menos otro virus atenuado del dengue seleccionado entre dengue-1 45AZ5 PDK 20 con ATCC Nº VR2648, dengue-2 S 16803 PDK50 con ATCC Nº VR2653, y dengue 4 341750 PDK20 con ATCC Nº VR2652.

2. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende dengue-1 45AZ5 PDK20 con ATCC Nº VR2648, dengue-2 S 16803 PDK50 con ATCC Nº VR-2653, dengue-3 CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647, y dengue-4 341750 PDK20 con ATCC Nº VR-2652.

3. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que comprende adicionalmente un adyuvante para potenciar la respuesta inmune.

4. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, formulada en una dosis de 10^{2} a 10^{6} PFU de virus atenuado.

5. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho virus del dengue se produce en células de vertebrados.

6. La composición inmunogénica de la reivindicación 5, en la que dichas células son células Vero.

7. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho virus del dengue-1 está en una cantidad de 10^{2} a 10^{7} pfu/ml, dicho virus del dengue-2 está en una cantidad de 10^{2} a 10^{7} pfu, dicho virus del dengue-3 está en una cantidad de 10^{2} a 10^{7} pfu, y dicho virus del dengue-4 está en una cantidad de 10^{2} a 10^{7} pfu/ml.

8. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 formulada para administración subcutánea.