CN101137675B - 生产具有改善的特性的硫酸纤维素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产硫酸纤维素的方法，该硫酸纤维素是完全水溶性的，并且在水溶液中具有可调节的溶液粘度，其使产生的硫酸纤维素钠(SCS)适合作为具有理想生物相容性的用于生物和医学应用的辅料，特别是它适合在微胶囊中包封和固定生物体，例如组织、细胞、微生物、酶或病毒。

Description

生产具有改善的特性的硫酸纤维素的方法
本发明涉及一种生产具有改善的特性的区域选择性取代的硫酸纤维素钠(SCS)的方法，以及这种改善的SCS在微囊包封生物活性物质中的应用。这些种类的微胶囊也被称为对称(symplex)微胶囊，是通过将改善的硫酸纤维素的水溶液滴加到聚阳离子、优选pDADMAC(聚(二烯丙基二甲基氯化铵))或类似物的水溶液中而制备的。
硫酸纤维素钠(SCS)是一种长期以来已知的纤维素的硫酸半酯的水溶性聚合物。SCS是通过纤维素的羟基与硫酸化剂例如硫酸酐、硫酸或其衍生物酯化然后将酸化的半酯转化为中性钠盐而形成的。
生产SCS的基本方法是已知的，在该方法中，硫酸化可以在不溶解聚合物的情况下在非均相中进行(非均相)，也可以在溶解聚合物的同时在均相中进行(半均相)，或者在预先溶解聚合物以后在均相中进行(均相)。
Lukanoff，B.和Dautzenberg，H.(1994，Das Papier，Heft 6，287-298)进一步改进了众所周知的非均相生产方法(US 2,539,451；US 2,969,355)，他们使用硫酸和丙醇作为反应介质和硫酸化剂。对于这种类型的非均相生产方法，根据Bohlmann等人(2002，ChemieIngenieur Technik，74，359-363)所述，首先用摩尔比为1.8∶1的96％硫酸和异丙醇制备反应介质。纤维素的硫酸化在-5℃下进行150分钟。为了终止反应，使用醇从纤维素硫酸半酯中除去反应混合物，并冲洗。最后，使用氢氧化钠将洗涤后的产物转变为钠盐。
这种非均相的纤维素硫酸化方法的主要缺点是难以控制放热反应，不可避免地导致取代基沿聚合物链和在聚合物链之间不均匀分布，因此影响了获得的硫酸纤维素的溶解度和聚合水平。这种非均相生产方法的另一个严重的缺点是在前面的硫酸化过程中纤维素链快速、高效地降解。为了减少纤维素降解，用洗涤步骤结束硫酸化反应， 洗涤步骤可以充分地除去热，从而阻止了温度进一步升高。然而，扩散过程和来源过程以及纤维素的形态结构对反应进程具有相当大的影响，因为发生反应时纤维素总体保持固定的物理结构。
为了在不分离不溶性部分的情况下以＜0.8的取代度(DS)范围获得非均相生产的硫酸纤维素的完全水溶性，DD 295858A5和DE 4019116A1推荐了纤维素的预活化，这只能获得具有极低粘度的产物，在1％水溶液中最大为8.5mPa。在将该硫酸纤维素插入以生产对称微胶囊时，必须要注意，只形成具有极窄机械硬度的微胶囊。
根据DE 4021049所述，具有高粘度的硫酸纤维素可以从产生的反应产物中分离出来，而通过该方法中的其他步骤，可以分离水不溶性部分，并且可以洗去包含的具有极低粘度的可溶性部分(参见，Lukanoff，B.和Dautzenberg，H.：1994，Das Papier，Heft 6，287-298)。
结果是，非均相生产方法通过将纤维素转化为完全水溶性的纤维素，产生具有较高取代率(最低DS＝0.7)的产物，因此取代基分布不均匀，尽管使用了低粘度的高分子起始纤维素。
纤维素的均匀硫酸化通常导致可溶于有机溶剂的纤维素中间物的形成，由此在硫酸化反应期间，纤维素链的降解可以被抑制到可接受的范围内。由于硫酸化在固相结构完全溶解于双极性非质子溶剂中之后或同时进行，发生均匀的取代基交换。终产物具有较高的溶液粘度，并且是部分完全水溶性的，DS值为0.25。作为一个例子，使用具有相对较低DP的乙酸纤维素(Cuoxam-DP约为250，DS＝2.4)，合成的SCS的溶液粘度达到10mPas左右(使用Ubbelohde粘度计测定在2N NaOH中的2％溶液)(参见DE 4435180)。
基于部分取代的乙酸纤维素的均匀酯化，通过进一步改变生产方法，可以实现纤维素脱水葡萄糖单元的各个C原子上OH基的区域选择性取代。Wagenknecht等人(DE 4435082；DE 4435180和Das Papier，1996，712-720)描述了在C2/C3或C6位上的区域选择性硫酸化，其中使用可溶于有机溶剂的乙酸纤维素作为起始聚合物。
主要缺点是该设置在商售乙酸纤维素中的低聚合度(Cuoxam-DP约为200至350)，因此在现有的技术状态下，乙酸纤维素不能产生在1％水溶液中的溶液粘度高于约10mPas的硫酸纤维素。仍然需要由乙酸纤维素的给定起始DP调节获得的SCS的所需溶液粘度范围。
作为通过混合酯化生产硫酸乙酸纤维素、乙酸纤维素或硫酸纤维素的基本原理，天然纤维素的乙酰硫酸化长久以来即是已知的。因此引入硫酸作为试剂，在冰醋酸中的乙酸酐作为反应介质(US 2,683,143；US 2,969,356；US 3,086,007；US 3,075,963；US 4,005,251)。也可以使用氯磺酸钠代替硫酸(US 2,969,355)。作为Chauvelon生产水溶性硫酸乙酸纤维素的试验结果(Chauvelon，G.等人，CarbohydrateResearch 338(2003)743-750)，这种非均相反应的强烈的不一致性是明显的，因此只能通过分级分离来获得最终产物。
此外，已知在使用N，N-二甲基甲酰胺作为反应介质溶解形成的硫酸乙酸纤维素酯的情况下可以实现纤维素的乙酰硫酸化。在这种情况下，乙酸酐/三氧化硫(Wagenknecht，W.等人，″Cellulosics：materials for selective separations and other technologies″，Kennedy，Phillips，Williams，Horwood(1993)205-211)或乙酸酐/氯磺酸(Wagenknecht，W.，Das Papier 50(1996)12，712-720)可以用作反应混合物。在碱性除去不稳定的乙酰基后获得仅在脱水葡萄糖单元取代的水溶性硫酸纤维素的C6位最高约0.8的DS-硫酸酯。
根据该方法合成的硫酸纤维素的缺点是取代分布的不对称性，DS＜0.6，这导致水溶液的不均一性，因此无法用于产生对称膜。
SCS作为聚阴离子，应当满足本发明对于自动生产限定大小、足够的机械硬度和长期稳定性的球形对称微胶囊的需要，必须满足以下要求：
-在水性介质中可溶，不剩余残余物
-在指定浓度下可调节的溶液粘度
-低结构粘性，以便保持规则的微胶囊，甚至在高滴加速度的情况下
-范围为0.3至0.7的可调节的硫酸酯-DS，用于形成稳定的对称结构
-在C6位的区域选择性硫酸化
-在pH7时使水溶液灭菌的可能性
-生物相容性，例如无菌并且不含内毒素、低重金属含量
非均相以及均相生产方法的最大缺点是在硫酸化反应过程中无法控制链长的降解。这种链长降解的结果是，迄今为止还不能生产这样的SCS：其在DS为0.3至接近1、优选0.3至0.6时为完全水溶性，并且其在1％溶液中的溶液粘度在乙酰硫酸化反应过程中处于小范围内，即15至60mPas。
当使用SCS包封生物活性物质时，溶解的SCS的足够高的、可调节的溶液粘度特别令人感兴趣，在用于此的方法中，生物活性物质在SCS水溶液中的悬浮液从喷嘴滴加到反离子溶液中。液滴的形成、液滴的均一性和液滴大小的重复性直接取决于溶解的SCS的溶液粘度。另一方面，胶囊壁的厚度和硬度受SCS的聚合度和浓度的影响。
尽管极低的溶液粘度允许形成液滴，因此允许潜在的生物材料包封，但是它也导致所述液滴形成的不均一性以及由它产生的微胶囊的不均一性。这些种类的不均一性可见于均一性丧失、大小分布不等、缺乏稳定性和生物材料包封不均一。因此，溶解于水中的SCS的极低的溶液粘度是常规生产的SCS和由它生产的所有产物的严重缺点。
这一缺点，即极低的溶液粘度，部分是由于各种生产方法限定使用特定纤维素原材料所引起的。常用的商售乙酸纤维素(纤维素-2，5-乙酸酯)具有平均250-270个聚合物单元(DP)。仅从该DP限度不能获得高粘度的SCS。在SCS生产过程中，特别是在用强酸试剂硫酸化过程中，导致链进一步降解，由此溶液粘度进一步降低。通常获得低于10mPas的溶液粘度(参见，例如，DE 4435180)。
有时用作原材料的木浆的DP-值为600左右。在上述众所周知的生产工艺中使用木浆导致链的明显降解，对应于具有极低溶液粘度的最终产物。
理想的是，为了获得可能的最长的聚合物链，从而获得高溶液粘度，将具有大约1250-1400个聚合物单元的高DP值的天然高分子纤维素如棉籽绒转化为SCS。
棉籽绒在非均相硫酸/丙醇法中用作原材料，但是如同已经提到的那样，该生产方法导致相当多的链断裂，因此在合成后获得的产物只显示低溶液粘度。由于非均相生产方法也不允许硫酸酯基团的均匀分布，因此产物的特性，例如SCS的水溶性，受到负面影响。
因此本发明的目的是提供一种另外的改善的生产区域选择性取代的SCS的方法，该方法避免了现有技术的缺点，并且允许需要的溶液粘度的调节，终产物具有完全的水溶性，使用特定DP的纤维素原材料。
通过主权利要求1的方法步骤实现了这一目的。在从属权利要求的特征中描述了特别的实施方案。
对于该方法，纤维素，优选棉籽绒，通过与由乙酰化剂和硫酸化剂组成的试剂混合物混合酯化为乙酸-硫酸-混合酯，在极性溶剂中的半均相反应而溶解。一个优点是，首先在持续搅拌下，使纤维素在反应介质中在升高的温度下，优选在30至100℃下溶胀较长的时间，优选0.5至12小时，并且在室温下静置，以进一步溶胀。最后，在持续搅拌下，加入先前制备的试剂混合物，该试剂混合物优选含有乙酰化剂、硫酸化剂和具有确定组成的极性溶剂。使用试剂彼此之间的摩尔关系和与纤维素的摩尔关系，DS-硫酸酯和DS-乙酸酯的部分取代水平可以用本领域技术人员公知的方法调节至最高总DS＝3。乙酰硫酸化反应优选在30至80℃的温度范围下发生，由此产生的硫酸乙酸纤维素在反应体系中溶解为粘性溶液。如果温度主要保持恒定的预定水平，则聚合物溶液的粘度随着反应的进行而降低，于是该粘度可以在预定的水平调节。
根据本发明，重要的是通过限定的中和来终止进一步的降解，并由此固定在再处理后获得的硫酸纤维素溶液的聚合水平和粘度。
为了中和，在以钠盐形式沉淀之前或者同时转化硫酸半酯基团， 而不去除乙酰基。在本发明的条件下，除此之外，在用溶解于适当中和剂和/或沉淀剂中的碱性中和剂优选NaOH沉淀之前或同时，小心中和硫酸半酯基团，而不以任何速度分解乙酰基团。
随后，用适当的洗涤介质，优选用含有乙酸钠的乙醇或乙醇和水的混合物洗涤优选以特定形式沉淀的硫酸纤维素混合酯。
然后进行终产物的再处理，包括在非均相中利用乙醇NaOH对乙酰基进行碱水解，回复中和至pH值接近7，优选使用乙醇水溶液反复洗涤，直到无盐，随后在大约40℃下真空干燥硫酸纤维素钠。
在这个合成过程后，可以产生不含残余物的、完全可溶的硫酸纤维素钠，其DS大于或等于0.3，在C6位显示非常有利的、均一的、区域选择性的硫酸半酯基团取代基交换，并且确定在水中为1％的给定浓度下，其可调节的溶液粘度在10mPas至500mPas、优选15至400mPas、进一步优选20至300mPas、进一步优选15至100mPas、进一步优选20至60mPas的范围内。
由于获得的产物基本上是纯的，因此不需要通过透析或超速离心进一步纯化。
而在迄今为止所知的方法中，在洗涤步骤和/或脱乙酰化后进行中和，本发明人表明，当在硫酸化步骤结束时直接进行中和而不预先进行脱乙酰化或洗涤步骤时，产生的SCS的质量明显较好。当在沉淀的同时进行中和时，也能够获得在统计学上良好的结果。
对于中和，根据本发明的方法，向反应混合物中加入碱或碱性溶液，优选NaOH，由此使碱、碱性溶液或NaOH与硫酸化试剂准确配价。例如，1Mol的三元酸如氯磺酸用3Mol的NaOH中和，1Mol的二元酸如硫酸用2Mol的NaOH中和。
在中和过程中快速进行是有利的，因为聚合物链在酸性介质中总是被攻击并且降解，因此中和过程中时间的缩短减少了聚合物链长度的这种降解。
通过在涉及本发明SCS生产方法的方法步骤中进行调节，并且在酸体系中早期中和，可以在聚合物链长度降解方面控制该生产方法。 根据本发明产生的SCS在25℃的1％水溶液中不具有或者仅具有极低的结构粘度，同时可在10至500mPas、进一步优选15至400mPas、进一步优选20至300mPas、进一步优选15至100mPas、进一步优选20至60mPas的溶液粘度范围内调节，上述范围是在25℃的1％水溶液中测定的。
此外，根据本发明的方法产生的SCS是水溶性的，而没有剩余残余物，并且具有从0.25开始的DS值，这与使用H2SO4/异丙醇反应通过非均相方法产生的不同，因此没有水不溶性组分需要使用另外的处理来除去。
根据本发明的方法，能够使用不同来源和具有不同DS值的纤维素作为起始材料。优选使用高分子纤维素，特别是超纯的和基本上不含重金属的棉籽绒。因此，聚合程度限制了粘度的可调节范围。
作为根据本发明对生产方法的一个选择，纤维素在极性溶剂如N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中溶胀。优选使用DMF。
另外，本发明的方法可以使用如下选择进行，对于在有机溶剂中可溶并且总DS最多为3个硫酸的硫酸乙酸纤维素的混合酯化，使用酰胺硫酸、三氧化硫、磺酰氯或氯磺酸作为硫酸化剂。优选使用氯磺酸作为硫酸化剂。
本发明的方法可以使用以下选择进行，对于在有机溶剂中可溶并且总DS最多为3的硫酸乙酸纤维素的混合酯化，组合乙酰氯或乙酸酐作为乙酰化剂。优选使用乙酸酐作为乙酰化剂。
根据本发明生产SCS应当优选在下述条件下进行：
首先，天然纤维素在最高150℃、优选30至100℃、进一步优选40至80℃的升高的温度下溶胀最多24小时、优选最多12小时、进一步优选3至8小时，随后的时间在室温下，使得进一步的冷却和在室温(RT)下的溶胀进行最多48小时。在整个溶胀时间中，优选搅拌悬浮液。在室温下进一步溶胀的过程中，搅拌不再是必需的。
随后在恒定搅拌下和0℃至110℃如优选20至80℃、进一步优选30 至70℃、进一步优选40至65℃、进一步优选50至60℃的反应温度下向溶胀的纤维素中加入硫酸化剂和乙酰化剂。
在恒定搅拌下获得的乙酸纤维素硫酸半酯完全溶解，粘度缓慢降低，直到聚合物溶液达到所需的和预期的流动性，这可以通过实验来确定。
之后立即优选在恒定小心搅拌和室温(RT)下进行中和，因此与反应温度相比，聚合物溶液仍然可以是温的，即，例如，反应在50℃下进行，而在冷却一点儿之后将其加到中和/沉淀浴中，此时仍然是温的。中和浴/沉淀浴与聚合物溶液的比例是3∶10，优选3∶5。作为一个条件，按照该生产方法产生的SCS基本无菌，不含内毒素和/或重金属。为此目的，该方法在无菌条件下进行，特别是在无细菌的条件下进行。特别是，选择条件和原材料，以便在终产物中检测不到酵母、需氧菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等。终产物的内毒素含量处于0.02至0.11 I.E/ml的范围内，按照欧洲药典Ph.Eur.4.00方法C(浊度动力学)，使用1％SCS水溶液通过LAL-试验检测。
另外，必须注意以下事实，使用的原材料也不含重金属例如Cd、Pb、Hg、Fe、Ni、Ti、Mn、Zn和Cu，因此由其生产的SCS不超过以下阈值：
不包括铁的总重金属含量：≤10ppm，
铁含量：≤20ppm，
其中不包括铁的总重金属含量包括所有可想到的重金属的总和。
为此，优选该反应只使用不释出任何可检测量的上述重金属之一的材料和装置。
根据另一个实施方案，通过该方法产生的SCS应当是区域选择性取代的。优选在C6位具有完全均一的取代基交换，或者在C2/3位具有可达30％硫酸酯基团的交换。按照现有方法(Wagenknecht等人，1996)使用试剂控制所需的区域选择性硫酸化。
本发明的SCS特别适合用于生物材料的微囊包封。根据其可调节 的溶液粘度，在基本上不改变聚合物溶液的浓度的情况下，很容易实现调节10至50mPas、40至70mPas、60至100mPas、80至200mPas、150至300mPas或250至500mPas的粘度范围(使用Ubbelohde粘度计测定1％水溶液)。因此，该SCS允许不复杂的处理和在生物材料包封过程中极高的工作速度。
与此相反，在大量生产水溶性硫酸纤维素的方法中极其有限地描述了可以用于生产微胶囊产品、具有相当高机械硬度和达到潜在医学应用的生物化学需要的那些。
在DD 218734 A4和DE 3306259 C2中描述了生产微胶囊的方法，其中描述了活生物体的固定。因此使用N2O4/SO2/DMF方法产生了使用的SCS。高毒性氧化物棒的使用是该方法的一个主要缺点，首先氧化还原过程形成亚硝酸酯硫酸酯的混合酯，其可溶于二甲基甲酰胺(DMF)。在分离不稳定的纤维素亚硝酸酯基团后，产生的毒性副产物，特别是致癌性二甲基亚硝胺，在用于活生物体之前，特别是在用于生物医学应用时，必须从硫酸纤维素中除去。然而，根据本发明的方法产生的微胶囊适合医学应用。
在DE 4021050 A1和EP 0892852中，描述了使用非均相H2SO4/丙醇法生产SCS。正在试图使用该SCS生产对称微胶囊，以用于固定活生物体。由于在SCS生产过程中链长的降解和不均匀的硫酸化，水不溶性部分的分离和/或高度取代的低分子部分的去除不可避免。由这样生产的SCS制成的微胶囊较不稳定，并且是非常不均一地形成的。它们因此不适合医学应用，例如注射形式。
DD 298643A5和DD 299313A5公开了一种生产在C6位区域选择性取代的硫酸纤维素的方法，该硫酸纤维素是使用可溶于无机溶剂的三烷基甲硅烷基纤维素产生的，并且产生具有广泛的溶液粘度的产物。进一步提到这些产物可以用于生物技术、药学和医学领域。然而，这些潜在的应用领域没有被任何实验数据所支持。被认为是该技术的严重缺点的是，似乎不能建立需要的溶液粘度，尽管DS保持稳定，并且溶液粘度明显依赖于起始材料的DP和硫酸化水平(Philipp等人，Das Papier 49(1995)2，58-64)。
DE 19837673 A1、DE 19838535 A1和WO 2000010694 A1描述了使用磺烷基纤维素的阴离子酯作为阴离子对称成分用于生产扁平膜。对称扁平膜的产生根本不同于胶囊的产生。因此不能得出使用SCS产生微胶囊的结论。
Richau，K.等人，J Membr.Sci 1996，113，31-41和DD 298790A5也描述了具有低粘度的SCS，它们是由商售的纤维素-2.5-乙酸酯生产的，能够用于生产对称扁平膜(Cellulose Chem.Technol.25(1991)343-354)。对称扁平膜的生产完全不同于胶囊的生产，无法得出SCS用于生产微胶囊，特别是生产在生物医学领域有用的微胶囊的结论。
Wagenknecht等人(DE 4435180 C1；Das Papier 50(1996)12，712-720)描述了SCS的合成和用于对称扁平膜的应用，它是由乙酸纤维素产生的。通过使用不同硫酸化剂对主要为低分子的纤维素-2.5-乙酸酯在N，N-二甲基甲酰胺中进行均相硫酸化，随后分解乙酰基团，产生SCS，其中进行再处理除盐。这样产生的SCS的溶液粘度低得无法令人满意。尽管该SCS可以用于产生可以用于分离溶剂的对称扁平膜，但是由这样产生的SCS形成的微胶囊稳定性较低，并且是极不均一地形成的，因此不适合医学应用，例如注射形式。
如在DE 4435180中所述的，低粘性SCS不需要通过全蒸发蒸馏也适合用于例如分离溶剂。DE 4435180所述的SCS是将商售乙酸纤维素硫酸化而生产的，显示缩短的聚合物链，以及低溶液粘度。由这类SCS生产的微胶囊很少稳定，并且是非均一地形成的。它们因此不适合医学应用，例如注射形式，和可重复的药物释放。
总之，确定已知有大量方法可以用于生产SCS，但是所有终产物，或者具有极低的溶液粘度、不均匀的取代基分布，或者由于链的大量降解而完全或主要由短纤维组成，或者由于使用毒性试剂而被污染。
当在实验室水平上使用这种SCS微囊包封生物材料时，证明这些胶囊是不稳定的，并且其大小和膜的厚度是不均一的。也观察到生产方法导致的毒性负载对被包封的细胞的生存力或对胶囊的生物相容 性具有相当大的负面影响。
本发明的另一个目的是由天然纤维素产生具有特定分子结构的完全可溶的硫酸乙酸纤维素，以及由它产生具有改善的溶解特性的完全水溶性的、生物相容的SCS，其可以用作生物和医学应用的辅料，特别可以用于将活性生物体固定在由对称膜形成的微胶囊上。
与以前描述的生产方法和终产物不同，根据本发明产生的SCS的特征是例如确定的可调节的溶液粘度范围，这可以使用具有足够高聚合度(DP)值的起始材料，并在生产过程的均相阶段控制缓慢的链降解来实现。利用当前描述的方法产生的SCS通过这些特征解决了以前所述的在生物材料微囊包封过程中的问题。
基本上微胶囊可以分为三种：固体球体、包被的球体和空心球体。
固体球体可以如下产生，胶化物质(例如琼脂、明胶)作为液滴分散到流体聚集体内，并冷却到其熔点以下，使其固化。用于固体球体的基质是例如海藻酸盐和氯化钙(CaCl2)或其他多价金属离子的组合。通过将聚合物溶液滴加到含有带相反电荷的离子的浴内，可以产生空心球体，如固体球体。使用的带相反电荷的离子根据扩散限制应当不渗入浸入其中的液滴内。因此，只在液滴的上表面发生连接反应，由此在流体核心周围形成稳定的膜。溶解连接的核心或者溶解固体球体的核心也可以形成空心球体。包被的球体可以由固体或空心球体通过沉积另外一层或几层复合物形成物质而产生，该复合物形成物质由带相反电荷的聚离子(例如PLL(聚-L-赖氨酸)、壳聚糖)形成。
根据本发明产生的SCS特别适合用于生产空心球体或包被的球体。
已知有多种方法和相应的技术变化用于生产微胶囊。在最简单的情况下，通过套管流动的流体简单的滴落产生胶囊。重力和表面张力与套管外径之积决定了滴下的液滴的大小。该方法只可用于大于1mm的胶囊，但是只有有限的生产能力。
所谓的空气喷射法，也即空气吹脱(Air-Stripping)法，通过在毛细管周围流动的气体层流将重力喷射的液滴带到进料同心毛细 管的末端。通过这种方法，可以减小微滴的直径。
通过空气刀(Air-Knife)法，喷射的流体射流被空气的湍流涡流打破为细小的液滴。但是这两种方法都具有大约0.1-2ml/min的低生产能力。
与纯粹靠重力进行液滴形成因此不适合高粘度溶液的空气喷射法不同，喷射切割器(Jet-Cutter)法通过给定的压力产生了恒定的液流。使用旋转丝以机械方式分散流体的喷射流。利用相应下落途径上流体表面张力的相互依赖性，由分离的流体柱产生球形颗粒。该方法的缺点是与体系相关的切片(slice)和喷射废物。
静电支持的液滴形成通过在毛细管和集合浴之间施加强电场加速了在毛细管中形成液滴，由此在重力滴落的情况下，相当小的液滴从毛细管上滴下。
在利用旋转盘形成液滴的过程中，水流体被引导至快速旋转的盘的中点附近，然后通过产生的离心力流动到盘的边缘。在盘的边缘，流体膜破裂为小的液滴。通过将流体上的振动进行外差作用(heterodyning)，改善了液滴形成。
在使用旋转圆柱体形成液滴的过程中，水流体通过具有确定开口的旋转圆柱体流动。离心力促进在圆柱体边缘形成液滴，在此处流体破裂为小的液滴。
由流体喷射形成液滴能够提高容积流速，因此提高生产能力。在本文中可以区分主要3种方法：
在浸流法(dipping stream process)中，液流高速注射到另一种流体中。由于高剪切力，该喷射流被分散为细小的液滴，但是具有较大的大小变化。
在振动法中，将适当频率的正弦振荡叠加分散从喷嘴喷出的流体的层流射流。该原理追溯到Lord Rayleigh(Proc.London Math.Soc.10(4)，4-13，1878)，他分散了不太粘稠的液流，当旋转对称振荡的波长提高时，流体圆柱体被分散，喷射范围不受影响。最适波长取决于流体的直径、动态粘度、密度和表面张力。
除此之外，还有大量的其他方法和上述方法的改变。Renken和Hunkeler给出了该方法的综述(Renken A.和Hunkeler D.，Microencapsulation：A Review of Polymers and Technologies witha Focus on Bioartificial Organs，Polimery，43(9)，530-537(1998))。
所有这些上述方法都适合生产本发明所述的微胶囊。
使用Inotech公司(Dottikon，Switzerland)制造的包封机(IE-50R)进行微胶囊的生产，即由具有均一大小分布的SCS-微滴生产微胶囊。这些工作基于上述振动法。对于生物医学应用，本说明书中提到的所有方法步骤也可以在无菌条件下进行。这种包封机和功能的描述可见，例如EP 1 062 032 B1。
根据Lord Rayleigh所述，在包封过程中，利用恒定的气压或蠕动泵或线性推进，使SCS水溶液从贮存容器中通过喷嘴输送，以产生恒定的流体喷射流。这样，可以调节恒定的体积流速，结果可以产生同等大小的胶囊。溶解度和溶液粘度取决于本发明SCS的化学特性，可以针对给定的喷嘴在宽范围内自由调节，据此可以获得高工作速度。根据喷射毛细管，可以使用1-15ml/min、优选6-9ml/min的体积流速。
根据目的不同，SCS水溶液可以在不同部分容纳其他的成分。对此，首先是被包封的材料。除此之外，可以按照不同比例加入其他成分(例如基质、防冻剂(例如甘油、DMSO)、蛋白质、溶剂或盐，例如0.9％NaCl)，或者SCS可以直接溶解在特定溶液(例如细胞培养基)中。
振动发射器以100至4000Hz的可变范围产生并向流经喷嘴的流体上传送垂直正弦振动。为了产生微胶囊，优选使用600至3000Hz的频率。除了频率以外，振幅也可以是0-100％。利用产生的垂直振动，可以实现喷射液流分散为相同体积的微滴。原则上利用垂直正弦振动，可以产生限定大小的胶囊。
为了阻止飞行阶段过程中微滴的碰撞，通过在喷嘴和带正电荷的 电极(阳极)之间施加0.8到1.5kV的高电压在喷射液流中产生电荷位移。通过使电流通过电压臂，在喷嘴上被负极化的带负电荷的微滴被拉向阳极方向，从而水平定向。
产生的阳离子微滴在其表面形成围绕非复合流体核心的壳形对称膜；通过微滴中含有的阴离子聚电解质与复合浴中所含的阳离子聚电解质(例如pDADMAC)在微滴相界面上复合，形成壳。膜的厚度随着在聚合物阳离子水溶液中保持的时间而增加。
复合浴由具有不同分子量的聚合物阳离子的水溶液组成。形成的对称膜的稳定性因此取决于化学性质(官能团，取代基的数目和分布)。例如，十二烷胺、乙二胺、哌嗪、亚甲蓝、精氨酸、聚(丙烯胺盐酸盐)、三乙基四胺或精胺适合于该包封方法。优选使用具有季铵基团的聚合物，更优选聚(二烯丙基二甲基铵)或聚(乙烯基苄基三甲基铵)的盐，优选聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)或聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵)。
综合水平，即产生的微胶囊的稳定性，进一步与使用的聚阳离子的链长相关。对于pDADMAC，平均分子量可以位于10,000至500,000，优选15,000至50,000的范围内。用于包封的pDADMAC的合适浓度范围为0.5-5％(w/v)，优选0.8-2％(w/v)。
聚阳离子水溶液根据目的不同可以含有不同比例的其他成分，例如，减小水溶液表面张力的物质、有机溶剂、防冻剂(甘油、DMSO)或盐，等等，例如0.9％NaCl，或者聚阳离子可以直接溶解在特定溶液(例如培养基)中。
在复合浴中存在磁力搅拌器，它产生朝向液滴的滴加方向的垂直液流，因此将形成的微滴运送到新的液滴落入的区域以外，从而使尚未完全形成的微胶囊凝聚的危险减到最小。此外，该搅拌器保持漂浮的微滴，这对于膜形成反应的对流以及随后的洗涤步骤是有利的。
为了根据本发明产生微胶囊，首先产生SCS的水溶液。SCS溶液应当具有1％至4％(w/v)，优选1.5％(w/v)至3％(w/v)的浓度。根据剪切力，可以从粘度图上读出合适的参数。因此，例如，本发明的SCS的 1％溶液应当显示10至500mPas、优选10至200mPas，进一步优选15至80mPas，进一步优选20至50mPas或40至60mPas的溶液粘度。
根据一个实施方案，按照本发明生产的SCS基本上以球形颗粒形成，即本发明的微胶囊显示0.1-50μm、1-100μm、50-250μm、50-500μm、100-250μm、100-500μm、250-500μm、250-700μm、500-1000μm、700-1500μm、1000-2500μm、1500-3000μm、2500-4000μm、3000-5000μm的直径。微胶囊优选显示200-1500μm、进一步优选600-800μm的直径。
为了生物医学应用，由根据本发明产生的SCS形成的SCS溶液可以用现有的方法灭菌，例如通过放射性照射。根据本发明产生的SCS的稳定性在121℃30分钟的蒸汽灭菌过程中得到证明。
按照本发明产生的SCS特别适合产生更稳定的且更均匀的微胶囊。该微胶囊适合包封生物体，例如细菌、病毒、酵母、细胞和组织，用于生物医学应用，而且也适合以生物技术规模产生药理活性成分。它们也可以用于固定药理活性成分，例如用于技术应用的粉末催化剂、胶体、金属络合物、酶、抗体、染料和色素。
按照本发明产生的胶囊因此特别适合在兽医和人类医学中使用，因为它们满足了如下所述的高要求。
为了在血液循环系统或动物或人组织即器官中使用微胶囊，例如用于治疗癌症，微胶囊必须是相对均一的，并且在大小上是可重复的，使得一方面可以避免注射套管和/或血管的充血/堵塞，此外还可以保证每个胶囊使用恒量的包封剂(例如药理活性成分、酶、每个胶囊的细胞数)。胶囊的球形几何形状保证了例如在导管中良好的流动性，以及所有方向均等，和理想的药理活性成分的释放。
此外，胶囊的轻微可压缩性是有用的，因为这减少了胶囊被粘住因而(例如)被压缩的胶囊堵塞导管的机会。胶囊上表面较低的粘着性(特别是在生物流体中)防止了胶囊凝聚。通过以上本发明所述方法产生的SCS在可调节的溶液粘度的基础上允许简单的处理和在生物材料包封过程中预料不到的高工作速度，这对于工业生产基于微胶囊 的药学化合物特别有利。
上述发明的其他优点和应用在下文中根据进行的实施例描述，参照如下附图：
图1显示具有不同所需大小的SCS胶囊的大小分布的显微镜检测(图1A-D)，这些胶囊是使用Inotech包封机IE-50R以不同批次生产的，使用Zeiss Axiovert测定胶囊大小分布。在每种情况下，SCS-溶液以及pDADMAC溶液含有1％NaCl(w/v)。每次喷嘴的振动幅度为100％。其他变量参数如下调节。
表1
  图   胶囊大小  +/STD(μm)   SCS  (％)   pDADMAC  (％)   喷嘴φ(μm)   体积流速  (ml/min)   频率  (Hz)   电压  (V)
  A   264+/-10   1.5   0.85   100   1.5   2000   1300
  B   521+/-16   1.8   1.00   200   6.1   1100   1100
  C   703+/-38   2.8   1.50   250   8.5   700   1100
  D   1180+/-32   2.0   2.50   300   12.9   600   1200
通过选择适合于胶囊生产的参数，能够获得产生的宽范围的微胶囊大小。带宽范围为10至5000μm，取决于根据本发明产生的SCS的可调节的溶液粘度。形成的微胶囊在检测的所有大小时都显示几乎完全理想的球形几何形状和高水平的重复性。
图2，在图2a和2b中，显示了SCS胶囊中的HEK 293细胞在各个时间点的生长行为。胶囊在含4.5％葡萄糖(w/v)(Gibco，Glasgow)和10％胎牛血清(FCS)(Gibco，Glasgow)的DMEM培养基中培养36天。在各个时间采集等份。
图2a从左上到右下定性地显示了微胶囊中细胞数的增加，其中在包封后第1、2、3、7、14和21天采样。用于包封的SCS水溶液(2％w/v)在开始时含有2x106细胞/ml，另外含有1％NaCl(w/v)。包封的其他参数是：
pDADMAC溶液的浓度：1.1％(w/v)，所需的胶囊直径：600μm， 喷嘴直径：200μm，体积流速：6.1ml/min，振幅：100％，频率：900Hz，分散电压：1100V。
图2b显示在对固定的活细胞进行MTT试验(Roche，Mannheim)时在具有600至1200μm所需直径的胶囊中包封的HEK 293细胞的生长行为。为此，胶囊在T75-细胞培养瓶中培养36天。用于在600μm胶囊中包封的参数(--)对应于图2a所述。为了包封在1200μm胶囊中(--)，使用以下参数：用于包封的2％SCS溶液在开始时含有1.5x106细胞/ml，另外含有1％NaCl(w/v)。包封的其他参数是：
pDADMAC溶液的浓度：2.5％(w/v)，喷嘴直径：300μm，体积流速：12.9ml/min，振幅：100％，频率：600Hz，分散电压：1200V。
两条曲线都不能直接比较，但是都显示HEK 293细胞的理想的对数生长行为。这在表面上显示胶囊内的复合SCS和非复合SCS对包封的细胞都没有细胞毒性作用或负面影响。
图3显示含有HEK 293-细胞的SCS胶囊在深冷并解冻后的显微照片。胶囊在深冷之前在含有4.5g/l葡萄糖(Gibco，Glasgow)和10％胎牛血清(Gibco，Glasgow)的DMEM-培养基中培养21天。深冷在含有10％DMSO(v/v)的DMEM培养基中进行。在温育2小时后，胶囊冷却至-80℃。解冻步骤在轻微搅拌下在37℃水浴中进行。为了进一步培养，将DMSO培养基反复更换为新鲜的DMEM培养基，以除去过量的DMSO。利用MTT检测能够确定固定的细胞在冻融程序后存活，尽管在胶囊内有高密度的细胞，并且可以进一步培养。在解冻后，肉眼可见的膜结构和胶囊的几何形状保持完整。
图4显示实施例1b2的b2批的13C NMR谱。在C6位羟基被硫酸酯基团区域选择性取代的结果是，信号从60ppm转移到67ppm。在C2或C3位未检测到乙酸酯基团或任何硫酸酯基团的取代。测定的DS值(DS6＝0.4)显示与由硫测定计算的DS值非常一致。
下列实施方案或实施例不作为本发明的限制。而且在说明书、实施例或实施方案的上下文中，这些变化、要素和组合已经被公开证实，其组合或本身的修饰具有包括在总的说明书、实施例、权利要求书或 图表中的特征，尽管或者即使这些特征组合或变化没有明确地在实施方案中显示或描述，而导致改变的主题或新的方法步骤，即新的方法步骤顺序。
实施例
实施例1：硫酸纤维素钠(SCS)的产生
实施例1a：
取93.73％干含量的10.7g纤维素(Cuoxam-DP为1230的棉籽绒)加到333ml二甲基甲酰胺(DMF)中。纤维素在室温下溶胀大约14小时。
在成功溶胀后，通过加入由8mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酸酐(47ml)作为乙酰化剂和0.7mol/mol AGU的氯磺酸(2.9ml)作为硫酸化剂以及100ml DMF组成的反应混合物，开始混合酯化。合成在50℃的温度下进行。纤维素开始溶解，在大约3小时后可以获得澄清透明的聚合物溶液。
5小时后，将聚合物溶液缓慢倒入(在大约15分钟内)由42.9g氢氧化钠(NaOH)、80g H2O和20g乙酸钠组成并用乙醇补充到1.5l的中和/沉淀介质中，在恒定搅拌下进行中和/沉淀，优选在室温下进行。在聚合物溶液完全倒入中和/沉淀介质中后，再搅拌1小时。随后过滤，洗涤三次，每次使用600ml由在乙醇-水混合物(1∶1，w/w)中的4％(w/w)乙酸钠组成的洗涤溶液。
然后加入333ml脱乙酰化剂(13g NaOH，27g H2O，用333ml乙醇补足)，进行脱乙酰化。将混合物搅拌大约1小时，静置大约12小时。通过用乙酸-乙醇混合物(1∶1，w/w)将pH值调节为8.0导致混合物中和。随后用1升乙醇洗涤三次。在40℃下真空干燥。
使用的乙酰化剂和硫酸化剂的比例和含量依赖于所需的在C2、C3和C6位的区域选择性取代。混合物的适宜比例是本领域技术人员公知的。获得的SCS在水中可溶，DS＝0.33，在1％水溶液中的粘度为25mPas。
使用下列方法对本发明的硫酸纤维素进行分析表征：
A.通过元素分析法进行硫测定：
在定量灼烧SCS样品后，利用元素分析法(装置来自Carlo Erba)确定元素C、H、N和S的百分比，其中根据以下公式由硫含量计算硫酸酯基团的取代程度(考虑制品中的含湿量)：
DS硫酸酯＝162x％S/(3200-102x％S)
B.使用光发射光谱法进行痕量金属分析：
在将纤维素和纤维素衍生物特定制浆后，利用ICP-OES(感应耦合等离子体光学发射光谱法；Perkin-Elmer)进行分析。
C.通过液体13C NMR检测总DS、C6位的部分DS、乙酰基的完全去除：
AGU各个位置的部分取代程度由硫酸纤维素钠D2O溶液的液体13CNMR谱计算，方法是将信号面积积分，比较取代的和未取代的SCS的表面积分。使用Bruker MSL 400分光计以100.63MHz的频率测量光谱，其中使用四甲基硅烷作为化学位移的参照。
D.硫酸纤维素水溶液的澄清溶解性：
除了目测评价硫酸纤维素钠的1％水溶液以外，使用2100AN型浊度计(Hach-Lange GmbH，Düsseldorf，Germany)测定90°角的浊度值，单位为NTU(浊度分析浊度单位)。
E.溶液粘度：
在25℃下利用Viscoboy 2+SAE/KM2自动毛细管粘度计(Lauda，Germany)测定硫酸纤维素钠的1％水溶液的动力学粘度。在使用密度转化后粘度以mPas的单位表示。
实施例1.b1和1.b2
在80℃恒定搅拌8小时下将21.1g棉籽绒(94.86％干含量，DP＝1264)缓慢加到550ml DMF(二甲基甲酰胺)中，冷却至室温(RT)，再搅拌12小时。在溶胀后，加入由8mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酸酐(93ml)和0.9mol/mol AGU的氯磺酸(7.4ml)组成并用DMF补充到200ml总体积的试剂混合物开始混合酯化。然后在50℃和快速搅拌下将试剂混合物快速加到纤维素溶液中。作为形成硫酸乙酸纤维素的 结果，在大约1.5小时后获得淡黄色透明聚合物溶液。在4.5小时后，将该批分为两部分。取出一半聚合物溶液加到由42.9g NaOH、80g H2O和20g乙酸钠组成并用乙醇补充到1.51体积的中和和沉淀介质中(b1)。另一半(b2)在50℃下再搅拌3.5小时，然后加到中和和沉淀介质中。在发生沉淀后，将两批分开过滤，用600m l洗涤溶液(4％乙酸钠(w/w)，在乙醇-水混合物(1∶1，w/w)中)洗三次。加入333m l脱乙酰化剂(13g NaOH，27g H2O，用乙醇补充至333ml的体积)开始脱乙酰化。两批都搅拌1小时，在室温下静置大约12小时。使用乙酸-乙醇混合物(1∶1，w/w)调节pH。两个硫酸纤维素制品分别用1升乙醇洗三次，并在40℃下真空干燥。获得的SCS的性质在表aa中给出。图4显示了b2批的13C NMR谱。C6位羟基被硫酸酯基团区域选择性取代的结果是，信号从60ppm转移到67ppm。未能检测到C2或C3位的乙酸酯基团或硫酸酯基团的任何取代。测定的DS值(DS6＝0.4)显示与根据硫测定计算的DS值非常一致。
表aa：
  b1批   b2批
  反应时间[h]   4.5   8
  质量[g]   12.1   10.7
  干含量[％]   84.11   85.31
  硫含量[％]   7.99   7.24
  取代程度(DS)   0.54   0.48
  区域选择性   C6   C6
  粘度[mm/s2]   66   14
实施例1.c1和1.c2：
如实施例1b所述，使用不同的起始化学品制备两种不同的SCS制剂。在c1批中，没有注意到起始化学品的金属含量。使用金属勺进行化学品的称重或添加。沉淀步骤中使用金属搅拌器。在c2批中，只使用具有极低金属含量的化学品。另外，在合成过程中避免任何与含金属装置如搅拌器、药勺等的接触。两种制剂中重金属含量的分析在表bb中给出。
表bb：
  重金属   Cu   Ni   Ti   Mn   Zn   Fe
  制剂c1(ppm)   3   2   1   0   37   12
  制剂c2(ppm)   1   0   1   0   0   2
实施例1.d1
使用与实施例1b相同的程序，不同的是使用来自Rettenmayer(Germany)的研磨纤维素粉末Arbocell M80代替棉籽绒。21.2g Cuoxam(DP＝750，干含量＝94.16％)用11mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酸酐和1mol/mol AGU的氯磺酸在200ml DMF中转化。脱乙酰化后，经透析纯化所获得的产物，然后冷冻干燥。获得的澄清的可溶性硫酸纤维素钠(SCS)水溶液具有DS＝0.49，1％水溶液的粘度为15mPas。
实施例1.d2
如实施例1a中一样使用棉籽绒，但是使用在200ml DMF中的11mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酸酐和1.1mol/mol AGU的氯磺酸。获得的澄清的可溶性硫酸纤维素钠(SCS)水溶液具有DS＝0.57，1％水溶液的粘度为120mPas。
实施例1.e1和1.e2
硫酸纤维素钠(SCS)如实施例1a所述产生。另外，脱乙酰化后的合成步骤如实施例a1所述进行，但是对于实施例e2，这在层状盒(laminar box)中进行以比较污染程度。结果在表dd中给出。
无菌性检测按照“欧洲药典4”的推荐在液体培养基“巯基乙酸培养基”(对于厌氧性微生物)和“胰胨豆胨培养液”(对于需氧微生物)中进行。另外，也使用低养分液体培养基“1/4强度蛋白胨酵母提取物培养液”。在制备营养培养基后，将10ml一次倒入带有螺旋盖的小瓶中。然后在121℃高压灭菌。每个小瓶接种1ml样品，然后在28℃下控制温度14天。每一试验使用双份制剂进行。作为无菌对照，在相同条件下使用两小瓶未接种的培养基。
观察到混浊或沉积物的那些小瓶被认为是污染的。在无菌条件下制备的样品e2不显示混浊或沉积物，被认为是不含细菌的。
表dd：
Figure G200680007761320070912D000221
图例：-在培养14天后没有生长
+在培养14天后生长
++在14天后强烈生长
实施例1.f
如实施例1a所述将10.7g棉籽绒(TG＝93.9％，DP＝1351)加到230ml的DMF中，在连续搅拌8小时下使之溶胀。起始温度调节为80℃。冷却到室温后，混合物不进行搅拌再保持12小时。在发生溶胀后，加入试剂混合物开始酯化。该试剂混合物分别通过向100ml DMF中连续加入11mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酸酐(64ml)和1mol/molAGU的磺酰氯(5ml)经冷却和搅拌产生。然后将该试剂混合物快速加到纤维素中，同时继续搅拌。随后，使反应温度为50℃。6小时后通过向中和和沉淀介质中缓慢(在大约15分钟内)加入-仍然继续搅拌-聚合物溶液发生中和和沉淀，该中和和沉淀介质由42.9g NaOH、80g H2O和20g乙酸钠组成，用乙醇补充到体积为1.51，并且优选在 室温下进行。在将聚合物溶液加到中和和沉淀介质中后，整个混合物再搅拌1小时。随后将制剂过滤、每次用600ml在乙醇-水混合物(1∶1，w/w)中的硝酸钠的洗涤溶液(4％w/w)洗涤三次。在每种情况下加入333ml脱乙酰化剂(13g NaOH，27g H2O，用333m l乙醇补足)，进行脱乙酰化。将制剂搅拌1小时，在室温下静置大约12小时。用乙酸-乙醇混合物(1∶1，w/w)将pH调节为8.0。然后用1升乙醇洗涤该制剂三次，在40℃下真空干燥。获得的SCS的硫含量为6.49％，导致取代度DS＝0.51。使用NMR(DS总＝DSc6)测定的DS值为0.55。1％水溶液的粘度为40mPas(mm2/s)。
实施例1g：
进行如实施例1f相同的程序，不同的是使用250ml N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)作为溶剂。在加入由11mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酸酐(64ml)作为乙酰化剂和0.5mol/mol AGU的酰胺硫酸(2.9ml)作为硫酸化剂以及100ml N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)组成的反应混合物溶胀后开始混合酯化。合成在70℃的温度下进行。产物的沉淀、脱乙酰化、洗涤和干燥如实施例1f所述进行。得到的在水中完全可溶的S CS具有5.12％的硫含量(DS＝0.31)。使用NMR测定DS值(DS总＝DSc6)为0.33。1％水溶液具有12mPas的粘度。
实施例1h：
进行如实施例1f相同的程序，不同的是使用350ml N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)作为溶剂。在加入由11mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酸酐(64ml)作为乙酰化剂和0.9mol/mol AGU的硫酸(3ml，98％H2SO4)作为硫酸化剂以及150ml DMAc组成的反应混合物溶胀后开始混合酯化。合成在70℃的温度下进行。产物的沉淀、脱乙酰化、洗涤和干燥如实施例1f所述进行。得到的在水中完全可溶的SCS具有6.93％的硫含量(DS＝0.45)。1％水溶液具有5mPas的粘度。
实施例1i：
进行如实施例1f相同的程序，不同的是使用350ml N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)作为溶剂。在加入由6mol/mol脱水葡萄糖单位(AGU)的乙酰氯(29ml)作为乙酰化剂和1.5mol/mol AGU的硫酸(4.9ml)作为硫酸化剂以及150ml DMAc组成的反应混合物溶胀后开始混合酯化。合成在70℃的温度下进行。产物的沉淀、脱乙酰化、洗涤和干燥如实施例1f所述进行。得到的在水中完全可溶的SCS具有10.73％的硫含量(DS＝0.82)。1％水溶液具有13mPas的粘度和2.5NTU的浊度值。
实施例1j：
进行如实施例1f相同的程序，不同的是使用350ml NMP作为溶剂。在加入由6mol/mol AGU的乙酰氯(29ml)作为乙酰化剂和1.5mol/molAGU的SO3/DMF复合物(14g，商业上可作为1∶1的复合物获得)作为硫酸化剂以及150ml NMP组成的反应混合物溶胀后开始混合酯化。合成在60℃的温度下进行。产物的沉淀、脱乙酰化、洗涤和干燥如实施例1f所述进行。得到的在水中完全可溶的SCS具有9.83％的硫含量(DS＝0.72)。1％水溶液具有12mPa s的粘度和6.6NTU的浊度值。
实施例2：由本发明的SCS生产SCS微胶囊
按照已知的制备微胶囊的方法(AirJet-法；JetCutter-法；振动法)(Orive等人，2004，Trends Biotechnol.1022(2)：87-92)，逐滴加入硫酸纤维素溶液，用于利用包封装置(Inotech，型号IE-50R)在聚阳离子溶液(例如pDADMAC)中复合。
纤维素-硫酸微滴浸入搅拌的聚阳离子(pDADMAC)水溶液中，通过自发进行的复合反应导致在相界面处形成半透膜，其包裹一个非复合的液体核心。随着反应时间推移，通过聚阳离子在胶囊膜中长时间扩散，膜强度提高，直到形成的三维网络的密度产生对于聚合电解质的扩散屏障。
为了制备胶囊，产生硫酸纤维素浓度为1.5-3.5％(w/v)的均匀 的SCS水溶液。用于该目的的SCS的取代度(DS)为0.3至0.99。该SCS溶液以1-15ml/min的层流速度，通过100-300μm的喷嘴，逐滴加入0.8-2％pDADMAC-溶液(w/v)中。由于本发明的SCS溶液同时具有低结构粘度和高表面张力，较高的工作速度是可能的。通过容积流速、物理流体特性、喷嘴直径的选择、以及在振动法的情况下也通过控制液体喷射流分解为液滴的激发频率和频率幅度，来确定液滴形成和液滴大小。为了产生直径约为650-700μm的球形微胶囊，将该频率设定为600-1100Hz。提高频率导致较小的胶囊大小，并且如果降低频率则大小变得更大。优选地，选择650Hz的频率，使用250μm的喷嘴，产生平均大小为700μm直径的胶囊。选择1100Hz的频率产生平均大小为500μm的胶囊，选择500Hz的频率产生平均大小为800μm的胶囊。可以通过调节其他参数来进行微调。
此外，胶囊的大小也受硫酸纤维素与pDADMAC反应的影响。反应时间延长、pDADMAC的高浓度和低分子量可降低胶囊大小。能够显示，用本发明的S CS制备的对称微胶囊显示可重复的、准理想的球形几何形状，同时显示较低的大小分散(图1)。
实施例3：含有生物体的SCS-胶囊的生产
生产SCS-微胶囊的方法包括以下重要步骤：(a)制备SCS-溶液，(b)制备SCS-细胞悬浮液，(c)将胶囊转化为液滴，(d)在复合浴中形成复合物，以及(e)终止复合物形成反应。
本发明的SCS首先在室温和搅拌下以1.5-3.5％(w/v)的浓度溶解在生理缓冲盐溶液(0.8-1.0％(w/v))中，并用0.1N NaOH或0.1N HCl将pH值调节至7.2。制备的SCS-溶液在与细胞混合之前在121℃高压灭菌。
SCS-细胞悬浮液的制备：
为了包封SCS-胶囊，使用HEK293-细胞(ATCC CRL-2828)、Jurkat-细胞(ATCC TIB-152)或HIT-细胞(ATCC CRL-1777)。但是原则上可以使用大量附着的以及悬浮的细胞。细胞培养物以适当的常规细胞培 养方法例如在T75瓶或滚瓶中指数扩增，在90％汇合形成单层后收获。使用的细胞系在含4.5g/l葡萄糖(Gibco，Glasgow，UK)和10％胎牛血清(Gibco，Glasgow，UK)的DMEM-培养基中培养。将释放的细胞转移到50ml Falcon-管中，以200g离心5分钟，弃去上清液。然后用PBS缓冲液仔细洗涤细胞沉淀物，最后合并到SCS溶液中，在SCS溶液中均匀悬浮，转移到注射器中，然后在无菌条件下连接到装备有高压灭菌的软管连接和容器的包封单元上。之后立即开始包封过程。
转化为液滴和产生胶囊：
为了包封，首先将速度提高到一定程度，使液体流均匀地流出毛细管；之后可以将体积流速降至最适合转化为液滴的速度。在落入硬化浴中之前，通过旋转集水罐截取在此时转化为液滴的废SCS-细胞悬浮液，在形成均匀的液体喷射(稳定相)后将其转动到一侧，使得发生胶囊形成。产生的微胶囊可以从反应区域连续泵出，并且应当用生理缓冲盐溶液PBS(磷酸盐缓冲液)或培养基洗涤或稀释，以除去未复合的pDADMAC。所有步骤都可以在无菌条件下进行。
之后，在无菌工作区，在胶囊沉淀之后，利用移液器从集合容器中吸出上清液，并用培养基代替。之后立即将包封的细胞在T-瓶或滚瓶中在37℃、5％CO2、饱和湿度和2rpm下培养。4-8小时后，再次更换一次培养基，以除去剩余的pDADMAC。在制备胶囊时，必须注意所有组分和溶液保持无菌。
通过台盼蓝染色确定生存力：
通过台盼蓝染色测定生存力用于测定总细胞计数(死亡的和存活的细胞)。台盼蓝(0.8mM，在PBS中(Sigma-Aldrich，Deisenhofen，Germany))是一种带负电荷的染色剂，它可以选择性地在具有不完整细胞膜的细胞中扩散，并且能够将其细胞质染为蓝色。结果，死亡细胞在光学显微镜下显示蓝紫色，而活细胞显示白色到淡黄色。然后可以利用Neubauer-计数室通过显微镜确定活细胞和死亡细胞的计数。
利用MTT试验的生存力测定
利用MTT试验(MTT-增殖试剂盒，Roche，Mannheim，Germany)的 生存力测定与上述台盼蓝染色不同，只计数活细胞。
该测定方法是一种量热试验，其中黄色四唑盐3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基-四唑-溴(MTT)被动吸附到活细胞中，并且通过加入脱氢酶还原为不溶于水的紫色甲 晶体。在恒定和足够长的温育期内形成的甲 
Figure G200680007761320070912D000272
的量与活细胞数成正比。在37℃温育4小时后在λ＝570nm下通过光度法进行测定。
对于被包封细胞的MTT-生存力检测
MTT试验最初是开发用来测定细胞悬浮液的活细胞数。也可以对完整的胶囊中进行定量MTT-试验。但是，对于定量测定，必须通过使胶囊在超声波浴中在20％SDS-溶液(Sigma-Aldrich，Germany)中温育1小时将细胞溶解到胶囊之外。离心仍然可以获得的胶囊和细胞片段。根据供应商说明进行MTT试验(MTT-增殖试剂盒，Roche，Mannheim，Germany)。通过分光光度法测定MTT-浓度。
实施例4：
使用不同SCS生产批次确定胶囊质量的重复性
为了生产600μm胶囊，制备含1％NaCl(w/v)的2％SCS(w/v)溶液和含1％NaCl(w/v)的1.0％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液升温至30℃。将20ml SCS逐滴加到300ml搅拌的1.0％pDADMAC溶液中。反应时间为3分钟。
喷嘴直径为200μm。体积流速为6.1ml/min。喷嘴振动幅度设定为100％，频率设定为900Hz。分散电压为1100V。
为了生产具有固定的细胞的600μm胶囊，修改如实施例3所述的方法。另外，在T75-瓶中用胰蛋白酶消化生长至90％汇合的细胞，吸收到NM-培养基(DMEM-培养基，含4.5g/l葡萄糖+10％FCS(Gibco，Glasgow，UK))中，以200g沉淀5分钟。将沉淀物重悬浮在PBS中，测定细胞浓度。为了达到2x106细胞/ml SCS的细胞浓度，将一等份细胞悬浮液沉淀。将洗涤后的沉淀物重悬浮在SCS溶液中，并装入注射器中。在之后立即进行细胞悬浮液向液滴的转化。
胶囊大小的测量：
在Neubauer-计数室中用显微镜在4倍放大倍数下测量胶囊大小(光学显微镜M 200和软件″Zeiss Imaging Vers.4″(Carl Zeiss Jena，Jena，Germany)。
微胶囊的稳定性测定：
使用力位移测量装置(LUMiTexture，Lerche GmbH，Berlin，Germany)测定SCS-微胶囊的机械性质。
使用冲压器(stamp)以可编程的速度向测试物体上施加负载，同时用电子秤测量产生的力。根据力位移曲线可以确定对称膜中出现的破裂压力和最大张力的参数。稳定性测定用于不含固定细胞的胶囊，以及用于研究不含固定细胞的胶囊的长期稳定性。
表2
  生产批次   1   2   3   4
  平均最大应力[N/m]   1.36   1.43   1.35   1.38
  标准差[N/m]   0.27   0.29   0.22   0.20
  样品数   20   20   20   20
对具有相同包封参数但是用4种不同生产批次制备的胶囊的测定显示获得的胶囊稳定性是绝对相当的。平均稳定性变化约6％。各个批次之间的分散低于各自测定范围的标准差。该结果说明，由于可重复的SCS合成和选择的过程管理，形成对称膜的复合物形成反应可以极好地受到控制。持续较高的胶囊稳定性允许估计为特定目的产生的具有高机械负载的胶囊的适用性，从而使得对胶囊机械损伤的危险最小化。对于在静止和搅拌培养容器中的培养，以及对于静脉注射和向人和动物组织内的植入，该胶囊足够稳定。
实施例5
被包封的细胞对胶囊稳定性的影响：
如实施例3所述进行胶囊制备。按照实施例4所述的方法测定稳定性。胶囊在开始时装有300个细胞/胶囊。14天后进行测定。
表3
  样品   没有细胞   有细胞
  平均最大应力[N/m]   1.43   1.45
  标准差[N/m]   0.29   0.26
  样品数   20   20
如果悬浮细胞位于微滴表面，则它们在SCS和pDADMAC之间的复合反应过程中持久固定在膜中。测定的胶囊稳定性说明悬浮在SCS中的细胞不会负面影响胶囊膜的稳定性。这是用于固定不溶性固体如不溶于水的组织、人和动物细胞、微生物、微粒、纳米颗粒、固定化酶、催化剂和晶体物质的基本的必要条件。
实施例6
具有固定的细胞的SCS胶囊的长期稳定性：
根据实施例3中所述的方法制备并培养胶囊。如实施例4所述进行稳定性测定。开始时，每个胶囊包封300个细胞，在37℃和5％CO2下，使用2rpm滚瓶，在含有4.5g/l葡萄糖+10％胎牛血清(Gibco，Glasgow，UK)的DMEM-培养基中培养60天。
表4
  样品   制备后不久   培养60天后
  平均最大应力[N/m]   1.35   1.11
  标准差[N/m]   0.22   0.20
  样品数   20   20
对胶囊膜内最大应力(恰好出现在胶囊破裂之前)的测量显示，在60天的培养时间内胶囊的稳定性下降18％，但是仍然足够高地保持 胶囊的完整性。形成的对称膜对在细胞培养基中培养固定细胞过程中发生的渗透、化学和物理应激具有抗性。这使其能够在高盐浓度、改变的pH值和在持久的机械应力下使用。
实施例7
具有特定直径的SCS-微胶囊的生产和重复性
为了制备基准直径(reference diameter)为250μm的胶囊，制备含1％NaCl(w/v)的1.5％SCS(w/v)溶液，制备含1％NaCl(w/v)的0.85％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液升温到30℃。将10ml SCS逐滴加到300ml搅拌的0.85％pDADMAC溶液中。pDADMAC与SCS的浓度比为17(g/g)。反应时间为2分钟。
注射驱动器装备有10ml的塑料注射器。喷嘴直径为100μm。体积流速为1.5ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率设定为2000Hz。分散电压为1300V。结果显示在图1A中。
为了制备基准直径为520μm的胶囊，制备含1％NaCl(w/v)的1.8％SCS(w/v)溶液，和含1％NaCl(w/v)的1.0％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液升温到30℃。将20ml SCS逐滴加到300ml搅拌的1.0％pDADMAC溶液中。pDADMAC与SCS的浓度比为11.1(g/g)。反应时间为3分钟。
注射驱动器装备有塑料注射器。喷嘴直径为200μm。体积流速为6.1ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率设定为1100Hz。分散电压为1100V。结果显示在图1B中。
为了制备基准直径为700μm的胶囊，制备含1％NaCl(w/v)的2.8％SCS(w/v)溶液，和含1％NaCl(w/v)的1.5％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液升温到30℃。将15ml SCS逐滴加到8.5ml搅拌的1.5％pDADMAC溶液中。pDADMAC与SCS的浓度比为10.7(g/g)。反应时间为3分钟。
注射驱动器装备有塑料注射器。喷嘴直径为250μm。体积流速为8.5ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率设定为700Hz。分散电压为 1100V。结果显示在图1C中。
为了制备基准直径为1200μm的胶囊，制备含1％NaCl(w/v)的2％SCS(w/v)溶液，和含1％NaCl(w/v)的2.5％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液升温到30℃。将30ml SCS逐滴加到300ml搅拌的2.5％pDADMAC溶液中。pDADMAC与SCS的浓度比为10.7(g/g)。反应时间为5分钟。
注射驱动器装备有塑料注射器。喷嘴直径为300μm。体积流速为12.9ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率设定为600Hz。分散电压为1200V。结果显示在图1D中。
在Neubauer-计数室中用显微镜在4倍放大倍数下测量胶囊大小(光学显微镜M 200和软件″Zeiss Imaging Vers.4″(Carl Zeiss Jena，Jena，Germany)。
使用不同SCS生产批次测定胶囊大小的重复性
为了比较不同生产批次的重复性，使用含有1％NaCl(w/v)的1.7％SCS(w/v)溶液和含有1％NaCl(w/v)的1.5％pDADMAC(w/v)溶液，制备基准直径为710μm的SCS胶囊。pDADMAC溶液升温到30℃。以8.1ml/min将15ml SCS逐滴加到300ml搅拌的1.5％pDADMAC溶液中。pDADMAC与SCS的浓度比为10.7(g/g)。反应时间为3分钟。
注射驱动器装备有塑料注射器。喷嘴直径为250μm。体积流速为8.1ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率设定为750Hz。分散电压为1350V。结果显示在表5中。
在Neubauer-计数室中用显微镜在4倍放大倍数下测量胶囊大小(光学显微镜M 200和软件″Zeiss Imaging Vers.4″(Carl Zeiss Jena，Jena，Germany)。
表5
  生产批次   1   2   3   4   5
  平均直径[μm]   667   725   714   720   717
  标准差[μm]   16   29   26   25   18
  标准差[％]   2.3   4.0   3.6   3.5   2.5
 所有批次的平均直径[μm]   709
 所有批次的平均标准差   24μm  (3.3％)
其他的生产规范对应于实施例2中所述的方法。
图1所示的实施例说明可以生产不同直径的单分散的SCS-微胶囊，它们开启了胶囊的广泛应用的可能性。胶囊直径的标准差较低，为平均值的4％。批间差异较低，对于直径为710μm的胶囊为3.3％，因此使用本发明的方法生产的SCS可以达到高重复性。这是由于以下事实：从喷嘴喷出的液体喷射流具有恒定的流速，这只有在非常均一的聚合物溶液时才是可能的。这特别适于制备较低直径的胶囊，因为流速的微小变化导致胶囊大小的较大变化。甚至在265μm的低平均直径时，本发明的SCS也达到4％的标准差(图1a)，尽管非均一S CS溶液导致的最小体积变化可能对大小分布具有显著的负面影响。在520μm胶囊时，可以达到2％的标准差(图1b)。产生的胶囊的单分散能够使固定的材料具有极精确的剂量，因为可以准确计算胶囊的表面。被固定的细胞在单分散的颗粒中均匀地生长。在搅拌的培养容器中，单分散的胶囊确保具有均匀的分散，因此所有培养的细胞都具有最佳生长条件。只有对于具有低大小分散的胶囊才能够使用套管应用微胶囊，因为这使堵塞的危险最小化。较高的喷嘴直径允许固定分离的小组织，而具有最低的堵塞危险。也可以用其制备单分散的胶囊(图1C)。可以生产的胶囊的最小大小只受为产生液滴而选择的方法限制，而不受使用的SCS-溶液限制。
实施例8
SCS胶囊对细胞生长行为的影响的研究
HEK 293细胞的生长行为在时程实验中进行。
为了产生SCS胶囊，用胰蛋白酶消化T75-瓶中90％汇合的分裂的细胞，收集到DMEM-培养基中，以200g离心5分钟。将物质重悬浮在PBS中，测定细胞浓度。为了调节2x106细胞/ml SCS的细胞浓度，再次沉淀一份细胞悬浮液。将洗涤后的沉淀物重悬浮在SCS溶液中，并装入 注射器中。之后立即发生细胞悬浮液向液滴的转化。
为了产生600μm的胶囊，采用含1％NaCl(w/v)的2％SCS(w/v)和含1％NaCl(w/v)的1.1％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液保持在30℃的适中温度下。将20ml SCS溶液滴加到300ml搅拌的1.1％pDADMAC溶液中。反应持续时间为3分钟。
喷嘴直径为200μm。流速调节为6.1ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率调节为900Hz。分散电压为1100V。
为了产生1200μm的胶囊，采用2％SCS(w/v)、1％NaCl(w/v)溶液和含1％NaCl(w/v)的2.5％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液加热到30℃。
将30ml SCS溶液滴加到300ml搅拌的2.5％pDADMAC溶液中。反应持续时间为5分钟。喷嘴直径为300μm。流速为12.9ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率调节为600Hz。分散电压为1200V。
图2a从左上图至右下图显示微胶囊中细胞计数的提高，其中在包封后1、2、3、7、14和21天采集测试样品。
图2a在显微镜照片中清楚地显示了SCS胶囊中固定的HEK 293细胞的良好的细胞生长。这些细胞作为单个、非凝聚的细胞固定，在开始时附着在胶囊膜的内表面上，最后充满胶囊。细胞然后在胶囊腔内发生密集、组织样的细胞凝聚。
在图2b中，显示了600μm和/或1200μm胶囊中固定的HEK 293细胞的生长曲线。该图说明了封入的HEK 293细胞在36天期间的增加。胶囊在含30ml NM培养基的T175-瓶中培养。利用MTT试验(MTT-增殖试剂盒，Roche，Mannheim，Germany)按照生产商说明确定每ml SCS溶液的活细胞计数。
图2b进一步显示对数生长期，其在根据最初的包封具有低生长速度的扩大的过渡期之后，并转化为最终的稳定期。甚至使用静止培养，使用直径为600μm的胶囊也能获得每ml SCS 5.61x107个细胞的极高的细胞密度，使用直径为1200μm的胶囊获得每ml SCS 3.1x107个细胞的细胞密度。较小胶囊中的较高细胞密度与增加的比交换表面 成正比，其限制了气体和营养物的不确定的材料转移(表6)。
表6
 R球体[mm]   A球体/V球体  [mm2/mm3]   细胞密度  [细胞/ml SCS]
  0.3   10.0   5.60E+07
  0.6   5.0   3.10E+07
在对数生长早期测定的倍增时间(tD)为tD 600nm＝73h，tD 1200nm＝86h，其大小相当，因为此时扩散还不是细胞生长的限制因素。
实施例9
冻融后SCS胶囊的稳定性
为了进行该检测，将T75-瓶中90％汇合的分裂细胞悬浮在DMEM培养基中，以200g离心5分钟。将沉淀物重悬浮在PBS中，测定细胞浓度。为了调节细胞浓度为2x106细胞/ml SCS，将一份细胞悬浮液沉淀。将洗涤后的沉淀物重悬浮在SCS溶液中，并装入注射器中。在之后立即开始包封过程。
为了产生600μm的胶囊，采用含1％NaCl(w/v)的2％SCS(w/v)和含1％NaCl(w/v)的1.1％pDADMAC(w/v)溶液。pDADMAC溶液保持在30℃温度下。将20ml SCS滴加到300ml搅拌的1.1％pDADMAC溶液中。反应持续时间为3分钟。
喷嘴直径为200μm。流速调节为6.1ml/min。喷嘴振动幅度为100％，频率调节为900Hz。分散电压为1100V。
胶囊在冷冻之前在含有30ml含4.5g/l葡萄糖+10％FCS的DMEM培养基的T175-瓶中培养21天。
冷冻在加入了另外10％DMSO(v/v)的含4.5g/l葡萄糖+10％FCS的DMEM培养基中进行。培养2小时后，将胶囊以恒定的冷却速度冷却到-80℃。胶囊贮存在-80℃以供进一步使用。
显微镜图像(图3)显示在根据生产商说明使用MTT试验(MTT-增 殖试剂盒，Roche，Mannheim，Germany)进行活染色后的具有固定的细胞的胶囊，它已经解冻，并且然后在DMEM培养基中培养24小时。
解冻后，肉眼可见的胶囊膜结构保持十分完整。在该程序之后胶囊也使固定的细胞保持稳定。使用MTT试验也可以看出，固定的细胞在冻融程序后存活，并且可以容易地再次培养，尽管在胶囊内部具有极高的细胞密度。胶囊膜看起来总体上是不透明的。这使得人们可以利用工业生产方法提供含有高浓度人细胞的胶囊。也可以以合理的费用提供等份贮存和低温保藏。

Claims (42)

1.生产区域选择性取代的硫酸纤维素钠的方法，其特征在于以下步骤的组合：
a)将天然纤维素在极性非质子溶剂中溶胀；
b)加入硫酸化试剂和乙酰化试剂，用于使乙酸酯基团和硫酸酯基团沿着聚合物链和在聚合物链之间同时酯化和分布；
c)之后直接用碱完全中和，由此在不切割乙酰基的情况下使硫酸酯转化为硫酸乙酸纤维素的钠盐，由此该直接进行的中和也避免了乙酸酯基团的切割及纤维素链的降解；和
d)随后沉淀、脱乙酰基化、洗涤并干燥硫酸纤维素钠，由此硫酸纤维素钠的特征为在水中浓度为1％时溶液粘度为10至500mPas。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤c)中的碱为氢氧化钠。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述中和步骤与沉淀同时完成。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围是可调节的，基于1％的水溶液，为15至400mPas。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围，基于1％的水溶液，为20至300mPas。
6.根据权利要求4的方法，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围，基于1％的水溶液，为15至100mPas。
7.根据权利要求4的方法，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围，基于1％的水溶液，为20至50mPas。
8.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述天然纤维素在选自N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺的极性溶剂中溶胀。
9.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于溶胀后的纤维素用选自硫酸、酰胺硫酸、三氧化硫、磺酰氯和氯磺酸的硫酸化试剂硫酸化。
10.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于溶胀后的纤维素用乙酰氯或乙酸酐乙酰化。
11.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述溶胀是在20℃至100℃的温度下进行的。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于所述溶胀是在40℃至80℃的温度下进行的。
13.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述乙酰化和硫酸化是在20℃至80℃的温度下进行的。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于所述乙酰化和硫酸化是在30℃至70℃的温度下进行的。
15.根据权利要求13的方法，其特征在于所述乙酰化和硫酸化是在40℃至65℃的温度下进行的。
16.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所有起始材料基本不含重金属，产生的硫酸纤维素钠的铁含量≤20ppm，因此产生的硫酸纤维素钠的不包括铁的总重金属含量≤10ppm。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于所有起始材料基本不含选自Cd、Pb、Hg、Fe、Ni、Ti、Mn、Zn或Cu的重金属。
18.通过权利要求1-3和8-17之一的方法获得的硫酸纤维素钠，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围是可调节的，基于溶于水的1％溶液，为10至500mPas。
19.根据权利要求18的硫酸纤维素钠，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围，基于溶于水的1％溶液，为15至400mPas。
20.根据权利要求18的硫酸纤维素钠，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围，基于溶于水的1％溶液，为20至300mPas。
21.根据权利要求18的硫酸纤维素钠，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围，基于溶于水的1％溶液，为15至100mPas。
22.根据权利要求18的硫酸纤维素钠，其特征在于产生的硫酸纤维素钠的溶液粘度范围，基于溶于水的1％溶液，为20至50mPas。
23.根据权利要求18的硫酸纤维素钠，其特征在于产生的硫酸纤维素钠不含重金属，产生的硫酸纤维素钠的铁含量≤20ppm，产生的硫酸纤维素钠不包括铁的总重金属含量≤10ppm。
24.根据权利要求23的硫酸纤维素钠，其特征在于产生的硫酸纤维素钠不含选自Cd、Pb、Hg、Fe、Ni、Ti、Mn、Zn或Cu的重金属。
25.生产微胶囊的方法，其特征在于以下方法步骤：
a)由权利要求18-24中任一项的硫酸纤维素钠制备0.5至10％的水溶液；
b)通过向硫酸纤维素钠水溶液中加入被包封材料并且任选地加入一种或多种其他基质、载体添加剂、溶液、防腐剂、盐、甘油或DMSO，制备用于包封过程的硫酸纤维素钠悬浮液；
c)将b)的悬浮液滴加到胶囊复合浴中；和
d)胶囊在含有聚(二甲基烯丙基氯化铵)水溶液的浴中复合。
26.根据权利要求25的方法，其特征在于所述被包封材料是生物来源的。
27.根据权利要求25或26的方法，其特征在于使用振动程序和100至4000Hz的频率进行滴加。
28.根据权利要求25或26的方法，其特征在于所述复合在含有平均分子量为10,000至500,000的聚(二甲基烯丙基氯化铵)的浴中完成。
29.根据权利要求28的方法，其特征在于所述复合在含有平均分子量为10,000至50,000的聚(二甲基烯丙基氯化铵)的浴中完成。
30.根据权利要求18-24中任一项的硫酸纤维素钠在生物材料微囊包封中的用途。
31.根据权利要求18-24中任一项的硫酸纤维素钠在根据权利要求25-30的方法中的用途。
32.由根据权利要求18-24中任一项的硫酸纤维素钠形成的微胶囊。
33.用根据权利要求25-29中任一项的方法制备的硫酸纤维素钠形成的微胶囊。
34.根据权利要求32或33的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊，其特征在于它们具有均一的大小分布，平均直径为0.1-50μm、100-250μm、500-1000μm或1500-3000μm。
35.根据权利要求32或33的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊，其特征在于它们具有均一的大小分布，平均直径为1-100μm、250-500μm、600-800μm、1000-2500μm或3000-5000μm。
36.根据权利要求32或33的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊，其特征在于它们具有均一的大小分布，平均直径为50-250μm、700-1500μm或2500-4000μm。
37.根据权利要求32或33的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊，其特征在于它们具有均一的大小分布，平均直径为50-500μm。
38.根据权利要求32或33的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊，其特征在于它们具有均一的大小分布，平均直径为100-500μm。
39.根据权利要求32或33的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊，其特征在于它们具有均一的大小分布，平均直径为250-700μm。
40.根据权利要求32或33的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊，其特征在于它们具有均一的大小分布，平均直径为200-1500μm。
41.作为药物的根据权利要求32-34中任一项的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊。
42.根据权利要求32-34中任一项的由硫酸纤维素钠形成的微胶囊在制备用于植入和/或注射的药物中的用途。
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