CN1351502A - 多价登革病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了减毒登革病毒的疫苗组合物。更具体地说,通过在PDK细胞中连续传代生产所述减毒病毒。本发明还通过施用减毒的登革－1、登革－2、登革－3和登革－4病毒提供了刺激个体的免疫系统以诱导抵御所有四种登革病毒血清型的保护作用的方法。

Description

多价登革病毒疫苗
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求1999年3月26日申请的美国系列申请60/126,313(仍在审查中)和2000年2月11日申请的美国系列申请60/181,724(仍在审查中)的优先权。引言
登革热是由登革病毒四种亚型，登革-1、登革-2、登革-3和登革-4中的任一种引起的，登革病毒是由蚊子传播给人。在成人中，登革感染通常引起自限但丧失行为能力的急性疾病，同时伴有发烧、肌肉疼痛、头痛以及偶尔会有皮疹。该疾病会伴有出血热，这可以由阳性止血器检测(positive tourniquet test)来证实，还有自发性瘀斑、侧翼出血(frank bleeding)和/或休克。登革出血热的死亡率约为0.5％。因曾感染登革病毒而产生抗体，但随后又被另一种登革毒株感染的患者有更高的登革出血热危险。
在所有热带和亚热带地区以及美国、欧洲、非洲和中东的某些温带地区均发现了带有登革病毒的蚊子载体。在最近几年，在中南美洲、东南亚、印度、非洲和加勒比及太平洋地区发生了地方性和流行性登革感染。对传病媒介进行控制是不现实的。
需要一种可抵御所有四种血清型登革病毒的有效疫苗。
发明概述
本发明满足了上述需要。本发明涉及含所有四种血清型减毒的登革病毒的疫苗组合物。与生理学上可接受的载体一起以有效量提供所述减毒病毒以便在人宿主中诱导免疫反应，并可包括佐剂以提高宿主免疫反应。
因此，本发明的目的之一是提供减毒的登革病毒组合物，所述组合物含有选自登革病毒-1、登革病毒-2、登革病毒-3和登革病毒-4的任意组合的一种以上的减毒的登革病毒。
本发明的另一目的是提供刺激个体免疫系统的方法以诱导针对登革病毒的保护。这些方法包括给个体使用免疫学足够量的选自所有四种已经连续传代减毒的血清型的登革病毒。
附图的简要描述
图1：施用疫苗后＞1级症状发病率的结果。
图2：血清型的反应原性指数的分布频率。
图3：表明剂量-变化四价登革疫苗研究结果的表。
图4：表明在10个个体中全量四价登革疫苗的免疫原性的表。
图5：表明所选四价疫苗制剂的详细研究结果的表。
图6，A-H：由从疫苗自愿者收集并用血清型特异性病毒刺激的PBMC生产γ干扰素。所有自愿者仅接受一种血清型疫苗。左边的图(A-D)表明在第32天施用第二剂量的自愿者的结果。右边的图(E-H)表明在第92天接受第二剂量的自愿者的结果。在第二剂量前，在大多数自愿者中发现超过1000pg/ml的反应。仅四个自愿者在接受第一疫苗剂量的前15天内有超过1000pg/ml的反应。
图7，A-D：从接受四价疫苗的疫苗自愿者中收集的PBMC生产γ干扰素。用每种血清型病毒逐个刺激PBMC。在每个图中的每个线代表一个自愿者的PBMC对一个病毒血清型的反应。对于单价疫苗受体，观察到晚期反应。
图8，A和B：从单价和四价疫苗自愿者中收集的PBMC的粒酶BmRNA生产。从在任何时间分泌≥1000pg γIFN/ml的PBMC的个体中收集细胞。这是由RTPCR检测的半定量mRNA的量。上图(A)描述了所有样品的所见带的强度。下图凝胶(B)来自有阳性和阴性RTPCR检测的所选的自愿者。
详细描述
本发明提供了适用于人用疫苗的所有四种血清型的减毒登革病毒。本文所述登革病毒是通过在适宜的宿主细胞系例如初级狗肾细胞中将传染性登革病毒分离物连续传代产生以便使突变积累，从而赋予所述分离物以减毒作用。连续传代指用病毒分离物感染细胞系，从宿主细胞中回收病毒子代，随后用所述病毒子代感染宿主细胞以产生下一代。
在本发明组合物中优选使用下列减毒病毒，尽管也可将任何血清型的其他病毒组合物(无论减毒的还是失活的)与本发明所述的减毒株一起使用。根据布达佩斯条约的规定，已将衍生于45AZ5分离物的减毒登革-1病毒保藏在美国10801 Boulevard大学的美国典型培养物收集中心(ATCC)(Manassas，Virginia 20110-2209)，保藏号为VR-2648。
根据布达佩斯条约的规定，已将衍生于S16803分离物的减毒登革-2病毒保藏在美国10801 Boulevard大学的美国典型培养物收集中心(ATCC)(Manassas，Virginia 20110-2209)，保藏号为VR-2653。
根据布达佩斯条约的规定，已将衍生于CH53489分离物的减毒登革-3病毒保藏在美国10801 Boulevard大学的美国典型培养物收集中心(ATCC)(Manassas，Virginia 20110-2209)，保藏号为VR-2647。
根据布达佩斯条约的规定，已将衍生于341750分离物的减毒登革-2病毒保藏在美国10801 Boulevard大学的美国典型培养物收集中心(ATCC)(Manassas，Virginia 20110-2209)，保藏号为VR-2652。
将有毒性(引起疾病)的登革病毒株连续传代可以分离减毒的，即不能引起疾病的传染性修饰病毒。用猴子检测这些病毒传染性的降低情况。然后在人中检测传染性降低的那些病毒。人是会表现出临床疾病的唯一的灵长类。临床反应性最小甚至没有但仍有传染性并可诱导免疫反应的病毒是减毒病毒。
在本发明的一个实施方案中，用初级狗肾(PDK)细胞将来自所有四种登革血清型的毒性登革分离物连续传代以得到减毒的毒株。通过用有毒性的病毒株感染PDK细胞，将感染的细胞培养数天，然后收集含病毒的培养液上清液完成传代。然后将收集的病毒用于新鲜PDK细胞以产生下一代。
在最后传代后，用胎恒河猴肺细胞(FRhL)检测各代传代物的临床效果。用FRhL细胞优化病毒滴度，其中通常认为第1代是主种(masterseed)，第2代是生产种，第3代是疫苗。在不同PDK传代水平制备疫苗，然后用猴子和人检测产品的减毒作用。通过每天监测症状例如体温(发烧)、头痛、皮疹等评估传代病毒的毒性，即引起疾病的能力。如果疫苗中的该病毒不能引起登革病的临床征兆，则认为该传代物是减毒的。
可以在许多可以使登革病毒生长的细胞系中繁殖本发明减毒的病毒。登革病毒可以在各种人和动物细胞中生长。用于繁殖疫苗用减毒登革病毒的优选细胞系包括DBS-FRhL-2、Vero细胞和其他猴细胞。通常用异倍体细胞系例如Vero细胞可得到最高的病毒产率。通常以约0.01-0.005的感染复数接种细胞，然后在可以使病毒复制的条件下，例如约30-37℃和约3-5天，或者只要使病毒达到足够的滴度所需的条件下培养细胞。通常通过熟知的纯化方法例如离心将病毒从细胞培养物中取出，然后与细胞组分分离，然后按照需要用本领域技术人员熟知的方法进一步纯化。
分离减毒病毒后可对其基因组进行序列分析以确定减毒表型的基础。同时可分析病毒DNA序列，相对于对照病毒的基因组序列鉴定减毒分离物中核苷酸改变。由此可表征赋予有毒株以减毒作用的分子变化。
本文提供的本发明的一个实施方案包括在表中所列的任何位置，单独或组合引入序列改变以产生减毒病毒子代。通过本领域技术人员熟知的任何标准重组DNA技术(Ausubel等，分子生物学的现有工具(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Associates &Wiley Interscience，New York，1989)将核苷酸改变导入克隆的DNA中以产生含所述改变的病毒基因组。然后将基因组连接到适宜的载体中，转染到用于生产病毒子代的宿主细胞中。
还可用通过质粒介导的病毒基因组导入以产生病毒子代的能力产生具有特定分子改变的病毒。在本发明的该实施方案中，可产生含改变的序列的稳定病毒原种，所述序列改变赋予所述病毒以所需的特性，例如降低的毒力。通过将所需的序列改变导入病毒基因组，从所述基因组产生病毒子代，然后回收病毒子代用于表征，这样还可用该方法评估分子改变对病毒各种特性即抗原型、毒力或减毒作用的影响。另外，还可用该方法构建含有插入到病毒基因组中的异源序列的病毒，所述异源序列目前由所述病毒传递以产生抗其他疾病的免疫反应。
用本领域技术人员已知的标准技术例如寡核苷酸指导的、接头扫描或聚合酶链反应为基础的诱变技术(Zoller和Smith，1984，DNA3，479-488；Botstein和Shortle，1985，Science 229，1193)可构建含特定分子改变的病毒基因组。通过本领域技术人员已知的标准方法可将所述基因组连接到用于转移的适宜载体中。用任何标准技术例如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、原生质体融合以及本领域技术人员已知的其他技术(Sambrook等，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)可将所述载体转染到用于生产病毒子代的宿主细胞中。
为了用于疫苗，可将本发明减毒病毒直接用于疫苗制剂，或者根据需要，用本领域技术人员熟知的冻干方法冻干，优选用稳定剂(Hoke，1990，Am J Trop Med Hyg 43，219226)。冻干病毒通常保持在约4℃。准备使用时，按下文所述，用水重新配制冻干病毒，或者如果需要使用稳定溶液，例如盐水或含Mg++和HEPES的溶液，加入或不加入佐剂。本文所引用的所有参考文献均全文引入本文作为参考。
因此，本发明的登革病毒疫苗含有作为活性成分的免疫原性有效量的一种以上的减毒登革病毒，所述病毒选自本文所述的登革-1、登革-2、登革-3和登革-4。可将减毒病毒组合物与生理学上可接受的载体和/或佐剂导入个体，特别是人。有用的载体是本领域熟知的，包括例如水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。可将所得溶液包装使用，或者冻干，按上述冻干制剂在施用前需再水合。所述组合物可按需要含有可药用辅助物质以达到近似生理的条件，例如pH调整和缓冲剂，渗涨度调整剂，湿润剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
通过任何适宜的方法，包括肠胃外的注射(例如腹膜内的、皮下或肌肉内注射)，通过鸟的卵注射、经口以及将所述病毒(通常是药物制剂中携带的)局部应用到气道表面可施用本文公开的活减毒病毒。通过鼻内给药(例如利用滴剂、拭抹或者可将药物制剂沉积在鼻内的吸入器)可将所述病毒局部施用到气道表面。通过吸入给药，例如通过产生含所述病毒作为气溶胶悬浮剂的药物制剂的可吸入颗粒(包括固体颗粒和液体颗粒)，然后使个体吸入可吸入颗粒，这样可将所述病毒局部施用至气道表面。施用药物制剂的可吸入颗粒的方法和装置是熟知的，可使用任何常规技术。接种的结果，宿主至少部分或完全对所施用血清型的登革病毒传染有免疫力，或者对发展的中度或严重登革病毒传染有免疫力。
将含本发明减毒登革病毒的疫苗组合物施用给易感的或者有登革传染危险的个体以提高所述个体自身的免疫能力。将所述量定义为“免疫原性有效量”。在所述应用中，更精确的量取决于个体的健康状态和体重、给药的方式、制剂的性质等，但通常为每个体施用约102-106pfu各血清型登革病毒。可调整即增加或减少各血清型病毒疫苗的量以得到可提供足够避免所需登革病毒传染的保护作用的制剂。当将四种血清型组合时，优选的组合物含有等量的各登革血清型。在任何过程中，疫苗制剂应提供一定量的各血清型的减毒登革病毒，该量足以使患者有效抵御疫苗制剂中的血清型的严重或威胁生命的传染，并在可能有其他血清型传染时产生交叉保护。
可将一种特定血清型的本发明减毒登革病毒与其他血清型的减毒登革病毒合用以达到抵御多种登革病毒的目的。通常将不同的经修饰的病毒混合并同时施用，但也可以分开施用。
在某些情况下，可将本发明的减毒登革病毒疫苗与可诱导对其他因素的保护反应的疫苗合用。
可一次或多次施用本发明的疫苗组合物。为引发足够水平的免疫可能需要多次施用。通过测定中和分泌和血清抗体的量可监测诱导的免疫水平，按需要调整计量或重复接种以便将保护作用保持在所需的水平。
提供下列实施例是为了说明而不是限制。
在下列实施例中施用下列材料和方法。用于疫苗生产的材料和方法
病毒株.从人和蚊子中分离后，将DEN病毒在初级狗肾(PDK)细胞培养物中传代。表1列出了在PDK细胞中适应和传代的病毒株。在PDK细胞中传代后，使病毒株进一步适应用于接种和疫苗生产的FRhL细胞。这样组成用于最终疫苗制备的另3-4代。表1中所列的亲本病毒株衍生于可以使DEN病毒复制的细胞中的低细胞培养传代物。
疫苗生产.用相似的方法，在FRhL细胞培养物中制备用于所有四种血清型的DEN疫苗。将保存并预检测的(参见表2的检测结果)FRhL细胞从液氮中取出，然后铺在用非必需氨基酸、胎牛血清、(FBS)(2％)(Biowhittaker，Waldersville，MD)和抗生素补充的150cm2烧瓶中的Eagle氏极限必需培养基(EMEM)(Biowhittaker，Waldersville，MD)细胞培养基中。烧瓶达到汇合后，取出培养基，用稀释的输入量为0.01MOI的DEN生产种接种烧瓶，然后在32℃吸附1小时。吸附后，用新鲜的EMEM培养基补料，再将烧瓶在32℃放4天。在接种后第4天，弃去所有烧瓶中的培养基，将细胞单层用100ml HanksBSS(Biowhittaker，Waldersville，MD)洗涤3次。洗涤后，将用含0.25％人血清白蛋白(HSA，Alpha Therapeutic Corp，Los Angeles，CA)的EMEM培养基代替FBS补充到烧瓶中。在32℃再培养2天后，从所有烧瓶中取出培养液上清液并合并。对样品作安全检测后，将剩余的培养液合并，通过0.45微米非蛋白质结合膜过滤器过滤澄清。将过滤的液体合并，与等体积含15％乳糖和5％HSA的稳定剂混合。将大批稳定的液体在-70℃贮存直到冷冻干燥。为了最后装瓶，将大批稳定的液体在41℃快速融解，以3ml分装在血清小瓶中。将放小瓶的盘在Hull冷冻干燥机中冷冻至-40℃，然后干燥1天。盖帽后，将小瓶贮存于-20℃的受监测冷冻器中。
疫苗检测.检测所有用于病毒制品的细胞库以及所有批次种子和疫苗是否存在污染物。表2中列出了检测条款和结果。在任何产品中均未发现可检测的污染物。
恒河猴接种.通过在前臂皮下接种0.5ml DEN疫苗或亲本病毒免疫成年雄和雌性恒河猴(6-15kg)。在接种前以及接种后14天中的每天从大腿静脉取血用于病毒分离和抗体检测。在免疫接种后30和60天也取血。同样完成病毒攻击。
在C6/36细胞中通过扩增分离病毒.Putnak等，1996(J.Infect Dis174，1176-1184)已描述了通过C6/36细胞培养扩增的病毒分离。简而言之，接种猴子后，从1-14天每天取血。分离血清，然后冷冻于-80℃。为了从血清中回收病毒，将融解的血清用细胞培养基1∶3稀释，然后用于接种含单层C6/36蚊子细胞的25cm2烧瓶。病毒吸附后，在EMEM维持培养基中将烧瓶保持于28℃。7天后，更换培养基，然后将烧瓶再温育7天。接种后14天，轻轻倒出培养上清液，与等体积热灭活的胎牛血清(FBS)混合后在-80℃冷冻。此后通过噬斑试验检测冷冻样品的感染性病毒。
表1.用于开发活减毒疫苗的登革病毒株
  血清型   原分离物   疫苗株：从人分离物传代   所选用于疫苗制备的PDK传代次数   用于种子和疫苗制备的FRhL传代次数   亲本株：从人分离物传代
  DEN-1(West Pac74；45AZ5)  人分离物Nauru，1974   20x FRhL(用噬斑筛选和用5AZ诱变)；传代20次制备的疫苗在2个自愿者中引起登革热   10，20，27   1：主种子2：生产种子3：疫苗   9xFRhL
  DEN-2(S16803)  人分离物，泰国，1974   1x蚊子；4xPGMK   10，20，30，40，50   1：主种子2：生产种子3：疫苗   4xPGMK；2xC6/36
  DEN-3(CH53489)  人分离物，泰国，1973   4xPGMK；5xC6/36   10，20，30   1：主种子2：生产种子3：疫苗   4xPGMK
  DEN-4(341750)  人分离物，哥伦比亚，1982   1x蚊子   6，10，15，20   1：预主种子(仅PDK-20)2：主种子3：生产种子4：疫苗   1x蚊子；5xPGMK；4x FRhL
表2.FRhl细胞库和DEN LAV种子和疫苗的临床前检测
          检测     FRhl细胞库   主种子   生产种   疫苗(大量)     疫苗(最终容器)
灭菌     X     X     X     X     X
支原体属     X     X     X
RT     X     X
血细胞吸附     X     X     X
细胞培养安全性(4个细胞系)     X     X
受孕卵的安全性     X
动物安全性：成年小鼠     X     X
动物安全性：乳鼠     X     X
动物安全性：豚鼠     X     X
动物安全性：兔     X
致肿瘤性     X     NA     NA   NA     NA
细胞核学     X     NA     NA   NA     NA
猴子安全性：神经毒性     NA  X(DEN-4)
猴子传染性/免疫原性     NA     X
猴子效力     NA  X(DEN-2，DEN-4)
传染性(噬斑检测)     NA     X     X     X     X
一般安全性     NA     X     X
残留的湿度     NA     X
重建的pH     NA     X
重建的重量摩尔渗透压浓度     NA     X
内毒素     NA     X
同一性(DEN)     NA     X     X     X
表3
  DEN病毒株   病毒  接种：PFU/0.5ml    Mks病毒血病/总数(病毒血症平均天数)    Mk血清转变/总数(接种后1-2 mo的GMT PRNT50)
  DEN-1，45AZ5   PDK-0(亲本)   3.3×104     4/4(6.8)     4/4(760)
  PDK-10(生产种)*   7.0×104     4/4(4.75)     4/4(1030)
  PDK-20(生产种)   1.7×104     4/4(4.5)     4/4(640)
  PDK-27(生产种)   1.8×104     0/4(0)     4/4(50)
  DEN-2，S16803   PDK-0(亲本)   5.0×106     4/4(5)     4/4(600)
  PDK-10(生产种)   3.8×105     4/4(4.75)     4/4(570)
  PDK-20(生产种)   2.2×105     4/4(6.5)     4/4(920)
  PDK-30(生产种1)   4.4×105     2/3(3.3)     4/4(640)
  PDK-30(生产种2)   2.1×105     3/3(6.0)     3/3(640)
  PDK-40(生产种)   1.0×104     2/4(1)     3/4(90)
  PDK-50(生产种1)   2.6×106     2/4(1)     4/4(310)
  PDK-50(生产种2)   5.9×105     3/4(3.25)     4/4(280)
  PDK-50(疫苗)   1×106     ND     4/4(270)
  DEN-3，CH53489   PDK-0(亲本)   8.0×103     3/3(3)     3/3(660)
  PDK-10(生产种)   2.5×106@     2/3(1.3)     3/3(150)
  PDK-20(生产种)   1.0×106@     0/3     3/3(130)
  PDK-30(生产种)   9.3×105@     0/3     0/3(＜10)
  DEN-4，341750   PDK-0(亲本)   1.0×103     3/3(4.7)     3/3(420)
  PDK-6(生产种)   1.7×105     1/4(0.5)     4/4(250)
  PDK-10(生产种)   2.9×105     1/4(1.3)     2/4(90)
  PDK-15(生产种)   5.5×104     1/4(0.25)     2/4(40)
  PDK-20(生产种)   5.5×104     1/4(0.25)     2/4(70)
  PDK-20(疫苗)   1.2×105     1/3(0.3)     3/3(50)
1，2两个不同的猴子试验组
@在C6/36细胞中完成的噬斑试验
噬斑试验.从扩增的病毒血症分离物滴定传染性病毒或按Sukhavachana等，1966(Bull WHO 35，65-66)的方法，用恒河猴肾(LLC-Mk2，ATCC CCL7)细胞通过噬斑试验直接从猴子血清滴定。按Putnak等，1996(同上文)所述完成在C6/36细胞中的试验。
中和试验.用与Russell等，1967(J Immunol 99，285-290)所用类似的噬斑减少中和试验从猴子血清测定DEN中和抗体。用表1中所列的亲本病毒测定血清样品中噬斑减少50％的终点(PRNT50)。实施例1
DEN病毒在PDK细胞中的修饰以及疫苗的生产.在PDK传代前，用于疫苗开发的DEN病毒株有不同的传代史。在DEN-4 341750的情况下，在接种PDK细胞培养物前，仅有一代蚊子传代细胞，而DEN-1 West Pac 74株在PDK传代前有20代FRhL细胞传代史(表1)。DEN-3例外，所有病毒株在少量PDK传代后均适应了。对于DEN-3，需要进行其他努力以在早期传代细胞中提高病毒输入以便使该毒株适应PDK细胞。适应PDK细胞后的一般情况是发现DEN病毒滴度为104-105 PFU/ml。提高滴度的努力没有成功，因此寻找其他细胞底物用于疫苗生产。由于如下原因选择DBS-FRhL-2(FRhL)细胞用于该目的：1)DEN病毒复制至滴度为约106 PFU/ml，使得用这些细胞可以制备DEN疫苗；2)已将所述细胞用于制备数种DEN疫苗，这些疫苗已进行了I期临床试验而没有与疫苗细胞底物有关的不利反应；3)FRhL细胞是正常的恒河猴肺双倍体细胞，这些细胞没有致瘤潜力，而且没有反转录酶活性和污染物；4)由于这些细胞是“正常”双倍体细胞，对于纯化疫苗没有调节或其他要求；5)FRhL细胞库可在用于疫苗制备的细胞代确立，从可获得的低传代细胞开始。因此，PDK传代为那些希望研究选择性减毒的经验过程的人们提供了一种优秀模式。但是，正是由于PDK连续传代产生累积性的选择过程，因此，在另一细胞底物中的进一步传代提供了其自身的选择压力。目前还不知道FRhL传代是否会提高或降低人病毒的毒力。利用必须仅一次完全表征的稳定细胞系是令人感兴趣的。但是，利用FRhL细胞的现有经验表明这些细胞会逆转或使在PDK连续传代中获得的生物学特性失去稳定性(Halstead等，1984，美国热带医学卫生杂志(Am J Trop Med Hyg)33，654-665；Halstead等，1984，美国热带医学卫生杂志(Am J TropMed Hyg)33，666-671；Halstead等，1984，美国热带医学卫生杂志(AmJ Trop Med Hyg)33，672-678；Halstead等，1984，美国热带医学卫生杂志(Am J Trop Med Hyg)33，679-683；Eckels等，1984，美国热带医学卫生杂志(Am J Trop Med Hyg)33，679-683)。
PDK-传代的病毒对FRhL的适应对于所有DEN病毒株同样成功并且不依赖于PDK传代。FRhL 1-4代细胞收集物的病毒滴度为105-106PFU/ml。通过第3-4次FRhL传代，制备所有DEN病毒的疫苗批次并按表2所列检测。在表2中还提供了FRhL细胞库检测以及主和生产种检测。这些要求确保安全性和无污染物的检测的结果是阴性或者在可接受规格范围内。对于DEN-4 341750 PDK-20生产种，要完成猴子神经毒性检测。该研究的结果可见于Hoke，1990(美国热带医学卫生杂志)(Am J Trop Med Hyg 43，219-226)。DEN-4生产种以及用于比较的DEN-4亲本病毒没有致神经病变的作用。基于来自该试验以及DEN猴子神经毒性的其他检测的数据(个人信息)，其余候选DEN疫苗是否需要评估神经毒性仍是可以讨论的。实施例2
用PDK传代的DEN病毒接种恒河猴.将在PDK细胞中传代并称为“毒株组”的DEN病毒的传染性与各血清型未改变的亲本病毒进行比较。表3列出了这些研究的结果，其中通过在接种后2周依次取的血清中发现病毒血症的天数测定对猴子的传染性程度。在分别用DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4接种的3-4只组成的猴子组中，给猴子接种亲本病毒后，发现病毒血症的时间分别平均为6.8、5、3和4.7天。对于DEN-2亲本，其他数据(未列出)还证实，使用类似的猴子和分离技术，伴有可测病毒血症的传染随时间流逝具有高度重现性。不幸的是，只有部分数据是有关猴子血清滴度的。现有的大部分数据来自用DEN-2亲本病毒进行的试验，其中在蚊子细胞培养物中滴定猴子的病毒血症血液。在接种后4-8天的峰病毒滴度使滴度达到105PFU/ml血清(Putnak等，1996，同上文)。
对于每个毒株组，PDK传代导致DEN病毒的改变，正如病毒传染猴子的能力降低所表明的。对于数个毒株组，由于在最高的PDK传代细胞完全没有病毒血症而使这一点得到清楚的证实。在PDK传代的27代细胞用DEN-1接种猴子，在4只猴子中病毒血症为0天。这可说成在共56份检测的血样中有0个分离物。DEN-3 PDK-20和PDK-30有类似的结果。在该病毒的PDK-30，猴子传染性的所有迹象均丢失，即在用106PFU病毒接种的猴子中，没有病毒血症和血清转变的迹象。DEN-2毒株需要最大次数的PDK传代以使猴子传染性得到改变。用这种病毒，为了降低病毒血症至少需要在PDK细胞培养物中传代40代。与该情况相反，DEN-4毒株341750仅需要在PDK细胞中传46代就可改变猴子传染性。对于另一DEN-1毒株，1009，与亲本病毒相比(数据未列出)甚至PDK传50代后也没有改变猴子传染性的迹象。因此，对于改变和使各种DEN病毒分离物减毒，PDK细胞传代似乎是一种有效的经验方法。这是一种DEN的非天然宿主，可能将选择压力放在病毒种群，所述病毒种群适于PDK复制但对于在猴子和人靶细胞中复制不是必需的。在人中候选疫苗研究的材料和方法
自愿者.通过一组检测包括血液化学、血液学、凝血酶原时间、部分组织促凝血酶原激酶时间、尿分析、快速血浆反应素抗体以及乙型肝炎表面抗原以及HIV抗体的血清学来检测和筛选年龄为18-45岁的健康男性和女性自愿者。在持续的显著异常或阳性检测的基础上排除自愿者。如果女性自愿者在疫苗接种48小时内怀孕检测为阴性并且愿意签署一份同意表格证明她们在接种后3个月用常规避孕法避免受孕，她们就可以参加试验。另外，如果自愿者以前有黄病毒免疫力就将其排除，因为这会影响对登革疫苗的反应[Scott，1983，J Infect Dis148，1055-1060]，或者如果有对新霉素、链霉素或庆大霉素过敏的历史也将其排除。先前将有黄病毒免疫力定义为没有可检测的针对登革1-4型、日本脑炎或者黄热病的血细胞凝集抑制抗体(在1∶10的血清稀释度)，以及没有黄热病接种或黄病毒感染史。
自愿者对设计用来检验临床试验各个方面知识的笔试得分≥70％。随后从每个自愿者手中得到告知服从US 21 CFR第50部分-人受试者的保护的同意书。临床协议与所有相关规范要求，包括Helsinki说明(草案)，和军队条款70-25-自愿者作为研究受试者和40-7-在人中研究性药物的使用和表1受控物质的使用一致。该研究得到美国军方普通外科处的人类受试者研究观察理事会、WRAIR人类应用研究委员会和巴尔地摩的马里兰大学研究观察理事会的批准。
研究疫苗.在表4中列出了所述研究疫苗。将疫苗病毒在初级狗肾细胞中重复传代，然后在胎恒河猴肺(FRhL)连续二倍体细胞培养物中最后传代3次以制备种子和疫苗。在用自愿者试验前，确定每个候选物与其野生型亲本病毒相比在接种的恒河猴中可引发实质上减弱的病毒血症。通过感染恒河猴测定的足够的减毒作用表明登革疫苗株是用于人检测的适宜疫苗。
在接种前，将一小瓶冻干的疫苗用用于注射的无菌水(USP)溶解。接种后，将未用的再水合疫苗保持在冰上，然后在4小时内在LLC-MK2细胞单层(Sukhavachana等，1966，Bull WHO 35，65-66)中滴定。根据注射的候选疫苗(表4)每个自愿者接受1.0×105-4.5×106 pfu的病毒。下文总结了每个研究疫苗的传代史。
表4.WRAIR活减毒的登革疫苗
    疫苗     PDK传代     年份   研究位点   自愿者数      剂量(×105pfu)
登革1(45AZ5)     27     1991     CVD     10     4.4-45
    20     19911992     CVD#     10     7.7-38
    10     19911992     CVD     9     2.8-3.5
    0     1984   USAMRIID##     2        ？
    登革2(S16803)     50     1991     CVD     3       6.8
    40     1996   USAMRIID     3        5
    30     19911992     CVD     10     5.6-10
    登革3(CH53489)     20     1992     CVD     6     1.0-1.4
    10     1992     CVD     3       3.8
    0     1986   USAMRIID     2        ？
    登革4(341750)     20     1989   USAMRIID     8       1.0
    15     1991     CVD     3       4.8
    总数     10      -      -     69        -
*初级狗肾传代水平
#疫苗开发中心，马里兰大学，巴尔地摩
##美国军队传染病医学研究所，Frederick，MD
登革145AZ5疫苗：在1974年从Nairu岛(西太平洋)的一名DEN热病人中分离DEN-1株West Pac 74。将该分离物在FrhL细胞中传代20次，然后制备疫苗。传代包括诱变以及噬斑筛选以回收减毒的并适用于人疫苗的病毒。给2名人自愿者接种后，决定不连续地使用疫苗，因为在1名自愿者中发生DEN病。通过在PDK和FrhL细胞培养物中传代进一步使疫苗减毒。现在，候选疫苗是DEN-1 45AZ5PDK-20。
登革2 S16803疫苗：登革2 S16803病毒株来源登革热患者的Thai病毒分离物。该病毒在PDK中共传代50次，最后用胎恒河猴肺二倍体细胞(DBS-FRhL-2)传代用于种子和疫苗生产。开始在第30和第50次PDK传代水平制备两种疫苗候选物，然后筛选用于检测。在WRAIR从相同登革2亲本株S16803病毒开发并由Salk Institute(Swiftwater，PA)在第40代生产另一候选疫苗。
登革-3型CH53489疫苗：登革3型CH53489病毒株来自Thai病毒株，在初级绿猴肾(PGK)和C6/36昆虫细胞中传代后，在初级狗肾(PDK)细胞中传代30次。用来自PDK 10、20和30代的病毒接种胎恒河猴肺二倍体细胞培养物。
登革4型341750 Carib疫苗：登革4型疫苗候选物来自登革4型的加勒比株(Columbia，1982)，在夏威夷大学传代，在WRAIR[Marchette，1990，Am J Trop Med Hyg 43，212-218]制备。亲本病毒的抗体中和包括H-241原型株的其他登革4型病毒。通过在初级狗肾(PDK)细胞培养物中传代20次使人分离物减毒。
研究计划.将标准随机的单盲住院病人临床方案用于所有小规模研究。大部分的研究在马里兰大学(巴尔地摩，马里兰)的疫苗开发中心完成。在马里兰弗雷德里克的美国军队传染病医学研究所(USAMRIID)的医学分部完成小规模的登革2型S16803 PDK 40疫苗和登革4型CH341750 PDK 20疫苗研究。
在疫苗的最初临床研究中，首先用3名自愿者检测特定病毒株的可得到的最高传代物。严密监测3周症状，如果自愿者保持良好状态，就检测较低的传代物。如果一名或多名自愿者生病，就不检测疫苗病毒株的较低传代物，按照推测较低的传代物可能被减毒得更少。用3名自愿者检测完所有可接受的传代水平后，选择不会引起疾病的最低传代水平进一步检测最多另外7名自愿者。
为了进行仔细观察，防止暴露于无关的传染病并防止蚊子可能的传播，在接种前将自愿者封闭在研究病房中直到接种后20天。记录在施用每个疫苗后在该期间发生的所有不利情况，不论严重或者它们是否与疫苗接种有关。事先按照没有下列严重不利情况来定义可接受的疫苗安全性：经诊断不能解释为与接种无关的任何严重临床疾病；持续发烧(在24小时内4次确定口腔体温≥38.5℃，连续3天每天口腔最高体温≥38.5℃，或者某一次超过40℃)；血小板减少症(少于100,000血小板/mm3)；或连续2次确定白细胞减少(绝对嗜中性白细胞计数＜1000)；或者连续3天或更多天除此无法解释的血清氨基丙氨酸转移酶(ALT)水平高于正常4倍。另外，将可能与使用疫苗有关的会表明任何显著副作用的任何情况记录为严重事件。
在0天给自愿者皮下接种0.5ml未稀释的疫苗。接种后，每6小时记录重要迹象。检查注射部位，测量红斑和硬结的最大直径并每天记录。接种后前20天每天评估临床迹象(发烧[＞37.8℃]、皮疹、呕吐、瘀斑和肝和脾增大)以及症状(不舒服、头痛、肌痛、关节痛、恶心和眼疼痛或者畏光)。将症状分为轻微(提及的症状但继续病房活动)或者严重(因症状而被强迫卧床)。如果自愿者要求，用盐酸丙氧芬治疗疼痛症状；不使用退热剂。在标准症状和身体状况清单上记录观察结果。在第21天将自愿者从研究病房放出，并要求其在接种后第1、6、12和24个月返回进行血清学研究。
用亲本登革1型45AZ5疫苗在USAMRIID接种2名健康的有黄病毒免疫力的自愿者，2年后，用登革3型CH53489疫苗的亲本株接种。对来自该研究的疫苗记录进行评述以确定是否存在下列迹象和症状：发烧、皮疹、不适、头痛、肌痛、关节痛和眼睛痛或者畏光。每天测定病毒血症。与本发明试验相反，未系统记录症状且未将症状的强度分级。另外，将在以后研究过程中在USAMRIID给8名自愿者试验登革4型341750 Carib PDK 20疫苗的临床情况摘录出并加以总结，与目前疫苗的结果进行比较[Hoke，1990，同上文]。
实验室评估.每隔一天从自愿者中收集血液，在第31天进行血红蛋白和血细胞比容、差别计数的白细胞计数、血小板计数以及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的常规医学检测。另外，每隔一天收集血液直到第20天，用于病毒分离和抗体研究。使血液(20ml)在4℃凝固≤2小时，将血清轻轻倒出分成1-ml样品，冷冻并于-70℃储存直到研究。
病毒分离.为了确定登革病毒血症，将血清融解，接种到C6/36蚊子细胞单层上，在28℃温育14天。通过在LLC-MK2细胞(Sukhavachana等.1966，Bull WHO 35，65-66)上检测噬斑来检测上清液培养液收集物。为了确定血清中的病毒数量，用Aedes albopictus蚊子细胞[Hoke，1990，同上]的C6/36克隆完成噬斑检测。用血浆稀释物接种细胞培养烧瓶，在35℃吸附1-2小时。加入由Hank′s平衡盐溶液和0.75％琼脂糖、5％乳清蛋白水解产物、0.12M NaHCO3和抗生素组成的覆盖培养基，将所有烧瓶在35℃温育。7天后，用5％液体中性红将烧瓶染色3-5小时。除去过量的染料，18小时后读噬斑。
血清学.抗体检测包括用相同血清型登革病毒作为待测疫苗中的病毒株完成的ELISA、HAI和噬斑减少中和试验(PRNT)。用修改的ELISA完成抗登革IgM抗体的检测，其中认为数值＞0.10 OD单位是阳性[Innis，1989，同上文]。用修改为微体积的标准计数完成HAI检测，其中使用4-8单位单个抗原，使用用丙酮提取以除去抑制剂的血清[Clarke和Casals，1958，Am J Trop Med Hyg 7，561-573]。按Russell等[Russell，1967，同上文]描述的方法完成PRNT检测。
统计学分析.用用于趋势和Spearman′s相关性的Cochran-Armitage试验，分别分析登革2型疫苗S16803(PDK30，40和50)和登革3型疫苗CH53489(PDK10和20)的传代水平与反应原性的频率与严重程度间的关系。独立分析的症状和迹象包括是否存在眼睛症状、头痛、不适、肌痛、关节痛、皮疹和发烧(温度＞37.8℃)以及经历的天数。在5％的可能性时，假设为零，即高PDK水平与较低反应原性无关。通过检查数据，根据各自愿者的临床和免疫学反应确定每个病毒的最佳传代水平。美国军队医学研究和开发控制黄病毒疫苗指导委员会选择没有引起不可接受的副作用但使约80％自愿者免疫的传代水平作进一步开发。
通过疫苗感染的定义.将通过疫苗感染定义为通过免疫后血清类型特异性中和抗体或IgM抗登革抗体的存在检测的在自愿者体内登革病毒复制。没有按照诊断感染的需要包括病毒血症，因为在没有抗体反应的情况下从未检测到。将疫苗失败定义为不可接受的有害临床反应或者不能发展恢复期的IgM或PRNT抗体。实施例3
对减毒登革疫苗的临床反应
登革2型S16803疫苗
在3名自愿者中检测来自第50代PDK传代细胞的登革2型S16803病毒株。自愿者状态很好，口腔温度不超过38.0℃。3名自愿者中有2人有暂时的轻微不适、头痛和眼睛症状(眼睛疼痛或畏光)。实验室发现包括在3人中的2人有轻微ALT升高(＜2x正常)，3人中有1人有轻微的白细胞减少。由于PDK50疫苗的可接受的安全性，选择下一个较低的可得传代物PDK30用于临床评估。
在10个人中检测的PDK30疫苗是不完全减毒的(underattenuated)并产生轻微至中度登革症状。4名自愿者在接种后9-14天(中值12天)(40％)产生低级别的发烧，T最大38.5℃。80％产生皮疹。大多数自愿者经历了眼睛症状(10/10)、头痛(9/10)和不适(9/10)，而70％有≥1的严重头痛、眼睛疼痛和畏光、不适或者肌痛。3名自愿者有轻微的丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高，ALT为肝病理学的量度。
由于认为PDK30疫苗有太高的反应原性而没有用自愿者进一步检测，从主种子产生PDK40疫苗。用PDK40接种的3名自愿者中的2人在接种后9-10天产生轻微登革样症状，有低烧(＜38.1℃)、皮疹、肌痛和头痛。症状在数天内自然消失而没有丧失劳动能力或者要求服药。伴随的症状是未预期到的血清肝酶升高，在1人中最高ALT水平为199IU/ml(正常的4倍)，在另一人中最大ALT为77IU/ml(从正常值升高1.5倍)。第3名自愿者仍无症状，但ALT也升高2倍(最高为102)。所有实验室异常在数天内均消失而未采取任何措施，在接种疫苗后21天，所有自愿者均以良好的健康状态而离开。由于与PDK40疫苗有关的异常肝炎发病频率，未计划进一步开发该产品。
表5总结了用WRAIR登革2型疫苗的开始临床经历。在30与50水平的传代疫苗间，发烧和皮疹迹象的减少最显著。此外，随传代的增加，口腔温度从T最高38.5℃降至正常，但一天以上的发烧过程没有改变。对于登革2型疫苗，眼睛症状、皮疹、头痛、不适和肌痛的频率与过程与传代水平显著有关。
表5.在登革2型S16803病毒疫苗受体中的临床反应
    传代水平   不适   头痛   肌痛    关节痛   眼部症状  皮疹     发烧T＞37.8∞C     发烧天数(平均)    发烧最高温度
 2-S16803-30   9/10   9/10   7/10     4/10   10/10  8/10     4/10     9-14(12)    38.5
 2-S16803-40   2/3   2/3   2/3     1/3   1/3  2/3     1/3     8,9    38.0
 2-S16803-50   2/3   2/3   0/3     1/3   2/3  0/3     0/3      -      -
症状-天数
    传代水平     不适    头痛   肌痛    关节痛   眼部症状   皮疹    发烧T＞37.8∞C
  2-S16803-30     2.2     3.6   2.4     1.7    3.3   5.4     0.5
  2-S16803-40     2.0     1.7   2.0     1.0    5.7   1.7     0.7
  2-S16803-50     0.6     0.7   0.0     0.3    1.0   0.0     0.0
表6.在登革3型CH53489病毒疫苗受体中的临床反应
A：有反应的患者数
    传代水平     不适    头痛    肌痛    关节痛    眼部症状   皮疹   T＞37.8℃(天数)   发烧最高温度
  3-CH53489-0     2/2     2/2     2/2     1/2     2/2   2/2   22(5-9)   40.6
  3-CH53489-10     1/3     2/3     2/3     1/3     1/3   2/3     1/3(10，11)   38.2
  3-CH53489-20     3/6     5/6     3/6     4/6     4/6   1/6    1/6(3)   38.7
B：症状天数
    传代水平   不适   头痛   肌痛    关节痛     眼部症状   皮疹   T＞37.8℃(天数)
  3-CH53489-0   3.5   4.0   4.5     2.0     3.5   7.5     5.0
  3-CH53489-10   0.3   3.3   2.3     1.0     1.3   6.3     0.7
  3-CH53489-20   1.7   2.8   1.0     2.0     1.3   0.8     0.2
表7.对登革疫苗的病毒血症和免疫反应
    疫苗和传代水平     病毒血症  病毒血症的天数(中值)    滴度范围             血清转变    GMT31   GMT60
  IgM   HAI   PRNT
    2-16803-30     10/10   6-12(10)    3-1200   8/10   6/9   10/10   343   262
    2-16803-40     2/3   6-10(8)    NA   3/3   2/3   3/3   640   618
    2-16803-50     0/3    -    -   1/3   1/3   2/3   11   13
    3-53489-0     2/2   3-10(6)    NA   2/2   2/2   2/2   2818   1995
3-53489-10 2/3 6-10(8) 84-6600 1/3 3/3 3/3 710 153
    3-53489-20     2/6   8-12(10)    12-138   2/6   1/6   3/6   556
    4-341750-15     1/3   8-10(9)    3-15   3/3   3/3   3/3
    4-341750-20     5/8   8-14(10)    10-1200   5/8   5/8   5/8   160
表8.WRAIR登革疫苗候选物的I期试验结果
  疫苗     PDK传代    病毒血症平均天数    平均疾病分数   可接受的反应原性 被感染数  血清转化数    血清转变％范围
  登革1(45AZ5)     27     0.0     2.4     是   7(70％)  4(40％)     3-77
    [20]     1.0     3.6     是   10(100％)  10(100％)
    10     5.0     3.9     是   7(78％)  7(78％)
  登革2(S16803)     [50]     0.0     5.0     是   2(67％)  2(67％)
    40     1.7     14.7     否   3(100％)  3(100％)
    30     2.2     19.1     否   10(100％)  10(100％)
  登革3(CH53489)     [20]     0.6     11.0     是   3(50％)  3(50％)
    10     2.3     15.3     否   3(100％)  3(100％)
  登革4(341750)     [20]     3.8     6.6     是   5(63％)  5(63％)
    15     0.6     20.7     否   3(100％)  3(100％)
a初级狗肾细胞传代水平
b定义为抗登革IgM阳性或者PRNT50血清转变
c定义为中性抗体滴度＞1∶10(PRNT50)
[]用于扩大的临床研究的毒株
登革3型CH53489疫苗.将在WRAIR开发的登革3型疫苗(CH53489，PDK0)施用2名健康的有黄热病免疫力的男性自愿者，皮下接种0.5ml 2×104pfu的病毒。免疫刚过后平静无事。第6天，2名自愿者生病，患有以高烧、寒战、肌痛、头痛、不适和弥散红斑皮疹为特征的中等严重程度的登革。这2人均有血小板减少和白细胞减少，但没有出血热的迹象。持续5天的发烧后，2人迅速恢复，到第21天非常好。由于2名自愿者均经历了严重的疾病，因此，在该传代水平没有进行进一步的试验。随后，将PDK10和PDK20传代水平制备为疫苗候选物。
给6名自愿者施用PDK20疫苗，产生轻微的反应原性。1名自愿者在第3天经历了早期发热并伴有暂时发烧(T最高38.2℃)、咽炎和颈淋巴结病。从该自愿者的血清中没有分离出登革病毒。该自愿者感觉有间发的发烧，这与接种没有直接关系。6名自愿者中的4人产生短期轻微登革症状，没有皮疹；关节痛、眼睛疼痛和头痛是最常见的并发症。但是，1名自愿者有3天更严重的头痛、不适和眼睛头痛。他还发展出白细胞减少以及持续的ALT水平升高；在第31天的随访中，这些实验室异常均消失。另一自愿者有轻微和可逆的ALT升高，比2x正常稍低。由于PDK20疫苗具有勉强可接受反应原性且是安全的，因此接下来检测可得的最低传代疫苗病毒(PDK10)。
证明PDK10病毒在受体中的反应原性太高。3名自愿者中1人在第10天和11天产生低级别的发烧(T最高38.3℃)，13天内有鲜红的皮疹。另一名自愿者在接种后第6-9天产生与盈亏(waxing and waning)荨麻疹有关的持续瘙痒，以及触痛的颈和腋淋巴结。他随后在10-12天产生斑丘疹皮疹并伴有不适、头痛和肌痛。该自愿者对疫苗有特应性的过敏反应，然后有典型的登革样病。这2名自愿者还有白细胞减少和ALT升高(＜2x正常值)的实验室异常，在第31天随访时消失。
表6总结了对登革3型CH53489疫苗的反应。尽管随传代水平升高有迹象和症状频率降低和过程变短的趋势，但是在这两个分析中均没有传代水平达到统计学显著水平。
登革4型341750疫苗.8名自愿者接受105PFU的PDK20疫苗[Hoke，1990同上文]。5名自愿者具有几乎不可观察到的斑点、白皮疹和最小的温度升高(最高38.1℃)。在这5名自愿者中还产生病毒血症和抗体反应(63％)。
从PDK15制备新的DEN-4 341750候选疫苗，预期较低的传代水平可能有更强的传染性。3名自愿者接受该疫苗，2人经历了最少的症状。第3人在第8天突然生病伴有发烧、脸和四肢浮肿、严重的倦怠、皮疹、眼睛头痛、畏光和关节痛。在3天内，发烧持续，T最高为39.6℃，但迹象和症状同时消失。由于存在这种对接种的严重不利反应，对PDK-15的进一步使用停止，选择PDK-20进一步评估。实施例4
对减毒登革疫苗的病毒血症和免疫反应
表7描述了对WRAIR登革疫苗的病毒血症和免疫反应。下文总结每个疫苗的感染性。
登革2型S16803疫苗.PDK50的受体没有产生病毒血症，但3人中的2人到第60天产生低滴度中和抗体。这些现象表明该疫苗病毒对人的感染性降低。相反，3名登革2型PDK40疫苗接种者中的2人有显著的病毒血症，并在接种后全部产生高滴度抗体。正如预期的，登革2型PDK30疫苗的感染性最高：在所有10名自愿者中均检测到病毒血症，到第60天所有个体均有中和抗体滴度为＞1∶60的血清转变。
登革3型CH53489疫苗.将保留疫苗病毒的温度敏感性和小噬斑表型的登革-3型病毒在登革3型PDK 0疫苗的2名有黄热病免疫力的受体中回收6和7天。随后用在第30和60天从2名自愿者收集的血清测定具有二级-感染-样交叉反应性的高滴度PRNT50和血细胞凝集抑制(HAI)抗体。感染性与接受登革3型PDK10减毒疫苗的个体的结果：3人中的2人产生病毒血症以及在所有人中接种诱导了中和抗体-相似。相反，6名登革3型PDK20疫苗受体中有2人产生可检测的病毒血症，3名自愿者随后发生血清转变，表明感染性降低。
登革4型341750疫苗.8名自愿者接收105 PFU的PDK20疫苗，随后在5人(63％)中产生病毒血症和抗体反应。从该候选物的较低传代物制备的疫苗，PDK15，有更强的感染性。从一名自愿者分离病毒，在接种后第8和10天，最大滴度为15pfu/ml。该自愿者随后产生具有二级HAI反应的滴度为450的中和抗体，发现该自愿者以前曾与圣路易斯脑炎病毒(接种前PRNT滴度1∶20)接触过。在接种后30天2名没有可检测病毒血症的自愿者产生分别为1∶10和1∶40的中和滴度。实施例5
候选疫苗的筛选
在表8中列出了WRAIR PDK-减毒疫苗安全检测的延续程序，该表列出了各血清型的疫苗的突出特征。PDK传代增加导致平均疾病分数降低，该分数评估了每个自愿者的症状持续期间和数量。另外，PDK传代增加还与病毒血症的平均天数减少有关，但登革4型疫苗例外。所检测的登革2、3和4型疫苗中，仅判断了一个传代水平具有安全性和可接受的反应原性，而且适宜进行展开的临床研究：登革2型PDK50、登革3型PDK20和登革4型PDK20。但是，被感染受体的百分比随PDK传代水平的增加而降低。按照中和抗体滴度≥1∶10的百分比定义的血清转变在宽置信区间内降低。
讨论
WRAIR长期与活减毒登革疫苗开发有关。通过由在狗肾(PDK)细胞中传代数次(在组织培养中重复生长)进行减毒，WRAIR和Mahidol登革疫苗项目已开发出数种活疫苗。在少量自愿者中的小规模检测结果确立了WRAIR候选疫苗的安全性。65名受体中没有自愿者要求紧急治疗持续的严重损伤。3名自愿者患与登革接种有关的暂时特应性反应，导致从进一步的临床研究中取消他们接受的疫苗。用减毒不够的疫苗进行试验性感染，尽管不舒服，但是可耐受的。
临床经历表明疫苗病毒的PDK传代水平增加提高了对自愿者的减毒作用。用登革1和登革3型病毒时，该效果最好，而亲本未传代的病毒会导致未改变的登革热，而经PDK传代20次产生可接受的反应原性。但是，增加PDK传代次数会降低疫苗病毒的感染性，导免疫原性原性降低。此外，在人中疫苗病毒的病毒血症减少似乎与恒河猴中的结果相关(登革4型PDK15例外)。这些发现表明自愿者中减毒登革病毒疫苗的感染性与免疫原性相等。应谨慎解释传代水平与反应原性间的关系，因为经历了一种症状的个体可能经历了数种症状。由于我们的分析方法假设这些症状是独立的，因此，基于独立p值的解释可能是脆弱的。然而我们仍相信皮疹与传代水平有明显相关(存在的独立p＝0.009，持续的p＝0.01)。由于对于登革2或3型疫苗，皮疹与其他症状间没有显著相关而使此观点得到支持(Spearman′s试验)。
仅选择具有可接受安全性图的疫苗进行展开的临床试验：登革1型45AZ5 PDK20、登革2型S16803 PDK50、登革3型CH53489 PDK20和登革4型341750 PDK20。由于归因于少数自愿者血清转变方面的宽置信区间，随后的研究寻求增加四种所选疫苗中的每一种的受体的数目。另外，进一步的试验希望能确定通过施用两个剂量而不是一个剂量用于这些研究是否可加强这些减毒疫苗的免疫原性。实施例6
单价疫苗的展开研究；按2个剂量施用单价疫苗；按1个和2个剂量给出的混合为四价制剂的单价疫苗
研究设计：这些研究的目的是评估按单剂量给出的四种单价疫苗，然后是两剂量接种方案的安全性和免疫原性。随后评估组合的四价疫苗的安全性和免疫原性。分别从巴尔地摩的马里兰大学和哥伦比亚特区华盛顿的WRAIR征募个体。将第一组22人分成4或5人的小组，共4组，每人接受单剂量的单价登革或黄热病(YF)17D病毒(Connaught)。17D黄热病疫苗作为反应原性的对照和基准。将另31人分成7-8人的小组，共四组，每人接受两剂量的一个单价疫苗，一半在一个月时，另一半在3个月时。最后，给10名自愿者施用2或3剂量的四价疫苗。前4名四价受体在0和1个月时接种。后6名四价受体在0、1和4个月时接种。除10名四价疫苗受体外，以随机和双盲方式给所有个体施用一种疫苗血清型。
个体：个体是年龄在18-50岁间的正常健康成人。所有个体均是乙型和丙型肝炎和HIV血清阴性。在进入试验前，通过血细胞凝集抑制检测所有个体均是登革1-4型、JE、SLE和YF血清阴性。
疫苗：最初从患临床疾病的人中分离四种血清型疫苗候选物。然后按上述通过在初级狗肾(PDK)细胞，然后在胎恒河猴肺细胞中连续传代使其改变。在人自愿者中的预先小规模研究基础上筛选这些候选病毒。用蒸馏水重建每种冻干单价疫苗，得到0.5cc。血清型1-4型的剂量分别为106、106、105和105pfu登革1、2、3和4。通过将0.25cc各重建的单价疫苗混合制备四价疫苗剂量，得到1cc的终体积。四价疫苗的剂量是1.1-2.8×106pfu。在上臂皮下进行接种。
临床安全性：通过在各接种后3周内组合每天的症状日记和定期的医生评估来评价对接种的反应。在接种后1周温育期后让个体住在研究处封闭观察5-7天，这是反应和病毒血症最可能发生的期间。给个体进行检查并具体询问发烧、寒战、头痛、眶后痛(retroorbital pain)、肌痛、关节痛、皮疹和其他症状。将每种症状分为0级(无)、1级(不影响正常活动；不需要药物治疗)、2级(需要药物治疗或活动改变)或3级(需要卧床休息或通过药物治疗不能缓解)。将最常见的症状分成四类。这些类别是：1)自觉的发烧和寒战，2)头痛和眶后痛，3)肌痛和关节痛和4)胃肠病包括恶心、呕吐和腹痛。通过每天最高症状级别与表现症状的天数的乘积来计算各类的症状指数。如果24小时内均发生某一症状，则该症状定为持续1天。反应原性指数(RI)是各类症状指数的简单总和。RI总结了各个体的疫苗反应。症状类别指数和RI使得可半定量比较个体和疫苗血清型间的疫苗反应。
通过在研究过程中连续CBC、血小板计数、AST和ALT可监测个体的血液和肝毒性。
将严重有害事件定义为没有其他可能原因的严重疾病，发烧＞38.5℃持续24小时以上或者连续3天T最高＞38.5℃或者一次口腔温度＞104℃，连续2次测定到中性白细胞减少＜1,000/ml或者血小板减少＜90,000/ml，或者血清ALT或AST＞5倍正常。
免疫原性：按照Clarke和Cassals，1958(Am J Trop Hyg 7，561-573)的方法完成血细胞凝集抑制试验。通过在除最后6名四价个体之外的所有个体中的捕获ELISA测定登革IgM和IgG。在每次接种后0和30天通过噬斑减少中和试验测定登革和黄热病中和抗体。研究终点确定是在最后接种后30天测定任何中和抗体。将中和抗体血清转变定义为以最小1∶5的稀释度，噬斑减少50％。在最初和第二次接种后7-14天针对血清确定病毒血症。用于病毒分离的方法是从Yuill，1968(Am JTrop Med Hyg 17，441-448)改编的延迟噬斑方法，使用LLC-MK2或C6/36细胞扩增以及Vero用于噬斑形成。
将来自单剂量和2剂量研究的数据组合完成该报告。在表9中列出了个体特征。共59名正常个体接受登革病毒疫苗；49名接受单价试验物，10名接受四价疫苗。4名接受许可的17D黄热病疫苗接种(Connaught)。
表9.个体特征疫苗      个体数(接受2个    性别    种族          平均年龄
        剂量的个体数)登革-1    12(8)             7M/5F   6W/6B           32登革-2    12(8)             7M/5F   7W/5B           36登革-3    13(8)             9M/4F   8W/5B           36登革-4    12(7)             6M/6F   4W/6B/1H/1AmI   33四价      4(4)              3M/1F   4W              26YF 17D    4(0)              3M/1F   3W/1B           30实施例7
反应原性
局部反应.59名登革疫苗受体中的19人(32％)报告在注射部位有轻微疼痛。其中7人接受DEN-1、4人接受DEN-2、1人接受DEN-3、1人接受DEN-4和5人接受四价疫苗。仅有5人在24小时后报告在注射部位有任何疼痛。没有人影响臂的使用。
全身反应.59登革受体中的20％在其第一次接种时没有任何症状，而70％的个体在第二次接种后无症状。接受第3剂量的4名个体没有报告与接种有关的任何症状。登革接种后报告的最常见的反应是头痛和肌痛。它们的严重性不一。图1表明第一次接种后引起每日活动改变或服药缓解的1级症状的发生率。第一剂量接种后，5名(8％)个体，1名血清型1，1名血清型4，和3名四价疫苗自愿者报告了持续不到1天的寒战、肌痛、头痛或恶心的3级严重症状之一。没有个体报告在再接种后有任何3级症状。
RI在0-35内。表10比较了各疫苗的报告的反应原性。DEN-1单价和四价疫苗与更强的反应原性有关。第二或第三剂量的所有登革疫苗始终不引起什么反应，甚至在初次接种后有中度或严重症状的个体中也是如此。
表2.平均反应原性指数
疫苗      个体总数    第一剂量   第二剂量     第三剂量
                      RI(数目)   RI(数目)     RI(数目)
Den-1      12         7.4(12)    0.5(8)        -
Den-2      12         3.8(12)    0.3(8)        -
Den-3      13         2.9(13)    0.8(8)        -
Den-4      12         3.7(12)    0.5(6)        -
四价       10         9.3(10)    1.9(10)       0.0(4)
YF 17D     4          3.8(4)      -            -
-＝未进行
图2表明随血清型RI的频率分布。8名个体(14％)发生发烧(＞100.4°F)。8名个体中4名接受DEN-1、1人接受DEN-2、1人接受DEN-3和2人接受四价疫苗。在DEN-1受体中发生最高和持续最长的发烧，T最高为103.3°F并发烧3天。只有一名个体尽管也接受了DEN-1，但发烧仅持续1天多。8名发烧者中的7人是在第一次接种后发烧的。
16名个体(27％)发生全身性皮疹，在第一次接种后发生在躯干和四肢。皮疹通常的红斑状的、斑点丘疹状和轻微瘙痒的。16名全身性皮疹个体中仅有7人发烧。16名患皮疹的个体中，5人接种DEN-1、2人接种DEN-2、1人接种DEN-3、3人接种DEN-4和5人接种四价疫苗。在接种后8-10天皮疹典型地变得明显在3？4天消失。没有个体发生任何瘀斑、紫癜或瘢痕形成。在再接种后没有个体再发生皮疹。
胃肠症状相对普通，在三分之一的个体中发生，但症状轻微且短暂，持续不到24小时。1名DEN-4受体发生1天与痉挛性腹痛有关的严重恶心。
6名个体(10％)，5名登革和1名黄热病病毒17D受体发生暂时中性白细胞减少，绝对嗜中性白细胞计数不到1000/ml。最低在一名DEN-1个体中，是288。中性白细胞减少一般在2-3天内消失。没有个体发生血小板减少。没有AST或ALT临床上的显著升高。
正如对该组接受其第一次登革病毒暴露的非免疫成人预期的，没有人发生任何登革出血热的临床迹象。实施例8
免疫原性
在10名个体(17％)中检测病毒血症，其中1人接受DEN-2、4人接受DEN-3、1人接受DEN-4和4人接受四价疫苗。没有检测到DEN-1病毒血症。尚未鉴定从四价个体分离的病毒的血清型。所有检测到的病毒血症均发生在第一剂量病毒后。奇怪的是仅3名四价受体发烧伴有病毒血症。所有病毒血症个体均产生中和抗体。1人没有产生IgM或IgG反应，即使伴有病毒血症。
表11总结了对单价接种的抗体反应。中和抗体比IgM和IgG更经常被检测到。通过IgM或IgG没有检测到血清转变，通过1∶10稀释度的PRNT50也未发现。当IgG存在时，第一次接种后14天有41％的IgM是阳性，到第21天是17％，到第30天是42％。通常到第一次接种后第30天IgM达到峰值。一个例外是在一个四价受体中，其IgM在第二次接种后3天达到峰值。IgM可持续3个月以上。对于单价血清型1、2、3和4，通过中和抗体的血清转变率分别为100％，92％，54％和58％。当存在时，通常到接种后第30天可检测到中和抗体。在0-30天间没有用于评估中和抗体的时间点。第二剂量疫苗使DEN-2 GMT加强4倍以上，用其他血清型未见到这种情况。2名DEN-3个体在第二剂量接种后发生血清转变，1人在1个月时，另一人在3个月时。在一个剂量后他们没有产生中和抗体。令人感兴趣的是，这两人的IgM/IgG模式表明在其第二剂量后发生二级反应，说明他们被第一剂量在免疫学上致敏了。
尽管对登革、SLE、JE和YF的血细胞凝集抑制检测是阴性，但被检测的53名个体中的5人(9％)产生二级抗体反应模式，IgM与IgG的比例为＜1.8。在接种前，所有5人对同源登革中和抗体均是阴性。这表明以前与黄病毒接触过。我们发现二级与初级抗体反应者间的平均RI没有显著差异(9.6对5.8，p＝0.19)。
有12名没有产生IgM/IgG或中和抗体的单价个体。1人接种DEN-2、6人接种DEN-3和5人接种DEN-4。该组抗体非反应者的平均反应原性指数不到1，这与2、3和4型中和抗体反应者的平均RI有显著差异。(0.9对4.9，p＜0.003)。
我们的研究包括25名黑人，31名高加索人。这两个种族的平均RI间没有显著差异。这是令人感兴趣的，因为有一些流行病学迹象表明在黑人中登革病要稍轻微一些。
 表11.IgM和PRNT50的单价疫苗血清转变率疫苗      第1剂量后由           第1剂量   第2剂量后由       第二剂量    通过如下两者测得
      IgM(+)PRNT50         GMT-1*    IgM(+)PRNT50    GMT-1      的累积血清转变
      测得的血清转变                   测得的血清转变                IgM      PRNT50DEN-1     10/12  12/12(100％)    668       0/2       -        513        10/12    12/12(100％)DEN-2     9/12   11/12(92％)     112       0/3       0/1      559        9/12     11/12(92％)DEN-3     4/13   6/13(53％)      15        2/9       1/7      16         6/13     7/13(54％)DEN-4     5/12   7/12(58％)      17        0/7       0/5      9          5/12     7/12(58％)YF17D     0/4    4/4(100％)      2935      -         -        -          0/4      4/4(100％)
*接种后30天所用的滴度，计算滴度负数所用的值
-＝未做
表12.四价疫苗受体的反应原性和免疫原性自愿者      疫苗方案          反应原性指数                 在下列给药后30天测的
         (月)                                              血清型中和抗体
                    剂量1    剂量2    剂量3      剂量1          剂量2        剂量333         0，1        16       0         -      1，2，3，4    1，2，3，4        -34         0，1        0        0         -          2            1，2           -35         0，1        4        0         -      1，2，3，4    1，2，3，4        -36         0，1        15       3         -          1            1，3           -37       0，1，4       2        0         0          1              1         1，2，338       0，4          35       14        -         1，2         1，2，3         -39       0，1，4       18       0         0       1，3，4         1，3      1，2，3，440       0，1，4       2        0         0          1              1          1，341       0，1，4       1        2         0          2              2       1，2，3，442         0，1        0        0         -          2            1，2           -
表13单价和多剂量四价的血清转变率
疫苗         DEN-1Ab      DEN-2Ab       DEN-3Ab     DEN-4Ab单价1个剂量       12/12        11/12         6/13        7/12四价1个剂量    7/10p＜.05   6/10 p＞.07   3/10 p＞.4   3/10＞.18四价2个剂量       9/10         6/10          5/10        2/10四价3个剂量       4/4          3/4           4/4         2/4
年龄、性别
表12表明来自10名四价疫苗个体的PRNT血清转变结果。前4名个体在0和1个月时接受两次接种。1人在第30天错过第二次接种，在第60天才接种。另6名个体在0和1个月时接种，如果反应不完全，在第4个月第3次接种。2名个体在一个剂量后对所有4种血清型均产生中和抗体。另2名四价受体在4个月的接种后对所有4种血清型产生血清转变。另2人产生三价反应。在1或2个月施用的第二剂量四价疫苗没有显著提高血清转变。这10名四价个体中对DEN-1、2、3和4的总血清转变率分别为100％、80％、80％和40％。实施例9
通过2-水平24因子设计一项研究来评估各血清型组分在四价疫苗中的相互作用。
给54名个体施用15个2剂量水平的各血清型的排列。结果列出图3。H，高剂量，表明未稀释的疫苗，在105-106pfu/ml之间；L，低剂量，表明未稀释疫苗以1∶30稀释，得到约103.5-104.5pfu/ml。
在0和1个月时，给6名个体施用全量四价疫苗。如果个体没有产生四价中和抗体反应，在4个月时给第三剂量。结果列于图4。
在0和1个月时给4人施用注射器混合的全量四价疫苗。终点是在第二次接种1个月后的临床安全性和中和抗体。在前4人中测定T细胞反应。结果列于图5。
结果表明在64名未免疫的美国自愿者中，发现四价疫苗(16种制剂)是安全的。反应原性是变化的。4种制剂在所有自愿者中均引发三价或四价中和抗体反应。与单价经历一致，在1个月时的第二剂量四价疫苗没有诱导显著的反应原性，而且也没有增强中和抗体反应。中和抗体反应的终滴定正在进行中。在没有中和抗体的情况下可以测定T细胞中的记忆γ干扰素反应。剂量间隔≥4个月可提高四价血清转变。
讨论
与历史上描述的用野生型登革的试验感染(Simmons等，1931，Manila Bureau of Printing)相比，这些疫苗在人中是减毒的。我们使用以自我报告的症状持续期间和严重性为基础的数字等级定量分析反应原性。所述方法有高估疫苗相关反应的倾向。理想的应是用自然登革感染验证。但是，RI不精确使我们能够合理比较个体和组间的症状。检测单价疫苗的结果表明在四种登革疫苗候选物中减毒程度是可变的。45AZ5 PDK20是减毒最少的，滴度最高，产生同样的血清转变。DEN-2候选物，S16803 PDK50相似地产生近100％血清转变，具有良性反应原性情况。Den-3和Den-4有低反应原性情况，但血清转变率仅为50-60％。应注意具有较低免疫原性毒株3和4型的剂量比1和2型的剂量低10倍。
第二剂量的病毒与显著的几乎没有的反应有关。但是，在1或3个月时第二剂量的单价疫苗的益处很小。Den-1和2型已经接近始终如一免疫原性，以致再接种是多余的。然而，Den-2的GMT被加强4倍以上。这可能是第二剂量后低水平病毒复制的证据或者所述剂量含有足够的可引发加强反应的抗原物质。用17D YF第二次接种也见到这种中和抗体反应模式。(Wisseman，1962，Am J Trop Med Hyg 11，570-575)。第一剂量的Den-3可能使2名单价个体致敏，其在第二剂量后产生血清转变，具有二级抗体反应模式。这表明我们的中和抗体检测可能不够敏感而不能检测到对3型疫苗候选物的适宜免疫反应。第二剂量没有增加任何对4型的新血清转变者。按照检测剂量和方案，施用第二剂量单价DEN-1或DEN-4没有明显的其他益处。
对单价疫苗没有产生中和抗体反应的12名单价个体也没有可测量的登革IgM或IgG反应。所有这些非反应者接受来自在其他个体中明显复制的相同小瓶中的活病毒。他们对接种没有产生反应。因此，所有迹象表明没有在这些个体中发生病毒复制的证据。这种非反应机制尚不清楚。可能是缺少感染所必需的宿主底物或有效的先天免疫的结果。
按照绕过病毒干扰的策略，多剂量值在与活减毒疫苗结合时更清晰可见。这里各组分的剂量以及给药间隔可能很重要。当组合施用登革病毒时，干扰和增强可能发生。4名个体对所有4种血清型产生中和抗体，2人在第一次给药后，2人在4个月第三次给药后。在第4个月接受再接种的5名自愿者中的4人对3种或多种血清型发生血清转变。这种差异的解释可能是在接种后1个月有足够的交叉反应性中和抗体抑制了疫苗中异型病毒的复制。Sabin发现当人个体接受一种血清型病毒时，这种暂时的交叉保护持续达3个月。(Sabin，1959，Viraland Rickettsial Infections of Man.Philadelphia：JB LippincottCompany)。我们未来的四价研究将施用0、6个月接种方案。
DEN-3和4的差免疫原性可能是与DEN-1和2相比，105pfu/ml剂量Den-3和Den-4是复制不利的，DEN-1和2在四价制剂中均是106pfu。我们探索其他生产方案以提高DEN-3和DEN-4的滴度。
没有检测所有4种病毒在四价反应者中的病毒血症的情况下，人们不能肯定存在中和抗体就必然意味着复制了所有4种血清型。测定的中和抗体可能是交叉反应性的并且是低亲合力的。通过观察各血清型抗体的长期存留可解决该问题。可用灵敏的和血清型特异性RT-PCR检测确定多价病毒血症作为病毒复制的证据。
在第一次接种后，仅有2名四价接种者对所有4种血清型产生中和抗体。对四价疫苗的所述不完全反应产生有关在与毒性异源血清型接触中发生登革出血热危险的问题。如果抗体依赖性增强是DHF的病理学机制，那么甚至当通过接种引发所有四种血清型抗体时危险也可能存在，但一种或多种血清型抗体有差别地减小至低于中和阈值。我们报告如下，TH1 T细胞反应在这些四价疫苗，甚至不存在中和抗体的情况下也可测量到。这样是否足以提供保护？这些问题可能只有通过在流行地区仔细地长期现场试验四价疫苗才能回答。
结论是，我们的结果表明四种血清型是可变的反应原性的，而1型单价疫苗比2、3和4血清型更强。血清型1和2引发＞90％的中和抗体，而血清型3和4具有较低的免疫原性。四价组合是安全的、合理的很耐受的，并在10名个体中的4人中诱导了针对所有4种血清型的中和抗体。以1或2个月的给药间隔接种时，2剂量的四价疫苗没有提高血清转变率。4个月以上的较长给药间隔可提高血清转变率。实施例10
用于对登革疫苗T细胞反应的材料和方法
个体.35名年龄在18-50岁的健康成年自愿者(21名男性，14名女性)参加了I期临床试验，该试验由Walter Reed Army Institute ofResearch完成，使用候选登革病毒疫苗。基于在循环系统中不存在抗黄病毒抗体从一组自愿者中筛选参与者。其他筛选标准是基于体检和对调查表反应具有HIV阴性状态和良好的健康状态。
疫苗组.30名个体随机接受2剂量的活减毒单价疫苗；4人接受2剂量的活减毒四价疫苗。1名单价受体(自愿者ID 1)在仅接受了第一次给药后即退出了研究。接种前，任何自愿者对1-4型登革病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒或黄热病病毒均没有可检测的血细胞凝集抑制血清抗体。按0.5ml皮下注射未稀释的病毒施用每个剂量。
PBMC收集在0天，以及在第一次给药后第二次给药前5个时间点(第3、7、9、14、28/30/31/60或91天)，通过静脉穿刺从每个自愿者收集外周血细胞(8ml)到Vacutainer细胞制备管(CPT)[BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ]中。再在第二次给药当天和其后4个时间点(第二次给药后3、7、9和14天)收集血液。第二剂量的给药时间取决于自愿者，因此是在第一剂量后约1-3个月。由于自愿者日程安排的变化，因此收集时间也有1个月左右的变化。通过以1000xg离心30分钟从全血中分离细胞。收集PBMC(在CPT试管中的凝胶上的细胞层)，然后用Hank′s平衡盐溶液(Life Technologies，Rockville，MD)洗涤2次，同时以500xg离心。将分离的PBMC重悬在4ml(每CPT试管)细胞冷冻介质(Cell Freezing Media)/DMSO(Sigma，St.Louis，MO)中，然后以1ml小样于-70℃冷冻过夜。然后将PBMC转移到液氮蒸气相长期贮存。
疫苗病毒.将上述下列活减毒登革病毒株用于单价疫苗：45AZ5PDK20(DEN1)、S16803PDK50(DEN2)、CH53489(DEN3)、341750PDK20(DEN4)。四价疫苗是所有这四种病毒株的等量混合物。
细胞培养病毒.将下列在Vero细胞中繁殖的登革病毒在培养中用于PBMC刺激：Westpac 74(DEN1)、S16803(DEN2)、CH53489(DEN3)和TVP360(DEN4)。所有四种血清型均是由Dr.Robert Putnak以1ml样品提供的，于-70℃贮存直到使用。病毒滴度为30-2.4×106pfu/ml。
PBMC的大量培养和用活病毒刺激.从液氮贮藏中取出PBMC的冷冻小瓶，在37℃缓慢融解。用RPMI培养基1640(Life Technologies，Rockville，MD)将PBMC洗涤2次，然后悬浮在含10％人男性AB血清(Sigma)加补充物[青霉素(100U/ml)-链霉素(0.1mg/ml)-fungisone(0.25mg/ml)[Sigma]，2mM L-谷酰胺(Life Technologies)和0.5mM 2-巯基乙醇(Sigma)]的完全培养基中。以2.5×106细胞/ml的浓度悬浮细胞。有些检测要求3.25×106细胞/ml。将PBMC(100ml)加到96孔V底平板(Costar，Acton，MA)的每个孔中。将用10％完全培养基稀释的浓度为3000-24000pfu/100ml的等体积登革病毒1、2、3或4加到各孔中。对照孔加入等体积的无病毒培养基。然后将细胞在37℃5％CO2中培养4天。
免疫检测
完成化学发光免疫检测以确定培养4天结束时组织培养上清液中分泌的淋巴因子数量。将96孔免疫检测平板，Microlite 2(DynatechLaboratories，Inc.，Chantilly，Virginia)用50ul/孔10mg/ml在0.1M碳酸氢钾缓冲液中的未标记的抗淋巴因子(IL-4，IL-10或干扰素γ)抗体(Pharmingin San Diego，CA)包被过夜。洗涤平板，1小时内加入100μl I-阻断缓冲液(Tropix，Bedford，MA)。标准(重组IL-4，IL-10和干扰素γ，Pharmingen，San Diego，CA)用起始浓度为10ng/ml的I-阻断缓冲液预稀释。将标准稀释8-3倍。将样品、对照和标准用等体积I-阻断缓冲液稀释。将50μl样品加到各检测平板中。样品在室温下温育1小时。洗涤平板。将二级生物素化抗体用I-阻断缓冲液以1∶1000稀释，然后以50μl/孔加到检测平板中。洗涤平板，将50μl/孔抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(Avidix AP，Tropix，Bedford，MA)加到检测平板中。将平板在室温温育1小时。将洗涤的平板与检测缓冲液(Tropix)温育2次，每次1分钟。将CDP Star底物(Tropix)加到各孔(100μl/孔)中。10分钟后，在MD2250发光计(Dyatech，Chantilly，VA)上对平板读数。用改变的方法检测第一种样品。不用使用抗生物素蛋白-碱性磷酸酶的检测步骤，而使用抗生物素蛋白-水母发光蛋白(Sealite Sciences，Atlanta，GA)。在研究过程中，该材料无法得到，因此修改了该方法。用标准和对照样品的两种检测方案中结果相同。
血清型交叉反应性.为了检测血清型特异性，将在第42、45或105天从所筛选的单价减毒疫苗(见结果)受体收集的PBMC在独立的培养中用各血清型病毒刺激4天，@250,000细胞/孔。然后用化学发光淋巴因子ELISA分析培养上清液。
T细胞亚群消耗.为了检测淋巴因子生产的具体细胞源，在刺激前PBMC被消耗了CD3+或CD8+T淋巴细胞。将所选的PBMC用RPMI培养基1640洗涤2次，然后以3.25×106细胞/ml悬浮在5％完全培养基(用30％以上的PBMC作为输入量以补偿消耗过程中的细胞损失)中。对于负消耗(negative depletion)，将细胞(650,000 PBMC)与洗涤的抗体包被的磁珠一起温育。使用两种磁珠，M-450抗CD3和抗CD8珠(Dynal，Oslo，Norway)。以5.2×106颗粒/试管的浓度使用抗CD3珠，得到比例为约20∶1的珠∶靶细胞。以4.0×106颗粒/试管的浓度使用抗CD8珠，得到比例为约31∶1的珠∶靶细胞(DYNABEADSTM(Dynal)在1.5ml微离心试管中)。将细胞在4℃温育30分钟，同时适度搅拌。用非消耗的PBMC作为对照。用MPC-2磁颗粒浓缩器(Dynal)从细胞混合物中除去标记的细胞。将CD3+和CD8+阴性筛选的PBMC转移到新鲜的微离心试管中。为了除去残留的未结合的细胞，将浓缩的Dynabeads用200μl完全培养基洗涤1次。转移后，将终体积(400μl)等分到96孔V底平板的2个孔中。4天后用化学发光淋巴因子ELISA分析消耗的和对照PBMC培养上清液。另外，检测培养的PBMC的细胞内粒酶B mRNA(见下文)。类似地完成CD4+消耗，但在用M-450CD4+(28.6ml/4.004×106颗粒，约31∶1珠∶靶细胞)dynabeads刺激后完成分离。仅分析CD4+阴性筛选的PBMC的细胞内粒酶B mRNA。
流式细胞计数.在随机筛选的未刺激的PBMC种群(非消耗的对照和CD3+或CD8+消耗组)双染色后用FACS分析消耗效率(测定为％消耗)。将细胞与PE标记的抗CD4+或抗CD8+和FITC标记的抗CD3+抗体(Becton-Dickinson)一起在4℃温育30分钟。然后在分析前，将标记的PBMC用荧光缓冲液[PBS(Sigma)，0.05％叠氮化钠，1％胎牛血清(Summit Biotechnology，Boulder，CO)洗涤3次并保存在荧光固定剂[PBS，1％福尔马林，0.05％叠氮化钠]。用CD4+Dynabeads未测量到消耗效率。
粒酶B检测.用野生型病毒刺激4天后，检测非消耗的对照PBMC和T细胞亚群消耗的PBMC的细胞内粒酶B mRNA。使用在96孔平板中的反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。
用″Straight A′s″mRNA分离系统(Novagen，Madison，WI)完成mRNA纯化。离心并除去用于淋巴因子ELISA分析的PBMC培养上清液后，将沉淀的PBMC用含二硫苏糖醇的200μl/孔溶解缓冲液溶解，然后与200mg/孔经洗涤的寡聚dT磁珠一起在室温温育30分钟。用8体积洗涤缓冲液，用MPC-96(Dynal)磁颗粒浓缩器彻底洗涤除去DNA、蛋白质和细胞碎片后，将mRNA在70℃用200μl/孔H2O洗脱20分钟。将洗脱液转移到1.5ml微离心管中，用另外200μl/孔水完成第二轮洗脱。将400μl洗脱液接下来用50μl 3M醋酸钠(pH5.2)、20mg糖原(Novagen)和300μl异丙醇沉淀。用70％冷乙醇最后洗涤后，将mRNA沉淀悬浮在30μl水中。
在96孔平板中完成RT-PCR步骤。对应于人粒酶B外显子(CTLA-1)并扩增120bp区域的寡核苷酸引物(22bp)是由Dr.SmartCohen在Walter Reed Army Institute of Research合成的。该引物有下列序列：grb2a(有义)5′AGC CGA CCC AGC AGT TTA TCC C(SEQID NO：1)，grb2b(反义)5′C TCT GGT CCG CTT GGC CTT TCT(SEQID NO：2)。
对于各反转录酶反应，总反应体积为40μl，包括下列组分：MgCl2(5mM)，10X缓冲液II(10mM Tris HCl，50mM KCl，pH8.3)，dNTP(各1mM)和RNase抑制剂(40单位)[Perkin Elmer，Norwalk，CT]AMV反转录酶(10单位)[Siekagaku]，grb2b引物(3pmoles)，sH2O和4ml的mRNA模板。RT温育步骤在9600热循环仪(Perkin Elmer)中完成，参数为在42℃(90分钟)，99℃(5分钟)，4℃(无期限)。对于各PCR，总反应体积为50μl，包括下列组分：MgCl2(2mM)，10X缓冲液II(与上述相同)，dNTP(各.4mM)，amplitaq gold(1.25单位)，grb2a和grb2b引物(各1pmole)，sH2O和5μl cDNA模板。也在9600热循环仪中完成PCR温育步骤，参数为在95℃开始变性/酶激活(10分钟)，30个循环：[95℃变性(30秒加10秒间隔时间(ramp))/60℃退火(30秒加30秒间隔时间(ramp))/72℃延伸(30秒加30秒间隔时间(ramp))]，72℃最后延伸(7分钟)，4℃(无限期)。
用电泳，在溴乙锭染色的2％琼脂糖(SeaKem)/1X TAE(Tris-乙酸盐-EDTA)凝胶上分离最后的扩增PCR产物(10μl)，然后用数码照相机(Scientific Imaging Systems，New Haven，CT)分析。
据分析如果可以证明对加强剂量的活疫苗的加强反应，则就可以使用更多的减毒活病毒。加强反应是抗体和T细胞反应均加强。
尽管已测定了对登革疫苗的T细胞反应，但T细胞反应的测量比抗体反应的少。因此对针对使用活登革疫苗的T细胞反应了解不太多。本研究的一个目的是按照T辅助细胞反应、血清型特异性和细胞毒潜力确定T细胞针对所述疫苗的反应的性质。
针对这些疫苗占优势的T细胞反应是Th1反应。这是通过在4天培养中由活登革病毒刺激的外周血单核细胞(PBMC)分泌γ干扰素而确定的。γ干扰素是由CD3+CD8-T细胞分泌的。所述T细胞反应是登革病毒血清型特异性的，并具有一些交叉反应性反应。记忆反应在一些个体中被注意到，但在另一些人中没有。
登革刺激的细胞分泌淋巴因子
用活登革病毒刺激PBMC培养物。培养中所用的刺激病毒的血清型与疫苗病毒的血清型相同。4天后，检测组织培养上清液中是否存在γ干扰素、IL-4和IL-10。在所有培养物中，IL-4和IL-10一致是阴性的。用两种检测对照确保检测正确进行。首先，标准曲线用重组淋巴因子，第二，使用对照样品以确保在存在组织培养上清液的情况下可检测到淋巴因子。
与IL-4和IL-10的负表达相反，在数个培养上清液中检测到高水平的γ干扰素。图6表明从接受单价疫苗的自愿者中收集的细胞的γ干扰素表达动力学。总而言之，最高的γ干扰素反应是从登革1和2型候选疫苗的受体中收集的PBMC产生的，尽管少数登革3和4型受体也有较高的反应。到第一次接种后第14天可偶然检测到γ干扰素，但常常直到正好在第二剂量给药之前或之后才能检测到γ干扰素的表达。因此，分泌动力学远比预期的慢。就在该研究中对单价受体的加强反应看，没有一致的模式。根据个体，在第二剂量给药后，γ干扰素水平或者提高或者降低。
在所有收集时间点来自所有自愿者的未刺激的PBMC表明没有可检测水平的γ干扰素。第0天刺激的细胞的平均表达为127pg/ml，标准偏差为230pg/ml。
对于单价疫苗受体，有16名阳性和14名阴性γ干扰素反应者(平均±3标准偏差)。30名单价疫苗受体中的16人在至少1个时间点PBMC培养物中的干扰素g结果＞1000pg/ml。12人＞1000pg/ml的干扰素g分泌持续2或更多个连续时间点。另外，30人中的12人在检测的最后时间点分泌＞1000pg/ml。
4名自愿者接受四价疫苗(所有四种单价病毒株的等体积混合物)。图7表明了从这些四价受体收集的PBMC的γ干扰素生产。用四种登革病毒中的一种在不同培养物中刺激PBMC。来自自愿者#33和#36的PBMC在用四种血清型每一种刺激后的至少一个时间点分泌显著量的γ干扰素，＞1000pg/ml。来自自愿者#35的PBMC应答四种血清型中的3种(没有登革3型)分泌显著量的γ干扰素。来自自愿者#34的PBMC应答登革2型病毒分泌显著量的γ干扰素。最高反应明显是对DEN1和2。在四价疫苗受体中γ干扰素生产动力学延迟，与在单价自愿者中的一样。只有恰在第二剂量接种前和之后检测到高水平γ干扰素。就加强反应看，与单价受体一样，在第二剂量给药后没有一致的γ干扰素分泌模式。
总的来看，这些结果表明在单价和四价疫苗受体中的优势T淋巴细胞反应是抗原特异性的Th1反应。实施例11
血清型交叉反应性.检测来自12名单价疫苗受体的PBMC是否存在登革血清型特异性和交叉反应性反应。根据动力学，选择在最后时间点(最后收集当天之后)上PBMC培养上清液中分泌＞1000pg/ml γ干扰素的那些个体。来自最后收集当天的PBMC在独立培养中用每种登革血清型刺激4天，然后分析培养上清液中γ干扰素。尽管有一些血清型交叉反应型，但在用与原接种相同的血清型病毒刺激的PBMC中总是发现最高反应(表14)。因此，来自所选的单价疫苗受体的PBMC中的γ干扰素反应是登革血清型特异性的。
交叉反应是血清型特异性反应的一半(或更低)。对于登革2型受体，最高交叉反应是与登革4型病毒。对于登革4型疫苗受体，最高交叉反应是与登革2型病毒。对于登革1型疫苗受体，交叉反应是变化的。在该组中只有1名登革3型疫苗受体，反应是血清型特异性的。
表14.从单价疫苗受体收集的PBMC的血清型特异性和交叉反应性γ干扰素表达。将从接受单价减毒登革疫苗的个体收集的PBMC在培养中用四种登革病毒血清型每一种分别刺激。根据在其他检测中γ干扰素生产至少为1000pg/ml来筛选细胞亚型。血清型特异性反应总是最高，但是也注意到交叉反应。结果表示为(pg/ml)上清液中的γ干扰素。
  自愿者   血清型    登革1    登革2    登革3    登革4
    4101 516222931112031213     111111122344     1030648163173154616837569079701239445     202580512000051756101019871391     4194215250159260960850714106711     12973050647002610962044104818
实施例12
T细胞亚群消耗.为了证实这是Th1反应，确定分泌γ干扰素的细胞的性质。这是通过培养前消耗T细胞或T细胞亚群完成的。本研究所用的细胞是用密度梯度离心从全血中分离的混合的PBMC。PBMC种群中的优势细胞包括T细胞、B细胞、单核细胞和NK细胞。为了进行该评估，我们根据13名单价和3名四价自愿者的动力学选择最高γ干扰素反应时间点。
用免疫磁细胞分离法从PBMC中除去细胞。用实验性消耗中的流式细胞计数评估消耗效率。由于可得到的数量少，因此没有分析培养的PBMC。在实验性消耗中，用CD3单克隆抗体除去CD3+细胞导致相对于非消耗的PBMC对照，CD3+细胞减少92％。用CD3和CD4双标记、CD3和CD8双标记和CD3单标记监测CD3消耗。CD4+细胞对CD3的消耗比CD8+细胞更彻底，在CD3消耗组中，98％的CD3/CD4 T细胞被消耗，90％的CD3/CD8细胞被消耗。用CD8单克隆抗体除去CD8+细胞导致CD8+细胞减少99.9％。
所选的PBMC被消耗掉用登革病毒在培养4天中刺激的CD3+或CD8+T淋巴细胞，然后检测分泌的γ干扰素。将结果与同时培养的非消耗的PBMC对照进行比较。在刺激前未消耗CD4+T淋巴细胞，因为其他细胞种群需要CD4+T辅助生产γ干扰素。
如表15所示，在培养前除去CD3+细胞实质上减少了γ干扰素生产。在CD3+消耗后γ干扰素减少的程度为59-100％。在某些CD3+消耗培养中见到减少但显著的γ干扰素生产。这种残留的生产表明要么免疫磁细胞分离后残留的CD3+少量细胞仍分泌γ干扰素和/或另一细胞种群也分泌γ干扰素。
表15.分泌(或诱导分泌)γ干扰素的淋巴细胞是CD3+CD8-T细胞。用免疫磁细胞分离技术负消耗所选的淋巴细胞亚群。剩余的细胞用活登革病毒刺激4天，然后检测培养上清液的γ干扰素。培养前消耗CD3+淋巴细胞对γ干扰素的生产产生负面影响。
    对照         CD3消耗          CD8消耗
  自愿者34101112131516172022293133T35T36T   γ干扰素(pg/ml)88330844295525100005977136518615764614130324789952393100003542   γ干扰素010381781881017385255844213293953709202469    ％改变100665983909481959371899963999887   γ干扰素565555942716331000083921910211312654235134956813057211496373257    ％改变36[80]0.6[21]0[40][40][14][120]8[3.5][129][207]1248
除在1名个体中外，培养前除去CD8+细胞没有减少γ干扰素的生产。在16个培养物中的9个，除去CD8+细胞实际上提高了其生产，可能是由于除去了这些细胞的抑制作用或者减少了由CD8+细胞毒淋巴细胞对感染的抗原呈递细胞的杀死。
总之，这些结果表明在这些PBMC培养物中的γ干扰素要么是由CD4+T淋巴细胞分泌的和/或由CD4+T淋巴细胞影响的细胞分泌的。这一结果支持了Th1反应的发现。实施例13
粒酶B.Th1反应尤其与细胞毒淋巴细胞反应有关。试图努力发现在这些疫苗自愿者中是否存在能够介导杀死的细胞，在用于消耗试验培养的PBMC中测定粒酶B mRNA。取出用于淋巴因子分析的培养上清液后，将细胞沉淀、溶解以提取mRNA。用粒酶B特异性引物进行RT-PCR。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。使用用于比较的参考相片(图8)将凝胶带强度转变成+、-等级。将来自7名自愿者的额外细胞在无病毒的情况下培养。来自这些自愿者的未刺激的PBMC几乎没有(-或+)粒酶B mRNA表达。用抗原特异性刺激，在所选的所有16名疫苗受体中，表达基本上都是上调的(图8)。用CD8单克隆抗体的T细胞亚群消耗相对于对照pBMC没有显著降低粒酶B的表达。有3名个体(ID 16、22和33)其在CD8消耗组中的粒酶B表达降低。在1人(ID 33)中，降低是实质性的。相反，用CD3单克隆抗体的T细胞亚群消耗在14名自愿者中均降低了表达。在8名单价自愿者和所有3名四价自愿者中，降低是实质性的。4名γ干扰素非反应者中也检测了粒酶B mRNA。所有结果均表明了低水平表达(数据未列出)。
在来自7名自愿者的细胞中，在培养4天后发烧用CD4单克隆抗体消耗T细胞亚群。在培养后进行消耗以便给培养过程中需要帮助的所有细胞提供T辅助活性。在分析的7名自愿者中，刺激后除去CD4+细胞相对于非消耗的对照不会影响粒酶B表达。因此，尽管存在由CD4+Th1细胞介导的抗原依赖性粒酶B生产，但生产粒酶B的实际细胞可能是T细胞以外的细胞。尚不知道是NK细胞还是巨噬细胞。
讨论
该研究的两个目的是确定在疫苗受体中是否有可测量的T细胞反应以及是否可见到对第二剂量疫苗的细胞介导的反应。为了达到这些目的，通过再刺激在两个剂量左右的间隔收集的细胞来测定T细胞反应动力学。用活病毒再刺激在研究过程中收集的大量PBMC培养物。
该研究的第三个目的是确定以下T细胞反应的性质：1.由淋巴细胞所有组成成分限定的细胞类型，2.登革血清型特异性和交叉反应性应答，和3.测量细胞毒潜力、粒酶B生产的量度。用来自单价和四价疫苗受体的PBMC测定这些反应。就四价疫苗受体而言，重要的是确定是否可检测到对所有四种血清型登革病毒的反应。
可将人和小鼠T辅助反应根据其淋巴因子表达方式分成2组。T辅助1(Th1)细胞的特征在于分泌IL-2和γ干扰素。在这两种淋巴因子中，就鉴定Th1细胞而言，γ干扰素最重要。T辅助2(Th2)细胞的特征在于分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。在细胞的混合种群或者PBMC大量培养物中，两种分泌模式之一通常占优势。
影响Th1对Th2反应的一种因素是攻击感染的性质。病毒感染，和一些细菌感染例如李司特氏菌属和分枝杆菌属(Peters，1996，Hepatology 23，909-916)常诱导Th1反应，而一些寄生虫感染会诱导Th2反应(Conrad等，1990，J Exp Med 171，1497-1508)。在感染过程中，两种反应的比例可能改变。例如，尽管病毒感染通常是从Th1反应开始，但在感染后期也可产生Th2反应。开始的Th1反应可能增进CTL反应，并指导免疫球蛋白同种型转换，而随后的Th2反应会增进B细胞的抗体生产。
在天然登革感染中，一项研究表明在大多数个体中是Th1反应。Th1反应与有效的免疫反应有关，而与严重的发病机理无关。相反，有些个体产生与更强致病性有关的Th2反应。
尽管Th1反应与有效的抗登革免疫反应有关，但Th1反应的关键淋巴因子γ干扰素对免疫反应有正面影响又有负面影响。在泰国，Kurane发现在DHF患者的血清中有高水平的γ干扰素，而在DF患者的血清中则γ干扰素水平较低(Kurane等，1991，J Clin Invest 88，1473-1480)。γ干扰素的增加可作为免疫激活的指标。需要激活γ干扰素并保持细胞毒细胞的激活(CD4+T细胞，CD8+T细胞和NK细胞)。尽管该机制可能引起严重感染中的发病，但通过抗原特异性细胞溶解而减少病毒感染的细胞数量，这样一些反应在轻微的感染中可能是有益的。最近的α、β和γ干扰素缺陷型的小鼠剔除模型说明了γ干扰素在控制登革病毒感染方面的积极作用。剔除小鼠对登革病毒的致死感染是敏感的，而正常成年对照对感染是有抗性的(Johnson和Roehrig，1999，J Virol 73，783-786)。
或者，γ干扰素可能引起登革病毒感染的发病。发病的一种机制可能是由于提高了一种主要靶细胞，巨噬细胞的感染而导免疫原性提高引起。在培养中，γ干扰素通过提高巨噬细胞表面上的Fc受体数而提高了所述细胞的抗体介导的感染(Kontny等，1988，J Virol 62，3928-3933)。尽管用正常培养的巨噬细胞的另一项研究表明有降低感染的相反影响(Sittisombut等，1995，J Med Virol 45，43-49)。考虑这些冲突结果，不清楚γ干扰素是否有助于增加巨噬细胞的感染。
在该研究中，Th1反应是优势反应。IL-4和IL-10的检测始终是阴性，表明没有TH2反应。在许多培养上清液中检测到高水平的γ干扰素，这表明在这些培养物中存在Th1反应。
由于刺激的细胞是全PBMC，因此需要确定分泌γ干扰素的细胞。这可以通过用免疫磁方法消耗T细胞亚群来完成。在培养前，用识别CD3或CD8的抗体进行负消耗。由于CD3消耗导致γ干扰素分泌的取消，而CD8消耗不会，因此可以得出结论CD3+CD8-淋巴细胞是分泌γ干扰素的细胞种群或者至少是控制γ干扰素分泌的细胞种群。这证实了γ干扰素是Th1反应的结果。在消耗后某些培养物中残留的γ干扰素可能是由于在消耗后有些剩余的CD4+T淋巴细胞或者在培养物中有其他细胞，可能是天然杀伤细胞或巨噬细胞。
峰γ干扰素反应是血清型特异性的。当用四种血清型登革病毒中的每种分别刺激来自单价疫苗受体的细胞时，峰γ干扰素生产响应与疫苗病毒同源的登革病毒的刺激。其次，注意到在数种培养物中有应答其他登革病毒的交叉反应。这与其他人用不同测量方法即淋巴细胞增殖得到的结果类似。在一项研究中，来自接受登革2型病毒的个体的细胞对登革2型病毒有最大反应，但也注意到交叉反应(Dharakul，JInfect Dis 170，27-33)。这证实在克隆水平上，得自登革3型疫苗受体的大多数克隆对登革3型抗原应答最好，但对另3种登革抗原有交叉反应(Kurane等，1989，J Exp Med 170，763-775)。后者研究的结论是初次登革病毒感染产生占优势的交叉反应性CD4+淋巴细胞反应(增殖和产生γ干扰素)。
在该研究中，单价疫苗受体的PBMC的交叉反应性应答通常是血清型特异性反应的一半或更少。在四价疫苗受体中，应答各血清型登革病毒的γ干扰素分泌在4名四价疫苗受体中的3人中是显著的。反应在各疫苗受体内的变化足以使得不可能确定较低的反应是血清型特异性反应还是交叉反应性应答。
由γ干扰素分泌表明的T细胞激活动力学比预期的慢。在一些情况下，到第14天才可以检测到反应。但是，在大多数情况下，直到恰在第二剂量疫苗给药前才检测到反应。不清楚什么原因引起延迟的动力学。一种解释可能是由疫苗病毒感染的细胞所进行的抗原生产慢且持续。但是，同样可能所述方法优先检测到记忆反应而不是急性反应。例如，如果活性CD8+细胞抑制在早期感染过程中收集的PBMC中的CD4+反应，则可检测的反应就会减弱。在其中消耗CD8+淋巴细胞的培养中，由剩余淋巴细胞进行的γ干扰素分泌在一半以上的培养物中得到提高。这种抑制作用在早期感染中可能更强。
其他人已观察到更敏锐的淋巴因子生产动力学。在用减毒登革疫苗接种后17天内检测血清淋巴因子包括血清γ干扰素。在该研究中注意到急性反应，在病毒血症发生时达到峰值(Kurane等，1995，J ClinLab Immunol 46，35-40)。
对第二剂量的反应是混合型的。有些个体表现出γ干扰素生产增加，而其他人则降低。在第二剂量前从疫苗受体收集的细胞所进行的γ干扰素生产很高以致于可能掩盖了对第二剂量的任何记忆反应。另外，后期γ干扰素反应可能使对记忆T细胞反应的测量更加困难。很清楚有些个体应答第二剂量。这可以表明存在活性免疫反应的情况下，有一些局域化的病毒生长。
总之，对施用这些活减毒登革病毒的优势T细胞反应是Th1反应。通过再刺激从疫苗受体收集的PBMC而分泌γ干扰素表明了这一点。在再刺激后，来自疫苗受体的细胞的PBMC培养物均没有显著分泌IL-4或IL-10至培养上清液中。通过表明CD3+CD8-淋巴细胞分泌γ干扰素可证实Th1反应。Th1反应主要是登革血清型特异性的，但也有较小的交叉反应。实施例14
在有免疫力和易感自愿者中用登革病毒作为攻击毒株进行临床和免疫学评估
该研究的主要目的是在易感和免疫自愿者中表征4种候选登革攻击病毒中每种的临床反应以判断其作为攻击毒株用以进行人疫苗效力研究的适宜性。所述研究的第二个目的是就抗登革热保护的免疫相关性提出假设。
剂量、方案和途径：所有自愿者将接受4种登革攻击病毒中的任一种或安慰剂，在研究第0天在三角肌区域皮下施用一个剂量0.5ml。
研究组：
自愿者组#1(易感的)：接受DEN-1、DEN-2、DEN-3、DEN-4或安慰剂。
自愿者组#2(有免疫力)：接受DEN病毒(血清型对应于先前接受的疫苗)或安慰剂。
一般合格标准：年龄18-35岁，健康状况很好，没有任何慢性病，在书面研究理解考试的分数＞75％，本人同意，研究期间可以找到，来自上级的同意参与的信(仅部队)，应答以前登革接种的血清转变(仅#2组自愿者)。
统计学：由于在各试验项目组只有少量自愿者，该小规模研究中的数据分析主要是描述性的。主要关心与安慰剂组相比，4个研究组记录临床事件的频率(预先说明的和未预料到的)。
发生登革热的所有被攻击自愿者的攻击前免疫测量结果和攻击后免疫反应将与仍保持良好的所有被攻击自愿者的数据进行比较，以发展有关保护免疫相关性的假设。
人登革攻击模型的应用：与大多数历史上设计用来表征登革病或评估活疫苗候选病毒的减毒作用的人登革攻击试验相反，本攻击研究想要达到的目的是：1)验证4种登革病毒在黄病毒首次用于其中的自愿者中作为攻击毒株(自愿者组#1)，和2)鉴定单型登革疫苗受体当随后用同型登革病毒攻击时的免疫相关性(自愿者组#2)。
如果在自愿者组#1中的临床反应表明这些毒株适用于攻击，则在未来受控制的试验中，将会将这些攻击毒株施用给登革疫苗候选病毒的受体或安慰剂受体以筛选最有潜力的疫苗候选病毒进行进一步开发。
如果在自愿者组#2中的免疫反应表明攻击前免疫的某些方面(抗体和/或T细胞记忆)与保护作用有关，则所述保护相关性可能会简化登革疫苗的开发。
鉴定作为攻击毒株的待测登革病毒的确定标准：适宜的登革攻击病毒将1)在自愿者组#1中可再现地引起持续3-7天的无并发的登革，2)按照Good Manufacturing Practices(GMP)生产且没有外来物质或反应原性非病毒组分，和3)可以足够的数量作为冻干病毒获得(＞100剂量)。攻击病毒包括失活的DEN-1 45AZ5(PDK-0)、DEN-2 S16803(PDK-10)、DEN-3 cl 24/28(PDK-0)、DEN-4 341750(PDK-6)(PDK＝初级狗肾细胞)。
各攻击病毒的剂量以噬斑形成单位(pfu.)计为0.5x滴度。
所述研究用攻击病毒符合后两项标准。该研究的目的是说明所述研究用候选攻击病毒株符合第一条标准。我们有一些证据表明本研究中的4种待测登革病毒的致病性是适当的。已经表明DEN-1和DEN-3攻击病毒在自愿者中引起无并发的发热。尽管在本研究中施用的DEN-2和DEN-4攻击病毒在自愿者中未试验，但相信它们是致病性的，因为它们是因在自愿者中引起发热病而被拒绝的登革病毒疫苗候选物的前体。拒绝4种研究用候选登革攻击病毒任一种的唯一原因是它们是否会在黄病毒首次用于其中的自愿者(自愿者组#1)中不引起病或者在任何自愿者中引起过分的疾病(自愿者组#1和#2)。
自愿者组#1：使10名健康的黄病毒首次用于其中的自愿者随机用4种血清型(每种血清型2名自愿者)中的1种进行登革病毒攻击或接受安慰剂。自愿者和研究人员对接种物都不知道。我们预期接种登革攻击病毒的8名自愿者将会发生中等程度的疾病，发烧3-7天，严重头痛和肌痛。从疾病发作到完全恢复可能需要14天。根据2名受体的临床反应将会认为每种攻击病毒均是适宜的，而且所述病毒必须满足登革的研究定义。登革的定义为：一种有如下2种或多种下列症状的疾病：头痛、肌痛、红斑皮疹、眼眶后疼痛、关节痛以及持续发烧48小时或者更长使得需用扑热息痛退热，以及在发烧过程中和此后数天有组织反应，表现为中性白细胞减少或血小板减少或者肝损失，以及发烧过程中登革病毒血症的迹象。
自愿者组#2：多达12名年轻、健康的免疫自愿者将接受同型登革攻击病毒(N＝10，不考虑血清型)或者安慰剂(N＝2)。免疫自愿者是预先的单价、活减毒登革疫苗受体，它们有初级中和抗体反应。预期免疫自愿者将保持良好的状态。其攻击前免疫状态或攻击中免疫激活的测量结果将说明保护作用的相关性。
                          序列表<110>沃尔特里德军事研究院(WALTER REED ARMY INSTITUTE OF RESEARCH)<120>多价登革病毒疫苗<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>引物<400>1agccgaccca gcagtttatc cc                                  22<210>2<211>22<212>DNA<213>引物<400>2ctctggtccg cttggccttt ct                                  22

Claims (16)

1.免疫原性组合物，包括在生理学上可接受的载体中的选自登革-1、登革-2、登革-3、登革-4的一种以上减毒登革病毒。
2.根据权利要求1的免疫原性组合物，还包括提高免疫反应的佐剂。
3.根据权利要求1的免疫原性组合物，以102-106 PFU的减毒病毒剂量配制。
4.刺激登革病毒特异性免疫反应的方法，所述方法包括给个体施用在生理学可接受载体中的免疫上足够量的选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的一种以上减毒登革病毒。
5.权利要求4的方法，其中所述减毒病毒经肠道外施用。
6.权利要求4的方法，其中所述减毒病毒经鼻内施用。
7.多价活减毒登革病毒疫苗，包括选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的登革病毒血清型的任意组合。
8.权利要求7的疫苗，其中所述登革1是45AZ5 PDK20，ATCC保藏号为VR-2648。
9.权利要求7的疫苗，其中所述登革2是S16803 PDK50，ATCC保藏号为VR-2653。
10.权利要求7的疫苗，其中所述登革3是CH5389 PDK20，ATCC保藏号为VR-2647。
11.权利要求7的疫苗，其中所述登革4是341750 PDK20，ATCC保藏号为VR-2652。
12.权利要求7的疫苗，其中登革1是ATCC保藏号为VR2648的45AZ5 PDK20，登革2是ATCC保藏号为VR-2653的S16803PDK50，登革3是ATCC保藏号为VR2647的CH5389 PDK20且登革4是ATCC保藏号为VR-2652的341750 PDK20。
13.权利要求7的登革病毒疫苗，其中所述登革病毒是在脊椎动物细胞中生产的。
14.权利要求13的登革病毒疫苗，其中所述细胞是Vero细胞。
15.权利要求7的登革病毒疫苗，其中所述登革-1病毒的量为102-107pfu/ml，所述登革-2病毒的量为102-107pfu，所述登革-3病毒的量为102-107pfu且所述登革-4病毒的量为102-107pfu/ml。
16.权利要求15的登革病毒疫苗，其中所述疫苗经皮下施用。
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Granted publication date: 20050302

Termination date: 20100324