CN109265705A - 胶原巯基化衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

胶原巯基化衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种胶原巯基化衍生物及其制备方法和应用。以胶原为原料，以同时带有巯基和羧基或同时带有巯基和氨基的巯基化合物作修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入巯基。本发明巯基改性后的胶原衍生物侧链灵活可变，制备出的不同改性的胶原巯基化衍生物，其具有很好的亲核性能、抗氧化性能，并且可以进一步通过亲核反应、交联反应等进行衍生，应用范围十分广泛。将其应用于制备快速固化的水凝胶，在再生医学和组织工程领域有重要的应用。该胶原巯基化衍生物的通式为：或其中，R为胶原分子链去除羧基和氨基的残基部分；R1为烷基或亚烷基，R2为亚烷基。

Description

胶原巯基化衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及一种胶原巯基化衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
胶原是一类重要的蛋白质，通常由三条肽链组成，这些肽链被称为α- 链。胶原是细胞外基质中的一种结构蛋白，按照其结构功能的划分，可分为I、II、III、IV等型胶原。胶原水凝胶已经成功实现了细胞在三维基板上的培养，在组织工程中也被认为是一种非常有应用前景的支架材料。胶原分子链上存在游离氨基和羧基。
胶原分子以其独特的分子结构和理化性质在机体内发挥着重要的作用，临床上也得到了广泛应用。但现有的胶原分子不能够与含马来酰亚胺、乙烯砜、α-β不饱和醛、酮、酸、酯等结构的其他高分子衍生物发生化学反应，来制备快速固化的水凝胶。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种胶原巯基化衍生物，其通过在胶原分子中引入巯基进行改性得到，该胶原巯基化衍生物具有很好的亲核性能、抗氧化性能，并且可以进一步通过亲核反应、交联反应等进行衍生，应用范围十分广泛。
本发明的第二个目的在于提供上述胶原巯基化衍生物的制备方法，其路线设计合理，制作方法简单，对设备需求低，能够快速高效地得到胶原巯基化衍生物。
本发明的第三个目的在于提供上述胶原巯基化衍生物在制备水凝胶中的应用，使得制备的水凝胶具有快速固化、生物相容性好以及机械强度可调的性能。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种胶原巯基化衍生物，其由胶原与巯基化合物反应生成，其通式为：
其中，R为胶原分子链去除羧基和氨基的残基部分；R1为烷基、环烷基、芳基、杂芳基、硝基或亚烷基，R2为亚烷基。
一种上述胶原巯基化衍生物的制备方法，将含有所述胶原的溶液与含有所述巯基化合物的溶液在羧基活化剂的作用下进行反应。
上述胶原巯基化衍生物在制备水凝胶中的应用。
本发明实施方式的胶原巯基化衍生物及其制备方法的有益效果是：该制备方法通过将同时含有巯基和羧基或同时含有巯基和氨基的巯基化合物作为修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入巯基。该制备方法的路线设计合理，操作简单可行，对设备要求低，能够高效高产率地得到胶原巯基化衍生物。该胶原巯基化衍生物由于巯基侧链的作用，而具有很好的亲核性能、抗氧化性能以及丰富的衍生性，其可以进一步通过亲核反应、交联反应等进行衍生，应用范围十分广泛。
本发明实施方式的胶原巯基化衍生物在制备水凝胶上的应用的有益效果是：改性后的形成的胶原巯基化衍生物在碱性条件下巯基质子离去可产生硫负离子，可与含马来酰亚胺、乙烯砜、α-β不饱和醛、酮、酸、酯等结构的其他高分子衍生物发生化学反应来制备的得到水凝胶，提高了水凝胶的固化速度，也改善了水凝胶的机械强度和弹性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的胶原与胶原巯基衍生物傅里叶红外图谱 (FTIR)对比分析图；
图2为本发明实施例1中的胶原巯基衍生物的扫描电子显微镜(SEM) 表面微观结构图；
图3为本发明实施例11中的固化后水凝胶的扫描电子显微镜(SEM) 表面微观结构图；
图4为本发明实施例11中的固化后水凝胶的表面孔径扫描电子显微镜 (SEM)表面微观结构图；
图5为本发明实施例11中的水凝胶力学测试曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式或实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施方式的胶原巯基化衍生物及其制备方法和应用进行具体说明。
一种胶原巯基化衍生物，其由胶原与巯基化合物反应生成，其通式为：
其中，R为胶原分子链去除羧基和氨基的残基部分；R1为烷基或亚烷基，R2为亚烷基。
其中，R1或R2为亚烷基时，亚烷基可以为至少一个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中至少一种基团取代的亚烷基。即可以是亚烷基中有一个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的一种基团取代；也可以是亚烷基中有两个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的两种基团取代；也可以是亚烷基中有两个以上的氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的两种以上的基团取代；也可以是亚烷基中多个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羟基和卤代烷基中的多个同一种基团取代或被其中多个不同基团的组合对应进行取代。
需要说明的是，R1为烷基时，烷基的氢原子也可以被任意基团进行取代。
其中，R1和R2的碳原子数均可为1～20个，优选1～15个，更优选1～10 个。即R1可以为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、 C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、硝基或亚烷基；R2可以为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、 C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20 的亚烷基。
胶原选自胶原蛋白、碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白、基因重组胶原蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、酸性基因重组明胶蛋白、核心蛋白、多糖层粘连蛋白以及纤维结合蛋白中的一种或多种。这些胶原分子链上存在游离的氨基和羧基，从而可以通过与氨基或羧基进行反应，达到对胶原分子链进行修饰改性的目的。
与胶原发生反应的巯基化合物为同时具有羧基和巯基的化合物；或所述巯基化合物为同时具有氨基和巯基的化合物。同时具有羧基和巯基的化合物和同时具有氨基和巯基的化合物也可以通过经水解反应、氨解反应等直接生成，或者可通过含二硫键经还原后直接得到。例如，同时具有羧基和巯基的化合物可以为：二巯基丁二酸、巯基乙酸、3-巯基丙酸、半胱氨酸、硫代乙醇酸；同时具有氨基和巯基的化合物：半胱氨酸甲酯、半胱氨酸乙酯、4-氨基-3-巯基苯甲酸。
具体地，胶原巯基化衍生物由以下反应式生成：
本发明一些实施方式涉及胶原巯基化衍生物的制备方法，包括胶原与巯基化合物在羧基活化剂的存在下进行反应。
根据一些实施方式，胶原巯基化衍生物的制备方法包括：将含有所述胶原的溶液与含有所述巯基化合物的溶液在羧基活化剂的作用下进行反应。
具体地，本发明实施方式中的胶原巯基化衍生物可以通过以下方法制备：
(1)制备含有胶原的溶液：将胶原溶解于0.01～30％的酸溶液中。
(2)制备含巯基化合物的溶液：将巯基化合物，根据其溶解性，溶解于双蒸水或碱溶液或酸溶液中。
(3)将羧基活化剂加入到上述含巯基化合物的溶液中，混合均匀后，调节其PH值至4.5～6.5，继续混合搅拌。
(4)将活化后的含有巯基化合物的溶液与含有胶原的溶液进行混合，充分搅拌均匀，优选转移至圆底烧瓶中，放置在温度为37℃以下进行恒温反应。
(5)将反应后得到的反应液进行透析2～5天，再将得到的透析产物进行冷冻干燥2～5天后，得到胶原巯基化衍生物。通过透析的手段可以除去残留的小分子杂质，从而得到纯度更高的胶原巯基化衍生物。
根据一些实施方式，含有所述胶原的溶液是酸溶液。根据一些实施方式，酸溶液可以是有机酸溶液，优选乙酸溶液。即优选将述胶原溶解于 0.01～30％的乙酸溶液中。
根据一些实施方式，含有所述巯基化合物的溶液是双蒸水或碱溶液或酸溶液。根据一些实施方式，碱溶液可以为强碱溶液，例如氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钙溶液等，也可以为弱碱溶液，例如氨水溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液等，优选氢氧化钠溶液。双蒸水将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水，其可以使得溶解后的溶液纯度更高，后续反应效果越好。溶解巯基化合物的酸溶液可以是有机酸溶液，优选乙酸溶液。
根据一些实施方式，羧基活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。EDC是个可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶联物的制取，常和NHS或N-羟基硫代琥珀酰亚胺连用，以提高偶联效率。NHS即N-羟基琥珀酰亚胺，活化羧基以用于酰胺键的形成。用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体。本发明实施方式中的羧基活化剂可按照EDC和NHS的质量比为10：1～1： 1的比例进行配制，这种比例有利于二者达到更好的偶联效率，使得对巯基化合物的羧基活化效果更好。
根据一些实施方式，可以取EDC和NHS在磁力搅拌器作用下加入到上述含巯基化合物的溶液中，以达到更好的混合效果。
根据一些实施方式，混合羧基活化剂后，用碱或酸溶液调节加有羧基活化剂的巯基化合物溶液的PH值，使得其PH值为4.5～6.5。优选地，用 1M氢氧化钠或1M盐酸溶液进行调节PH值。EDC和NHS在PH值为 4.5～6.5的条件下能够达到对羧基最好的活化效果。
根据一些实施方式，调节PH值后混合搅拌的时间为10～150min，使得羧基活化剂能够对巯基化合物的羧基进行充分的活化，以更好地对胶原进行修饰。
根据一些实施方式，反应温度优选10～30℃，进一步优选15～20℃，当然反应温度不限于37℃以下。反应时间可以为1～8h，优选2～6h，更优选地4～5h。
需要说明的是，上述过程中也可以先进行步骤(2)和(3)，再进行步骤(1)，不会影响最终产物的生成。
本发明实施方式中的胶原巯基化衍生物还可以通过以下方法制备：
(1)制备含有胶原的溶液：将胶原溶解于0.01～30％的酸溶液中。
根据一些实施方式，酸溶液可以是有机酸溶液，优选乙酸溶液。即优选将所述胶原溶解于0.01～30％的乙酸溶液中。
(2)制备含巯基化合物的溶液：将巯基化合物，根据其溶解性，溶解于双蒸水或碱溶液或酸溶液中。
根据一些实施方式，碱溶液可以为强碱溶液，例如氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钙溶液等，也可以为弱碱溶液，例如氨水溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液等，优选氢氧化钠溶液。双蒸水可以使得溶解后的溶液纯度更高，后续反应效果越好。溶解巯基化合物的酸溶液可以是有机酸溶液，优选乙酸溶液。
(3)将羧基活化剂加入到上述含胶原的溶液中，混合均匀后，调节其 PH值至4.5-6.5，继续混合搅拌。
根据一些实施方式，羧基活化剂包括EDC和NHS。本发明实施方式中的羧基活化剂可按照EDC和NHS的质量比为10：1～1：1的比例进行配制，这种比例有利于二者达到更好的偶联效率，使得对胶原的羧基活化效果更好。
根据一些实施方式，可以取EDC和NHS在磁力搅拌器作用下加入到上述含胶原的溶液中，以达到更好的混合效果。
根据一些实施方式，混合羧基活化剂后，用碱或酸溶液调节加有羧基活化剂的胶原溶液的PH值，使得其PH值为4.5～6.5。优选地，用1M氢氧化钠或1M盐酸溶液进行调节PH值。EDC和NHS在PH值为4.5～6.5 的条件下能够达到对羧基最好的活化效果。
根据一些实施方式，调节PH值后混合搅拌的时间为10～150min，使得羧基活化剂能够对胶原的羧基进行充分的活化，以更好地对胶原进行修饰。
(4)将活化后的含有巯基化合物的溶液与含有胶原的溶液进行混合，充分搅拌均匀，搅拌时间优选10～150min，且优选将混合液转移至圆底烧瓶中，放置在温度为37℃以下进行恒温反应。
根据一些实施方式，反应温度优选10～30℃，进一步优选15～20℃，反应时间可以为1～8h，优选2～6h，更优选地4～5h，其中，反应温度不限于37℃以下。
(5)将反应后得到的反应液进行透析2～5天，再将得到的透析产物进行冷冻干燥2～5天后，得到胶原巯基化衍生物。通过透析的手段可以除去残留的小分子杂质，从而得到纯度更高的胶原巯基化衍生物。
需要说明的是，上述过程中也可以先进行步骤(2)，再进行步骤(1)，其不会影响最终产物的生成。
本发明实施方式中制备胶原巯基化衍生物的方法操作工艺简单，反应条件温和。其为制备一种新的胶原巯基化衍生物以及水凝胶提供了一种简单可行的新方法。所得的胶原巯基化衍生物可用于再生医学、组织工程支架以及医药卫生领域，应用范围广泛。
需要说明的是，胶原巯基化衍生物也可以与小分子或纳米粒子等发生反应来制备其他化学材料。
上述制备方法得到的胶原巯基化衍生物可在制备水凝胶中进行应用，可以将胶原巯基化衍生物与马来酰化壳聚糖混合后制备水凝胶。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将0.15g的胶原溶解于质量分数0.01％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液，其中胶原选择胶原蛋白。
(2)取0.09g二巯基丁二酸，溶解于氢氧化钠溶液中，得到二巯基丁二酸氢氧化钠溶液。
(3)取0.075g EDC和0.019g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述二巯基丁二酸氢氧化钠溶液中，充分混合均匀，再用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH至4.5，将混合溶液搅拌10min，使羧基充分活化。
(4)将羧基活化后的二巯基丁二酸氢氧化钠溶液与胶原乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为20℃下恒温反应数1h。
(5)经过反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例2
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将0.3g的胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(2)取1.5g二巯基丁二酸，溶解于氢氧化钠溶液中，得到二巯基丁二酸氢氧化钠溶液。
(3)取0.8g EDC和0.2g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述二巯基丁二酸氢氧化钠溶液中，充分混合均匀，再用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH至5.5，将混合溶液搅拌80min，使羧基充分活化。
(4)将羧基活化后的二巯基丁二酸氢氧化钠溶液与胶原乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应数5h。
(5)经过反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例3
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将0.3g的胶原溶解于质量分数2％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(2)取1.5g二巯基丁二酸，溶解于氢氧化钠溶液中，得到二巯基丁二酸氢氧化钠溶液。
(3)取0.8g EDC和0.2g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述二巯基丁二酸氢氧化钠溶液中，充分混合均匀，再用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH至5.5，将混合溶液搅拌80min，使羧基充分活化。
(4)将羧基活化后的二巯基丁二酸氢氧化钠溶液与胶原乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应数5h。
(5)经过反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例4
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将4.5g的胶原溶解于质量分数30％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液，其中胶原选择酸性明胶蛋白。
(2)取2.8g二巯基丁二酸，溶解于一定量的氢氧化钠溶液中，得到二巯基丁二酸氢氧化钠溶液。
(3)取1.6g EDC和0.4g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述二巯基丁二酸氢氧化钠溶液中，充分混合均匀，用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH，使其PH为6.5，再搅拌150min时间，使羧基充分活化。
(4)将活化后的混合液加入胶原乙酸溶液中拌150min时间，充分搅拌均匀，并将混合液转移至圆底烧瓶中，在温度10℃以下恒温反应数8h。
(5)经过反应的反应液经透析5d、冷冻干燥5d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例5
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)取2.1g半胱氨酸乙酯，溶解于一定量的氢氧化钠溶液中，得到半胱氨酸乙酯氢氧化钠溶液。
(2)将4.5g的胶原溶解于质量分数30％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液，胶原选择碱性明胶蛋白。
(3)取1.6g EDC和0.4g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述胶原乙酸溶液中，充分混合均匀，并用1M稀盐酸调节加入EDC和NHS的混合溶液的PH至5，再混合液搅拌150min时间，使羧基充分活化。
(4)将活化后的混合溶液与半胱氨酸乙酯氢氧化钠溶液混合后搅拌 150min时间，充分搅拌均匀，再将混合液转移至圆底烧瓶中，在温度5℃以下恒温反应数8h。
(5)将经过反应的反应液进行透析5d、冷冻干燥5d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例6
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)取1g半胱氨酸乙酯，溶解于一定量的氢氧化钠溶液中，得到半胱氨酸乙酯氢氧化钠溶液。
(2)将2g的胶原溶解于质量分数20％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液，胶原选择酸性基因重组明胶蛋白。
(3)取0.8g EDC和0.15g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述胶原乙酸溶液中，充分混合均匀，并用1M稀盐酸调节加入EDC和NHS的混合溶液的PH至6，再混合液搅拌100min时间，使羧基充分活化。
(4)将活化后的混合溶液与半胱氨酸乙酯氢氧化钠溶液混合后搅拌50 min时间，充分搅拌均匀，再将混合液转移至圆底烧瓶中，在温度18℃以下恒温反应数5h。
(5)将经过反应的反应液进行透析4d、冷冻干燥4d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例7
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将0.8g的胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(2)取1.5g 3-巯基丙酸，溶解于氢氧化钾溶液中，得到3-巯基丙酸氢氧化钾溶液。
(3)取0.8g EDC和0.2g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述3- 巯基丙酸氢氧化钾溶液中，充分混合均匀，再用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH至5.5，将混合溶液搅拌80min，使羧基充分活化。
(4)将羧基活化后的3-巯基丙酸氢氧化钾溶液与胶原乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为12℃下恒温反应数5h。
(5)经过反应后的反应液进行透析2d、冷冻干燥2d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例8
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将0.8g的胶原溶解于质量分数10％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(2)取1.5g 3-巯基丙酸，溶解于碳酸钠溶液中，得到3-巯基丙酸碳酸钠溶液。
(3)取0.8g EDC和0.2g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述3- 巯基丙酸碳酸钠溶液中，充分混合均匀，再用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH至5.5，将混合溶液搅拌80min，使羧基充分活化。
(4)将羧基活化后的3-巯基丙酸碳酸钠溶液与胶原乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为 12℃下恒温反应数7h。
(5)经过反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例9
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将2g的胶原溶解于质量分数5％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(2)取1.5g硫代乙醇酸，溶解于碳酸钠溶液中，得到硫代乙醇酸碳酸钠溶液。
(3)取0.8g EDC和0.2g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述硫代乙醇酸碳酸钠溶液中，充分混合均匀，再用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH至5.5，将混合溶液搅拌100min，使羧基充分活化。
(4)将羧基活化后的硫代乙醇酸碳酸钠溶液与胶原乙酸溶液混合后搅拌10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为 20℃下恒温反应数8h。
(5)经过反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例10
本实施例中的胶原巯基化衍生物的反应方程式为：
(1)将3g的胶原溶解于质量分数5％的乙酸溶液中，得到胶原乙酸溶液。
(2)取2g硫代乙醇酸，溶解于乙酸溶液中，得到硫代乙醇乙酸溶液。
(3)取0.8g EDC和0.2g NHS在磁力搅拌器作用下一次加入上述硫代乙醇酸乙酸溶液中，充分混合均匀，再用1M稀盐酸调节上述混合溶液的PH至5.5，将混合溶液搅拌100min，使羧基充分活化。
(4)将羧基活化后的硫代乙醇酸乙酸溶液与胶原乙酸溶液混合后搅拌 10min时间，充分搅拌均匀，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，在温度为20℃下恒温反应数8h。
(5)经过反应后的反应液进行透析3d、冷冻干燥3d后，得到胶原巯基化衍生物。
实施例11
准确称取壳聚糖1.5g溶于质量分数0.01％质量分数的乙酸溶液中，在磁力搅拌器作用下基本溶解均匀后，置于超声振荡器中超声30min左右。准确称取马来酸酐1.8g，加入5ml丙酮使其完全溶解。将溶解后的马来酸酐匀速缓慢的加入壳聚糖乙酸溶液中，在磁力搅拌器下搅拌20min左右使其充分混匀。将混合均匀的液体转入150ml圆底烧瓶中，置集热式磁力搅拌器中，设置温度40℃，恒温加热反应2h。反应停止后透析三天，每隔5 h换一次透析液。冷冻干燥三天左右得到MCS产物。
化学反应式：
准确称取MCS 60mg，用一定质量分数的乙酸溶液溶解，超声震荡，氮气除气泡，配成浓度为10mg/ml的溶液。准确称取实施例1中的胶原巯基化衍生物(COL-SH)60mg，用氢氧化钠溶液溶解，超声震荡，氮气除气泡，配成浓度为10mg/ml的溶液，用还原剂处理10min左右，震荡混合均匀。将配好的MCS和COL-SH溶液在3D打印机上由进样系统进样，计算机程序控制出样速度和打印模式，均匀混合制备3D生物打印水凝胶。
对实施例1中的胶原以及胶原巯基化衍生物傅里叶红外分析图谱，分别得到图1，图1中胶原与巯基化胶原红外图谱对比分析可以看出，在波数 900cm-1附近，巯基化胶原有一个明显区别于胶原的弱吸收峰，说明巯基化胶原上存在C-S键，表明巯基化合物成功引入到胶原链上；同时，通过扫描电镜对实施例1中的胶原巯基化衍生物以及固化后的水凝胶的表面结构和表面孔径做扫描电镜(SEM)分析。结果依次如图2，图3，图4所示。 SEM分析表明固化后水凝胶表面出现很多交联后的孔洞，说明交联反应进行得很完全，进一步说明制备得到的胶原巯基化衍生物可以成功制备快速固化水凝胶。
进一步地，通过用instron力学测试机对实施例11中得到的水凝胶进行测试，使用10N传感器，置于传感器压缩基底上，根据样品的大小设置好测试参数，测试曲线出现突变后，停止压缩，系统自动得出弹性模量值。
测试参数为：长10mm，宽8mm，高5mm，压缩速率0.8mm/min。测试结果如图5所示，在压缩位移为3.38mm，压缩应力为0.049MPa时发生断裂，从而测得弹性模量为0.107MPa，因此，可以看出该水凝胶具有较好的机械强度和弹性性能。
综上所述，本发明实施方式中，通过将同时含有巯基和羧基或同时含有巯基和氨基的巯基化合物作为修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入巯基。该制备方法的路线设计合理，操作简单可行，对设备要求低，能够高效高产率地得到胶原巯基化衍生物。该胶原巯基化衍生物由于巯基侧链的作用，而具有很好的亲核性能、抗氧化性能以及丰富的衍生性，其可以进一步通过亲核反应、交联反应等进行衍生，其应用范围十分广泛。例如，将该胶原巯基化衍生物与含马来酰亚胺、乙烯砜、α-β不饱和醛、酮、酸、酯等结构的其他高分子衍生物发生化学反应，来制备快速固化的水凝胶，在再生医学和组织工程领域有重要的应用。又比如，由于该胶原巯基化衍生物较好的亲核性能以及生物相容性，可以将该胶原巯基化衍生物用于制备药物载体，其良好的亲核性能，利于其与靶细胞的结合，可以达到增加药效的目的；或者，利用该胶原巯基化衍生物良好的抗氧化性能，将其与天然聚合物制成高分子膜，在储存保鲜领域，发挥其作用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。该胶原巯基化衍生物具有丰富的变化和衍生性，其适用广泛，此处仅仅列举了其可能的部分用途，并不能穷举，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例或者其它可能的应用方式，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种胶原巯基化衍生物，其特征在于，其通式为：
其中，R为胶原分子链去除羧基和氨基的残基部分；R1为烷基、环烷基、芳基、杂芳基、硝基或亚烷基，R2为亚烷基。
2.根据权利要求1所述的胶原巯基化衍生物，其特征在于，所述亚烷基为至少一个氢原子被烷基、羧基、氨基、烷氧基、芳香基、酯基、羧基和卤代烷基中至少一种基团取代的亚烷基。
3.根据权利要求1或2所述的胶原巯基化衍生物，其特征在于，R1和R2的碳原子数均各自独立地为1～20个。
4.一种如权利要求1～3任意一项所述的胶原巯基化衍生物的制备方法，其特征在于，胶原与巯基化合物在羧基活化剂的存在下进行反应。
5.根据权利要求4所述的胶原巯基化衍生物，其特征在于，所述胶原选自胶原蛋白、碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白、基因重组胶原蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、酸性基因重组明胶蛋白、核心蛋白、多糖层粘连蛋白以及纤维结合蛋白中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将含有所述胶原的溶液与含有所述巯基化合物的溶液混合并在羧基活化剂的存在下进行反应；其中，含有所述胶原的溶液优选酸溶液；含有所述巯基化合物的溶液优选双蒸水或碱溶液或酸溶液；所述羧基活化剂优选包括EDC和NHS，所述EDC和所述NHS的质量比为10：1～1：1。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，利用所述羧基活化剂对含有所述巯基化合物的溶液或含有所述胶原的溶液中待反应的羧基进行活化，然后混合含有所述巯基化合物的溶液和含有所述胶原的溶液进行反应，优选反应时间为1～8h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胶原巯基化衍生物由以下反应式生成：
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述巯基化合物为同时具有羧基和巯基的化合物；或所述巯基化合物为同时具有氨基和巯基的化合物。
10.如权利要求1～3任意一项所述的胶原巯基化衍生物在制备水凝胶中的应用。
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