CN117089339A - 一种ECL复合材料、传感器及其制备与在miRNA-133a检测中的应用 - Google Patents

一种ECL复合材料、传感器及其制备与在miRNA-133a检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ECL复合材料、传感器及其制备与在miRNA‑133a检测中的应用。所述复合材料包括具有过氧化物酶活性的镍铁普鲁士蓝类似物，负载在所述镍铁普鲁士蓝类似物纳米粒子表面的金铂纳米颗粒，以及通过金‑氮共价键与所述金铂纳米颗粒连接的电化学发光底物；所述传感器包括工作电极和均相体系，工作电极上修饰有复合材料，复合材料上连接有淬灭探针，淬灭探针为修饰有多巴胺的单链报告探针PH；均相体系包括负载有脱氧核酶链和轨道发夹TH的金纳米颗粒，脱氧核酶链为长臂链WS和阻断链BS组装形成的双链。本发明利用ECL复合材料的高ECL输出信号，以及3D DNAzyme Walker的信号放大能力，构建了一种ECL传感器，实现miRNA‑133a的高特异性、高灵敏度检测。

Description

一种ECL复合材料、传感器及其制备与在miRNA-133a检测中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种ECL复合材料、传感器及其制备与在miRNA-133a检测中的应用。
背景技术
急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)作为一种严重的心血管疾病，具有较高的发病率和死亡率，而且近年来发病人群逐渐年轻化，早期准确的诊断和有效的血管重建治疗对降低AMI患者的发病率和死亡率起着至关重要的作用。目前，检测AMI的金标准是心肌肌钙蛋白I(CTnI)的免疫学检测检测，因其具有高度的特异性，但是，由于免疫检测的昂贵以及抗体的容易灭活，限制了其广泛的应用。据报道，AMI发病后，血浆中miRNA-133a的浓度急剧增加，而且miRNA-133a和cTnI的表达峰值几乎同时出现，可用于AMI的辅助诊断。
MicroRNA(miRNA)是一种单链、长约19-23个核苷酸的内源性非编码调控RNA，在生物体的早期发育、细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥着重要的调控作用。大量研究表明，miRNA的异常表达与许多疾病有关，特别是与肿瘤的发生发展密切相关，因此，分析患者血清中的miRNA在疾病的早期筛查及精准诊疗过程中蕴含巨大潜力和价值。值得一提的是，miRNA有许多独特的特性，如小尺寸、高序列相似性、易降解、低丰度等，这对其准确的检测和定量提出了分析挑战。传统的miRNA分析方法，包括反转录-定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、微阵列技术等已得到广泛应用，但存在灵敏度低、方法费时、假阳性高、设备昂贵等缺点。因此，开发一种灵敏、特异和简便的检测新技术来监测miRNA-133a水平，实现AMI的早期筛查及诊疗具有重要的意义。
DNA步行器(DNA Walker)是DNA纳米设备的其中一种，可以精确地控制微米尺度或纳米尺度的程序化寡核苷酸，在生物传感、药物传递等领域具有广泛的应用潜力。在受到熵驱动的链置换反应、酶、光或化学刺激后，DNA Walker可以沿着设计好的轨迹移动，这些轨迹包括一维(1D)的平面轨迹、二维(2D)的DNA折纸或三维(3D)立体轨道，其中3D DNAWalker所有的反应组分都集中在微米或纳米尺度的3D轨道上，从而产生较高的局部有效浓度和稳定的信号输出。例如，在生物传感方面，Li和他的同事们设计了一种酶驱动的3DWalker传感器，它可以实现等温均一的信号放大用于特定核酸的检测；Fan等人还编程了一种由核酸外切酶III(Exonuclease III，Exo III)驱动的DNA Walker产生级联信号放大，用于超灵敏的生物分析；Liu和他的团队研发了一种3D DNA Walker用于测定8-羟基-2’-脱氧鸟苷，与以前报道的方法相比，该方法的检测下限降低了三个数量级。尽管这些方法显示出超高的灵敏度，但它们都是一种依赖于生物酶的方法，这些方法具有一些生物酶固有的不足：易受复杂实验条件(如缓冲液和温度)的影响、较高的检测成本和不适合长期存储。因此，开发一种无酶的3D DNA Walker具有十分重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种ECL复合材料、传感器及其制备与在miRNA-133a检测中的应用，利用复合材料的高ECL输出信号，以及3D DNAzymeWalker的信号放大能力，实现对miRNA-133a的高特异性、高灵敏度检测。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)复合材料，所述复合材料包括具有过氧化物酶活性的镍铁普鲁士蓝类似物(Ni-Fe PBA)，负载在所述镍铁普鲁士蓝类似物纳米粒子表面的金铂纳米颗粒(AuPt NPs)，以及通过金-氮共价键(Au-N键)与所述金铂纳米颗粒连接的电化学发光底物。
在一些实施例中，所述电化学发光底物选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)、鲁米诺中的任意一种，优选为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
在一些实施例中，所述镍铁普鲁士蓝类似物为纳米级，其形状为正方体，粒径为50～60nm。
本发明第二方面提供一种根据第一方面所述的电化学发光复合材料的制备方法，包括如下步骤：
以镍前驱体、柠檬酸三钠和铁配位化合物为原料，通过常温静置的方法合成得到镍铁普鲁士蓝类似物；
在镍铁普鲁士蓝类似物表面原位还原，使其负载金铂纳米颗粒，形成AuPt@Ni-FePBA材料；
将AuPt@Ni-Fe PBA材料与电化学发光底物通过金-氮共价键(Au-N键)连接，得到所述电化学发光复合材料。
在一些实施例中，以镍前驱体、柠檬酸三钠和铁氰化钾为原料，通过常温静置的方法合成得到镍铁普鲁士蓝类似物包括：
将镍前驱体和柠檬酸三钠溶解在水中，形成溶液A；将铁氰化钾溶解在水中，形成溶液B；将溶液A和溶液B混合搅拌均匀后，在室温下静置老化；静置老化结束后离心，洗涤沉淀得到镍铁普鲁士蓝类似物。
在一些实施例中，镍元素、柠檬酸三钠和铁氰化钾的摩尔比为10～15∶10～20∶5～12，优选为1∶1∶1、2∶3∶2、4∶5∶4、12∶15∶10或12∶15∶8。
在一些实施例中，所述镍前驱体为含镍元素的可溶性盐，所述含镍元素的可溶性盐选自乙酸镍、氯化镍、硝酸镍中的任意一种。在一些实施例中，在室温下静置老化时间不低于24h，优选为24-36h，例如24、26、28、30、32、34、36h。
在一些实施例中，在镍铁普鲁士蓝类似物表面原位还原，使其负载金铂纳米颗粒，形成AuPt@Ni-Fe PBA材料包括：
在镍铁普鲁士蓝类似物溶液中加入表面活性剂，形成溶液C；将金前驱体、铂前驱体溶解在水中，形成溶液D；将溶液D加入溶液C中，搅拌均匀，再加入还原剂，搅拌进行还原反应；反应结束后离心，洗涤沉淀，得到AuPt@Ni-Fe PBA材料。
在一些实施例中，所述镍铁普鲁士蓝类似物溶液由镍铁普鲁士蓝类似物溶解在溶剂中形成，用于溶解镍铁普鲁士蓝类似物的溶剂选自水或乙醇。
在一些实施例中，所述表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
在一些实施例中，所述金前驱体选自含金元素的可溶性盐，所述含金元素的可溶性盐选自氯金酸盐(AuCl4 -)、硝酸金盐(Au(NO3)4 -)、二氰合金酸钾K[Au(CN)2]中的任意一种，所述氯金酸盐选自氯金酸、氯金酸钠、氯金酸钾、氯金酸铵中的任意一种，所述硝酸金盐选自硝酸金。
在一些实施例中，所述铂前驱体选自含铂元素的可溶性盐，所述含铂元素的可溶性盐为氯铂酸盐(PtCl4 -)，所述氯铂酸盐选自氯铂酸、氯铂酸钠、氯铂酸钾、氯铂酸铵中的任意一种。
在一些实施例中，所述还原剂选自硼氢化钠。在一些实施例中，金元素、铂元素的摩尔比为1∶1。
在一些实施例中，还原反应时间不低于30min，优选为30～60min，例如30、35、40、45、50、55、60min。
在一些实施例中，将AuPt@Ni-Fe PBA材料与电化学发光底物通过金-氮共价键(Au-N键)连接，得到所述电化学发光复合材料包括：
将AuPt@Ni-Fe PBA材料与电化学发光底物加入水中，在室温下搅拌进行反应，反应结束后用水洗涤去除多余的电化学发光底物，得到所述电化学发光复合材料。
在一些实施例中，将AuPt@Ni-Fe PBA材料与电化学发光底物加入水中，在室温下搅拌进行反应的时间不低于30min，优选为30～60min，例如30、35、40、45、50、55、60min。
在一些实施例中，所述电化学发光复合材料悬浮于壳聚糖溶液中保存备用，所述壳聚糖溶液浓度为0.05％～0.2％。
本发明第三方面提供一种电化学发光传感器，包括工作电极和均相体系，所述工作电极上修饰有如第一方面所述的电化学发光复合材料，所述电化学发光复合材料上连接有淬灭探针，所述淬灭探针为修饰有多巴胺(Dopamine，DA)的单链报告探针PH，所述单链报告探针PH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述均相体系包括金纳米颗粒(Au NPs)，所述金纳米颗粒上负载有封闭的脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme)链和可被切割的轨道发夹TH，所述脱氧核酶链为长臂链WS和阻断链BS组装形成的双链，所述长臂链WS、阻断链BS和轨道发夹TH的核苷酸序列依次如SEQID NO.1、2和4所示。
本发明的电化学发光传感器的检测原理为：首先，电化学发光复合材料作为工作电极上的底层材料，提供高强度的ECL信号基础；其次，在底层材料上连接淬灭探针，即修饰有DA的单链报告探针PH，通过DA对ECL信号的猝灭作用，实现信号“on”到“off”的转变；最后，通过在均相体系中的AuNPs上负载预先封闭的DNAzyme链(WS+BS)和可被切割的轨道发夹TH，构成3D脱氧核酶步行器(3D DNAzyme Walker)，其中轨道发夹TH同时含有被WS切割的位点和被封闭的DNAzyme序列。当靶标miRNA-133a存在时，通过链置换作用暴露出WS链的DNAzyme部分，轨道发夹TH的特异性位点被切割，暴露出新的DNAzyme序列，形成具有多足的活性3D DNAzyme Walker，当将所述均相体系滴加到工作电极表面时，3D DNAzyme Walker的结合臂能够特异性识别并切割工作电极上的猝灭探针，猝灭探针顶部的猝灭基团DA被释放，由此产生可被测量的ECL信号，实现对miRNA-133a的检测。
在一些实施例中，所述均相体系还包括Mn2+。当靶标存在时，暴露出的WS能在Mn2+的辅助下切割TH。
在一些实施例中，所述单链报告探针PH、轨道发夹TH、脱氧核酶链(WS+BS)与Mn2+的摩尔比为10∶10∶1∶5000～15000，优选为10∶10∶1∶10000～12000，例如10∶10∶1∶10000、10∶10∶1∶11000、10∶10∶1∶12000。
在一些实施例中，所述脱氧核酶链(WS+BS)的制备方法包括如下步骤：
将长臂链WS和阻断链BS退火变性组装形成双链，得所述脱氧核酶链。
在一些实施例中，长臂链WS和阻断链BS的摩尔比为1∶1.1～1.3，例如1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3。
在一些实施例中，能通过链置换作用暴露出长臂链WS的靶标TA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施例中，所述均线体系中，多巴胺的浓度为1.0～1.20mM。
在一些实施例中，所述工作电极为玻碳电极。
在一些实施例中，在所述工作电极上修饰有所述电化学发光复合材料的方法包括如下步骤：
将所述电化学发光复合材料悬浮于壳聚糖溶液中后，滴加在所述工作电极上，干燥，形成底层材料。
在一些实施例中，所述壳聚糖溶液浓度为0.05％～0.2％。
在一些实施例中，将所述电化学发光复合材料悬浮于壳聚糖溶液中后，滴加在所述工作电极上，干燥，在所述工作电极上形成材料层。
在一些实施例中，干燥温度为37℃。
在一些实施例中，干燥时间不低于20min，优选为20～30min，例如20、25、30min。
在一些实施例中，在所述电化学发光复合材料上连接淬灭探针的方法包括如下步骤：
在修饰有所述电化学发光复合材料的工作电极上滴加修饰有多巴胺的单链报告探针PH，静置反应。
在一些实施例中，静置反应温度为0～8℃，优选为4℃。
在一些实施例中，静置反应时间不低于12h，优选为12～16h，例如12、14、16h。
在一些实施例中，所述淬灭探针的制备方法包括如下步骤：
在单链报告探针PH的5’端和3’端分别修饰羧基和巯基，活化羧基后，与多巴胺溶液混合进行反应，形成修饰有多巴胺的单链报告探针PH，即所述淬灭探针。
在一些实施例中，采用含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的反应体系活化羧基。
在一些实施例中，所述多巴胺溶液的浓度为1.0～1.20mM。
在一些实施例中，与多巴胺溶液混合进行反应的时间不低于8h，优选为8～12h，例如8、10、12h。
本发明第四方面提供根据第一方面所述的电化学发光复合材料和第三方面所述的电化学发光传感器在制备miRNA-133a检测试剂盒中的应用。
本发明第五方面提供一种miRNA-133a检测方法，采用第三方面所述的电化学发光传感器检测样本中miRNA-133a的存在，包括如下步骤：
将待测样本加入所述均相体系中，混匀后进行第一次循环反应；反应结束后再滴加到所述工作电极上，进行第二次循环反应；反应结束后测量电化学发光(ECL)信号，根据测量得到的电化学发光信号判断样本中miRNA-133a的存在。
在一些实施例中，所述第一次循环反应和第二次循环反应的反应温度为35～40℃，优选为37℃，反应时间为1～3h，优选为2h。
如上所述，本发明的ECL复合材料、传感器及其制备与在miRNA-133a检测中的应用，具有以下有益效果：
本发明利用ECL复合材料的高ECL输出信号，以及3D DNAzyme Walker的信号放大能力，构建了一种ECL传感器，实现了对miRNA-133a的高特异性、高灵敏度检测，据此建立的灵敏，快速，简单的ECL分析技术，有望实现在临床上对AMI的早期诊断和及时治疗。
本发明提供的ECL复合材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA具有较强的过氧化物酶活性，同时表面的AuPt NPs足够细小(2～3nm)，铺散均匀，可大量负载ABEI，显著提高ECL信号。
本发明利用DNAzyme的切割作用，构建了双重DNA Walker级联扩增系统，有望实现更高的检测灵敏度，且无生物酶参与的设计降低了实验环境的要求；同时，该传感器具有一定通用性，有望用于其他生物标志物的检测以及相关医学领域的研究中，为检测其它多种核酸标志物提供新的思路和技术指导。
附图说明
图1显示为本发明实施例中传感器的构建过程及检测原理图。
图2显示为本发明实施例1中材料Ni-Fe PBA的扫描电镜(SEM)表征图。
图3显示为本发明实施例1中材料Ni-Fe PBA的透射电镜(TEM)表征图。
图4显示为本发明实施例1中材料AuPt@Ni-Fe PBA的扫描电镜(SEM)图。
图5显示为本发明实施例1中材料Ni-Fe PBA和AuPt@Ni-Fe PBA的X射线衍射(XRD)结果图。
图6显示为本发明实施例1中材料Ni-Fe PBA和AuPt@Ni-Fe PBA的TMB显色结果图。
图7显示为本发明实施例1中材料Ni-Fe PBA和AuPt@Ni-Fe PBA对ABEI的ECL信号促进作用结果图。
图8显示为本发明实施例1中终材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA的ECL信号结果图。
图9显示为本发明实施例2中验证本发明双循环体系可行性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果图。
图10显示为本发明实施例3中验证本发明验证双循环体系可行性的荧光信号结果图。
图11显示为本发明实施例5中验证多巴胺(DA)修饰的猝灭探针PH对ECL信号的猝灭作用结果图。
图12显示为本发明实施例6中验证ECL传感器对靶标miRNA-133a的检测的可行性的结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)是一种由电化学方法触发的化学发光现象。与化学发光相比，ECL无需使用任何额外光源，而是将化学发光技术的超灵敏性和电化学技术的高可控性巧妙结合，赋予了其独特的优势，如操作简单、响应快速、灵敏度高、可控性强及背景信号低等，ECL生物传感器己广泛应用于生物医学、食品安全、环境检测等多个领域。电化学发光底物N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)是发光底物鲁米诺的一种新的衍生物，它比原型更活跃，更容易与共反应物反应，从而获得更强的ECL信号。
普鲁士蓝(Prussian Blue，PB)及其类似物(Prussian Blue Analogue，PBA)具有成分和结构的多样性，且表现出独特的磁性、光学、主客体、氧化还原和吸附特性。首先，PB(A)s具有多种氧化还原性质，包括芬顿(Fenton)催化剂、析氧反应(OER)和析氢反应(HER)催化剂。此外，它们在近红外(NIR)区域表现出重要的吸收，具有相对较高的光-热转换系数和抗辐照稳定性，使其可以作为光热剂(PTA)用于癌症或细菌杀灭的光热疗法(PTT)。最后，调整化学成分的PB(A)s可以用作磁共振成像(MRI)、闪烁扫描、光声或计算机断层扫描(CT)成像的纳米探针。PB(A)s的应用具有以下优势：(1)即使在低pH条件下也具有重要的化学稳定性；(2)几种类型的孔隙率允许捕获单价阳离子、小分子和络合物；(3)由于存在非饱和金属中心，可功能化表面；(4)其化学成分的可调性，允许通过取代或掺杂引入不同的过渡金属离子或镧系元素，而不会发生结构变化。这些多重性质和优势使PB(A)s在生物医学、气体捕获与储存、电池、催化、传感、去污等技术应用中非常广泛。
脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme)是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。首先，它的分子量相对较小，结构稳定，催化效率高，易于合成修饰；其次，只需金属离子的辅助就可具较高酶活性，不需其他辅助蛋白；此外，通过两端结合臂与靶标序列的互补配对结合可精确识别和切割靶标，具有较高的特异性。基于以上优点，其在生物医学领域得到了广泛应用。
基于以上各个方面，本发明主要从提高检测的灵敏度和特异性出发，整合分子生物学、生物分析化学、纳米材料科学等多学科多技术，构建了一个高灵敏度的电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)传感器，以实现对miRNA的低丰度、高特异性检测。
本发明的ECL传感器构建过程及检测原理如图1所示，首先，合成具有过氧化物酶活性的镍铁普鲁士蓝类似物(Ni-Fe PBA)，并在表面原位还原金铂纳米颗粒(AuPt NPs)，实现对电化学发光底物N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)的大量负载和ECL信号的联合促进作用，合成的终材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA作为电极上的底层材料，提供高强度的ECL信号基础；其次，在底层材料上连接修饰多巴胺(Dopamine，DA)的单链报告探针PH，通过DA对ECL信号的猝灭作用，实现信号由“on”到“off”的转变；最后，通过在均相体系中的金纳米颗粒(AuNPs)上负载预先封闭的脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme)链(为长臂链WS和阻断链BS组装形成的双链)和可被切割的轨道发夹TH，构成3D脱氧核酶步行器(3D DNAzymeWalker)，其中轨道发夹TH同时含有被WS切割的位点和被封闭的DNAzyme序列。当靶标miRNA-133a存在时，通过链置换作用暴露出长臂链WS的DNAzyme部分，轨道发夹TH的特异性位点被切割，暴露出新的DNAzyme序列，形成具有多足的活性3D DNAzyme Walker，当将该均相体系滴加到工作电极表面时，3D DNAzyme Walker的结合臂能够特异性识别并切割电极上的猝灭探针，淬灭探针顶部的猝灭基团DA被释放，由此产生可被测量的ECL信号，实现对miRNA-133a的检测。
具体的，本发明的ECL复合材料、传感器的构建过程及对靶标miRNA-133a的检测方式主要如下：
1.ECL复合材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA的构建
首先，通过常温静置的简便方法，合成具有过氧化物酶活性的Ni-Fe PBA，其次，在材料表面原位还原，使其负载均匀的AuPt NPs，形成AuPt@Ni-Fe PBA。AuPt NPs的作用有二，即(1)具有过氧化酶活性，能够催化反应底物H2O2，促进ABEI的ECL信号；(2)作为连接中间体，连接ABEI和Ni-Fe PBA。最后，通过连接ABEI，得到具有良好ECL初始信号的复合材料。
2.核酸序列的设计与3D DNAzyme Walker的构建
组成3D DNAzyme Walker的成分主要有作为Walker主体部分的核酸链，以及作为3D轨道的Au NPs。首先，设计合理的核酸序列，使其能够通过靶标驱动级联循环的进行，分别通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光平台进行可行性的验证。其次，合成粒径均匀、分散良好的Au NPs，作为3D Walker的载体部分；最后，通过盐老化法，将Walker组分的核酸链通过Au-S键与Au NPs连接，最终得到均相中的多臂3D DNAzyme Walker。
3.整体ECL传感器的整合，靶标miRNA-133a的检测
在均相体系中加入靶标，启动第一循环过程，37℃反应1h，得到的活性3D DNAzymeWalker滴加到ECL电极的固相平台上，进行第二个循环过程，37℃反应1h，猝灭探针被剪切，检测ECL信号的恢复情况，根据最后的ECL信号，即可定量检测miRNA-133a的含量。
本发明提供的技术简单、快速、灵敏，具有优良的信号放大性能，将被发展用于低丰度靶标miRNAs含量的超灵敏检测。
另外，为提高检测效能，实现临床实际应用，基于上述ECL平台所建立的生物传感检测新策略，本发明拟收集临床AMI患者血液样本，应用所构建的传感器对靶标miRNA-133a进行快速、超灵敏检测，并从准确度、精密度、线性范围等方面对方法学进行评价，并开展临床检测应用。
下面具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
复合材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA的合成与表征
1.Ni-Fe PBA的合成
以乙酸镍、二水合柠檬酸三钠和铁氰化钾为原料，通过常温静置的方法合成得到Ni-Fe PBA，此方法不需额外的加热和搅拌操作，简便快捷。所有化学试剂均购自上海生工。具体步骤如下：
1.1.将0.30g四水合乙酸镍(II)【Ni(CH3COO)2·4H2O】和0.441g二水合柠檬酸三钠【Na3C6H5O7.2H2O】溶解在40mL去离子水中，形成溶液A；
1.2.将0.264g六氰基铁酸钾(III)(铁氰化钾)【K3Fe(CN)6】溶解在60mL去离子水中，形成溶液B；
1.3.在磁力搅拌下将溶液B添加到溶液A中，连续搅拌1min后，所得混合溶液在室温下静置老化24h；
1.4.通过分装离心100mL产物溶液(9000rpm，5min)，得到深棕色沉淀，用去离子水洗涤3次去除未反应试剂，最后复溶为20mL Ni-Fe PBA水溶液，颜色为棕黄色。留取部分4℃暂存，进行后续实验，剩余部分在65℃下干燥过夜，以粉末状保存以及送检X射线衍射(XRD)表征。
2.AuPt@Ni-Fe PBA的合成
在含有表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)的去离子水体系中，依赖还原剂NaBH4的还原作用，以HAuCl4和H2PtCl6为原料进行金铂的原位还原，得到AuPt@Ni-Fe PBA，所有步骤均在常温下进行。具体步骤如下：
2.1.取2mL Ni-Fe PBA水溶液，离心去上清，无水乙醇复溶为8mL体系，加入0.01gPVP，搅拌30min；
2.2.将0.144mL H2PtCl6(20mM)/0.098mL HAuCl4(29.4mM)溶于9.6mL去离子水中，一次性全部加入上述体系，继续搅拌10min；
2.3.现配NaBH4溶液，将0.005g NaBH4溶于10mL去离子水中(为尽量避免产生气泡，可将EP管冰浴)；
2.4.取0.5mL NaBH4溶液加入上述体系，搅拌30min；
2.5.通过离心(9000rpm，5min)上述反应体系得到沉淀，使用去离子水洗涤3次，最后复溶为4mLAuPt@Ni-Fe PBA水溶液(稀释2倍)，4℃暂存备用。
3.ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA的合成
在去离子水中通过直接搅拌的方式，通过Au-N键连接发光底物ABEI，得到终材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA，修饰在玻碳电极上后，在碱性PBS体系中产生高ECL信号。具体步骤如下：
3.1.将2mL AuPt@Ni-Fe PBA水溶液用去离子水稀释至20mL体系，加入500μL 10mMABEI，在室温下搅拌30min；
3.2.通过离心获得沉淀，用去离子水洗涤3次以除去多余的ABEI，得到终材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA，最后悬浮于2mL 0.1％壳聚糖溶液中，4℃保存备用。
4.复合材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA的表征
对材料进行了表征分析，包括扫描电子显微镜(SEM)，透射电子显微镜(TEM)，X射线衍射分析(XRD)。图2和图3分别为Ni-Fe PBA的SEM和TEM图像，可见材料为大小十分均一的正方体形状，粒径在50-60nm之间，分散性良好；图4为AuPt@Ni-Fe PBA的TEM图像，可见正方体表面变得相对粗糙，可见AuPt NPs的负载，同时，其负载未改变Ni-Fe PBA的相貌；图5为两种中间材料的XRD结果，与标准Ni-Fe PBA的特征性衍射峰保持一致，同时AuPt NPs的负载未改变其内部晶体结构，说明材料的成功合成。
5.材料的性能验证
5.1.TMB显色实验
通过TMB显色初步验证了材料Ni-Fe PBA和AuPt@Ni-Fe PBA的过氧化物酶活性。显色体系：100μL TMB显色液+2μL 10M H2O2溶液+1μL材料。结果如图6所示，由于AuPt NPs的负载，AuPt@Ni-Fe PBA的显色程度显著高于Ni-Fe PBA。
5.2.ECL检测实验
5.2.1.通过在溶液中滴加材料(Ni-Fe PBA/AuPt@Ni-Fe PBA)和ABEI，验证材料的递进促进作用。反应体系：2mL 0.1M PBS(pH 8.0)+2μL 10M H2O2溶液+1μL10M ABEI+2uL材料。实验参数：电位范围：0-0.5V；扫描速率：0.15Ws；光电倍增管高压：800V。结果如图7所示，两种材料对ABEI的ECL信号有明显的促进作用。由于AuPt NPs的负载，AuPt@Ni-Fe PBA的显色程度明显高于Ni-Fe PBA。
5.2.2.将终材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA的壳聚糖溶液混匀后修饰于玻碳电极上，每根电极10μL，在37℃烘箱中干燥30min左右，待形成一层平滑的材料层，使用ECL仪检测信号。反应体系如下：2mL 0.1M PBS(pH 8.0)+2μL 10M H2O2溶液。实验参数：电位范围：0-0.5V；扫描速率：0.15V/s；光电倍增管高压：800V。结果如图8所示，材料产生较高的ECL信号，且在连续多个扫描循环中信号没有明显变化，具有较好的稳定性。
实施例2
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)验证双循环体系可行性
通过PAGE实验验证本发明双循环体系的可行性，体系中涉及的核苷酸序列见表1。
表1核苷酸序列表
注：下划线部分表示DNAzyme活性序列；/rA/表示核糖腺苷酸。
1.双链和发夹的组装
所有核苷酸链使用Tris-HCl Buffer(170mM NaCl，20mM Tris，5.0mM KCl，1.0mMMgCl2，pH 7.4)融链，终浓度为100μM，分装保存，5种组分均取10μL，稀释至20μL 10uM备用；将WS和BS单链在Tris-HCl Buffer中以1∶1.1的摩尔比退火，退火过程为在95℃水浴变性5min，然后缓慢降至室温，最后置于4℃冰箱中保存，制备成终浓度为10μM的*WS+BS双链；发夹TH稀释为10uM，以相同的方式退火，形成稳定的发夹结构*TH。
2.PAGE体系反应与电泳
配制浓度为12％的PAGE凝胶进行电泳实验。实验参数：各核苷酸组分终浓度为1μM；Mn2+浓度为10mM；反应温度为37℃；反应时间为1h；反应总体积为10μL；泳道加样体积为6μL；电压为110V，电泳时间为50min。各泳道体系见表2，每组分加样量为1μL，不足10μL的体系用去离子水补足。
表2电泳体系
组分/泳道 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
WS + +
BS +
TA + + + +
*TH + + + + + +
PH + + + + +
*WS+BS + + + + + +
Mn2+ + + + + + +
电泳结果如图9所示，其中泳道M为20bp DNA Marker；泳道1、2、3、4和5分别对应于WS、BS、TA、TH和PH；泳道6表可见WS和BS成功组装为双链；泳道7可见靶标TA链置换出阻断链BS形成双链结构，暴露出WS单链；泳道8可见当不存在TA时，双链中的WS无法切割轨道发夹*TH，而泳道9存在TA时，暴露出的WS在Mn2+的辅助下切割了TH链；泳道10和11为完整双循环系统体系的阴阳性组，可见不存在TA时，发夹TH和探针PH很少被切割，而存在TA时，TH和PH几乎被完全切割；泳道12中可见单独的WS无法切割PH，表面第一个循环中的DNAzyme无法切割第二个循环中的探针，泳道13可见发夹*TH在被切割前，其中的DNAzyme序列几乎未切割探针PH，由此说明了双循环体系的依次进行。综上，证明了双循环系统的可行性。
实施例3
通过荧光验证双循环体系可行性
在探针PH的两端修饰荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，命名为PHf,通过荧光检测进一步验证双循环系统的可行性。实验参数：总体积为100μL；PHf终浓度800nM，其余各核苷酸组分终浓度为400nM；Mn2+终浓度为10mM；反应温度为37℃；反应时间为1h；反应体系见表3。
将上述反应物加入石英比色皿中，利用荧光分光光度计进行测量，具体包括以下步骤：
1.荧光比色皿清洗：将荧光比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗；
2.设置参数：设置激发波长为490nm，发射波长范围为500nm，电压为600V；
3.调零：向荧光比色皿中加入ddH2O，进行调零；
4.进行检测：将反应液加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
荧光结果如图10所示，当靶标TA存在时，荧光信号得到明显的恢复，由此验证了双循环体系的可行性。
表3荧光可行性的验证体系
组分/样本 阴性组(a) 阳性组(b)
*WS+BS + +
TA +
*TH + +
PHf + +
Mn2+ + +
实施例4
3D DNAzyme Walker的构建
1.合成粒径为13nm的Au NPs：
在带有磁力搅拌珠的烧杯中加入85.2mL去离子水和3mL HAuCl4(29.4mM)，置于磁力搅拌器上的油浴装置中，130℃环境下搅拌加热直至沸腾；
配制三水合柠檬酸三钠溶液，0.1g粉末溶于10.1mL去离子水中，迅速全部加入上述沸腾溶液，持续加热煮沸20min，溶液颜色由金黄转为黑色，最后变为酒红色；
停止油浴加热，继续搅拌，缓慢冷却至室温，后转移至避光瓶中置于4℃冰箱储存。
2.盐老化法构建3D DNAzyme Walker：
2.1.将巯基修饰的长臂链SH-WS与阻断链BS按1∶1.1退火形成双链(SH-WS+BS)；
2.2.将4.5uL的SH-WS+BS(50uM)、44.5uL巯基修饰的轨道发夹SH-TH(50uM)，5uL醋酸钠(500mM，pH 5.2)和0.15uL三(2-羧乙基)膦(TCEP)(100mM)在室温下混合静置1h，以活化巯基；
2.3.上述体系中加入1.6mL己合成的Au NPs，室温避光静置16h；
2.4.上述体系中加入16uL Tris-乙酸(500mM，pH 8.2)，同时加入40uL NaCl(1M)，之后每间隔4h滴加一次40uL NaCl，一共滴加4次，总计160uL，最后一次加入后，混合物室温避光静置过夜(大约10h)；
2.5.上述体系离心(12 000rpm，10min)去除多余试剂，所得沉淀用1.6mL PBS(0.01M，pH 7.4)复溶，在4℃中避光保存备用。
实施例5
验证猝灭探针PH的对ECL信号的猝灭作用
1.将探针PH的5’端和3’端分别修饰羧基和巯基，在EDC-NHS溶液中处理活化羧基。体系为：145μL PBS(0.01M，pH 7.4)+5μL PH链(100uM)+40μL EDC(0.1M)+10μL NHS(0.1M)，4℃冰箱中静置2h；
2.现配1mL 0.1M多巴胺(DA)溶液，具体为，称取0.019g DA粉末，溶于1mL PBS(0.01M，pH 7.4)中。以此为原倍DA溶液，然后，用PBS分别稀释100倍和120倍，待用；
3.将200μL步骤1中活化羧基后的PH链分为两份，分别与100μL的100倍和120倍DA溶液混合，在4℃冰箱中，使用旋转混匀仪震荡过夜，至少8h，形成修饰有两种浓度DA的猝灭探针(100倍DA链和120倍DA链)，可直接使用；
4.清洗玻碳电极，修饰10μL复合材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA，37℃烘箱中烘干后，分别滴加10μL Tris-HCl Buffer、100倍DA链和120倍DA链，在4℃冰箱中静置12h，使用PBS(0.01M，pH 7.4)冲洗电极，去除未结合链，然后测ECL信号。
5.结果如图11所示，复合材料表现出较高的ECL信号，而在修饰有DA链后，信号显著降低；当DA浓度降低时(100倍稀释至120倍稀释)，猝灭作用稍有下降，使得信号得以上升，由此证明了DA对ECL信号的猝灭作用。
实施例6
ECL传感器的整合与靶标miRNA-133a的检测
1.均相反应在30uL体系中进行，阳性组包含10μL已合成的3D DNAzyme Walker(具体操作见实施例4)、3μL 100mM MnCl2、5μL Tris-HCl Buffer(170mM NaCl，20mM Tris，5.0mM KCl，1.0mM MgCl2，pH 7.4)、2μL去离子水和10μL靶标miRNA-133a，阴性组中用去离子水代替靶标，37℃反应1h；
2.电极的修饰提前一晚进行，玻碳电极充分清洗后，使用氮气吹干表面，修饰10μL复合材料ABEI@AuPt@Ni-Fe PBA，37℃烘干，滴加120倍DA链(具体操作见实施例5)，4℃冰箱中静置过夜；
3.将均相反应体系滴加至三根修饰电极上(10μL/根)，37℃反应1h，PBS(0.01M，pH7.4)冲洗电极，然后测ECL信号。反应体系：2mL 0.1M PBS(pH 8.0)+2μL 10M H2O2溶液。实验参数：电位范围：0-0.5V；扫描速率：0.15V/s；光电倍增管高压：800V。
4.结果如图12所示，当靶标不存在时，ECL信号保存猝灭状态(曲线a)，信号较低，而当靶标存在时，信号明显得以恢复(曲线b)，说明ECL信号的恢复与靶标miRNA-133a有关，由此证明了该ECL传感器的可行性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种电化学发光复合材料，其特征在于，包括具有过氧化物酶活性的镍铁普鲁士蓝类似物Ni-Fe PBA，负载在所述镍铁普鲁士蓝类似物纳米粒子表面的金铂纳米颗粒AuPtNPs，以及通过金-氮共价键与所述金铂纳米颗粒连接的电化学发光底物。
2.根据权利要求1所述的电化学发光复合材料，其特征在于：所述电化学发光底物选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺、鲁米诺中的任意一种。
3.根据权利要求1～2任一项所述的电化学发光复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以镍前驱体、柠檬酸三钠和铁配位化合物为原料，通过常温静置的方法合成得到镍铁普鲁士蓝类似物；
在镍铁普鲁士蓝类似物表面原位还原，使其负载金铂纳米颗粒，形成AuPt@Ni-Fe PBA材料；
将AuPt@Ni-Fe PBA材料与电化学发光底物通过金-氮共价键连接，得到所述电化学发光复合材料。
4.一种电化学发光传感器，其特征在于：包括工作电极和均相体系，所述工作电极上修饰有如第一方面所述的电化学发光复合材料，所述电化学发光复合材料上连接有淬灭探针，所述淬灭探针为修饰有多巴胺的单链报告探针PH，所述单链报告探针PH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述均相体系包括金纳米颗粒Au NPs，所述金纳米颗粒上负载有封闭的脱氧核酶链和可被切割的轨道发夹TH，所述脱氧核酶链为长臂链WS和阻断链BS组装形成的双链，所述长臂链WS、阻断链BS和轨道发夹TH的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、2和4所示。
5.根据权利要求4所述的电化学发光传感器，其特征在于：所述均相体系还包括Mn2+。
6.根据权利要求4所述的电化学发光传感器，其特征在于：能通过链置换作用暴露出长臂链WS的靶标TA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求4所述的电化学发光传感器，其特征在于：在所述电化学发光复合材料上连接淬灭探针的方法包括如下步骤：在修饰有所述电化学发光复合材料的工作电极上滴加修饰有多巴胺的单链报告探针PH，静置反应。
8.根据权利要求4所述的电化学发光传感器，其特征在于：所述淬灭探针的制备方法包括如下步骤：在单链报告探针PH的5’端和3’端分别修饰羧基和巯基，活化羧基后，与多巴胺溶液混合进行反应，形成修饰有多巴胺的单链报告探针PH，即所述淬灭探针。
9.根据权利要求1～2任一项所述的电化学发光复合材料和权利要求4～8任一项所述的电化学发光传感器在制备miRNA-133a检测试剂盒中的应用。
10.一种miRNA-133a检测方法，所述检测方法为非疾病检测或治疗目的，其特征在于：采用权利要求4～7任一项所述的电化学发光传感器检测样本中miRNA-133a的存在，包括如下步骤：
将待测样本加入所述均相体系中，混匀后进行第一次循环反应；反应结束后再滴加到所述工作电极上，进行第二次循环反应，反应结束后测量电化学发光信号，根据测量得到的电化学发光信号判断样本中miRNA-133a的存在。
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