CN115902202A - 一种mof-dna生物条形码扩增的crispr检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明将纳米技术与生物技术相结合，公开了一种MOF‑DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法对肿瘤生物标志物检测的应用。具体是将酶联免疫检测、纳米技术和CRISPR检测技术三者相结合，通过在Zr‑MOF纳米粒子上共价连接目标物的检测抗体和CRISPR激活链得到Zr‑MOF纳米探针。利用抗体对目标物的特异性识别原理，在目标物的存在下，捕获抗体功能化的磁性纳米探针与Zr‑MOF纳米探针形成夹心免疫结构。Zr‑MOF纳米探针经过一定浓度磷酸盐处理后，可激活链从Zr‑MOF上脱落进而激活CRISPR蛋白的反式切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号，从而实现对目标物的定量检测，方法操作简单、灵敏度高。

Description

一种MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术相结合，具体涉及一种MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法对肿瘤生物标志物及拓宽到其他分子检测上的应用。

背景技术

近些年来，聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)系统在基因组编辑和生物传感领域受到广泛关注。在CRISPR/Cas家族中，Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14和Csm6等Cas蛋白都具有反式切割的活性。因此它们在分子诊断领域显示出了巨大的潜力。由于CRISPR/Cas系统的可编程性依赖于导向RNA与核酸的相互作用，因此往往需要采用一些核酸扩增技术来增强核酸检测的信号输出，如聚合酶链式反应(PCR)、RPA(重组酶聚合酶扩增)和环介导等温扩增(LAPM)等。然而，这些方法不仅耗时、费力、成本高，而且容易造成样品之间的交叉污染。因此，迫切需要有效的策略来实现信号转换和放大，以拓宽CRISPR/Cas系统在非核酸靶标检测中的应用。

金纳米粒子DNA生物条形码技术是一种高效的信号转换策略，可用于检测具有PCR敏感性的蛋白质。然而，该技术使用二硫代苏糖醇(DTT)作为试剂从金纳米粒子中释放DNA生物条形码。由于DTT不稳定，且能减少Cas蛋白中的二硫键，因此该信号转换策略很难与CRISPR/Cas分析相结合。金属-有机骨架材料(MOF)是指过渡金属离子与有机配体通过自组装形成的具有周期性网络结构的晶体多孔材料。由于其具有丰富的孔隙度、高比表面积、显著的吸附亲和力、良好的热稳定性等独特的优点，在生物传感中常被用作生物分子的载体。目前，通过MOF金属位点和核酸化学基团之间形成化学键的策略已经被开发出来。Zr-MOF作为研究较多的MOFs之一，它显示了对磷酸基(-PO3)的高亲和力，可以形成牢固的Zr-O-P配位键，基于这一特性，末端磷标记的DNA链可以通过Zr-O-P键直接共轭到Zr-MOFs表面，具有很高的修饰效率。有趣的是，高浓度的磷酸盐会导致Zr-MOF支架的分解，使装载在MOFs上的DNA释放。Zr-MOF具有易于加载和释放DNA激活链的特点，这表明Zr-MOF可以与寡核苷酸功能化，构建一种新的生物条码工具来转换和放大信号。

然而目前，缺乏一种检测成本低的MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法及其应用。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测成本低的MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法对肿瘤生物标志物及其他分子检测的应用，

为此，本发明采用以下技术方案：本发明的一种Zr-MOF纳米探针的构建方法，所述的Zr-MOF纳米探针是由检测抗体和激活链依次通过共价连接到Zr-MOF纳米粒子上制备形成的；所述的激活链可特异性与CRISPR体系中的crRNA结合，激活CRISPR蛋白的反式切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号。

进一步地，所述的Zr-MOF纳米粒子与激活链摩尔比为1:500，检测抗体的浓度为10μg/mL；所述的抗体为可特异性识别CEA(癌胚抗原)、PSA(前列腺癌特异性抗原)或其它生物标志物中的任意一种；所述的激活链为单链DNA、双链DNA或单链RNA中的任意一种，所述的激活链为5’端修饰磷酸基团的核酸链。

本发明所述的Zr-MOF纳米探针的构建方法制得的Zr-MOF纳米探针。

本发明的一种MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法，包括如下步骤：(1)制备磁性纳米探针：将磁性纳米粒子与抗体共价连接得到磁性纳米探针；

(2)制备Zr-MOF纳米探针：将Zr-MOF纳米粒子与检测抗体、激活链依次共价连接得到Zr-MOF纳米探针；

(3)夹心结构的形成：磁性纳米探针制备完成以后，加入目标物进行反应，之后再加入Zr-MOF纳米探针，通过抗体对目标物的特异性识别作用，三者形成磁性纳米探针-目标物-Zr-MOF纳米探针的夹心复合物结构；

通过抗体对抗原的特异性识别原理，最后三者形成磁性纳米探针-目标物-Zr-MOF纳米探针的夹心结构；

(4)激活链的脱落处理：将一定浓度的磷酸盐对夹心复合物进行降解处理，使激活链从Zr-MOF纳米探针上脱落下来；

(5)基于CRISPR的荧光激活反应：将脱落的激活链加入CRISPR反应体系进行反应，激活链激活CRISPR蛋白的反式切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号，最后通过荧光分光光度计测量荧光强度，数据分析实现目标物的定量分析检测。

进一步地，在步骤(1)中，所述的磁性纳米粒子采用溶剂热法制得，粒径为550nm；在步骤(2)中，所述的Zr-MOF纳米粒子采用溶剂热法制得，粒径为65nm；在步骤(5)中，荧光激活反应在100μL的CRISPR试剂中进行，包括1×NEB 2.1缓冲液、20nM Cas12a蛋白、40nMcrRNA、100nM荧光报告分子。

进一步地，在步骤(5)中，所述的CRISPR试剂包括CRISPR蛋白，crRNA和荧光报告分子，所述的荧光报告分子为两端分别修饰有荧光基团和荧光猝灭基团的核酸链；所述的荧光报告分子中的核酸链为单链DNA或单链RNA中的任意一种；所述的具备反式切割活性的CRISPR蛋白为Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14或Csm6中的任意一种。

本发明所述的将Zr-MOF纳米粒子进行降解处理的方法，用一定浓度的磷酸盐将Zr-MOF纳米粒子降解。

本发明利用所述的CRISPR检测方法进行检测的试剂盒。

进一步地，所述的试剂盒包括CRISPR试剂、阳性标准品和所述的Zr-MOF纳米探针。

本发明的一种利用所述的CRISPR检测方法用于肿瘤生物标志物及其他分子细菌、细胞检测中的应用。

本发明所述的CRISPR检测方法或如所述的试剂盒在疾病筛查、诊断、免疫分析等方面的应用。

有益效果：本发明的方法检测成本低、操作简单、灵敏度高、特异性强，为生物医学研究，食品安全，卫生监管等领域提供一种新的研究手段和思路。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：

(1)本发明是将ELISA、纳米技术与CRISPR生物技术相结合，利用抗体对目标物的特异性识别原理生成夹心复合物结构，完成了目标物识别信号到CRISPR反式切割活性信号的转化，最后再通过CRISPR生物技术，对目标物进行定量分析。整个过程成本低，操作简单、高灵敏度、高特异性。

(2)本发明所述的在Zr-MOF纳米粒子上共价连接抗体和激活链制成Zr-MOF纳米探针的策略，不仅可特异性识别目标物，而且还能激活CRISPR蛋白的反式切割活性，任意切割荧光报告分子产生荧光信号。实现了将目标物识别信号到CRISPR反式切割活性信号的转化。

(3)本发明所述的在Zr-MOF纳米粒子上共价连接抗体和激活链制成Zr-MOF纳米探针的策略，一方面，拓宽了Zr-MOF纳米粒子在生物分析检测中作为生物载体的应用；另一方面，Zr-MOF纳米探针上连接了大量的激活链，可用来代替PCR、LAMP等核酸扩增手段，操作简单、省时。

(4)本发明所述的CRISPR检测方法，其设计思路具有通用性，通过改变Zr-MOF纳米探针上的抗体就可以推广到更多种类疾病肿瘤标志物、细菌、细胞及其他小分子的定量检测，不需更换激活链和相应的crRNA，简化了检测的操作过程，因此，也充分说明了该检测方法有着极高的适用性。

(5)本发明所述的CRISPR检测方法可以将其与试剂盒相结合，使之能够在短时间得到检测结果，为生物医学研究，食品安全，卫生监管等领域提供一种新的研究手段和思路。

附图说明

图1为本发明提供的Zr-MOF纳米探针制备过程的示意图和MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法对肿瘤生物标志物检测的原理示意图；

图2为本发明所述的Zr-MOF纳米粒子(a)和Zr-MOF纳米探针(b)的透射电镜表征图；

图3为本发明所述的Zr-MOF纳米粒子及Zr-MOF纳米探针的紫外表征图；

图4为本发明的PSA(0～10ng/mL)的标准曲线图；

图5为本发明的CEA(0～10ng/mL)的标准曲线图；

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例只是描述性的，不是限定性的，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例1

如图1所示，通过图1简单描述本发明提供的MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法对肿瘤生物标志物的检测原理：

如图1中的“a”部分为Zr-MOF纳米探针的制备过程，通过溶剂热法合成Zr-MOF纳米粒子，之后再分步共价连接抗体和激活链，最后即可得到Zr-MOF纳米探针。如图1中“b”部分所示为MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法对肿瘤生物标志物的检测示意图：具体过程为在目标物存在的条件下，捕获抗体功能化的磁性纳米探针和Zr-MOF纳米探针根据抗体对抗原的特异性识别作用，三者使之形成抗体-目标物-抗体的夹心结构复合物；随后将一定浓度的磷酸盐对夹心复合物进行降解处理，激活链从Zr-MOF纳米探针上脱落下来，而脱落的激活链可与crRNA特异性结合，激活CRISPR蛋白的反式切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号，对反应体系中的荧光强度进行检测，进而实现对分析物的定量分析。

本发明的Zr-MOF纳米探针上的激活链经过一定的磷酸盐处理后可从Zr-MOF上脱落进而激活成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR蛋白的反式切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号，从而实现对目标物的定量检测。本发明利用Zr-MOF纳米探针实现了目标物识别信号到CRISPR反式切割活性信号的转化，同时实现了检测信号的放大。

实施例2

本实施例中，以PSA作为目标物，对其进行定量分析。

1.Zr-MOF纳米粒子的合成

Zr-MOF纳米粒子是通过溶热法合成。首先，将ZrCl₄(32.2mg)超声溶解在1mL的N,N-二乙基甲酰胺(DMF)中。然后，将90.6mg配体BDC-NH₂(2-氨基对苯二甲酸)和4mL DMF倒入10mL的闪烁瓶中超声处理，之后再放在磁力搅拌器上加热到90℃。当瓶内壁表面呈现白雾或水蒸气状态时，将上述的ZrCl₄溶液和2.86mL乙酸同时快速加入进闪烁瓶中，再继续反应6小时。用DMF和甲醇各洗涤三次，最后得到平均粒径为65nm的Zr-MOF纳米粒子。图2a为Zr-MOF纳米粒子的透射电镜表征图；

2.Zr-MOF纳米探针的制备

Zr-MOF纳米探针采用盐析法合成，其制备流程如图1a所示，将1mg的Zr-MOF纳米粒子分散在1mL的HEPES缓冲溶液(10mM，pH7.4)中，然后加入50μL的戊二醛(25％，v/v)并在室温下振荡1.5小时。之后将得到的混合物在8500rpm下离心5分钟，用10mM HEPES洗涤5次。然后，将50μL 10μg/mL的检测抗体加入到上述产品中(溶解在450μL HEPES缓冲液中)，在4℃下反应12小时。用Tris-HCl(pH＝7.4，0.1M NaCl)洗涤两次，最后将产物分散在Tris-HCl缓冲液中，4℃下储存备用。

将上述修饰完抗体的Zr-MOF纳米粒子与10μM的激活链混合，并在室温下振荡12小时。之后，将所得的混合物在8500rpm下离心5分钟，以去除多余的未结合在Zr-MOF纳米粒子上的激活链，并用10mM Tris-HCl(pH7.4，含0.1MNaCl)冲洗两次。最后加入5％牛血清白蛋白BSA阻断缓冲液，在37℃孵育1小时后，用10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl缓冲液洗三次，即可得到产物Zr-MOF纳米探针。图2b为Zr-MOF纳米探针的透射电镜表征图，此外，如图3紫外表征，表明Zr-MOF纳米探针的成功制备。

所述的Zr-MOF纳米粒子：激活链摩尔比为1：500。

3.夹心结构的形成

首先，将一系列不同浓度的PSA(0、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10ng/mL)与磁性纳米探针(1mg/mL)在37℃下孵育1小时，并用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4，含0.1M NaCl)洗涤两次。然后，加入Zr-MOF纳米探针，在37℃继续孵化一小时，形成夹心复合物。通过用去离子水(0.1M NaCl，0.05％v/v Tween-20)洗涤五次，去除未结合的Zr-MOF纳米探针。最后，加入磷酸三钠溶液(10μL，8mM)，在室温下反应30分钟，使Zr-MOF纳米探针解离并释放CRISPR-associated蛋白Cas12a的激活链。然后，用磁铁分离取上清液保存，用于CRISPR/Cas12a系统反应。

所述的PSA购买于上海领潮生物科技有限公司，用磷酸缓冲盐溶液PBS(10nM，pH7.4)缓冲液稀释成不同的浓度。

4.基于CRISPR的荧光激活反应

荧光激活反应在100μL的CRISPR试剂中进行，包括1×NEB 2.1缓冲液、20nMCas12a蛋白、40nM crRNA、100nM荧光报告分子。将上述实验所取的上清液与CRISPR试剂混合，在37℃孵育60min，然后用荧光分光光度计测量其荧光强度。从而实现PSA的定量检测。荧光基团的激发波长和发射波长分别为480nm及520nm。

所述的NEB 2.1缓冲液、Cas12a蛋白均购买自New England Biolabs(NEB)公司。

所述的荧光报告分子的序列为：5’-6-FAM-TTATT-BHQ1-3’

所述的crRNA的序列为：

5’-UUUCUACUAAGUGUAGAUAUCCAUGAGGUACUACUGGCCAA-3’

所述的激活链的序列为：5’-P、-TTTTTTTTTGGCCAGTACCTCATGGAT-3’

5.实验结果

图4为PSA在0～10ng/mL内的标准曲线图，由图可知，检测体系的信号随着PSA目标物的浓度增加而增强，检出限为0.03pg/mL，且在0.5～10ng/mL范围内有良好的线性关系。

实施例3

本实施例中，以CEA作为目标分析物，对其进行定量检测。与实施例2的区别在于，将PSA的相关抗体全都替换为CEA抗体。

所述的CEA购买于上海领潮生物科技有限公司，用PBS(10nM，pH 7.4)缓冲液稀释成不同的浓度：(0、0.0005、0.001、0.01、0.1、0.5、1、3、6、8、10ng/mL)

图5为CEA从0～10ng/mL范围内的荧光信号标准曲线图，由图可知，检测体系的信号随着CEA浓度的增加而增加，检出限为0.1pg/mL，且在0.5～10ng/mL有良好的线性关系。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种Zr-MOF纳米探针的构建方法，其特征在于：所述的Zr-MOF纳米探针是由检测抗体和激活链依次通过共价连接到Zr-MOF纳米粒子上制备形成的；所述的激活链可特异性与CRISPR体系中的crRNA结合，激活CRISPR蛋白的反式切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号。

2.根据权利要求1所述的Zr-MOF纳米探针的构建方法，其特征在于：所述的Zr-MOF纳米粒子与激活链摩尔比为1:500，检测抗体的浓度为10μg/mL；所述的抗体为可特异性识别CEA(癌胚抗原)、PSA(前列腺癌特异性抗原)或其它生物标志物中的任意一种；所述的激活链为单链DNA、双链DNA或单链RNA中的任意一种，所述的激活链为5’端修饰磷酸基团的核酸链。

3.权利要求1或2所述的Zr-MOF纳米探针的构建方法制得的Zr-MOF纳米探针。

4.一种MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)制备磁性纳米探针：将磁性纳米粒子与抗体共价连接得到磁性纳米探针；

(2)制备Zr-MOF纳米探针：将Zr-MOF纳米粒子与检测抗体、激活链依次共价连接得到Zr-MOF纳米探针；

(3)夹心结构的形成：磁性纳米探针制备完成以后，加入目标物进行反应，之后再加入Zr-MOF纳米探针，通过抗体对抗原的特异性识别原理，三者形成磁性纳米探针-目标物-Zr-MOF纳米探针的夹心复合物结构；

(4)激活链的脱落处理：将一定浓度的磷酸盐对夹心复合物进行降解处理，使激活链从Zr-MOF纳米探针上脱落下来；

(5)基于CRISPR的荧光激活反应：将脱落的激活链加入CRISPR反应体系进行反应，激活链激活CRISPR蛋白的反式切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号，最后通过荧光分光光度计测量荧光强度，从而实现目标物的定量检测。

5.根据权利要求4所述的MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的磁性纳米粒子采用溶剂热法制得，粒径为550nm；在步骤(2)中，所述的Zr-MOF纳米粒子采用溶剂热法制得，粒径为65nm；在步骤(5)中，荧光激活反应在100μL的CRISPR试剂中进行，包括1×NEB 2.1缓冲液、20nM Cas12a蛋白、40nM crRNA、100nM荧光报告分子具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR检测方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述的CRISPR试剂包括CRISPR蛋白、crRNA和荧光报告分子，所述的荧光报告分子为两端分别修饰有荧光基团和荧光猝灭基团的核酸链；所述的荧光报告分子中的核酸链为单链DNA或单链RNA中的任意一种；所述的具备反式切割活性的CRISPR蛋白为Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14或Csm6中的任意一种。

7.权利要求4所述的将Zr-MOF纳米粒子进行降解处理的方法，其特征在于：用一定浓度的磷酸盐将Zr-MOF纳米粒子降解。

8.一种利用如权利要求4所述的CRISPR检测方法进行检测的试剂盒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括CRISPR试剂、阳性标准品和权利要求1所述的Zr-MOF纳米探针。

10.一种利用如权利要求4所述的CRISPR检测方法用于肿瘤生物标志物及其他分子细菌、细胞检测中的应用。

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