CN114414557B - 基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料在电致化学发光检测miRNA中的应用 - Google Patents

基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料在电致化学发光检测miRNA中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料，并将其用于ECL发光体的构建中，借助核酸信号放大技术成功开发了针对miRNA‑24的高灵敏特异性ECL传感器，具有很高的检测灵敏度和准确性。

Description

基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料在电致化学 发光检测miRNA中的应用
技术领域
本发明属于电化学传感技术领域，具体涉及一种基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料，及其在电致化学发光检测miRNA中的应用。
背景技术
电致化学发光(ECL)分析技术拥有电化学的高可控性和光分析的高灵敏性，在生物医学分析、临床检验和环境检测等领域都有着广泛的应用。
新类型的ECL发光体的设计与开发成为目前的研究热点。卟啉类的化合物作为ECL发光体的研究报道也较为普遍。结合低毒性的金属制成配位聚合物不仅能较好的维持生物分子的活性，还可以可有效改善发光体的光学性能。
金属有机框架(MOF)是由金属离子和有机连接自组装而成的微孔结晶材料，具有内表面积大、尺寸可调、易于改性等优点，其固有的有序多孔性使其具有快速扩散通道，有利于电子转移应用广泛。纳米级的MOF材料更是结合了纳米材料和自身MOF的优势，低维度的MOF发光纳米材料可以更有效的改进其ECL发光效率。
MicroRNA是一种内源性非编码小分子RNA，其表达失衡与多种疾病包括癌症密切相关。其中，microRNA-24是非常重要的一员，不仅在多种神经系统疾病、心血管系统疾病中发现其表达异常，还参与肺癌、乳腺癌、肝癌等多种癌症肿瘤的发生发展，是疾病早期诊断、病理分级、病程进展和预后评估的重要分子标志物。近年来，国内外学者发展了一些microRNA-24的检测方法，如以多壁碳纳米管-聚酰胺树枝状大分子和亚甲基蓝为氧化还原指示的传感，以聚苯胺水凝胶的氧化还原电流作为检测DNA/RNA杂交反应的生物传感和基于三维纳米多孔导电聚合物的电化学生物传感，然仍需提升性能以适应临床要求。microRNA-24作为疾病标志物的快速、灵敏、准确的ECL传感检测平台仍有待开发。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料，并将其用于ECL发光体的构建中，借助核酸信号放大技术成功开发了针对miRNA-24的高灵敏特异性ECL传感器，具有很高的检测灵敏度和准确性。
因此，本发明首先提供了纳米级金属有机框架材料(2D-Zn-TCPP MOF)在miRNA的ECL检测方面的应用，所述纳米级金属有机框架材料(2D-Zn-TCPP MOF)具有：由四羧基苯基卟啉(TCPP)与锌通过苯环上的羧基配位形成的纳米层，纳米层间通过4，4′-联苯二甲酸(BPDC)和四羧基苯基卟啉(TCPP)的羧基与锌配位形成间隔，同时锌还与四羧基苯基卟啉(TCPP)的卟啉环中的氮配位结合。
在所述纳米级金属有机框架材料(2D-Zn-TCPP MOF)结构中，在纳米层内，通过锌与卟啉环中的氮配位、以及锌与TCPP的苯环上的羧基配位，形成金属节点间的配位螯合作用，有效提高了纳米层的ECL性能；同时，4，4′-联苯二甲酸(BPDC)作为成核调节剂，通过锌同时与BPDC和TCPP的苯环上的羧基配位，形成纳米层间间隔，空间位阻的增加阻碍了MOF的各向异性生长，促进了二维结构的形成和稳定。二维结构的纳米级金属有机框架材料有利于嵌入双链DNA沟槽并与锌配合物掺杂石墨烯量子点Zn,N,S-GQDs协同作用。
其中，所述纳米级金属有机框架材料(2D-Zn-TCPP MOF)的原料中，锌(以原料中的Zn计)、四羧基苯基卟啉(TCPP)和4，4′-联苯二甲酸(BPDC)的原料质量比为(3±0.3)：(1±0.3)：(1±0.3)。
本发明还提供了一种用于miRNA检测的ECL传感器，包括：含有锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)的基础电极，能够与目标物miRNA特异性结合的DNA链HP1，能够置换目标物miRNA与DNA链HP1复合的DNA链HP2，能够连接于DNA链HP2并交替循环的DNA链HP3和DNA链HP4，以及上述纳米级金属有机框架材料(2D-Zn-TCPP MOF)。
其中，所述锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)由锌配位的二硫苏糖醇(Zn-DTT)在含有二水柠檬酸三钠和尿素的混合溶液中制成。三者质量比为(0.5mg-2.5mg)：(0.4g-0.6g)：(0.6g-0.8g)。所述锌配位的二硫苏糖醇(Zn-DTT)由二硫苏糖醇(DTT)溶液和可溶性锌盐溶液混合制成，其中二硫苏糖醇和锌离子的摩尔比为(1～2)：1。
其中，所述DNA链HP1通过Zn-S键与锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)连接。
其中，所述miRNA为miRNA-24。
其中，所述基础电极上，未连接HP1的位置上还设有6-巯基-1-己醇(MCH)封闭的非特异性位点。
其中，所述ECL传感器对miRNA具有10fM～1aM的检测范围和数量级在aM级的检测限。
本发明还提供了一种对miRNA检测的方法，采用含有锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)的基础电极，将目标物miRNA和能够与目标物miRNA特异性结合的DNA链HP1共同加入基础电极并进行CHA循环，然后加入DNA链HP3和DNA链HP4在HP2上进行HCR循环，最后在电极表面修饰上述纳米级金属有机框架材料(2D-Zn-TCPP MOF)，根据ECL响应强度与miRNA浓度的线性关系对目标物miRNA的浓度进行判定。
其中，所述锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)由锌配位的二硫苏糖醇(Zn-DTT)在含有二水柠檬酸三钠和尿素的混合溶液中制成。三者质量比为(0.5mg-2.5mg)：(0.4g-0.6g)：(0.6g-0.8g)。所述DNA链HP1通过Zn-S键与锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)连接。所述miRNA为miRNA-24。所述基础电极上，未连接HP1的位置采用6-巯基-1-己醇(MCH)进行非特异性位点的封闭。
本发明的有益效果在于：基于卟啉配体与金属锌的低毒性低维度金属有机框架ECL发光体纳米材料的开发，其展现了较好的ECL性能。将其应用于针对miRNA的ECL传感器设计、尤其是针对miRNA-24传感器的设计，具有相对于现有技术更好的选择性和灵敏度，背景信号低。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为本发明锌的金属有机框架纳米材料的合成以及ECL传感器的构建过程。
图2为Zn,N,S-GQDs形貌(A)和元素表征(B)图。
图3为Zn-MOF、Zn-TCPP与TCPP的UV-vis吸收光谱表征结果。
图4为Zn-MOF与TCPP的荧光光谱表征结果。
图5为采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA的组装的验证结果。
图6为修饰电极各个步骤的ECL响应测试结果。其中，
(a)GCE；
(b)GCE/AuNPs；
(c)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs；
(d)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1；
(e)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH；
(f)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2；
(g)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4；
(h)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF。
图7为修饰电极各个步骤的CV(A)和EIS(B)响应测试结果。其中，
(a)GCE；
(b)GCE/AuNPs；
(c)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs；
(d)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1；
(e)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH；
(f)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2；
(g)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4；
(h)GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF。
图8为本发明制备的Zn-MOF以及修饰电极的ECL测试结果。其中，(Aa)修饰电极GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/Zn-MOF进行ECL测试的T-P数据，(Ab)修饰电极GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/Zn-MOF进行ECL测试的稳定性数据，(Ac)修饰电极GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF进行ECL测试的稳定性数据。
图9为不同卟啉结构的纳米材料对修饰电极的信号放大作用的ECL测试结果。其中，2D-ZnMOF(BPDC)、2D-ZnMOF(BA)、TCPP、和Zn-TCPP分别为不同的电极修饰材料，依次分别对应：
GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF(BPDC)；
GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF(BA)；
GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/TCPP；
GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-TCPP。
图10为本发明的传感器对miRNA-24的线性响应图。(A)为miRNA-24不同浓度下的ECL信号强度，(B)为传感器的ECL相应与miRNA-24浓度的线性关系。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明采用锌配位卟啉类有机物，设计形成了低毒性低维度纳米级金属有机框架MOF，作为ECL发光体具有有效改进的光学性能，并结合核酸信号放大策略，针对miRNA高灵敏特异性的检测要求，进行了多步修饰电极的优化设计，获得了低背景信号的ON-OFF-ON型ECL传感器，尤其适用于miRNA-24的高灵敏特异性检测。
下面通过一种详细的示例具体说明本发明传感器的制备过程及其性能评价。
如图1所示为本发明锌的金属有机框架纳米材料的合成以及ECL传感器的构建过程。具体过程如下。
(1)低毒性低维度纳米级金属有机框架MOF(下文简称2D-Zn-TCPP MOF，或Zn-MOF)的制备
将4.0mg四羧基苯基卟啉(TCPP)溶解于24ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中形成均相溶液。再添加4ml硝酸锌(3mg·ml-1)，在上述28ml TCPP和硝酸锌的混合物中边搅拌边加入4.0mg 4，4′-联苯二甲酸(BPDC)，混合物加热到150℃，并搅拌反应一小时。通过离心并用乙醇洗涤三次得到2D-Zn-TCPP MOF。
(2)锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)的制备
将1ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液(60mg mL-1)和二硫苏糖醇(DTT)溶液(0.1M)与硫酸锌(0.5ml，0.1M)混合，搅拌10min，使用氢氧化钠(1.0M)将PH调整至5-6。随后，用超纯水纯化，得到的Zn-DTT在2.5mL超纯水中重新分散。将0.5200g二水柠檬酸三钠和0.6003g尿素溶解在11.2mL超纯水中，搅拌形成Zn-DTT悬浮液的透明溶液。将溶液转移到50mL特四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在160℃下加热8小时。在溶液中加入乙醇并洗涤3次，收集最终产物Zn,N,S-GQDs。
(3)ECL传感器的制备
将处理干净的裸玻碳电极(GCE)先通过电沉积法将AuNPS修饰到电极上，获得GCE/AuNPs。待其干燥后再滴加Zn,N,S-GQDs于电极表面，获得GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs，此时得到“On1”信号。然后与发夹状DNA1(HP1，10μL，2.00×10-6mol·L-1)在4℃下孵育过夜，获得GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1。接下来在室温下，滴加10μL MCH(1.00mmol·L-1)40分钟以阻断非特异性结合位点，获得GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH。然后继续在室温下将5μL不同浓度(1.00×10-18至1.00×10-10mol·L-1)的靶向miRNA-24和5μL发夹状DNA2(HP2，1.00×10-6mol·L-1)分别滴到电极上孵育1h，获得GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2。然后，将电极与5μL杂交DNA3(HP3，1.00×10-6mol·L-1)和5μL杂交DNA4(HP4，1.00×10- 6mol·L-1)孵育1h以形成双链聚合DNA，获得GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4，此时得到“OFF”信号。然后再向电极滴加2D-Zn-TCPP MOF，待其干燥后测ECL，获得GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF，得到“On2”信号。每一步滴加物质孵育后都用超纯水淌洗，以除去未结合的核酸链。
上述步骤中所用的各核酸序列如下：
miRNA-24：
UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG；
HP1：
Figure BDA0003479985750000061
HP2：
Figure BDA0003479985750000062
HP3：
Figure BDA0003479985750000063
HP4：
Figure BDA0003479985750000064
本方法构建ECL传感器的原理为：
首先利用新型锌配合物掺杂石墨烯量子点(Zn,N,S-GQDs)作为基础ECL发光体，结合基于目标物(miRNA-24)的核酸信号放大策略，将相应的可互补的发夹DNA链HP1修饰于电极表面，HP1可通过Zn-S键修饰到电极上。用6-巯基-1-己醇(MCH)封闭非特异性位点后待用。
然后滴入的目标物microRNA-24通过与HP1的特异性结合，展开HP1以触发(催化发夹自组装反应)CHA循环。发夹DNA链HP2与HP1新暴露出的粘性末端区域杂交，打开HP2的发夹结构，置换出microRNA-24，形成HP1-HP2复合物，释放的microRNA-24进一步与另外的HP1杂交，形成新一轮的CHA循环。此过程对目标物形成了循环放大的效果。
HP3和HP4的加入启动杂交链式反应(HCR)。HP2暴露出的粘性末端区域与发夹DNA链HP3杂交，打开发夹结构，HP3新暴露出的粘性末端区域与发夹DNA链HP4杂交，然后HP3和HP4交替往复循环并被固定在电极表面，淬灭ECL信号。
最后，在电极表面修饰上新型的自制卟啉类发光体2D-Zn-TCPP MOF，由于本发明二维的卟啉类配合物可嵌入双链DNA沟槽，大量Zn-MOF可与锌配合物掺杂石墨烯量子点Zn,N,S-GQDs协同作用，作为ECL信号源以再次“Signal-on”的方式，实现对疾病标志物microRNA-24的超灵敏传感分析。通过对HP1的DNA序列进行设计，可构建具有普适性的核酸类目标物的特异性、高灵敏ECL传感。
图2为本发明制备的Zn,N,S-GQDs的表征结果。由透射电镜(A)可以看出，其形貌为直径在2nm左右的粒子，样品的均一性较好。微区成分元素种类与含量分析表征结果(B)显示，材料中含有Zn,N,S元素，掺杂量子点的制备成功。
图3为Zn-MOF、Zn-TCPP与TCPP的UV-vis吸收光谱表征结果。其中，TCPP是采用上述制备Zn-MOF相同的方法，直接将四羧基苯基卟啉制备成分散液，然后滴加在电极表面替代Zn-MOF进行修饰的对比物；Zn-TCPP是将金属锌与卟啉环中的氮结合、而没有与苯环上的羧基结合而形成的化合物制成分散液，滴加在电极表面替代Zn-MOF进行修饰的对比物。替代Zn-MOF进行修饰的TCPP和Zn-TCPP的结构分别为：
Figure BDA0003479985750000071
TCPP在419nm处表现出较强的光吸收，在513nm、52nm、590nm、648nm处表现处较弱的光吸收。当金属锌离子与TCPP卟啉环中的氮原子结合形成Zn-TCPP时，TCPP的主吸收峰由419nm偏移至414nm，随着2D-Zn-TCPP MOF纳米材料的形成，光吸收峰进一步发生偏移，这是TCPP配体与金属锌离子发生配位反应的结果。
图4为Zn-MOF与TCPP的荧光光谱表征结果。TCPP在660nm和720nm处有两个峰值，随着2D-Zn-TCPP MOF的合成，峰值偏移到620nm和670nm处，这是金属离子的配位作用，使其光学性质发生了改变。
图5采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA的组装进行了验证。测试条件为：6％PAGE，样品总体积30uL，梯度退火(95℃5min；65℃30min；50℃30min；37℃30min；25℃30min)，跑胶条件：110V 60min 25℃。单一的DNA链(HP1-HP4)和miR-24(即microRNA-24)分别呈现不同的单一的条带。通过对不同DNA链的1:1混合测试，我们可以看到混合物HP1+miR-24和HP2+HP3的条带略有集中，说明二者之间存在了一定的作用而又非完全的结合。HP3与HP4的混合样与ladder测试有出现很多个条带，表明HP3与HP4不断延伸，起到了放大目标RNA的作用。
图6显示了采用ECL技术对传感器的分步组装的验证结果。裸玻碳电极(GCE，曲线a)基本无ECL信号产生；当沉积了纳米金粒子之后(GCE/AuNPs，曲线b)，出现了较弱的ECL信号，源于金纳米粒子对过硫酸根的催化作用；继续修饰锌掺杂的石墨烯量子点之后(GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs，曲线c)，则出现了一个较大的ECL信号，源于掺杂石墨烯量子点的强ECL发光性能；随着逐步修饰HP1(GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1，曲线d)、封闭剂巯基己醇MCH(GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH，曲线e)，miR-24和HP2(GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2,曲线f)，HP3和HP4(GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4，曲线g)，修饰电极的ECL信号强度依次减弱，源于DNA骨架对电子传递的阻碍作用，使得信号明显减弱。当孵育了本方案的Zn-MOF材料之后(GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF,曲线h)，ECL信号具有较大的提升，源于DNA骨架对卟啉分子的吸附能力和本方案卟啉Zn-MOF的强发光能力。
图7为采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)技术进一步对传感器的分步组装的验证结果。如图A，裸玻碳电极(GCE)显示出一对可逆的氧化还原峰[Fe(CN)6]3-/4-(曲线a)。在裸GCE上修饰AuNPs后，峰电流明显增大(曲线b)。当用锌参杂的石墨烯量子点和DNA依次修饰AuNPs/GCE时，由于量子点的是半导体，以及形成的DNA分子层阻碍了电子的传递，使峰电流逐次降低(曲线c至g)。最后，当本方案提出的Zn-MOF修饰上之后(曲线h)，电流略有升高，源于其在电极表面对DNA骨架分子的填充更利于电子的传输。图B显示了传感构建过程的奈奎斯特曲线图。首先，由于[Fe(CN)6]3-/4-(曲线a)的电子转移电阻(Ret)较低，裸露的GCE呈现出较小的半圆形直径。将AuNPS修饰在裸GCE上后，由于电子转移效率的提高，AuNPs/GCE的Ret明显降低(曲线b)。将锌掺杂的石墨烯量子Zn,N,S-GQDs修饰到AuNPs/GCE上，由于半导体量子点的负电阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-的电子转移，Ret增加(曲线c)。随后，将DNA、RNA链和封闭剂MCH等修饰到电极上后，由于DNA骨架带负电阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-的电子转移，Ret增加(曲线d至f)。最后，当本方案提出的Zn-MOF修饰上之后(曲线h)，Ret减小，源于其在电极表面对DNA骨架分子的填充更利于电子的传输。该测试结果与CV一致，表明传感器的构建成功。
图8显示了本发明制备的修饰电极的ECL稳定性测试结果。ECL测试方法为将待测试的修饰电极置于装有PBS(PH＝7.4)的K2S2O8(50mM)溶液中作为底液进行ECL测试。其中图Aa和图Ab采用不含HP3-HP4杂交链的修饰电极GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/Zn-MOF,作为对比参照，图Ac为本发明方法制备的GCE/AuNPs/Zn,N,S-GQDs/HP1-MCH/Prob-HP2/HP3-HP4/Zn-MOF修饰电极。图Aa所示，在电势为-1.4V左右有较强发光，并伴有双峰现象，其最大发光强度为16500a.u.左右，且图Ab所示在连续350S的连续测试下具有较好的稳定性。在上述的测试条件下，本发明制备的修饰电极(图Ac)也在250S的连续循环测试中展现了较好的稳定性和较强的ECL强度，并且消除了双峰现象。
图9针对不同卟啉结构的纳米材料对修饰电极的信号放大作用进行了ECL测试。由图可以看出，本发明以四羧基苯基卟啉(TCPP)为配体制备的2D-Zn-TCPP MOF，相比于以苯甲酸(BA)为小配体制备的Zn-MOF(BA)、以及TCPP或Zn-TCPP的直接修饰，对生物传感具有更好的ECL信号响应，以及更好的灵敏度。
图10展示了本发明的传感器对miRNA-24的线性响应图。随着miRNA-24浓度的增加，生物传感器的ECL强度相应增强(图A)。传感器的ECL响应与miRNA-24的浓度呈较好的线性关系，检测范围为10fM～1aM，检测限为0.34aM，线性回归方程为I＝20628+1006.4lgC(R＝0.9986)(图B)。
通过将生物传感器的检测范围以及检测限与其他工作进行比较(表1)，也表明本发明的生物传感器分析性能良好，相对于现有一般技术的检测精度，本发明的检测限降低了3个数量级。
表1本发明与其他现有技术检测方法对miRNA-24的检测效果对比
Figure BDA0003479985750000091
1.L.Yang,H.Wang,H.Lü,N.Hui,Phytic Acid Functionalized AntifoulingConducting Polymer Hydrogel for Electrochemical Detection of MicroRNA,Analytica Chimica Acta,https://doi.org/10.1016/j.aca.2020.05.025.
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最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种用于miRNA检测的ECL传感器，包括：含有锌配合物掺杂石墨烯量子点的基础电极，能够与目标物miRNA特异性结合的发夹DNA链HP1，能够置换目标物miRNA与发夹DNA链HP1复合的发夹DNA链HP2，能够连接于发夹DNA链HP2并交替循环发生杂交链式反应的发夹DNA链HP3和发夹DNA链HP4，以及纳米级金属有机框架材料2D-Zn-TCPP MOF；
所述发夹DNA链HP1通过Zn-S键与锌配合物掺杂石墨烯量子点连接；
所述纳米级金属有机框架材料具有：由四羧基苯基卟啉与锌通过苯环上的羧基配位形成的纳米层，纳米层间通过4，4′-联苯二甲酸和四羧基苯基卟啉的羧基与锌配位形成间隔，同时锌还与四羧基苯基卟啉(TCPP)的卟啉环中的氮配位结合，所述锌不仅与卟啉环中的氮配位结合，还与苯环上的羧基配位结合形成二维拓扑结构；
所述锌配合物掺杂石墨烯量子点由锌配位的二硫苏糖醇在含有二水柠檬酸三钠和尿素的混合溶液中制成，三者质量比为(0.5mg-2.5mg)：(0.4g-0.6g)：(0.6g-0.8g)，所述锌配位的二硫苏糖醇由二硫苏糖醇溶液和可溶性锌盐溶液混合制成，其中二硫苏糖醇和锌离子的摩尔比为(1～2)：1。
2.根据权利要求1所述的用于miRNA检测的ECL传感器，其特征在于，所述纳米级金属有机框架材料2D-Zn-TCPP MOF的原料中，锌、四羧基苯基卟啉和4，4′-联苯二甲酸的原料质量比为(3±0.3)：(1±0.3)：(1±0.3)。
3.根据权利要求1所述的用于miRNA检测的ECL传感器，其特征在于，所述miRNA为miRNA-24。
4.根据权利要求1所述的用于miRNA检测的ECL传感器，其特征在于，所述基础电极上，未连接HP1的位置上还设有6-巯基-1-己醇封闭的非特异性位点。
5.根据权利要求1所述的用于miRNA检测的ECL传感器，其特征在于，所述ECL传感器对miRNA具有10fM～1aM的检测范围和数量级在aM级的检测限。
6.一种非疾病诊断目的的miRNA的检测方法，采用含有锌配合物掺杂石墨烯量子点的基础电极，将能够与目标物miRNA特异性结合的发夹DNA链HP1通过Zn-S键与锌配合物掺杂石墨烯量子点连接，将目标物miRNA和能够置换目标物miRNA与发夹DNA链HP1复合的发夹DNA链HP2共同加入基础电极并进行CHA循环，然后加入能够连接于发夹DNA链HP2并交替循环的发夹DNA链HP3和发夹DNA链HP4在HP2上进行HCR循环，最后在电极表面修饰纳米级金属有机框架材料，根据ECL响应强度与miRNA浓度的线性关系对目标物miRNA的浓度进行判定；
所述纳米级金属有机框架材料具有：由四羧基苯基卟啉与锌通过苯环上的羧基配位形成的纳米层，纳米层间通过4，4′-联苯二甲酸和四羧基苯基卟啉的羧基与锌配位形成间隔，同时锌还与四羧基苯基卟啉(TCPP)的卟啉环中的氮配位结合，所述锌不仅与卟啉环中的氮配位结合，还与苯环上的羧基配位结合形成二维拓扑结构；
所述锌配合物掺杂石墨烯量子点由锌配位的二硫苏糖醇在含有二水柠檬酸三钠和尿素的混合溶液中制成，三者质量比为(0.5mg-2.5mg)：(0.4g-0.6g)：(0.6g-0.8g)，所述锌配位的二硫苏糖醇由二硫苏糖醇溶液和可溶性锌盐溶液混合制成，其中二硫苏糖醇和锌离子的摩尔比为(1～2)：1。
7.根据权利要求6所述的非疾病诊断目的的miRNA的检测方法，其特征在于，所述纳米级金属有机框架材料2D-Zn-TCPP MOF的原料中，锌、四羧基苯基卟啉和4，4′-联苯二甲酸的原料质量比为(3±0.3)：(1±0.3)：(1±0.3)；所述miRNA为miRNA-24；所述基础电极上，未连接HP1的位置采用6-巯基-1-己醇(MCH)进行非特异性位点的封闭。
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