CN112851796B - 胶原共轭烯酮化衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胶原共轭烯酮化衍生物及其制备方法和应用，涉及生物材料技术领域。该胶原共轭烯酮化衍生物以胶原为原料，用含有共轭烯酮结构的化合物作修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入共轭烯酮结构。本发明胶原共轭烯酮化衍生物侧链灵活可变，制备出的不同结构改性的胶原共轭烯酮化衍生物，共轭烯酮结构可以进一步发生亲电加成，应用范围十分广泛。将其应用于快速成型的水凝胶的制备，在再生医学和组织工程领域有重要的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及一种胶原共轭烯酮化衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
胶原分子作为一类重要的蛋白质，具有独特的分子结构和理化性质，其在机体内发挥着重要的作用，在临床上具有广泛的应用价值。
胶原水凝胶已经成功实现了细胞在三维基板上的培养，也被认为是一种非常有应用前景的组织工程用支架材料。胶原分子链上存在着游离的氨基和羧基。但现有的胶原难以和含马来酰亚胺、乙烯砜、α-β不饱和醛、酮、酸、酯等结构的其他高分子衍生物发生化学反应，因此，无法实现水凝胶制备过程中的快速成型。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种胶原共轭烯酮化衍生物，其通过在胶原分子中引入含共轭烯酮结构化合物进行化学改性得到，该胶原共轭烯酮化衍生物可以进一步进行亲电加成反应，应用范围十分广泛。
本发明的第二个目的在于提供上述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法，其路线设计合理，制作方法简单，对设备需求低，能够快速高效地得到胶原共轭烯酮化衍生物。
本发明的第三个目的在于提供上述胶原共轭烯酮化衍生物在水凝胶中的应用，使得制备的水凝胶具有快速成型、生物相容性好以及机械强度可调的性能。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种胶原共轭烯酮化衍生物，其通式为：
其中，R1为残基，所述残基为胶原去除羧基和氨基的部分；
R2为氢原子、亚烷基或烷基；R3，R4为烷基、氢原子、羧基或羟基的衍生物。
进一步的，所述亚烷基中的至少一个氢原子被氨基、烷氧基、烷基、芳香基、羧基、酯基、羧基和卤代烷基中至少一种基团取代。
更进一步的，R1和R2的碳原子数均各自独立地为1～20个。
本发明提供的一种上述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法，在羧基活化剂的存在下，使胶原与含共轭烯酮结构的化合物发生反应。
进一步的，所述胶原选自酸性基因重组明胶蛋白、酸性明胶蛋白、多糖层粘连蛋白、碱性明胶蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、核心蛋白、胶原蛋白、基因重组胶原蛋白或纤维结合蛋白中的至少一种。
进一步的，所述制备方法包括以下步骤：
(a)提供含有所述胶原的溶液；
(b)提供含有共轭烯酮化合物的溶液；
(c)将步骤(a)和步骤(b)的溶液混合，并在羧基活化剂的存在下使其发生反应；
优选地，所述含有所述胶原的溶液为酸溶液；
优选地，所述含有所述共轭烯酮化合物的溶液为双蒸水、碱溶液或酸溶液；
优选地，所述羧基活化剂包括NHS和EDC，所述NHS和EDC的质量比为1：1～10：1。
更进一步的，利用所述羧基活化剂对含有所述共轭烯酮化合物的溶液中待反应的羧基进行活化，或者，利用所述羧基活化剂对含有所述胶原的溶液中待反应的羧基进行活化，然后混合含有所述共轭烯酮化合物的溶液和含有所述胶原的溶液使其进行反应；
优选地，所述反应时间为1～8h。
进一步的，所述胶原共轭烯酮化衍生物通过如下反应得到：
进一步的，共轭烯酮化合物为同时具有羧基和共轭双键结构的化合物或者共轭烯酮化合物为同时具有氨基和共轭烯酮结构的化合物。
本发明提供的上述胶原共轭烯酮化衍生物在制备水凝胶中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本申请提供的胶原共轭烯酮化衍生物，该衍生物通过在胶原分子中引入含共轭烯酮结构化合物进行化学改性得到，该胶原共轭烯酮化衍生物可以进一步进行亲电加成反应，应用范围十分广泛。
本发明提供的上述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法，该在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入共轭烯酮结构。该制备方法的路线设计合理，操作简单可行，对设备要求低，能够高效高产率地得到胶原共轭烯酮化衍生物。该胶原共轭烯酮化衍生物具备较好的亲电性质，可以进一步发生亲电加成反应，应用范围十分广泛。
本申请提供的胶原共轭烯酮化衍生物可以广泛应用于水凝胶的制备过程中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的胶原与胶原共轭烯酮化衍生物傅里叶红外图谱(FTIR)对比分析图；
图2为本发明实施例1中的胶原共轭烯酮化衍生物的扫描电子显微镜(SEM)表面微观结构图；
图3为本发明效果例1中的固化后水凝胶的扫描电子显微镜(SEM)表面微观结构图；
图4为本发明效果例1中的固化后水凝胶的表面孔径扫描电子显微镜(SEM)表面微观结构图；
图5为本发明效果例1中的水凝胶力学测试曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式或实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施方式的胶原共轭烯酮化衍生物及其制备方法和应用进行具体说明。
根据本发明的一个方面，一种胶原共轭烯酮化衍生物，其通式为：
其中，R1为残基，所述残基为胶原去除羧基和氨基的部分；
R2为氢原子、亚烷基或烷基；R3，R4为烷基、氢原子、羧基或羟基的衍生物。
本申请提供的胶原共轭烯酮化衍生物，该衍生物通过在胶原分子中引入含共轭烯酮结构化合物进行化学改性得到，该胶原共轭烯酮化衍生物可以进一步进行亲电加成反应，应用范围十分广泛。
在本发明的一种优选实施方式中，当R1或R2为亚烷基时，所述亚烷基中的至少一个氢原子被氨基、烷氧基、烷基、芳香基、羧基、酯基、羧基和卤代烷基中至少一种基团取代。
在上述优选实施方式中，当R1或R2为亚烷基时，所述亚烷基中有一个氢原子被烷氧基、芳香基、酯基、烷基、羧基、氨基、羟基和卤代烷基中的一种基团取代；
在上述优选实施方式中，当R1或R2为亚烷基时，所述亚烷基中有两个氢原子被氨基、烷氧基、芳香基、酯基、烷基、羧基、羟基和卤代烷基中的两种基团取代；
在上述优选实施方式中，当R1或R2为亚烷基时，所述亚烷基中有两个以上的氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的两种以上的基团取代；
在上述优选实施方式中，当R1或R2为亚烷基时，所述亚烷基中多个氢原子被烷基、羧基、氨基、酯基、烷氧基、芳香基、羟基和卤代烷基中的多个同一种基团取代或被其中多个不同基团的组合对应进行取代。
需要说明的是，R1为烷基时，烷基的氢原子也可以被任意基团进行取代。
在上述优选实施方式中，R1和R2的碳原子数均各自独立地为1～20个。
优选地，所述R1和R2的碳原子数均各自独立地为1～15个；
更优选地，所述R1和R2的碳原子数均各自独立地为1～10个；
上述R1的碳原子数典型但非限制性的优选实施方案为：C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、硝基或亚烷基。
上述R2的碳原子数典型但非限制性的优选实施方案为：C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20的亚烷基。
根据本发明的一个方面，一种上述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法，在羧基活化剂的存在下，使胶原与含共轭烯酮结构的化合物发生反应。
本发明提供的上述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法，该在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入共轭烯酮结构。该制备方法的路线设计合理，操作简单可行，对设备要求低，能够高效高产率地得到胶原共轭烯酮化衍生物。该胶原共轭烯酮化衍生物具备较好的亲电性质，可以进一步发生亲电加成反应，应用范围十分广泛。
在本发明的一种优选实施方式中，所述胶原选自酸性基因重组明胶蛋白、酸性明胶蛋白、多糖层粘连蛋白、碱性明胶蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、核心蛋白、胶原蛋白、基因重组胶原蛋白或纤维结合蛋白中的至少一种。
作为一种优选的实施方式，上述胶原的分子链上存在游离的氨基和羧基，从而可以通过与氨基或羧基进行反应，达到对胶原分子链进行修饰改性的目的。
在本发明的一种优选实施方式中，所述制备方法包括以下步骤：
(a)提供含有所述胶原的溶液：将胶原溶解于0.01～30％的酸溶液中。
(b)提供含有共轭烯酮化合物的溶液：将含共轭烯酮结构的化合物，根据其溶解性，溶解于双蒸水或碱溶液或酸溶液中。
(c)将步骤(a)和步骤(b)的溶液混合，将羧基活化剂加入混合液中，混合均匀后，调节其pH值至4.5-6.5，继续混合搅拌。
(d)将活化后的含有共轭烯酮结构的化合物溶液与含有胶原的溶液进行混合，充分搅拌均匀，搅拌时间优选10～150min，且优选将混合液转移至圆底烧瓶中，放置在温度为37℃以下进行恒温反应。
(e)将反应后得到的反应液进行透析2～5天，再将得到的透析产物进行冷冻干燥2～5天后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。通过透析的手段可以除去残留的小分子杂质，从而得到纯度更高的胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
需要说明的是，上述过程中也可以先进行步骤(2)，再进行步骤(1)，其不会影响最终产物的生成。
作为一种优选的实施方式，上述制备胶原共轭烯酮化衍生物的方法操作工艺简单，反应条件温和。其为制备一种新的胶原共轭烯酮化衍生物以及水凝胶提供了一种简单可行的新方法。所得的胶原共轭烯酮化衍生物可用于再生医学、组织工程支架以及医药卫生领域，应用范围广泛。
在本发明的一种优选实施方式中，所述含有胶原的溶液为酸溶液；
优选地，所述酸溶液为有机酸溶液；
更优选地，所述有机酸溶液为乙酸溶液，优选为浓度0.01～30％的乙酸溶液。
在本发明的一种优选实施方式中，所述含有所述共轭烯酮化合物的溶液为双蒸水、碱溶液或酸溶液；
优选地，所述双蒸水可以使得溶解后的溶液纯度更高，后续反应效果越好。
优选地，所述溶解含共轭烯酮结构化合物的酸溶液可以是有机酸溶液，优选为乙酸溶液。
优选地，所述溶解含共轭烯酮结构化合物的碱溶液可以为强碱溶液，优选为氢氧化钠溶液。
上述强碱溶液典型但非限制性的优选实施方案为：氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液。
优选地，所述溶解含共轭烯酮结构化合物的碱溶液可以为弱碱溶液；
上述弱碱溶液典型但非限制性的优选实施方案为：氨水溶液、碳酸氢钠溶液、双蒸水溶液等。
在本发明的一种优选实施方式中，所述羧基活化剂包括NHS和EDC。
作为一种优选的实施方式，上述EDC，又名1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，是一种溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也经常用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶联物的制取，常和NHS或N-羟基硫代琥珀酰亚胺连用，以提高偶联效率。NHS，又名N-羟基琥珀酰亚胺，活化羧基以用于酰胺键的形成。
在上述优选的实施方式中，所述NHS和EDC的质量比为1：1～10：1。
作为一种优选的实施方式，上述质量比能够有效提高NHS和EDC的交联效率，进而更好的活化本申请含共轭烯酮结构化合物的羧基。
优选地，所述EDC和NHS在磁力搅拌器作用下加入到上述含共轭烯酮结构化合物的溶液中，以达到更好的混合效果。
在本发明的一种优选实施方式中，利用所述羧基活化剂对含有所述共轭烯酮化合物的溶液中待反应的羧基进行活化，或者，利用所述羧基活化剂对含有所述胶原的溶液中待反应的羧基进行活化，然后混合含有所述共轭烯酮化合物的溶液和含有所述胶原的溶液使其进行反应；
在上述优选实施方式中，混合羧基活化剂后，用碱或酸溶液调节加有羧基活化剂的共轭烯酮化合物溶液的pH值，所述pH值为4.5～6.5。
作为一种优选的实施方式，上述EDC和NHS在pH值为4.5～6.5的条件下能够达到对羧基最好的活化效果。
优选地，用1M氢氧化钠或1M盐酸溶液进行调节pH值。
在上述优选实施方式中，所述反应时间为1～8h，优选为2～6h，更优选为4～5h。
在上述优选实施方式中，反应温度为10～30℃，优选为15～20℃。
在本发明的一种优选实施方式中，所述胶原共轭烯酮化衍生物通过如下反应得到：
在本发明的一种优选实施方式中，共轭烯酮化合物为同时具有羧基和共轭双键结构的化合物或者共轭烯酮化合物为同时具有氨基和共轭烯酮结构的化合物。
根据本发明的一个方面，上述胶原共轭烯酮化衍生物在制备水凝胶中的应用。
本申请提供的胶原共轭烯酮化衍生物可以广泛应用于水凝胶的制备过程中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
注：由于胶原特殊的三股螺旋结构，其上所含的官能团的摩尔量难以定量，胶原材料在改性及使用过程中一般都用质量来粗略计算，保证使用的小分子修饰剂过量即可。本发明中1g胶原对应一定量的共轭烯酮，共轭烯酮的含量在具体实施例中体现。当使用的胶原含有其他接枝的氨基酸(天冬、谷、赖氨酸等)时，酰胺化反应同样用胶原质量来控制，无法严格定量控制。
实施例1
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取0.15g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数0.01％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取0.09g乌头酸，随后将乌头酸溶解于氢氧化钠溶液中，得到乌头酸氢氧化钠溶液。
(c)、羧基活化：将0.075g EDC和0.019g NHS加入步骤(b)乌头酸氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将乌头酸氢氧化钠溶液的PH至4.5，继续搅拌10min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的乌头酸氢氧化钠溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为20℃下恒温反应1h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例2
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取0.3g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1.5g乌头酸，随后将乌头酸溶解于氢氧化钠溶液中，得到乌头酸氢氧化钠溶液。
(c)、羧基活化：将0.8g EDC和0.2g NHS加入步骤(b)乌头酸氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将乌头酸氢氧化钠溶液的PH至5.5，继续搅拌80min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的乌头酸氢氧化钠溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应5h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例3
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取0.3g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数2％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1.5g乌头酸，随后将乌头酸溶解于氢氧化钠溶液中，得到乌头酸氢氧化钠溶液。
(c)、羧基活化：将0.9g EDC和0.019g NHS加入步骤(b)乌头酸氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将乌头酸氢氧化钠溶液的PH至5.5，继续搅拌80min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的乌头酸氢氧化钠溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应5h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例4
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取4.5g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数30％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取2.8g乌头酸，随后将乌头酸溶解于氢氧化钠溶液中，得到乌头酸氢氧化钠溶液。
(c)、羧基活化：将1.6g EDC和0.4g NHS加入步骤(b)乌头酸氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将乌头酸氢氧化钠溶液的PH至6.5，继续搅拌150min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的乌头酸氢氧化钠溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌150min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为10℃下恒温反应8h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析5d、冷冻干燥5d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例5
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取4.5g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数30％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液，胶原选择碱性明胶蛋白。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取2.1g顺丁烯二酸，随后将顺丁烯二酸溶解于氢氧化钠溶液中，得到顺丁烯二酸氢氧化钠溶液。
(c)、羧基活化：将1.6g EDC和0.4g NHS加入步骤(b)顺丁烯二酸氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将顺丁烯二酸氢氧化钠溶液的PH至5，继续搅拌150min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的顺丁烯二酸氢氧化钠溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌150min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为5℃下恒温反应8h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析5d、冷冻干燥5d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例6
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取2g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数20％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液，胶原选择酸性基因重组明胶蛋白。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1g顺丁烯二酸，随后将顺丁烯二酸溶解于氢氧化钠溶液中，得到顺丁烯二酸氢氧化钠溶液。
(c)、羧基活化：将0.8g EDC和0.15g NHS加入步骤(b)顺丁烯二酸氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将顺丁烯二酸氢氧化钠溶液的PH至6，继续搅拌100min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的顺丁烯二酸氢氧化钠溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌50min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为18℃下恒温反应5h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析4d、冷冻干燥4d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例7
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取0.8g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取0.09g甲基丙烯酸，随后将甲基丙烯酸溶解于氢氧化钾溶液中，得到甲基丙烯酸氢氧化钾溶液。
(c)、羧基活化：将0.8g EDC和0.2g NHS加入步骤(b)甲基丙烯酸氢氧化钾溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将甲基丙烯酸氢氧化钾溶液的PH至5.5，继续搅拌80min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的甲基丙烯酸氢氧化钾溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应5h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例8
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取0.8g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1.5g甲基丙烯酸，随后将甲基丙烯酸溶解于氢氧化钾溶液中，得到甲基丙烯酸氢氧化钾溶液。
(c)、羧基活化：将0.8g EDC和0.2g NHS加入步骤(b)甲基丙烯酸氢氧化钾溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将甲基丙烯酸氢氧化钾溶液的PH至5.5，继续搅拌80min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的甲基丙烯酸氢氧化钾溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应7h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例9
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取0.8g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1.5g 1-氨基-3-戊烯-2-酮，随后将1-氨基-3-戊烯-2-酮溶解于双蒸水溶液中，得到1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液。
(c)、羧基活化：将0.8g EDC和0.2g NHS加入步骤(b)1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液的PH至6，继续搅拌100min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应7h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例10
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取1.0g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1.5g 1-氨基-3-戊烯-2-酮，随后将1-氨基-3-戊烯-2-酮溶解于双蒸水溶液中，得到1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液。
(c)、羧基活化：将1.0g EDC和0.4g NHS加入步骤(b)1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液的PH至5.5，继续搅拌80min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的1-氨基-3-戊烯-2-酮双蒸水溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应7h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例11
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
/>
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取1.0g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1.5g 2-丁烯酰胺，随后将2-丁烯酰胺溶解于双蒸水溶液中，得到2-丁烯酰胺双蒸水溶液。
(c)、羧基活化：将1.0g EDC和0.8g NHS加入步骤(b)2-丁烯酰胺双蒸水溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将2-丁烯酰胺双蒸水溶液的PH至5.5，继续搅拌80min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的2-丁烯酰胺双蒸水溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌10min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为20℃下恒温反应5h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥2d后，得到胶原α-β不饱和羰基化衍生物。
实施例12
本实施例中的胶原共轭烯酮化衍生物的反应方程式为：
所述胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)、提供含有胶原的溶液：称取1.5g的胶原，随后将胶原溶解于质量分数0.01％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(b)、提供含有共轭烯酮化合物的溶液：称取1.8g二巯基丁二酸，随后将二巯基丁二酸溶解于氢氧化钠溶液中，得到二巯基丁二酸溶液。
(c)、羧基活化：将0.8g EDC和0.2g NHS加入步骤(b)二巯基丁二酸溶液中，在磁力搅拌器作用下充分混匀；
随后，使用1M稀盐酸调节将二巯基丁二酸溶液的PH至5.5，继续搅拌80min，使羧基充分活化；
(d)、胶原与含共轭烯酮结构的化合物反应：将步骤(c)充分活化后的二巯基丁二酸溶液与步骤(a)胶原乙酸溶液混合搅拌20min时间，得到混合溶液，随后将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为35℃下恒温反应2h。
(e)、后期处理：对步骤(d)反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥2d后，得到COL-SH产物。
效果例1
为更好的证明本申请胶原共轭烯酮化衍生物的结构性能，现对实施例1中的胶原以及胶原共轭烯酮化衍生物进行红外分析图谱以及扫描电镜分析，其结果如下所示：
图1为本发明实施例1中的胶原与胶原共轭烯酮化衍生物傅里叶红外图谱(FTIR)对比分析图；
图2为本发明实施例1中的胶原共轭烯酮化衍生物的扫描电子显微镜(SEM)表面微观结构图；
由图1可知，在波数1600cm-1附近，共轭烯酮化胶原有一个酰胺带的伸缩振动特征吸收峰，同时在3000波数附近也出现了共轭烯酮结构的伸缩振动吸收特征峰，表明共轭烯酮化合物成功引入到胶原链上；
效果例2
为表明应用本申请胶原共轭烯酮化衍生物制备的到的水凝胶具有较好的机械强度和弹性性能。现特将本申请实施例11的COL-SH产物进一步制备为水凝胶材料，进行检测，具体如下：
(一)、制备水凝胶：
(1)、称取实施例12制备得到的COL-SH产物60mg，作为溶质溶解于乙酸溶液中，得到浓度为10mg/ml的COL-SH溶液。
(2)、称取实施例1中的COL-TAA产物60mg，作为溶质溶解于用氢氧化钠溶液中，用还原剂处理10min，得到浓度为10mg/ml的COL-TAA溶液。
(3)、将配好的COL-SH和COL-TAA溶液引入3D打印机，通过3D打印机制备得到3D生物打印水凝胶。
(二)、力学检测：
使用instron力学测试机对上述制备得到的水凝胶进行测试，将水凝胶置于10N传感器压缩基底上；所述水凝胶的规格为长10mm，宽8mm，高5mm；
调节压缩速率至0.5mm/min，经检测当压缩位移为2.87mm，压缩应力为0.133MPa时水凝胶发生断裂，从而测得弹性模量为0.490MPa，具体检测结果如图5所示。
图5为本发明效果例1中的水凝胶力学测试曲线图。所述图5水凝胶测试的具体信息为：通过用instron力学测试机对实施例1中得到的水凝胶进行测试，使用10N传感器，置于传感器压缩基底上，根据样品的大小设置好测试参数，测试曲线出现突变后，停止压缩，系统自动得出弹性模量值。测试参数为：样品直径10mm，高8mm，压缩速率0.8mm/min。
由图5可知，本申请胶原共轭烯酮化衍生物制备的到的水凝胶具有较好的机械强度和弹性性能。
进一步的，对上述固化后水凝胶进行扫描电子显微镜(SEM)分析，其结果如下：
图3为本发明效果例1中的固化后水凝胶的扫描电子显微镜(SEM)表面微观结构图；
图4为本发明效果例1中的固化后水凝胶的表面孔径扫描电子显微镜(SEM)表面微观结构图；
通过图3、图4可以清晰的看出水凝胶表面出现很多交联后的孔洞，这表明本申请交联反应进行得很完全，这也进一步的说明了，本申请制备得到的胶原共轭烯酮化衍生物可以成功制备快速固化水凝胶。
综上所述，本发明实施方式中，通过将同时含有共轭烯酮结构和羧基共轭烯酮化合物作为修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入共轭烯酮结构。该制备方法的路线设计合理，操作简单可行，对设备要求低，能够高效高产率地得到胶原共轭烯酮化衍生物。该胶原共轭烯酮化衍生物由于共轭烯酮结构侧链的作用，具备较好的亲电性能，可以进一步发生亲电加成反应，其应用范围十分广泛。例如，将该胶原共轭烯酮衍生物与含巯基结构的其他高分子衍生物发生化学反应，来制备快速固化的水凝胶，在再生医学和组织工程领域有重要的应用。又比如，由于该胶原共轭烯酮化衍生物较好的亲电加成性能以及生物相容性，可以将该胶原共轭烯酮化衍生物用于制备药物载体；或者，利用该胶原共轭烯酮衍生物良好的抗氧化性能，将其与天然聚合物制成高分子膜，在储存保鲜领域，发挥其作用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。该胶原共轭烯酮化衍生物具有丰富的变化和衍生性，其适用广泛，此处仅仅列举了其可能的部分用途，并不能穷举，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例或者其它可能的应用方式，都属于本发明保护的范围。
Claims (7)
1.一种胶原共轭烯酮化衍生物，其特征在于，所述共轭烯酮化合物为同时具有羧基和共轭双键结构的化合物；
其通式为：
其中，R1为残基，所述残基为胶原去除羧基和氨基的部分。
2.根据权利要求1所述的胶原共轭烯酮化衍生物，其特征在于，R1的碳原子数均各自独立地为1～20个。
3.一种根据权利要求1或2所述的胶原共轭烯酮化衍生物的制备方法，其特征在于，在羧基活化剂的存在下，使胶原与含共轭烯酮结构的化合物发生反应。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述胶原选自酸性基因重组明胶蛋白、酸性明胶蛋白、多糖层粘连蛋白、碱性明胶蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、核心蛋白、胶原蛋白、基因重组胶原蛋白或纤维结合蛋白中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括：
(a)提供含有所述胶原的溶液；
所述含有所述胶原的溶液为酸溶液；
(b)提供含有共轭烯酮化合物的溶液；
所述含有所述共轭烯酮化合物的溶液为双蒸水、碱溶液或酸溶液；
(c)将步骤(a)和步骤(b)的溶液混合，并在羧基活化剂的存在下使其发生反应；
所述羧基活化剂包括NHS和EDC，所述NHS和EDC的质量比为1：1～10：1。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，利用所述羧基活化剂对含有所述共轭烯酮化合物的溶液中待反应的羧基进行活化；
或者，利用所述羧基活化剂对含有所述胶原的溶液中待反应的羧基进行活化，然后混合含有所述共轭烯酮化合物的溶液和含有所述胶原的溶液使其进行反应，所述反应的时间为1～8h。
7.如权利要求1或2所述的胶原共轭烯酮化衍生物在制备水凝胶中的应用。
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