CN107602693B

CN107602693B - 一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途

Info

Publication number: CN107602693B
Application number: CN201710797007.4A
Authority: CN
Inventors: 李征宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN107602693A

Abstract

本发明提供一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途：取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，低温球磨≥24h，得到纳米胶原。本发明制备的胶原纯度高、活性得到有效保留，且杂质少。本发明制备的纳米胶原在医药等领域具有广泛的应用价值。

Description

一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途

技术领域

本发明属于医学生物材料领域，具体涉及一种纳米尺度胶原的制备。

背景技术

目前具有医用生物活性的纳米级胶原的产品很少见到报道，且目前采用酶解加超滤的方法获得纳米级胶原蛋白，不仅工艺复杂，而且通常采用的酶解温度较高，造成胶原医用生物活性大大降低，超滤法的使用导致其纳米胶原产率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种生物活性纳米医用胶原的制备方法，该纳米医用胶原由提取的天然胶原经球磨而制成，包括以下步骤：

1)取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；

2)将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，得到(海绵状)胶原；

3)将步骤2)得到的(海绵状)胶原低温球磨≥24h，得到纳米胶原。

所述步骤1)具体包括以下步骤：

1.1)预处理：取新鲜的动物跟腱、动物皮或动物关节软骨，洗净后去除脂肪、真皮层、筋膜、皮毛，得到富含胶原的动物组织；

1.2)脱脂：将富含胶原的动物组织依次经切细、双蒸水洗涤、绞碎后置于氯仿-甲醇混合溶剂中浸泡脱脂，浸泡时间为3～6h；

1.3)洗涤：将脱脂的富含胶原的动物组织于NaCl和NaHCO₃混合水溶液中浸泡，NaCl质量分数为2％～30％，NaHCO₃质量分数为1％～10％，浸泡时间为3～8h；然后依次经双蒸水洗涤、离心后过300～800目筛，筛余物即为胶原提取的原料。

所述酶解的条件为：胃蛋白酶:胶原提取的原料的质量比为0.1～5:10～80，酶解消化温度为2～4℃，酶解消化时间为1～7天。

所述酶解前将胶原提取的原料浸没于0.5～1M醋酸中浸泡10～72h。

所述盐析采用质量分数2％～30％的NaCl水溶液。

所述复溶采用0.5～10M醋酸为溶剂。

所述透析的截留分子量为8000～20000Da。

所述球磨温度为-70℃～-20℃，时间为24～72h。

上述制备方法制备的生物活性纳米医用胶原在制备用于抑制神经胶质细胞活化的药物中的应用。

上述制备方法制备的生物活性纳米医用胶原在制备用于海马神经元缺失性疾病治疗的药物以及增强皮肤细胞、受损组织细胞、神经细胞代谢的药物中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明中的制备方法简单易行，成本低，工艺流程可控性强。本发明制备的纳米胶原纯度高、活性得到有效保留，且杂质少、生产效率高。本发明制备的纳米胶原在医药等领域具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为纳米胶原制备流程图。

图2为胶原显微视图。

图3为MTT法检测细胞生物活性的结果。

图4为外泌体复合胶原生物支架作用结果之一。

图5为外泌体复合胶原生物支架作用结果之二。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

1.主要试剂和仪器

胃蛋白酶、氯仿、冰醋酸、NaHCO₃、NaCl、高速离心机、冷冻干燥机、深低温冰箱、绞肉机、透析膜、液氮行星球磨机。

2.方法

(1)生物材料预处理：取新鲜的牛(猪、羊或其他动物)皮，洗净切除皮下脂肪及真皮层，剔除筋膜，去毛，切细。

(2)脱脂：经过切细的生物材料用双蒸水洗涤，绞肉机内绞碎，氯仿-甲醇混合溶剂(体积比1:1)中2～6℃(例如4℃)浸泡脱脂，浸泡时间为3～6h(例如4h)，期间间断搅拌。

(3)洗涤：将上述脱脂的生物材料于NaCl和NaHCO₃混合水溶液(NaCl质量分数为10％，NaHCO₃质量分数为10％)中2～6℃(例如4℃)浸泡，浸泡时间为3～8h(例如4h)，期间不断搅拌；然后双蒸水洗涤3～5次(例如，3次)，再以1000～20000r/min(例如20000r/min)离心5～60min(例如，15min)，倒掉液体，固体使用300～800目(例如，800目)筛子去除杂质、血清等成分，所得沉淀(筛余物)即为胶原提取的原料。

(4)提取胶原(图1)：

抽提：将原料浸没于0.5～1M醋酸(例如，1M)中2～6℃(例如4℃)浸泡10～72h(例如，48h)后，加入胃蛋白酶进行抽提(消化)，于2～4℃(例如置于4℃冰箱内)共抽提1～7天(例如，2～3天)，期间磁力搅拌器连续搅拌，得到抽提液；胃蛋白酶:原料的质量比为0.1～5:10～80(例如，1:10)。

离心：将上述抽提液于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心5～60min(例如，15min)，去除沉淀，所得上清液为胶原粗提液。

盐析：胶原粗提液加入质量分数2％～30％NaCl水溶液(例如，10％)中至有大量白色沉淀析出，2～6℃(例如4℃)静置5～60min(例如，60min)，于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心3～60min(例如，15min)，弃掉上清液，沉淀为粗提胶原物。

复溶：粗提胶原物复溶到0.5～10M醋酸(例如，1M)中，于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心3～60min(例如，15min)，除去不溶杂质，保留上清液。

透析：将复溶步骤所得上清液放入截留分子量为8000～20000Da透析膜(例如，14000Da)中，浸入双蒸水中2～6℃(例如4℃)透析24～72h(例如，48h)，每隔1～2h换液(双蒸水)一次，透析后获得精制胶原液(透析膜包裹的液体为精致胶原液)，即生物胶原溶液。

冻干：将精致胶原液放入大培养皿中，冷冻干燥机中进行冻干(-70℃缓慢升至-20℃，每2～4小时升温1～2℃)后，即可得到海绵状胶原(图2)。

球磨：将海绵状胶原于液氮行星球磨机中球磨24h～72h(例如，48h)，得到纳米胶原。

3.鉴定和活性分析

对胶原用Co₆₀或环氧乙烷等方法进行消毒，之后再对其成分、纯度、生物相容性进行精确鉴定。

表1.胶原成分对照表

将制备的海绵状胶原与I型胶原标准品的氨基酸组成对照，可以看出，二者氨基酸构成基本一致(表1)，将制备的海绵状胶原与I型胶原标准品的SDS-PAGE凝胶电泳图谱相对照，结果谱型一致，从上至下依次是γ链(分子量为130,000)、β链(分子量为98,000)、α链(分子量为97,200)，证明本实施例所制备的为纯度较高的I型胶原。

经鉴定为I型胶原(或其他类型胶原)后进行球磨，将球磨后的纳米胶原通过重溶(例如水、醋酸)和冻干制成固相纳米胶原支架，与胶标准品(非纳米)制成的固相标准胶原支架一并接种骨髓间充质干细胞，进行生物活性(毒性)检测。使用MTT法对接种于两种不同支架上的骨髓间充质干细胞进行检测。随着接种时间的增长，接种于两种支架上的细胞数目不断增多，且发现纳米胶原支架具有更高的组织相容性，细胞生长更快(图3中，黑色实心为固相纳米胶原支架结果，圆形空心为固相标准胶原支架，*表示差异显著)。

4.应用实例

分离骨髓或脐带间充质干细胞外泌体(MSC-derived exosomes,MSC-Exo)，外泌体数量≥10×10¹¹/mL(10～15×10¹¹/mL)，将纳米胶原溶解于双蒸水中，加入外泌体，磁力搅拌器搅拌均匀，配制成胶原质量分数为0.1％～10％的混合液，静置后无明显沉淀，获得混合液后，放入大培养皿中，冷冻干燥机中进行冻干后，即可得到获得复合外泌体的新型医用胶原海绵(即海绵状固体形态的MSC-Exo复合纳米胶原生物支架)，经检测外泌体在胶原中的分散浓度为3％～5％(w/w)。

MSC-Exo复合纳米胶原生物支架活性实验

实验1MSC-Exo复合纳米胶原生物支架对胶质细胞活化的抑制作用

8-10周SD大鼠腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)(5mg/kg)建立神经炎症动物模型，分别接受10μL PBS(对照组I，硬膜下注射，n＝10)、约6mm²MSC-Exo胶原复合生物支架(对照组II，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝10)、约6mm²MSC-Exo复合纳米胶原生物支架(实验组，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝12)处理，炎症高峰期4～6天收集各组样本，同龄段正常SD大鼠设为阴性对照。取脑组织切片行免疫组化染色Iba1(小胶质细胞标记物)和GFAP(星形胶质细胞标记物)，Image J软件分析结果。

实验1免疫组化染色结果显示，对照组I见海马和皮层GFAP+和Iba1+细胞(图4A)胞体大、突起明显，提示SD大鼠腹腔注射LPS后颅内神经胶质细胞明显活化，明显诱发神经炎症；对照组II见海马和皮层GFAP+和Iba1+细胞(图4B)胞体突起回缩，提示神经胶质细胞活化被抑制；实验组见海马和皮层GFAP+和Iba1+细胞(图4C)胞体和突起形态与阴性对照相差不大，提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架较对照组II(外泌体+I型标准胶原的复合支架)显著抑制神经炎症的胶质细胞活化。Image J分析结果显示，对照组I、对照组II和实验组阳性细胞的面积百分比分别为GFAP+：64.3±8.9％，Iba1+：57.7±4.2％；GFAP+：37.3±2.9％，Iba1+：27.5±4.9％；GFAP+：24±1.7％，Iba1+：19.7±3.2％(P＜0.01，实验组vs.对照组I或对照组II)。

根据实验1结论，提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架可用于抑制颅脑损伤、脑卒中、癫痫等诱发的神经胶质细胞活化(即神经炎症)。

实验2MSC-Exo复合纳米胶原生物支架的神经保护作用

8-10周SD大鼠接受3-5次(每次间隔45min)海人酸腹腔注射，诱导4级癫痫发作2小时，建立海马神经损伤模型，分别接受10μL PBS(对照组I，硬膜下注射，n＝10)、约6mm²MSC-Exo胶原复合生物支架(对照组II，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝10)、约6mm²MSC-Exo复合纳米胶原生物支架(实验组，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝12)处理，神经损伤模型诱导处理1周后收集各组样本，同龄段正常SD大鼠设为阴性对照。取脑组织切片行免疫组化染色NeuN(神经元标记物)，体视学定量分析实验结果。

实验2结果表明：对照组I见NeuN+细胞在海马CA1区(图5A)和齿状回门区(DH)较正常组明显减少，对照组II见海马CA1(图5B)和DH区神经元损失(NeuN+细胞)均较对照组I改善，实验组见NeuN+细胞在海马CA1区(图5C)和齿状回门区(DH)较对照组II显著增多。体视学定量分析NeuN+细胞量在各组分别为：对照组I CA1：1.4±0.15×10⁵，DH：0.9±0.11×10⁴；对照组II CA1：2.2±0.48×10⁵，DH：1.4±0.24×10⁴；实验组CA1：2.5±0.32×10⁵，DH：1.7±0.18×10⁴(P＜0.05，实验组vs.对照组I或对照组II)。综合提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架较MSC-Exo胶原复合生物支架硬膜下植入对神经损伤具有更好的神经保护作用。

根据实验2结论，提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架可以用于治疗癫痫、阿尔兹海默病、颅脑损伤、脑卒中等海马神经元缺失性疾病。

以上结论同样适用于其他类型胶原。

本发明证明纳米胶原，可以用于有关神经损伤、软骨损伤及皮肤、皮下组织损伤的修复，以及一种或多种复合系统疾病的治疗，可以作为食品、药品、保健品和化妆品的材料，应用于医疗、美容、康复等领域。

Claims

1.一种生物活性纳米医用胶原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；

所述步骤（1）具体包括以下步骤：

1）预处理：取新鲜的动物跟腱、动物皮或动物关节软骨，洗净后去除脂肪、真皮层、筋膜、皮毛，得到富含胶原的动物组织；

2）脱脂：将富含胶原的动物组织依次经切细、双蒸水洗涤、绞碎后置于氯仿-甲醇混合溶剂中浸泡脱脂，浸泡时间为3~6h；

3）洗涤：将脱脂的富含胶原的动物组织于NaCl和NaHCO₃混合水溶液中浸泡，NaCl质量分数为2%~30%，NaHCO₃质量分数为1%~10%，浸泡时间为3~8h；然后依次经双蒸水洗涤、离心后过300~800目筛，筛余物即为胶原提取的原料；

（2）将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，得到胶原；

（3）将步骤（2）得到的胶原球磨，得到纳米胶原，球磨温度为-70℃~-20℃；

所述酶解的条件为：胃蛋白酶:原料的质量比为0.1~5:10~80，酶解消化温度为 2~4℃，酶解消化时间为1~7天；所述酶解前将原料浸没于0.5~1M醋酸中浸泡10~72h；

所述盐析采用质量分数2~30%的NaCl水溶液；

所述复溶采用0.5~10M醋酸为溶剂；

所述透析的截留分子量为8000~20000Da；

所述球磨时间为24~72h。

2.一种如权利要求1所述的方法制备的生物活性纳米医用胶原，其特征在于：该纳米医用胶原由提取的天然胶原经球磨而制成。