CN114437709B - 一种核酸功能化mof材料及其制备和应用 - Google Patents
一种核酸功能化mof材料及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米材料和生物传感领域,具体涉及一种核酸功能化MOF材料的制备及其应用。本发明以2‑氨基‑4,4'‑联苯二羧酸和ZrCl4水热反应生成UiO‑67‑NH2,将带有羧基的单链DNA通过酰胺反应连接到其表面,通过适配体链与单链DNA部分杂交,将荧光染料包裹在MOF中,形成核酸功能化的MOF材料,发现制备的核酸功能化MOF具有优异的刺激响应释放性能。本发明制备的核酸功能化MOF具有良好的稳定性、生物相容性,在药物传递、生物传感方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料和生物传感领域,具体涉及一种核酸功能化MOF材料及其制备和应用。
背景技术
分子诊断是预防、识别和治疗多种疾病的基本工具,并且诊断过程是有效治疗各种疾病的基础。因此,开发强大的诊断工具是至关重要的。到目前为止,磁性纳米粒子、量子点和金纳米粒子等各种纳米材料已经被用作生物传感结构的信号传感器。这些生物传感器的优势包括强信号强度、多种有效的信号机制和纳米粒子的可转换光学特性,使分子检测成为可能。
金属有机骨架材料(Metal-organic frameworks,MOF)以其超高的表面积、独特的孔隙率、化学稳定性和生物降解性在生物医学领域得到了广泛的应用。
然而,作为封装信号分子的支持平台,MOF通常面临响应过程耗时和负载能力低的问题,限制了MOF的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对目前现有的技术问题,提供一种核酸功能化MOF材料的制备及其应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种核酸功能化MOF材料,核酸功能化MOF材料为MOF与包裹荧光染料的核酸适体相连接;其中,核酸适体中含有与待检测蛋白相匹配的适配体。
所述核酸功能化MOF材料为氨基化的MOF材料与带有羧基的单链DNA通过酰胺反应连接到其表面,再将荧光染料和与待检测样品的适配体链与前述带有羧基的单链DNA部分杂交,将荧光染料包裹在MOF中。
一种核酸功能化MOF材料的制备方法,氨基化的MOF与带有羧基的单链DNA通过酰胺反应连接,再将荧光染料和与待检测样品的适配体链与前述带有羧基的单链DNA部分杂交,将荧光染料包裹在MOF中。
所述核酸功能化MOF材料为以2-氨基-4,4'-联苯二羧酸和ZrCl4水热反应生成UiO-67-NH2,将单链DNA连接在UiO-67-NH2表面,再通过与待测样品的匹配的适配体链将荧光分子固定在MOF材料中。
所述2-氨基-4,4'-联苯二羧酸和ZrCl4的摩尔比为4:3;所述水热反应温度为100-110℃水热反应23-25小时。
所述适配体链为目标分子的适配体链,单链DNA为适配体链的补链。
一种所述核酸功能化MOF材料的应用,所述材料在分子快速诊断中的应用。
所述材料和核酸外切酶I在缓冲液中组装为生物检测器体系在分子快速诊断中的应用。
一种快速检测生物靶标的方法,将所述材料和核酸外切酶I在缓冲液中组装为生物检测器体系,而后加入至待检测样品溶液中,而后定量和/或定性检测生物靶标;其中,检测器体系中所述材料终浓度为25-30μg mL-1,核酸外切酶I终浓度为40-50U mL-1。
所述缓冲液可为磷酸盐缓冲液(PBS),HEPES缓冲液,Tris-HCl缓冲液等。
所述待检测样品生物靶标中与检测器体系的适配体匹配,适配体与靶标结合形成靶标-适配体复合物,使得材料中MOF脱离,且MOF双链DNA结构打开,核酸外切酶I从3'端降解MOF的游离单链DNA,进而快速释放荧光分子。使得体系具有荧光性,从而检测出待检测样品中含有相应的生物靶标。
更进一步的说,在没有靶标分子的情况下,双链DNA结构阻碍了荧光分子的释放。一旦靶标出现,适配体链与靶标结合形成靶标-适配体复合物并脱离MOF,导致MOF双链DNA结构被解锁,荧光分子释放。并且,双链DNA结构不能被核酸外切酶I水解,但靶标与适配体链结合后MOF双链DNA结构打开,核酸外切酶I从3'端降解MOF的游离单链DNA,降低了空间位阻,促进了荧光分子的快速释放。该平台是一种快速检测小分子的通用生物传感方法,推动了MOF材料在生物医学领域的应用。
上述待检测生物分子可为任何不同长短的核酸片段,相应材料中的双链DNA中适配体与待检测样品可结合;例如,待检测样品可为ATP,cyt c,乳酸脱氢酶,凝血酶等;前述待测样品对应的适配体序列分别为:
5’CCG TGT CTG GGG CCG ACC GGC GCA TTG3’;
5’ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GG3’;
5’CTGGGCGGTAGAACCATAGTGACCCAGCCGTCTAC3’;
5’AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT3’。
本发明的有益效果在于:
本发明以氨基化的金属有机骨架材料作为基础,将带有羧基的单链DNA通过酰胺反应连接到其表面,通过与待检测样品的适配体链与带有羧基的单链DNA部分杂交,将荧光染料包裹在MOF中,形成核酸功能化的MOF材料,发现制备的核酸功能化MOF具有优异的刺激响应释放性能。本发明制备的核酸功能化MOF具有良好的稳定性、生物相容性,在药物传递、生物传感方面具有广阔的应用前景。
利用制备的核酸功能化MOF以及核酸外切酶I构建生物传感器,实现ATP的快速检测,待检测样品的适配体链与待检测样品结合形成靶标-适配体复合物并脱离MOF,导致MOF双链DNA结构被解锁,游离单链DNA被核酸外切酶I水解,荧光分子快速释放,荧光信号增强。构建的传感器具有良好的检测效果和选择性,其中ATP检出限为5.03fM。
本发明生物功能化MOF在信号转导和选择性识别方面具有巨大的潜力,进而可用于建立用于分子诊断的生物传感器。
附图说明
图1为本发明实施例提供的核酸功能化MOF的合成路线图;
图2为本发明实施例1提供的核酸功能化MOF的TEM图(A、B)、XRD图谱(C)和FT-IR光谱(D);
图3为本发明实施例2提供的核酸功能化MOF的TEM图(A、B);
图4为本发明实施例提供的Rho 6G@UiO-66(左)和Rho 6G@UiO-67(右)在不同条件下荧光分子释放曲线;
图5为本发明实施例提供的核酸功能化MOF对不同浓度ATP检测的标准曲线图;
图6为本发明实施例提供的核酸功能化MOF对不同靶标分子检测的选择性图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明,应当指出的是,此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明,并不局限于本发明。
实施例1:
以测定ATP为例制备核酸功能化MOF的:
1)将488mg ZrCl4和218mg 2-氨基-4,4'-联苯二羧酸加入30mL DMF溶液中,超声溶解15min获得混合液,再将3.6mL醋酸添加到混合液中超声溶解5min。然后,将反应混合物于100℃水热反应24小时生成UiO-67-NH2;所得MOF产物(UiO-67-NH2)分别用DMF和无水乙醇各洗涤3次后,50℃真空干燥(参见图2A)。
2)将250μL补链DNA(100μM,5’COOH-GCAACAACGTACCCAATG3’)与125μL EDC(5mgmL-1)、125μL NHS(5mg mL-1)搅拌反应20min,然后将5mg上述获得UiO-67-NH2加入到反应混合物搅拌15h,获得修饰后的UiO-67,而后使用PBS(10mM,pH=7.4)清洗修饰后的UiO-67,并将产物溶解在500μL PBS中。
3)将上述100μL修饰后UiO-67与80μL Rho 6G(1mM)搅拌反应12h,获得反应液,随后,将20μL ATP的适配体链(10μM,5’CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTG3’)加入反应液中反应3h,形成核酸功能化MOF(Rho 6G@UiO-67)。用PBS洗涤所得产物并分散在100μL PBS待用(参见图2B)。
由通过透射电子显微镜(TEM)表征制备的UiO-67-NH2和Rho 6G@UiO-67的形貌。如图2A和图2B所示,UiO-67-NH2和Rho 6G@UiO-67都是均匀的纳米颗粒。UiO-67-NH2纳米颗粒表面粗糙,尺寸均匀,平均直径110-150nm。核酸功能化后,Rho 6G@UiO-67复合材料的尺寸与裸UiO-67-NH2的尺寸相似。此外,图2C展示了UiO-67-NH2的XRD图,与纯相UiO-67-NH2的模拟图完全匹配,揭示了其纯度和高结晶度。为了证明Rho 6G@UiO-67的成功制备,还测量了UiO-67-NH2和补链DNA-UiO-67的FTIR光谱(图2D)。1400-1680cm-1范围内的一组峰是指有机连接体,即羧酸根1409cm-1处的不对称和对称拉伸振动和1597cm-1,以及1541cm-1处的环形拉伸振动。660和771cm-1处的不同峰被认定为Zr-O纵向和横向振动,这是UiO-67-NH2的特征键。在1016cm-1(C-N)处出现的峰表明UiO-67-NH2的氨基与补链DNA的羧基之间形成酰胺键。此外,由于C-N强度的逐渐增加,UiO-67-NH2的特征键强度随着改性而减弱。这些都表明了核酸功能化MOF的成功合成。
实施例2:
以测定ATP为例制备核酸功能化MOF:
1)将488mg ZrCl4和188mg对苯二羧酸加入30mL DMF溶液中,超声溶解15min获得混合液,再将3.6mL醋酸添加到混合液中超声溶解5min。然后,将反应混合物于100℃水热反应24小时生成UiO-66-NH2。所得MOF产物(UiO-66-NH2)分别用DMF和无水乙醇各洗涤3次后,50℃真空干燥(参见图3A)。
2)将250μL补链DNA(100μM,5’COOH-GCAACAACGTACCCAATG3’)与125μL EDC(5mgmL-1)、125μL NHS(5mg mL-1)搅拌反应20min,然后将5mg上述获得UiO-66-NH2加入到反应混合物搅拌15h,获得修饰后的UiO-66,而后使用PBS(10mM,pH=7.4)清洗修饰后的UiO-66,并将产物溶解在500μL PBS中。
3)将上述100μL修饰后UiO-66与80μL Rho 6G(1mM)搅拌反应12h,获得反应液,随后,将20μL ATP的适配体链(10μM,5’CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTG3’)加入溶液中反应3h,形成核酸功能化MOF(Rho 6G@UiO-66)。用PBS洗涤所得产物并分散在100μL PBS待用(参见图3B)。
如图3所示,UiO-66-NH2和Rho 6G@UiO-66都是均匀的纳米颗粒。UiO-66-NH2纳米颗粒表面粗糙,尺寸均匀,平均直径100-150nm。核酸功能化后,Rho 6G@UiO-66复合材料的尺寸与裸UiO-66-NH2的尺寸相似
实施例3:
利用上述实施例获得材料进行ATP的检测:
在300μL PBS(10mM,pH=7.4)中分别加入40μL上述获得Rho 6G@UiO-66(250μgmL-1)或Rho 6G@UiO-67(250μg mL-1)。然后加入20μL核酸外切酶I(800U mL-1)(购自赛默飞世尔科技公司)和40μL ATP溶液(10nM)。取100μL不同时间的反应液,10000rpm离心3min,测量上清液在激发波长525nm,发射波长552nm时的荧光强度;记录上述实施例获得Rho 6G@UiO-66和Rho 6G@UiO-67的染料释放曲线,同时以未加核酸外切酶I,仅加入ATP的样品作为对照,未加核酸外切酶I且未加入ATP的样品作为空白(参见图4)。
如图4所示。曲线显示,在30min内,不添加ATP的样品荧光变化非常小。一旦目标出现,荧光信号逐渐增加。然而,在不含核酸外切酶I的样品中,反应30分钟后荧光仍不能达到平衡。添加核酸外切酶I的样品中,反应15分钟后荧光信号逐渐稳定,证明核酸外切酶I的添加大大加速了荧光信号的释放。
实施例4:
采用上述实施例获得检测APT的生物传感器应用于一系列的ATP浓度的检测:
应用于一系列的ATP浓度时,将生物传感器体系360μL加入40μL不同浓度ATP溶液,调整体系ATP浓度分别为8、10、20、50、100、200、500、1000fM,震荡反应15min,测量溶液在激发波长为525nm,发射波长552nm时的荧光强度(参见图5)。
其中,生物传感器体系为320μL PBS(10mM,pH=7.4)、40μL Rho 6G@UiO-67(250μgmL 1)和20μL核酸外切酶I(800U mL-1)。
如图5所示,通过分析ATP浓度与荧光强度的关系,该传感器在8-1000fM范围呈良好的线性关系。ATP检出限为5.03fM(S/N=3),具有很高的灵敏度。
实施例5:
基于生物传感器的选择性:
为探究基于核酸功能化MOF构建生物传感器的选择性,选择ADP、AMP和CTP作为模型干扰物质。将生物传感器体系380μL分别加入40μL ATP、ADP、AMP和CTP溶液,调整体系ATP和干扰物质的浓度为1fM,震荡反应15min,测量溶液在激发波长为525nm,发射波长552nm时的荧光强度(参见图6)。
生物传感器体系为320μL PBS(10mM,pH=7.4)、40μL Rho 6G@UiO-67(250μg mL1)和20μL核酸外切酶I(800U mL-1)。
如图6所示,干扰物质的检测结果与空白样品相似。但是ATP的添加引起了显著的荧光反应,表明适配体只能识别ATP以触发染料释放,显示了该传感器良好的选择性。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种核酸功能化MOF材料及其制备和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgtgtctgg ggccgaccgg cgcattg 27
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acctggggga gtattgcgga ggaagg 26
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgggcggta gaaccatagt gacccagccg tctac 35
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29
Claims (2)
1.一种检测生物靶标的方法,其特征在于:将核酸功能化MOF材料和核酸外切酶 I在缓冲液中组装为生物检测器体系,而后加入至待检测样品溶液中,而后定量和/或定性检测生物靶标;其中,检测器体系中核酸功能化MOF材料终浓度为25-30 μg mL-1,核酸外切酶I终浓度为40-50 U mL-1;所述生物靶标为ATP;
所述核酸功能化MOF材料的制备方法为:氨基化的MOF材料与带有羧基的单链DNA通过酰胺化反应连接到其表面,再将荧光染料和待检测样品的适配体链与前述带有羧基的单链DNA部分杂交,将荧光染料包裹在MOF中;所述氨基化的MOF材料为以2-氨基-4 ,4 '-联苯二羧酸和ZrCl4水热反应生成的UiO-67-NH2;
所述适配体链为ATP的适配体链,单链DNA为所述适配体链的补链;
所述适配体链的核苷酸序列为:5’CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTG3’;
所述带有羧基的单链DNA的核苷酸序列为:5’COOH-GCAACAACGTACCCAATG3’;
所述待检测样品的适配体链与待检测样品结合形成靶标-适配体复合物并脱离MOF,导致MOF双链DNA结构被解锁,游离单链DNA被核酸外切酶 I水解,荧光分子快速释放,荧光信号增强。
2.按照权利要求1所述的检测生物靶标的方法,其特征在于:所述2-氨基-4,4'-联苯二羧酸和ZrCl4的摩尔比为4:3;所述水热反应温度为100-110℃,水热反应23-25小时。
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