CN1292075C - 水溶性未变性天然胶原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性未变性天然胶原的制备方法。其特点是选取新鲜牛皮、猪皮或盐腌牛皮、猪皮100重量份，水洗去肉后，加入脱脂剂2-3重量份，处理3-5小时，脂肪含量多的处理2次，水洗拔除毛后，片皮，得到真皮层，用10%食盐水浸泡1天，水洗冷却后切碎，取碎皮块10重量份，用酸调节pH至2-4，加入蛋白酶0.1-1重量份，于温度4-6℃搅拌处理1-3天，离心分离除去残渣，上清液中加入3-5M NaCl盐析，所得沉淀用0.5-1M乙酸溶解成浓度为1%的胶原溶液，取胶原液200重量份，于室温下加入酰化剂1-10重量份，反应3-8小时，测得酰化率为92-95%，离心分离收集沉淀，再用0.01-0.1M稀酸水洗涤沉淀3次，冷冻干燥后得到水溶性未变性天然胶原。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种水溶性未变性天然胶原的制备方法。属于生物医用材料的制备领域。
二、背景技术
胶原蛋白或称胶原，是一种纤维状蛋白质，是重要的动物蛋白之一。胶原广泛地存在于各类动物体内，从脊椎动物到鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等动物的皮肤、腱、软骨、各种内脏器官、血管壁以及食道等处都有胶原。脊椎动物体内所有蛋白质中胶原占据了总量的30％，是主要的结构蛋白质，皮肤含有胶原50％以上。
未变性天然胶原(即生物活性胶原)，是一种生物大分子，分子量的为30万。其结构仍然保持在动物体内时的天然结构，即胶原的三股螺旋结构，这种天然胶原蛋白被看作是生物体的一个组成部分而不被认为是外来物质。天然胶原有利于细胞的存活和生长、能促进血小板凝结、低抗原性和良好的生物相容性等功能，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复方面已得到广泛应用。Chi H.Lee，Anuj Singla andYugyung Lee，Biochemical applications of collagen，International Journal of Pharmaceutics，2001，221：1-22.由于未变性天然胶原还具有优良的保湿性能和促进表皮细胞生长繁殖，所以有效地增强皮肤弹性、减少皱纹，所以也用于高档化妆品中。Chvapil，M.andEckmayer，Z.，Role of proteins in cosmetics，International Journal of Cosmetic Science，1985，7：41-49。
目前未变性天然胶原的获取主要采用的方法有：(1)酸法，即用有机酸如乙酸、柠檬酸、稀盐酸等提取天然胶原；(2)酸酶法，用酸和蛋白酶共同作用，在酸性条件下，将天然胶原从动物组织中提取出。Miller，E.J.and Rhodes，R.K.，Preparation andcharacterization of the different types of collagen，Methods Enzymol.，1982，82：33-64。因为未变性天然胶原是酸溶性胶原，所以经以上方法提取得到的胶原只能在酸性条件下才能稳定存在。如果将这种胶原溶液的pH值提高到6-8，则胶原将沉淀出来。如果是这种胶原溶液冷冻干燥后的固体物，那么这种固体物也只能溶于酸性溶液中，而不能溶于中性水里。所以通常得到的这种未变性天然胶原是不能溶于水中的。而在胶原应用的许多场合，则需要在中性条件下使用，要求胶原具有水溶性或者在pH6-8的中性条件下未变性天然胶原也能稳定存在而不出现沉淀，也不改变其天然的结构，同样具有良好的生物活性。如胶原用作止血材料、医用敷料时，直接与人体组织接触，一般人体的生理条件就是在中性，pH为7.2-7.4，胶原用于化妆品时，一般也要求pH在6-8的范围胶原能稳定存在，并且不发生变性。
三、发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种水溶性未变性天然胶原的制备方法，其特点是将酸性胶原制得未变性天然胶原可直接溶于水，以溶液状态稳定存在。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
水溶性未变性天然胶原的制备方法：
1.酸溶性未变性天然胶原的提取
取宰杀的新鲜牛皮、猪皮或盐腌牛皮、猪皮100份，用水洗去肉后，加入脱脂剂2-3份处理3-5小时，共处理2次，拔去毛后，片皮，得到真皮层(即下面一层皮)，用10％食盐水浸泡一天，水洗冷却后切碎，将切碎的碎皮块10份，用酸调节pH至2-4，加入蛋白酶0.1-1份，于温度4-6℃搅拌处理1-3天，获得酸溶性未变性天然胶原溶液。
2.酸溶性未变性天然胶原的纯化
将上述酸溶性胶原蛋白液用14000-16000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上清液中加入3-5M NaCl盐析，所得沉淀经离心分离后用0.5-1M乙酸溶解，得到浓度为1％的酸溶性未变性天然胶原溶液。
3.水溶性未变性天然胶原溶液的制备
将上述已纯化的酸溶性胶原溶液200份，加入酰化剂1-10份，于室温下反应3-8小时。测定酰化反应程度，酰化率为92-95％，得到水溶性未变性天然胶原粗产品。
4.水溶性未变性天然胶原的纯化
将上述水溶性未变性天然胶原粗产品离心分离，收集沉淀，再用0.01-0.1M稀酸溶液洗涤沉淀3次，得到的沉淀经冷冻干燥后制得水溶性未变性天然胶原。
脱脂剂为乙二醇乙醚、脂肪酸聚氧乙烯醚或烷基酚聚氧乙烯醚中的任一种。
酶为胃蛋白酶、537酸性蛋白酶、真菌复合酶中的任一种。
酰化剂为庚二酸酐、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐中的任一种。
用差式扫描量热计测得胶原溶液的变性温度为36-38℃，详见图1所示。SDS-PAGE电泳法测得胶原的分子量分别为α链10万、β链20万、γ链30万，详见图2所示。可溶于中性溶液或水中，溶于水后成稳定的透明粘稠溶液。这种水溶性未变性天然胶原可用于美容化妆品和生物医学领域。
四、附图说明
图1为水溶性天然胶原的DSC热变性温度测试图。
图2为水溶性天然胶原的SDS-PAGE电泳分离图。
五、具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：取宰杀后的新鲜牛皮100kg，去肉机除去肉面多余的肉类组织，水洗后加入乙二醇乙醚3kg，处理3小时，水洗后拔毛机拔去大部分毛，片皮，取下层真皮层，用10％食盐水浸泡1天，水洗后切成小碎块，取碎皮块10kg，用酸调节pH至2-4，加入胃蛋白酶0.5kg，4-6℃下搅拌处理1-3天，用14000rpm高速离心分离除滤渣，上清液中加入3M NaCl盐析，离心分离得到的沉淀用1M乙酸溶解，胶原溶液浓度为1％。取胶原溶液200g，加入庚二酸酐3g，于室温下反应3小时，测得酰化率为92％，离心分离，沉淀用0.05M稀酸水洗涤3次，冷冻干燥得到水溶性未变性天然胶原。
实施例2：取盐腌猪皮100kg，去肉机去肉处理后，水洗脱脂，加入脂肪醇聚氧乙烯醚3kg，处理5小时，共处理2次。水洗后拔毛机拔去大部分毛，片皮，取下层真皮层，用10％食盐水浸泡1天，水洗后切成小碎块，取碎皮块10kg，加入柠檬酸调节pH至2-4，加入537酶1kg，于温度4-6℃搅拌处理1-3天，用15000rpm高速离心分离除滤渣，上清液中加入5M NaCl盐析，离心分离得到的沉淀用0.5M乙酸溶解，胶原溶液浓度为1％。取胶原溶液200g，加入顺丁烯二酸酐5g，于室温下反应5小时，测得酰化率为95％，离心分离，沉淀用0.08M稀酸水洗涤3次后冷冻干燥得到水溶性未变性天然胶原。
实施例3：取盐腌牛皮100kg，去肉机除去肉面多余的肉类组织，水洗后加入烷基酚聚氧乙烯醚2kg脱脂，处理3小时，水洗后拔毛机拔去大部分毛，片皮，取下层真皮层，用10％食盐水浸泡1天，水洗后切成小碎块，取碎皮块10kg，加入柠檬酸调节pH至2-4，加入真菌复合酶0.2kg，于温度4-6℃搅拌处理1-3天，用16000rpm高速离心分离除滤渣，上清液中加入5M NaCl盐析，离心分离得到的沉淀用1M乙酸溶解，得到浓度为1％的酸溶性胶原溶液，取该胶原液200g，加入邻苯二甲酸酐8g，于室温下反应8小时，测得酰化率为93％，离心分离，沉淀用0.1M稀酸水洗涤3次后冷冻干燥得到水溶性未变性天然胶原。
Claims (2)
1.水溶性未变性天然胶原的制备方法，其特征在于：
(1)酸溶性未变性天然胶原的提取
选取新鲜牛皮、猪皮或盐腌牛皮、猪皮，100重量份，水洗去肉后，加入脱脂剂2-3重量份处理3-5小时共处理1-2次，拔除毛后片皮，得到真皮层，用10wt％食盐水浸泡1天，水洗冷却后切碎，取切碎的碎皮块10重量份，用酸调节pH至2-4，加入蛋白酶0.1-1重量份，于温度4-6℃搅拌处理1-3天，获得酸溶性未变性天然胶原溶液；
(2)酸溶性未变性天然胶原的纯化
将上述酸溶性胶原蛋白液用14000-16000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上层清液中加入3-5M NaCl进行盐析，所得沉淀经离心分离后用0.5-1M乙酸溶解，得到浓度为1％的酸溶性未变性天然胶原溶液；
(3)水溶性未变性天然胶原的制备
将上述已纯化的酸溶性天然胶原液200重量份，加入酰化剂1-10重量份，室温下反应3-8小时，测定酰化反应程度，酰化率为92-95％，得到水溶性未变性天然胶原相产品；
(4)水溶性未变性天然胶原的纯化
将上述水溶性未变性天然胶原粗产品离心分离，收集沉淀，再用0.01-0.1M稀酸水洗涤沉淀3次，得到的沉淀经冷冻干燥后制得水溶性未变性天然胶原；
其中脱脂剂为乙二醇乙醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚中的任一种；酰化剂为庚二酸酐、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐中的任一种。
2.如权利要求1所述水溶性未变性天然胶原的制备方法，其特征在于蛋白酶为胃蛋白酶、537酸性蛋白酶、真菌复合酶中的任一种。
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