CN109735618B - 一种用于QCM检测miRNA Let-7a的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于QCM检测miRNA Let‑7a的试剂盒及方法，所述试剂盒包括：基于miRNA Let‑7a探针链的QCM传感器，信号增强剂；所述信号增强剂为带正电的MOF UiO‑66纳米粒子。本发明提供的用于QCM检测miRNA Let‑7a的试剂盒能够显著提高QCM检测miRNA Let‑7a的灵敏度，实现低浓度miRNA Let‑7a的检测，而且，该试剂盒中的信号增强剂具有来源丰富、合成简单和价格便宜的优点，避免使用贵金属和生物试剂。
Description
技术领域
本发明涉及QCM检测miRNA技术领域，更具体地，涉及一种用于QCM检测miRNALet-7a的试剂盒及方法。
背景技术
miRNA是一种内源非编码性RNA，通过与mRNAs的3’非翻译区的互补序列结合，抑制其基因表达，从而使mRNAs降解，阻止其翻译。过去的十几年里，科研工作者们通过对人癌细胞转基因小鼠模型和基因敲除模型的功能丧失、功能增益实验，证明了miRNA在肿瘤发生、发展和转移过程中的关键作用，一个或多个碱基的突变可能与包括癌症在内的多种疾病有关，因此某些miRNAs可能成为重要的疾病诊断标志物(American Journal ofRespiratory&Critical Care Medicine,2012,186(11):1160；Gastroenterology,2014,147(4):847-859.e11.)，如肺癌标志物miRNALet-7a。但是，miRNA的小尺寸、序列相似性、细胞内含量极低等特点，给它们的精确检测带来了很大的挑战。
石英晶体微天平(QCM)是一种高灵敏度重量型传感器，基于石英晶体的压电原理，通过表面质量变化引起的振荡频率变化实现对目标分子的检测。QCM具有免标记、易操作、可实时检测等优点，被广泛用于蛋白质、酶、DNA等生物大分子的检测(Journal of theAmerican Chemical Society,2014,136(20):7261-7264；Journal oftheAmericanChemical Society,2017,139(29):9827；Sensors&Actuators B Chemical,2016,237:452-458.)。
但是，QCM检测miRNALet-7a的灵敏度不够高，QCM检测低浓度miRNA Let-7a仍存在很大困难。
为了提高QCM检测灵敏度以适用于分子量小且浓度低的miRNA，多种信号放大策略被提出，例如基于金纳米的链聚合法(Sensors&Actuators B Chemical,2015,216:1-5)、环介导等温扩增法(Nanoscale,2017,9(42):16205-16213)以及纳米银簇法(Biosensors&Bioelectronics,2018,105:137-142)等。总体而言，目前信号增强剂的种类很少，价格较高，合成方法过于复杂。同时，用于增强QCM检测miRNALet-7a的信号增强剂依然未见报道，缺乏能够用于QCM检测低浓度miRNALet-7a的试剂盒。
因此，急需开发出能够用于QCM检测低浓度miRNALet-7a的试剂盒。而且，该试剂盒中的信号增强剂具有来源丰富、合成简单和价格便宜的优点。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的QCM检测miRNALet-7a的灵敏度不够高的缺陷，提供一种用于QCM检测miRNALet-7a的试剂盒，提供的试剂盒能够显著提高QCM检测miRNALet-7a的灵敏度，实现低浓度miRNALet-7a的检测，而且，该试剂盒中的信号增强剂具有来源丰富、合成简单和价格便宜的优点。
本发明的另一目的在于提供一种增强QCM检测miRNALet-7a的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种用于QCM检测miRNALet-7a的试剂盒，包括：基于miRNALet-7a探针链的QCM传感器，信号增强剂；
所述信号增强剂为带正电的MOF UiO-66纳米粒子。
所述miRNA Let-7a探针链可以为miRNALet-7a互补链；miRNALet-7a互补链的5’端修饰巯基，从而键合到镀金QCM晶片上。本发明中QCM可以采用本领域常规的石英晶体微天平仪器。
MOF UiO-66纳米粒子是指锆基金属有机框架材料UiO-66纳米粒子。MOF UiO-66纳米粒子可由本领域技术人员根据现有技术制备得到。
具体使用方法：
QCM传感器置于QCM检测池内。将信号增强剂加入待测液中进行反应，得到检测液，反应的温度为-5～10℃，时间为12～36小时。将检测液通入QCM检测池，即可进行检测。优选地，反应温度为0℃，时间为24小时。待测液的溶剂为PBS缓冲溶液。
发明人研究发现，带正电的MOF UiO-66纳米粒子与miRNALet-7a作用力较强，可以有效形成Let-7a@UiO-66复合物；同时，带正电的MOF UiO-66纳米粒子与miRNALet-7a和探针链杂交形成的双链RNA之间具有强的相互作用，如此，才能使杂交形成的双链RNA与带正电的MOF UiO-66纳米粒子形成dsmiRNA@UiO-66复合物，从而不会导致MOF UiO-66纳米粒子的大量脱落；更重要的是，带正电的MOF UiO-66纳米粒子与miRNALet-7a探针链作用力较小，从而避免带正电的MOF UiO-66纳米粒子直接与miRNALet-7a探针链形成复合物，不会干扰对miRNALet-7a的检测。
与未加入上述信号增强剂时QCM检测miRNALet-7a的信号相比，上述试剂盒检测同样浓度的miRNA Let-7a的信号获得极大增强，能够显著提高QCM检测miRNALet-7a的灵敏度，实现低浓度miRNALet-7a的检测，而且，该试剂盒中的信号增强剂具有来源丰富、合成简单和价格便宜的优点。
优选地，所述MOF UiO-66纳米粒子的Zeta电位为25～35mV。
由于miRNA链Let-7a是带负电荷的，因此Zeta电位为正的MOF UiO-66与miRNALet-7a之间的作用力较强，适合形成Let-7a@UiO-66复合物。MOF UiO-66纳米粒子的Zeta为电位为25～35mV时，MOF UiO-66纳米粒子能更好地与miRNALet-7a形成复合物。
优选地，所述MOF UiO-66纳米粒子的粒径为200～900nm。MOF UiO-66纳米粒子的粒径较大时，空间位阻较大，可能会抑制其与miRNA结合；粒径较大时自身重量也较大，也不利于在晶片表面附着。因此，更优选地，所述MOF UiO-66纳米粒子的粒径为200～400nm。进一步优选地，所述MOF UiO-66纳米粒子的粒径为300nm。
优选地，所述QCM传感器由探针链和6-巯基-1-己醇的混合溶液与镀金QCM晶片组装得到。QCM传感器的组装温度可以为4℃，时间可以为24h。混合溶液的溶剂可以为PBS缓冲溶液。
优选地，混合溶液中所述探针链的浓度为30～70nM；所述探针链与6-巯基-1-己醇的摩尔比1∶300～800。探针链浓度及其与6-巯基-1-己醇的比例对形成的QCM传感器的频率响应具有较大的影响。镀金QCM晶片表面探针链的覆盖率太小，则能结合的miRNALet-7a太少；而镀金QCM晶片表面探针链的覆盖率太大，则由于位阻增加，不利于探针链结合miRNALet-7a。
发明人发现，当探针链的浓度为50nM，探针链与6-巯基-1-己醇的摩尔比1∶500时，制得的QCM传感器能够取得更好的检测效果。因此，更优选地，所述探针链的浓度为50nM；所述探针链与6-巯基-1-己醇的摩尔比1∶500。
进行检测时，信号增强剂MOF UiO-66纳米粒子的浓度对QCM检测miRNA Let-7a的增强效果也具有一定影响。
优选地，检测液中MOF UiO-66纳米粒子的浓度为3×10-5mg/L～5×10-5mg/L。更优选地，检测液中MOF UiO-66纳米粒子的浓度为4×10-5mg/L。
上述试剂盒还能实现互补链、单碱基错配及三碱基错配链的定性分析。
本发明还保护一种增强QCM检测miRNALet-7a的方法，所述方法包括如下步骤：
S1.将信号增强剂加入到待测液中，信号增强剂与待测液中的miRNALet-7a复合，得到检测液；所述信号增强剂为带正电的MOF UiO-66纳米粒子；
S2.将S1.的检测液通入QCM检测池，进行检测；所述QCM检测池内设有基于miRNALet-7a探针链的QCM传感器。
上述方法能够显著提高QCM检测miRNA Let-7a的灵敏度，实现低浓度miRNALet-7a的检测，而且，其使用的信号增强剂具有来源丰富、合成简单和价格便宜的优点。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的用于QCM检测miRNALet-7a的试剂盒能够显著提高QCM检测miRNALet-7a的灵敏度，实现低浓度miRNALet-7a的检测，而且，该试剂盒中的信号增强剂具有来源丰富、合成简单和价格便宜的优点，避免使用贵金属和生物试剂。
附图说明
图1为实施例1中平均粒径为300nm的MOF UiO-66纳米粒子的XRD测试图。
图2为QCM检测miRNALet-7a的过程示意图。图2中，PRNA是指探针链；TRNA是指miRNALet-7a；MOFs是指MOF UiO-66纳米粒子。
图3为MOF UiO-66纳米粒子与miRNALet-7a的复合后的ECD光谱。
图4为MOF UiO-66粒径与QCM频率变化的关系。
图5为MOF UiO-66浓度与QCM频率变化的关系。
图6为试验例8和对照例1的频率变化与时间的关系。
图7为不同miRNALet-7a浓度与频率变化的非线性拟合曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例中的原料均可通过市售得到；
miRNA寡核苷酸(上海生工)，浓硫酸(珠海市华成达化工有限公司)，30％过氧化氢(广州化学试剂厂)，6-巯基-1-己醇(绨希爱上海化成工业发展有限公司)，PBS缓冲液(pH＝7.4，福建厦门海标科技有限公司)，所有化学品均为分析纯，无二次提纯。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
粉末XRD衍射通过Ultima IV X-ray粉末衍射仪(Kurary,Tokyo,Japan)at 40kV,40mAequippedwith CuKαradiation
进行测试。
纳米粒径电位分析仪(Malvern ZetasizerNano ZS90,UK)对UiO-66的电位和尺寸进行了表征。
石英晶体微天平对传感器的频率变化进行检测。本发明中石英晶体微天平可以采用本领域常用的石英晶体微天平分析仪；一般地，实施例可采用意大利QCM-Dissapation的耗散型开放式石英晶体微天平分析仪QCM，其技术参数如表1所示。
表1石英晶体微天平分析仪的技术参数
miRNALet-7a的碱基序列为5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’；探针链为依照Let-7a设计的互补序列，5’端修饰巯基，探针链的碱基序列为5’-SH-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’。
实施例1
一种用于QCM检测miRNALet-7a的试剂盒，其制备过程如下：
组装QCM传感器：将镀金QCM晶片在piranha溶液(98％H2SO4/30％H2O2＝7/3,v/v)中浸泡10min，然后用高纯水冲洗干净，氮气吹干。将干燥后的镀金QCM晶片浸泡在在1mL探针链(50nM)和6-巯基-1-己醇(25μΜ)的混合溶液中，维持温度为4℃，浸泡24小时。然后将镀金QCM晶片从溶液中取出，用高纯水冲洗干净，氮气吹干，放置于干燥器中。
合成MOFUiO-66：ZrCl4(1.087g)和对苯二甲酸(0.525g)分别溶于15mL DMF中，搅拌15min，然后将溶液混合，继续搅拌20min后，将溶液转移到水热反应釜中，120℃下加热24h。所得固体通过离心收集，用DMF洗涤三次，再用甲醇洗涤三次，然后在甲醇中浸泡三天。最终得到的固体在真空150℃干燥过夜。产率为75％。所得产物通过离心分离，获得平均粒径为200、300、500、700、900nm的纳米粒子，所有纳米粒子的zeta电位均处于25～35mV之间。
平均粒径为300nm的MOF UiO-66纳米粒子的XRD测试图如图1所示，由此可见，其具有较高的结晶度；其他平均粒径的MOF UiO-66纳米粒子的XRD测试图与图1类似。
检测过程
检测过程如图2所示。
将Let-7a与UiO-66复合：首先制备MOF UiO-66纳米粒子初始溶液(A液)：准确称取2mgUiO-66粉末，加入到2mLPBS缓冲液中，超声30分钟使其分散均匀，备用。然后制备miRNALet-7a初始溶液(B液)：将miRNALet-7a加入100微升的DEPC水，振荡均匀，配置成浓度为0.1mM的miRNALet-7a溶液。制备Let-7a@UiO-66复合物时，用移液枪准确移取一定体积的A液和一定体积的B液，混合摇匀，加入PBS缓冲液使其最终体积为2mL，冰水浴超声使其混合均匀，混合时间为24h，形成稳定的悬浊液。
MOF UiO-66纳米粒子与miRNA Let-7a的结合情况：UiO-66纳米粒子与miRNA Let-7a的结合通过ECD光谱(ECD spectrawere recordedusing a JASCO J815Research-GradeCircularDichroism(CD)Spectrometer.)进行表征，结果如图3所示，与UiO-66作用后，miRNALet-7a在241nm处的负峰和273nm处的正峰均明显的减弱，表明UiO-66纳米粒子与miRNALet-7a结合形成复合物。
检测：将悬浊液注入检测池中进行杂交，杂交时间为5000s，检测得到频率变化值，记录频率变化值。频率变化值越大，则增强效果越显著，QCM检测miRNALet-7a的灵敏度越高。
试验例1～9及对照例1
试验例1～9及对照例1的试验条件如表2所示。
其中，试验例1～5研究了频率变化值与MOF UiO-66纳米粒子的粒径的关系，测试结果如图4所示，由此可见，粒径为200～400nm时，频率变化值较大；粒径为300nm时，频率变化值最大。
试验例2及试验例6～9研究了频率变化值与MOF UiO-66纳米粒子的浓度的关系，测试结果如图5所示，可知，MOF UiO-66纳米粒子的浓度为3×10-5mg/L～5×10-5mg/L，频率变化值较大；浓度超过4×10-5mg/L时，频率变化值不再显著增加。
试验例8和对照例1的频率变化与时间的关系如图6所示，对照例1中没有利用MOFUiO-66纳米粒子，频率变化仅为5Hz；而试验例8利用MOF UiO-66纳米粒子之后，频率变化增强为150Hz，可见其信号获得显著增强。
表2试验例1～9及对照例1的试验条件
半定量检测试验
MOF UiO-66纳米粒子的平均粒径为300nm，浓度为4×10-5mg/L时，配制miRNALet-7a的浓度从1×10-10M至5×10-8M变化的系列悬浊液进行测试。具体选择miRNALet-7a的浓度为1×10-10M，3×10-10M，5×10-10M，1×10-9M，3×10-9M，5×10-9M，1×10-8M，3×10-8M，5×10- 8M系列悬浊液。
测试结果如图7所示，从图中可知，浓度与频率变化值呈现大致的函数关系，所以，本发明提供的试剂盒还可用于miRNALet-7a的半定量检测。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种用于QCM检测miRNA Let-7a的试剂盒，其特征在于，包括：基于miRNA Let-7a探针链的QCM传感器，信号增强剂；
所述信号增强剂为带正电的MOF UiO-66纳米粒子；
所述MOF UiO-66纳米粒子的粒径为300nm；
所述QCM传感器由探针链和6-巯基-1-己醇的混合溶液与镀金QCM晶片组装得到；混合溶液中所述探针链的浓度为30～70nM；所述探针链与6-巯基-1-己醇的摩尔比1∶500；
所述MOF UiO-66纳米粒子的Zeta电位为25～35mV；
所述miRNA Let-7a的碱基序列为5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’；所述探针链为依照Let-7a设计的互补序列，5’端修饰巯基，所述探针链的碱基序列为5’-SH-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’。
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