PT1863851E - Processo para fabricar sulfato de celulose com características aperfeiçoadas - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA FABRICAR SULFATO DE CELULOSE COM CARACTERÍSTICAS APERFEIÇOADAS" A invenção faz parte de um processo para produção de sulfatos de celulose de sódio substituídos e regioselectivos (SCS) com caracteristicas aperfeiçoadas, assim como, da aplicação deste SCS aperfeiçoado para o micro-encapsulamento de substâncias biologicamente activas. Este tipo de microcápsulas, também conhecidas por microcápsulas simplex, é obtido gotejando uma solução aquosa no sulfato de celulose aperfeiçoado de um polielectrólito, preferencialmente pDADMAC (poli(sal amoniaco dialildimetilo)) ou idêntico. 0 sulfato de celulose de sódio (SCS) é um polímero solúvel em água já há muito conhecido dos semi-ésteres de ácido sulfúrico de celulose. SCS é formado pela esterificaçao dos grupos hidroxílicos da celulose com um agente de sulfatação, ou seja, anidridos de ácido sulfúrico, ácido sulfúrico ou seus derivados seguidos pela conversão do semi-éster acidificados num sal de sódio neutro.

Os métodos básicos são conhecidos pela produção de SCS, durante a qual a sulfatação pode ser levada a cabo numa fase heterogénea sem dissolver o polímero (heterogéneo) ou numa fase homogénea, seja juntamente com a dissolução do polímero (quase homogéneo) ou depois da dissolução prévia do polímero (homogéneo).

Lukanoff, B. e Dautzenberg, H. (1994, Das Papier, Heft 6, 287-298) aperfeiçoam um bem conhecido método heterogéneo 2 para a produção (US 2.539.451; US 2.969.355), utilizando um ácido sulfúrico e propanol como meio de reacção e agente de sulfatação. Para este tipo de método heterogéneo de produção, como por Bohlmann et al. (2002, Chemie Ingenieur Technik, 74, 359-363), o meio de reacção é primeiramente preparado a partir de 96% de ácido sulfúrico e isopropanol numa proporção molar de 1.8:1. A sulfatação da celulose é levada a cabo aqui a -5°C durante 150 minutos. Para cancelar a reacção, a mistura da reacção é removida do semi-éster de ácido sulfúrico da celulose com álcool e é lavada. Por fim, o produto lavado é transferido para um sal de sódio, utilizando hidróxido de sódio.

As desvantagens deste tipo de método heterogéneo de sulfatação da celulose têm a ver com a dificuldade em controlar a reacção exotérmica, que causa inevitavelmente irregularidades na distribuição de substituintes ao longo e entre a cadeia de polímeros, afectando assim a solubilidade e nível de polimerização do sulfato de celulose obtido. Outra grave desvantagem deste método heterogéneo de produção tem a ver com a rápida e eficiente degradação da cadeia de celulose durante a sulfatação anterior. Para reduzir a degradação da celulose, procede-se a operações de lavagem no fim da reacção de sulfatação, o que permite eliminar adequadamente o calor e evitar, assim, outro aumento da temperatura. Porém, o processo de difusão e de fonte, assim como, a estrutura morfológica da celulose têm uma influência considerável no curso da reacção porque esta ocorre com uma manutenção geral da estrutura física estável da celulose.

Para obter uma total solubilidade em água do sulfato de celulose heterogeneamente produzido sem separação da 3 parte insolúvel no grau de substituição faixa (DS) <0.8, recomenda-se uma pré-activação da celulose em DD 295858 A5 e DE 4019116 Al, em que são apenas obtidos os produtos com muito baixa viscosidade, no máximo 8,5 mPas em 1% de solução aquosa. Durante a inserção deste sulfato de celulose para a produção de micro-cápulas simplex, deve ter-se em atenção que são formadas apenas microcápsulas com uma resistência mecânica muito reduzida.

De acordo com DE 4021049, o sulfato de celulose com elevada viscosidade pode ser isolado dos produtos de reacção criados, enquanto que, através de passos adicionais no processo, as partes insolúveis em água podem ser separadas e as partes solúveis com muito pouca viscosidade podem ser lavadas (ver Lukanoff, B. e Dautzenberg, H. : 1994, Das Papier, Heft 6, 287-298).

Como resultado do método heterogéneo de produção, tornando a celulose completamente solúvel em água, obtêm-se produtos com taxas de substituição relativamente elevadas (minimo DS = 0,7) e, consequentemente, uma distribuição de substituição não homogénea, apesar de utilizar celulose inicial macro-molecular com baixa viscosidade. A sulfatação homogénea da celulose normalmente causa a formação de intermediários de celulose organicamente solúveis, através dos quais se pode suprimir a degradação da cadeia da celulose numa faixa aceitável durante a reacção de sulfatação. Uma vez que a sulfatação é levada a cabo depois ou em simultâneo com a dissolução completa da estrutura de fase sólida num solvente aprótico dipolar, observa-se uma troca uniforme de substituintes. O produto final tem uma maior viscosidade da solução e é já, em parte, completamente solúvel em água com um valor DS de 4 0,25. Por exemplo, utilizando acetato de celulose com DP relativamente baixo (Cuoxam-DP aprox. 250, DS=2,4), é obtida a viscosidade da solução do SCS sintetizado na gama dos 10 mPas (medida de uma solução de 2% em 2N NaOH num viscosimetro Ubbelohde) (ver DE 4435180).

Através de outras modificações do processo de produção baseado na esterificação homogénea dos acetatos de celulose em parte substituídos, obtém-se uma substituição regioselectiva dos grupos OH nos vários átomos de carbono da unidade anidro-glucose da celulose. Wagenknecht et al. (DE 4435082; DE 4435180 e Das Papier, 1996, 712-720) descreveram a sulfatação regioselectiva na posição C2/C3 ou C6, na qual é utilizado um acetato de celulose organicamente solúvel como polímero inicial.

As grandes desvantagens são o reduzido grau de polimerização do conjunto no acetato de celulose disponível no comércio habitual (Cuoxam-DP aprox. 200 a 350), de modo que de acordo com o estado actual da técnica nenhum acetato de celulose consegue produzir um sulfato de celulose com uma viscosidade de solução superior a aprox. 10 mPas numa solução aquosa de 1%. Continua a ambicionar-se a modulação de uma desejada gama de viscosidade da solução do SCS obtido a partir do acetato de celulose definido com DP inicial.

Já há muito se conhece a aceto-sulfatação de celulose nativa como princípio básico para a produção de sulfatos de acetato de celulose, acetatos de celulose ou sulfatos de celulose através da esterificação misturada. Assim sendo, o ácido sulfúrico é introduzido como reagente com anidrido de ácido acético num ácido acético glacial como meio de reacção (US 2.683.143; US 2.969.356; US 3.086.007; US 5 3.075.963/ US 4.005.251). Em vez de ácido sulfúrico pode também utilizar-se clorossulfinato de sódio (US 2.969.355). Como resultado dos ensaios de Chauvelon (Chauvelon, G. et al., Carbohydrate Research 338 (2003) 743-750) para a produção de sulfato de acetato de celulose solúvel em água, observa-se uma forte inconsistência desta reacção heterogénea, de modo a que o produto final possa ser obtido somente por fraccionamento.

Além disso, sabe-se que é possivel uma aceto-sulfatação da celulose sob dissolução do éster de sulfato de acetato de celulose que se formou pela utilização de dimetilf ormamida N, N como meio de reacção. Neste caso, pode utilizar-se anidrido acético/trióxido de enxofre (Wagenknecht, W. et al., "Cellulosics: materiais for selective separations and other technologies", Kennedy, Phillips, Williams, Horwood (1993) 205-211) ou anidridos acéticos/ácido clorossulfónico (Wagenknecht, W., Das Papier 50 (1996) 12,712-720) como mistura de reacção. O sulfato DS até aprox. 0,8 exclusivamente na posição C6 na unidade de anidro-glucose de substituição de sulfato de celulose solúvel em água é obtido após a eliminação alcalina dos grupos de acetilo instáveis.

As desvantagens do sulfato de celulose sintetizado de acordo com este método consistem na assimetria da distribuição da substituição em DS<0,6, o que causa a heterogeneidade numa solução aquosa e, consequentemente, a inutilidade para a produção das membranas simplex. SCS como polianião, que deve satisfazer as exigências de acordo com a invenção para a produção automatizada de microcápsulas simplex esféricas de determinado tamanho, 6 suficiente resistência mecânica e estabilidade a longo prazo, tem de cumprir com uma série de requisitos: - solubilidade num meio aquoso sem deixar residuos viscosidade da solução ajustável com determinada concentração - baixa viscosidade da estrutura para manter a micro-cápsula regular, mesmo quando há uma elevada velocidade de gotej amento - sulfato-DS ajustável na faixa entre 0,3 e 0,7 para a formação simplex estável - sulfatação localmente selectiva na posição C6 - possibilidade de esterilizar a solução aquosa a um valor pH 7 - bio-compatibilidade, ou seja, esterilizada e livre de endotoxinas, baixo teor de metais pesados A maior desvantagem do processo de produção heterogéneo, assim como, homogéneo é a degradação descontrolada do comprimento da cadeia durante a reacção de sulfatação. Devido a esta degradação do comprimento da cadeia nunca foi possível até agora produzir SCS, que seja completamente solúvel em água em DS de 0,3 até quase a 1, preferencialmente 0,3 a 0,6, e cuja viscosidade numa 7 solução de 1 % se situa numa gama pequena, isto é, de 15 a 60 mPas ao longo do curso da reacção de aceto-sulfatação.

Uma viscosidade da solução ajustável e suficientemente elevada do SCS dissolvido é particularmente interessante quando o SCS é utilizado para encapsular biologicamente material activo, pois no processo utilizado para o efeito há uma suspensão do material biologicamente activo numa solução SCS aquosa que pinga de um bocal para uma solução contra-iónica. A formação e homogeneidade das pingas e a reprodutibilidade do tamanho das pingas dependem directamente da viscosidade da solução do SCS dissolvido. Por outro lado, a espessura e resistência das paredes da cápsula são influenciadas pelo grau de polimerização e da concentração do SCS.

Apesar de uma viscosidade muito baixa da solução permitir a formação de pingas e, consequentemente, um potencial encapsulamento do material biológico, também causa irregularidades na mencionada formação de pingos e das microcápsulas que dai surgem. Este tipo de irregularidades são visiveis na falta de homogeneidade, distribuição não uniforme do tamanho, falta de estabilidade

e vedação irregular dos materiais biológicos. Uma viscosidade muito baixa da solução do SCS dissolvido em água, constitui assim uma desvantagem agravada do SCS convencionalmente produzido e de todos os produtos criados a partir dai.

Esta desvantagem, nomeadamente a viscosidade muito baixa da solução, é em parte causada pela limitação de vários processos de produção em utilizar uma determinada matéria-prima de celulose. O acetato de celulose disponível no comércio habitual e normalmente utilizado (acetato de 8 celulose 2,5) possui unidades de polímero (DP) médias de 250-270. Apenas a partir deste limite DP, é que não se pode obter uma viscosidade elevada do SCS. Durante a produção do SCS, especialmente durante a sulfatação com reagentes fortemente acídicos, há uma maior degradação da cadeia, através qual a viscosidade da solução é ainda mais reduzida. Obtém-se uma viscosidade típica da solução inferior a 10 mPas (ver por ex. DE 4435180). A pasta de madeira, que é por vezes utilizada como matéria-prima, tem valores DP à volta de 600. A utilização de pasta de madeira nos bem conhecidos processos de produção acima descritos causa uma degradação distinta da cadeia e, correspondentemente, obtém um produto final com uma viscosidade muito baixa da solução. O ideal seria transformar celulose nativa altamente molecular, como lintéres de algodão, que possui elevados valores DP de aprox. 1250 - 1400 unidades de polímero, em SCS para conseguir obter as maiores cadeias possíveis de polímero e, consequentemente, uma elevada viscosidade da solução.

Os lintéres de algodão são utilizados como matéria-prima no método de ácido sulfúrico heterogéneo/propanol, mas este método de produção causa, como já foi referido, um número considerável de rupturas na cadeia, de modo que os produtos resultantes após a síntese apresentem apenas uma baixa viscosidade da solução. Uma vez que o processo de produção heterogéneo também não permite uma distribuição uniforme dos grupos de sulfato, as características do produto, isto é, a solubilidade da água do SCS, são negativamente influenciadas. 9 É, pois, objectivo desta invenção fornecer um processo de produção adicional e aperfeiçoado para SCS substituído regioselectivo sem as desvantagens do estado da técnica e que permite ajustar a viscosidade da solução com uma total solubilidade da água do produto final e com a DP definida da matéria-prima de celulose utilizada. 0 objecto é tratado ao longo dos passos do processo da reivindicação principal 1. São descritas versões excepcionais nas características das reivindicações dependentes.

Neste método, a celulose (preferencialmente lintéres de algodão) é dissolvida por uma reacção quase homogénea num solvente polar por esterificação misturada com uma mistura de reagentes, que consiste de um agente de acetilação e um agente de sulfatação num éster de mistura de acetato e sulfato. Uma vantagem é o facto da celulose poder primeiramente expandir no meio de reacção as temperaturas que sobem, preferencialmente entre 30 e 100°C durante um longo período de tempo, preferencialmente de 0,5 a 12 horas, sob agitação prolongada, continuando a expandir à temperatura ambiente. Por fim, adiciona-se sob agitação prolongada a mistura de reagentes previamente preparada, preferencialmente com um agente de acetilação, um agente de sulfatação e um solvente polar de composição definida. O nível de substituição parcial do sulfato DS e acetato DS pode ser ajustado de um modo conhecido pelos técnicos até um máximo total de DS=3, utilizando a relação molar dos reagentes uns com os outros e a relação molar com a celulose. A reacção de aceto-sulfatação ocorre preferencialmente a uma temperatura entre os 30 e 80° C, dissolvendo-se o sulfato de acetato de celulose produzido 10 no sistema de reacção numa solução viscosa. Se a temperatura for mantida predominantemente constante num predeterminado nivel, a viscosidade da solução de polimero desce à medida que a reacção decorre, de modo a poder ajustar esta viscosidade para um determinado nivel.

Em conformidade com a invenção é importante parar a degradação através de neutralização definida, fixando assim nivel de polimerização e a viscosidade da solução do sulfato de celulose obtido depois do reprocessamento.

Para efeitos de neutralização, os grupos de semi-estéres de sulfato são transformados na sua forma de sal de sódio sem eliminar os grupos de acetilo antes ou (em alternativa também) em simultâneo com a precipitação. Sob as condições de acordo com a invenção e a acrescentar a isso, os grupos de semi-estéres de sulfato são cuidadosamente neutralizados sem decompor, de modo algum, os grupos de acetilo, seja antes ou (em alternativa também) em simultâneo com a precipitação com um neutralizador básico, preferencialmente NaOH, dissolvido num neutralizador e/ou precipitador apropriado. A seguir, o éster misturado com sulfato de celulose, que foi preferencialmente precipitado numa forma particular, é lavado com um meio de lavagem apropriado, preferencialmente com etanol, que contenha acetato de sódio ou uma mistura de etanol e água. O reprocessamento para o produto final é então levado a cabo através de hidrólise alcalina dos grupos de acetilo numa fase heterogénea com a ajuda de NaOH etanólico, neutralização de retorno para um valor pH perto de 7, lavagens repetidas preferencialmente com etanol aquoso até 11 ficar sem sal e subsequente secagem do sulfato de celulose de sódio a vácuo aprox. 40°C.

Após este processo de isenção de residuos de sintese, o sulfato de celulose de sódio claramente solúvel pode ser produzido com DS superior ou igual a 0,3, o que demonstra uma troca muito vantajosa, uniforme e regioselectiva de substituintes dos grupos de semi-estéres de sulfato na posição C6 e que são identificados por uma viscosidade ajustável da solução numa gama de 10 mPas a 500 mPas, preferencialmente de 15 a 400 mPas, ainda mais preferível entre 20 e 300 mPas, ainda mais preferível entre 15 e 100 mPas, ainda mais preferível entre 20 e 60 mPas com uma concentração de 1% na água.

Uma vez que os produtos obtidos são substancialmente puros, não é necessário purificá-los ainda mais por diálise ou ultra-centrifugação.

Enquanto que nos métodos conhecidos até então a neutralização era efectuada no fim depois da operação de lavagem e/ou desacetilação, os inventores demonstram que quando a neutralização é efectuada directamente no fim na operação de sulfatação e sem uma prévia desacetilação ou operações de lavagem, a qualidade do SCS produzido é visivelmente melhor. Podem também obter-se resultados satisfatórios quando a neutralização é efectuada ao mesmo tempo que a precipitação.

Para neutralizar é adicionada, em conformidade com a invenção do processo, uma base ou uma solução alcalina (preferencialmente NaOH) à mistura da reacção, sendo a base, a solução alcalina ou NaOH exactamente coordenados com o reagente de sulfatação. Por exemplo 1 mol de um ácido tribásico, como ácido clorossulfónico, é neutralizado com 3 12 mol de NaOH e 1 mol de um ácido dibásico, como ácido sulfúrico, é neutralizado com 2 mol de NaOH. 0 trabalho rápido é vantajoso durante a neutralização, uma vez que as cadeias de polímeros são sempre atacadas e degradadas em meios ácidos; um menor periodo de tempo durante a neutralização reduz muito a degradação do comprimento da cadeia de polímeros.

Com o ajuste nas operações do processo no que diz respeito ao processo de produção de SCS em conformidade com a invenção e a neutralização atempada em sistema ácido, é possível controlar o processo de produção relativamente à degradação do comprimento da cadeia de polímeros. 0 SCS criado em conformidade com a invenção possui apenas muito pouca ou nenhuma viscosidade estrutural numa solução aquosa de 1% a 25°C e é simultaneamente ajustável nas faixas da viscosidade da solução de 10 a 500 mPas, preferencialmente de 15 a 400 mPas, preferível ainda entre 20 e 300 mPas, preferível ainda entre 15 e 100 mPas, preferível ainda entre 20 e 60 mPas, medida numa solução aquosa de 1% a 25° C.

Além disso, o SCS criado em conformidade com o processo da invenção é solúvel em água sem deixar resíduos e tem um valor DS a partir de 0,25 ao contrário do que é produzido pelo processo heterogéneo, que utiliza a reacção H2S04/isopropanol, de modo a não ter de remover qualquer componente insolúvel em água com um tratamento adicional.

De acordo com o método da invenção, é possível utilizar como material de partida celuloses de diferentes origens e com vários valores DS. Podem utilizar-se preferencialmente celulose altamente molecular, especialmente ultra-pura e substancialmente metal pesado 13 sem lintéres de algodão. Neste caso, o grau de polimerização limita as gamas de viscosidade ajustáveis.

Como opção de acordo com a invenção para o processo de produção, a celulose é expandida num solvente polar, como por ex. dimetilacetamida N,N (DMAc), metilpirrolidona N,N (NMP), dimetilssulfóxido (DMSO) ou dimetilformamida N,N (DMF). É preferencialmente utilizado DMF. 0 processo de acordo com a invenção pode ainda ser levado a cabo com a opção de ser utilizado, na esterificação misturada de sulfatos de acetato de celulose solúveis em solventes orgânicos com um total de DS até 3, ácido sulfúrico, ácido amidosulfúrico, trióxido de enxofre, cloretos de sulfuril ou ácido clorossulfónico como agente de sulfatação. É preferencialmente utilizado ácido clorossulfónico como agente de sulfatação. 0 processo de acordo com a invenção pode ser executado com a opção, de na esterificação misturada de acetato de celulose, ser utilizado como agente de acetilação um sulfato solúvel em solventes orgânicos e com um total de DS até 3, combinado com cloreto de acetil ou anidrido acético. É preferencialmente utilizado anidrido acético como agente de acetilação. A produção de SCS De acordo com a invenção devia ocorrer preferencialmente sob as condições a seguir descritas:

Primeiro, a celulose nativa é expandida a uma temperatura que sobe até aos 150°C, preferencialmente de 30 a 100°C, preferível ainda de 40 a 80°C até 24 horas, de preferência até 12 horas, preferível ainda de 3 a 8 horas e num periodo subsequente à temperatura ambiente, de maneira 14 a proporcionar um arrefecimento e uma expansão à temperatura ambiente (RT) até 48 horas. Durante todo o tempo da expansão, a suspensão é preferencialmente agitada. Durante a continua expansão à RT, deixa de ser necessário agitar.

Subseguentemente o agente de sulfatação e o agente de acetilação são adicionados à celulose expandida com permanente agitação e uma temperatura de reacção de 0°C até aos 110°C, como preferencialmente de 20 a 80°C, preferível ainda de 30 a 70°C, preferível ainda de 40 a 65°C, preferível ainda de 50 a 60°C.

Enquanto agita constantemente o sulfato de acetato de celulose obtido, o semi-éster é completamente dissolvido e a viscosidade é lentamente reduzida até obter a desejada e pretendida fluidez da solução polimérica, que pode ser experimentalmente definida. A neutralização directamente subsequente é preferencialmente levada a cabo sob uma constante e cuidadosa agitação à temperatura ambiente (RT), em que a solução de polímero pode continuar quente em comparação com a temperatura de reacção, ou seja, a reacção será por ex. executada a 50°C e, depois de ter arrefecido um pouco, será adicionado ao banho de neutralização/precipitação enquanto ainda está quente. A relação do banho de neutralização/precipitação com a solução de polímero é de 3 a 10, preferencialmente de 3 a 5. Uma condição é que o SCS produzido de acordo com este processo de produção seja basicamente esterilizado, livre de endotoxinas e/ou de metais pesados. Para este efeito, o processo é executado sob condições de esterilização e, particularmente, em 15 condições livre de germes. Particularmente as condições e matérias-primas devem ser seleccionadas de modo a não ser detectado no produto final qualquer levedura, bactéria aeróbia, salmonela, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa etc.. 0 teor de endotoxinas do produto final situa-se entre 0,02 e 0,11 LE/ml e é detectado por um ensaio LAL conforme a Farmacopeia Europeia F. Eur. 4.00 Método C (cinética turbidimétrica) com uma solução aquosa de 1% de SCS.

Deve ainda prestar-se atenção ao facto das matérias-primas serem também utilizadas livres de metais pesados, como por ex. Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn e Cu, de modo que o SCS produzido a partir daqui não exceda os seguintes valores limite:

Teor total de metais pesados sem ferro: ^10 ppm,

Teor em ferro: <20 ppm, em que o teor total em metais pesados sem ferro contém a soma de todos os metais pesados imagináveis.

Neste caso, é preferível utilizar apenas materiais e instrumentos nas reacções, que não emitam qualquer quantidade detectável de um dos metais pesados acima mencionados.

Em conformidade com uma versão, o SCS produzido por este método devia ser regioselectivamente substituído. É preferível ter uma troca homogénea exclusiva de substituintes na posição C6 ou, em alternativa, uma troca até 30% dos grupos de éster de sulfato na posição C2/3. Os reagentes utilizados controlam a sulfatação regioselectiva 16 desejada de acordo com os métodos actuais (Wagenknecht et al., 1996). 0 SCS em conformidade com a invenção é particularmente adequado para ser utilizado no micro-encapsulamento de materiais biológicos. Com base na sua viscosidade ajustável da solução é fácil ajustar as gamas da viscosidade de 10 a 50 mPas, 40 a 70 mPas, 60 a 100 mPas, 80 a 200 mPas, 150 a 300 mPas ou 250 a 500 mPas (com a medição de uma solução aquosa de 1% num viscosimetro Ubbelohde) sem alterar essencialmente a concentração da solução polimérica. Assim sendo, este SCS permite um manuseamento fácil e uma velocidade surpreendentemente elevada do trabalho durante o encapsulamento de material biológico.

Ao contrário disto, de entre os numeroso métodos de produção de sulfatos de celulose solúveis em água foram muito restritivamente descritos aqueles que podem ser utilizados na produção de produtos de microcápsulas, aqueles com uma considerável resistência mecânica e aqueles que cumprem os requisitos biomédicos para uma potencial utilização médica.

Assim sendo, DD 218734 A4 e DE 3306259 C2 apresentaram métodos para a produção de microcápsulas, que descrevem a imobilização dos objectos biologicamente viáveis. O SCS utilizado é então produzido através do método N204/S02/DMF. A utilização do óxido de azoto altamente tóxico é uma grande desvantagem deste método, onde primeiramente um processo redox forma éster misturado de sulfato de nitrito, que é solúvel em dimetilformamida (DMF). Depois do isolamento dos grupos de éster de nitrito de celulose instáveis, os resultantes subprodutos tóxicos, especialmente dimetilnitrosamina cancerígena, têm de ser 17 eliminados do sulfato de celulose antes de poderem ser utilizados com objectos biológicos vivos, principalmente quando utilizados para fins biomédicos. No entanto, as microcápsulas produzidas em conformidade com o processo da invenção são adequadas para fins médicos.

Em DE 4021050 AI e EP 0892852 a produção de SCS é descrita, utilizando um método heterogéneo H2S04/propanol. Tenta-se utilizar este SCS na produção das microcápsulas simplex para uso e para imobilizar objectos biológicos viáveis. Devido à degradação do comprimento da cadeia e da sulfutação irregular durante a produção de SCS, não se consegue evitar o isolamento de partes insolúveis em água e/ou a eliminação de partes moleculares baixas altamente substituídas. As microcápsulas da produção de SCS deste tipo são menos estáveis e não muito homogeneamente formadas. Por isso, não são apropriadas para fins médicos, como por exemplo na forma de injecções.

As publicações DD 298643A5 e DD 299313A5 revelam um método para produzir sulfatos de celulose substituídos regioselectivamente na posição C6, através da utilização de uma trialquilsililcelulose solúvel em solventes inorgânicos e que proporciona produtos com uma larga gama de viscosidades da solução. Refere-se ainda que estes produtos podem ser utilizados no campo da biotecnologia, farmácia e medicina. No entanto, estas potenciais áreas de utilização não são suportadas por quaisquer dados experimentais. É considerada como uma séria desvantagem desta tecnologia o facto de parecer não ser possível estabelecer uma desejada viscosidade da solução, apesar do DS manter-se estável e da viscosidade da solução depender obviamente do DP do 18 material de partida e do nivel de sulfatação (Philipp et al., Das Papier 49(1995)2, 58-64). DE 19837673 Al, DE 19838535 Al e WO 2000010694 Al descreve a utilização de éster aniónico da celulose sulfoalquil como um componente simplex aniónico para a produção de membranas planas. Uma produção de membranas planas simplex é fundamentalmente diferente da produção de cápsulas. Assim sendo, não se podem tirar conclusões da utilização do SCS para a produção de microcápsulas.

Também em Richau, K. et al., J Membr. Sei 1996, 113, 31-41 e em DD 298790 A5 se descreveu que SCS com baixa viscosidade, produzido a partir de acetato 2,5 de celulose disponível no comércio habitual, pode ser utilizado para a produção de membranas planas simplex (Cellulose Chem. Technol. 25(1991) 343-354). A produção de membranas planas simplex é fundamentalmente diferente da produção de cápsulas e não se podem tirar conclusões relativamente à utilização de SCS na produção de microcápsulas, muito menos no que diz respeito à produção de microcápsulas úteis na área biomédica.

Wagenknecht et al. (DE 4435180 Cl; Das Papier 50 (1996) 12, 712-720) descreve a síntese e utilização de SCS para membranas planas simplex, que é produzido a partir do acetato de celulose. O SCS é, assim, produzido pela sulfatação homogénea de acetato 2,5 de celulose maioritariamente de baixa propriedade molecular em dimetilformamida N,N com diferentes agentes de sulfataçãos e subsequente decomposição dos grupos acetilo, sendo o reprocessamento executado sem sal. A viscosidade da solução do SCS produzido deste modo é insatisfatoriamente baixa. Mesmo assim este SCS pode ser útil na produção de membranas 19 planas simplex, que podem ser utilizadas na separação de solventes. As microcápsulas produzidas a partir de SCS obtido deste modo, são menos estáveis e formadas nada homogeneamente. Por isso, não são apropriadas para fins médicos, como por exemplo na forma de injecções. A baixa viscosidade de SCS, tal como é descrita em DE 4435180, é também por exemplo qualificada para a separação de solventes sem destilação através de pervaporação. O SCS descrito em DE 4435180 é produzido pela sulfatação de acetatos de celulose disponível no comércio habitual e mostra cadeias de polímeros mais curtas, assim como, uma menor viscosidade da solução. As microcápsulas produzidas a partir deste tipo de SCS são raramente estáveis e formadas de um modo não homogéneo. Deste modo, não são adequadas para fins médicos (como por exemplo na forma de injecções) nem para uma libertação reproduzível de substâncias farmacêuticas.

Resumindo, conhecem-se inúmeros métodos para a produção de SCS, mas todos eles obtêm um produto final ou com uma viscosidade muito baixa da solução, ou com uma distribuição irregular dos substituintes , ou que consistem completamente ou predominantemente de fibras curtas devido às inúmeras degradações da cadeia ou são poluídos pela utilização de reagentes tóxicos.

Mesmo quando se utiliza SCS ao nível laboratorial para o micro-encapsulamento de materiais biológicos, as cápsulas são instáveis, de tamanho não homogéneo e com uma espessura não homogénea da membrana. Também se detectaram significantes impactos negativos, através da carga tóxica causada pelo processo de produção, sobre a viabilidade das 20 células integradas ou ainda sobre a biocompatibilidade das cápsulas.

Outro objectivo da presente invenção é então produzir a partir da celulose nativa, sulfatos de acetato de celulose claramente solúveis com uma estrutura molecular definida, assim como, produzir SCS completamente solúvel em água e biologicamente compatível a partir disso com características de solubilidade melhoradas, que pode ser utilizado como material auxiliar para fins biológicos e médicos e pode ser especialmente utilizado para a imobilização de objectos biológicos activos em microcápsulas de membranas simplex.

Ao contrário do método de produção anteriormente descrito e dos produtos finais, o SCS produzido em conformidade com a invenção distingue-se por exemplo por uma gama definida da viscosidade ajustável da solução, que pode ser obtida utilizando um material de partida com um elevado grau adequado do valor de polimerização (DP) e controlando uma pequena degradação da cadeia durante a fase homogénea do processo de produção. O SCS produzido pelo método agora descrito através destas características, resolve os problemas previamente descritos durante o micro-encapsulamento de materiais biológicos.

Basicamente, as microcápsulas podem ser divididas em três categorias: esferas sólidas, esferas revestidas e esferas ocas.

As esferas sólidas podem ser produzidas enquanto as substâncias gelatinizadas (por ex. agarose, gelatina) são dissipadas nos agregados fluidos como pingas e são arrefecidas abaixo do seu ponto de fusão para as solidificar. A matriz utilizada para esferas sólidas 21 apresenta uma combinação de por ex. alginato e cloreto de cálcio (CaCl2) ou outros iões de metal polivalente. As esferas ocas podem ser produzidas como as esferas sólidas, gotejando a solução de polimero num lote com iões contra-carregados. Os iões contra-carregados utilizados não devem penetrar nas gotas mergulhadas neles com base nas limitações de difusão. Consequentemente, a reacção de ligação ocorre apenas na superfície superior da gota, por onde se desenvolve uma membrana estável à volta de um núcleo fluido. A dissolução de um núcleo de ligação ou a dissolução do núcleo de uma esfera sólida pode também desenvolver esferas ocas. As esferas revestidas podem ser produzidas a partir de esferas sólidas ou ocas pela deposição de uma ou várias camadas adicionais, de substâncias complexas de construção, que são constituídas por poli-iões opostamente carregados (por ex. PLL (poli-L-lisina), Chitosan). 0 SCS produzido em conformidade com a invenção é qualificado especialmente para a produção de esferas ocas ou revestidas.

Conhece-se uma série de métodos e correspondentes variações técnicas para a produção de microcápsulas. No caso mais simples, um simples gotejamento de um fluído, que flui pela cânula, produz as cápsulas. A força do peso e o produto da tensão interfacial e o diâmetro exterior da cânula determina o tamanho das gotas. Este procedimento é aplicável apenas a cápsulas superiores a lmm, mas tem uma produtividade limitada.

Com o chamado processo Air-Jet, também processo Air-Stripping, uma gota de fluido de ejecção gravimétrica é transportada para o fim de um vaso capilar concêntrico de 22 alimentação através de um fluxo de gás laminar à volta do vaso capilar. Este processo permite reduzir o diâmetro da gota.

Através do processo Air-Knife o jacto de fluido ejectado é interrompido em pequeníssimas gotas por um remoinho turbulento de ar. Ambos os processos, porém, apresentam uma produtividade baixa de aprox 0,1-2 ml/min.

Ao contrário do processo Air-Jet, no qual a formação de gotas é um processo puramente gravimétrico, não sendo assim adequado a soluções com elevada viscosidade, o processo Jet-Cutter possibilita um constante fluxo do fluido com uma certa pressão. O jacto do fluido dissipa-se mecanicamente, utilizando um fio rotativo. As partículas esféricas são criadas a partir dos cilindros de fluido separados com interdepêndencia na tensão da superfície do fluido ao longo de um correspondente percurso de queda. Adverso a este processo é a perda de pedaços e de salpicos relacionada com o sistema.

Uma formação de gotas electroestaticamente suportada acelera a formação de gotas no vaso capilar pela aplicação de um forte campo eléctrico entre o vaso capilar e o banho de integração, em que pequeníssimas gotas pingam do vaso capilar, como é o caso do gotejamento gravimétrico.

Durante o processo da formação de gotas com a ajuda de discos rotativos, é introduzido um fluido aquoso perto do ponto central de um disco de rápida rotação, fluindo depois através da força centrífuga criada na borda do disco, onde a película lubrificante é dividida em pequeníssimas gotas. A formação de gotas é melhorada pela heterodinação de uma oscilação no fluido. 23

Durante o processo de formação de gotas com um cilindro rotativo, o fluido aquoso flui por um cilindro rotativo com aberturas definidas. A força centrífuga facilita a formação de gotas na borda do cilindro, onde o fluido é dividido em pequeníssimas gotas. A formação de gotas a partir de jactos de fluidos permite aumentar o caudal volumétrico e, consequentemente, a produtividade. Aqui pode-se distinguir principalmente entre 3 métodos:

No caso do processo de corrente de água de imersão, é injectada a alta velocidade uma corrente de fluido para outro fluido. Devido à elevada força de cisalhamento, o jacto dissipa-se em pequeníssimas gotas, mas com uma grande variação do tamanho.

No caso do processo de vibrações, a sobreposição de uma oscilação sinusoidal com uma frequência apropriada dissipa um jacto laminar de fluido ejectado de um bocal. 0 principio remonta a Lord Rayleigh (Proc. London Math. Soc. 10(4), 4-13, 1878), que determinou um fluxo de fluidos não tão viscoso que desintegrasse um cilindro do fluido, quando esse comprimento de onda de uma oscilação rotativamente simétrica aumenta, como acontece com a gama do jacto intacta. O comprimento de onda ideal depende do diâmetro, da viscosidade dinâmica, da densidade e da tensão da superfície do fluido.

Além disso, há muitos outros métodos e método acima descrito. Renken e Hunkeler geral deste processo (Renken A. modificações do dão uma vista D., e Hunkeler 24

Microencapsulation: A Review of Polymers and Technologies with a Focus on Bioartificial Organs, Polimery, 43(9), 530-537 (1998)).

Todos estes métodos são adequados, como acima descrito, para a produção de microcápsulas como se declara nesta invenção.

As máquinas de encapsulamento (IE-50R) fabricadas pela empresa Inotech (Dottikon, Suiça) foram utilizadas para a produção de microcápsulas, nomeadamente de gotinhas de SCS com uma distribuição homogénea do tamanho. Este trabalho baseou-se no processo de vibrações acima descrito. Para fins biomédicos, todas as operações do processo mencionadas nesta especificação também podem ser executadas sob condições de esterilização. Pode, por exemplo, encontrar uma descrição de uma máquina de encapsulamento destas e a funcionalidade em EP 1 062 032 BI.

Segundo Lord Rayleigh, durante o processo de encapsulamento, é fornecida uma solução aquosa de SCS a partir de um reservatório de armazenamento através de um bocal com a ajuda de uma pressão constante do ar ou uma bomba peristáltica ou propulsão linear para criar um jacto constante do fluido. Deste modo, pode-se ajustar um caudal volumétrico constante e, consequentemente, podem criar cápsulas com o mesmo tamanho. É possível alcançar uma elevada velocidade de trabalho, dependendo da solubilidade e viscosidade da solução, que é condicionada pelas características químicas do SCS conforme a invenção e livremente ajustada por um bocal de largo espectro. O caudal volumétrico situa-se em l-15ml/min, podendo 25 utilizar-se preferencialmente 6-9ml/min dependendo do vaso capilar ejector.

Em função do objectivo, a solução aquosa de SCS pode ainda conter adicionalmente componentes em diferentes porções. Para este efeito, o mais importante é o material encapsulado. Além disso, pode adicionar-se componentes adicionais em várias proporções (por ex. substratos, anticongelantes (como glicerina, DMSO) proteínas, solventes ou sal, como por ex. 0,9% NaCl) ou o SCS pode ser directamente dissolvido em soluções especiais (por ex. meio de cultura celular).

Um transmissor de vibração cria e transmite uma vibração sinusoidal vertical para o fluido, que vai do bocal num largo espectro de 100 a 4000 Hz. Na produção de microcápsulas, são preferencialmente utilizadas frequências entre 600 e 3000 Hz. Para além da frequência, também a amplitude da vibração pode variar de 0 a 100%. Com esta vibração vertical criada, pode-se obter dissipação do jacto de fluido ejectado para as gotinhas com o mesmo volume. Em princípio, a vibração sinusoidal vertical permite produzir um tamanho definido de cápsulas.

Para impedir a colisão das gotinhas durante a fase do voo, é criada uma deslocação de carga no jacto ejectado do fluido, aplicando uma elevada tensão na ordem dos 0,8 a 1,5 kV, entre o bocal e o eléctrodo positivamente carregado (ânodo). Ao passar uma corrente por um induzido de tensão, as gotinhas negativamente carregadas, que são negativamente polarizadas no bocal, são empurradas na direcção do ânodo e, assim, horizontalmente direccionadas.

As resultantes gotinhas aniónicas desenvolvem à superfície uma membrana simplex em forma de concha, que 26 envolve um núcleo de fluido não complexado; a concha é formada pela complexação do poli-electrólito aniónico contido na gotinha com o poli-electrólito catiónico (por ex. pDADMAC) contido no banho de complexação na interface da fase da gotinha. A espessura da membrana aumenta com o tempo que permanece na solução aquosa do catião polimérico. 0 banho de complexação consiste de uma solução aquosa de um catião polimérico com diferentes pesos moleculares. A estabilidade da membrana simplex formada é, então, determinada pelas caracteristicas químicas (grupos funcionais, número e distribuição de substituintes ) . Por exemplo dodecilamina, etilenodiamina, piperazina, metileno azul, arginina, poli(hidrocloretos de alilamina), trietiltetramina ou espermina são adequados ao processo de encapsulamento. São preferencialmente utilizados polímeros com grupos de amónio quaternários, preferivelmente sais de poli(dialoldimetil-amónio) ou poli(vinilbenziltrimetilo-amónio), preferivelmente poli(dialildimetilo-amónio-cloreto) (pDADMAC) ou poli(vinilbenziltrimetilo-amónio-cloreto) . 0 nível de integração, nomeadamente a estabilidade de microcápsulas criadas correlaciona ainda o comprimento da cadeia do policatião utilizado. 0 peso molecular médio pode situar-se entre 10.000 e 500.000, preferencialmente entre 15.000 e 50.000 no caso de pDADMAC. A concentração adequada de pDADMAC para ao encapsulamento encontra-se na ordem dos 0,5-5% (p/v), preferencialmente na ordem dos 0,8-2% (p/v). solventes A solução de policatiões aquosa pode conter componentes adicionais em várias proporções, dependendo do propósito, por ex. a substância que reduz a tensão à superfície da solução aquosa, solventes orgânicos, 27 anticongelantes (glicerina, DMSO) ou sal, como por ex. 0,9% NaCl ou o policatiões pode ser directamente dissolvido em soluções especiais (por ex. meio de cultura).

No banho de complexação existe um agitador magnético, que cria uma corrente vertical no sentido da direcção das gotas e, assim, transporta as gotinhas formadas fora da região onde caiem as novas gotas, de modo a reduzir o risco de uma agregação de microcápsulas ainda não completamente formadas. Além disso, o agitador mantém as gotinhas suspensas, o que é vantajoso para a convecção da reacção de construção da membrana e também para a subsequente operação de lavagem.

Para a produção de microcápsulas de acordo com a invenção, deve começar-se por obter uma solução aquosa de SCS. A solução de SCS deve ter uma concentração entre 1% e 4% (p/v), preferencialmente entre 1,5% (p/v) e 3% (p/v). Dependendo da força de cisalhamento, podem-se consultar os parâmetros adequados num diagrama da viscosidade. Assim sendo, por ex. uma solução de 1% de SCS deve exibir segundo a invenção uma viscosidade de solução na ordem dos 10 e 500 mPas, preferencialmente de 10 a 200 mPas, melhor ainda entre os 15 e 80 mPas, ou entre 20 e 50 mPas ou entre 40 e 60 mPas.

Em conformidade com uma versão, o SCS produzido de acordo com a invenção forma-se basicamente em partículas esféricas, nomeadamente microcápsulas no sentido da invenção, exibindo um diâmetro de 0,1-50 ym, 1-100 ym, 50 250 ym, 50-500 ym, 100-250 ym, 100-500 ym, 250-500 ym, 250 700 ym, 500-1000 ym, 700-1500 ym, 1000-2500 ym, 1500-3000 ym, 2500-4000 ym, 3000-5000 ym. As microcápsulas exibem 28 preferencialmente um diâmetro de 200-1500 ym, ou melhor 600-800 ym.

Para fins biomédicos a solução de SCS criada a partir de SCS obtido conforme a invenção, pode ser esterilizada por meio dos métodos actuais, como por ex. através da radiação radioactiva. Ficou comprovada a estabilidade do SCS obtido conforme a invenção durante a esterilização em vapor por 30 min a 121°C. O SCS produzido conforme a invenção é particularmente adequado para produzir microcápsulas mais estáveis e mais homogéneas. Estas microcápsulas são adequadas para integrar objectos biológicos, como por ex. bactérias, virus, leveduras, células e tecido para fins biomédicos, mas também para a produção de ingredientes farmacologicamente activos na escala biotecnológica. Podem também ser utilizadas na imobilização de ingredientes farmacologicamente activos, como por ex. catalisadores de pó, calóides, complexos de metal, enzimas, anticorpos, corantes e pigmentos para fins técnicos.

As cápsulas produzidas conforme a invenção são, assim, especialmente adequadas para fins medicinais no campo veterinário e humano porque preenchem os elevados requisitos como abaixo explicamos.

Para utilizar as microcápsulas no sistema da circulação sanguínea ou no tecido animal ou humano, nomeadamente órgãos, por ex. para o tratamento do cancro, é necessário que as microcápsulas sejam correspondentemente uniformes e reproduzíveis numa série de tamanhos, de modo que por um lado se possa evitar o congestionamento/bloqueio da cânula de injecção e/ou vasos sanguíneos. Além disso, è possível garantir uma constante quantidade de agentes 29 encapsulados por cápsula (por ex. ingredientes farmacologicamente activos, enzimas, número de células por cápsula). A geometria esférica das cápsulas assegura um bom fluxo, como por exemplo em cateteres, e uma libertação ideal igual em todas as direcções dos ingredientes farmacologicamente activos. A ligeira compressibilidade das cápsulas é também útil porque reduz as probabilidades da cápsula ficar presa, bloqueando assim o cateter pelas cápsulas comprimidas. Uma menor adesão na superfície superior da cápsula, especialmente em fluidos biológicos, evita a aglomeração da cápsula. 0 SCS produzido de acordo com o método descrito na invenção acima mencionada, com base na viscosidade ajustável da solução permite um manuseamento fácil e uma velocidade de trabalho inesperadamente elevada durante o encapsulamento de materiais biológicos, o que é particularmente vantajoso na produção industrial de compostos farmacêuticos baseados em microcápsulas.

Mais abaixo descrevem-se outras vantagens e aplicações desta invenção com base em exemplos executados tendo em conta as figuras: A figura 1 mostra uma medição microscópica da distribuição de tamanhos das cápsulas SCS com diferentes tamanhos desejados (figura 1 A-D) fabricados em diferentes lotes, utilizando o encapsulador Inotech IE-50R e um Zeiss Axiovert para determinar a distribuição dos tamanhos das cápsulas. Em qualquer um destes casos a solução SCS, assim como, a solução pDADMAC compreendia 1% NaCl (p/v). A amplitude da oscilação dos bocais chegava sempre aos 100%. Os outros parâmetros variáveis foram ajustados como abaixo descrito. 30 TABELA 1

Fig Tamanho da cápsula +/STD(ym) SCS (%) pDADM AC (%) Bocais 0 (ym) Caudal volumétri co (ml/min) Frequên cia(Hz) Tensão (V) A 264+/-10 1,5 0,85 100 1,5 2000 1300 B 521+/-16 1,8 1,00 200 6,1 1100 1100 C 703+/-38 2,8 1,50 250 8,5 700 1100 D 1180+/-32 2,0 2,50 300 12,9 600 1200

Ao escolher parâmetros adequados para a produção de cápsulas, pode obter-se uma vasta gama de tamanhos das microcápsulas produzidas. A largura da banda situa-se entre 10 e 5000 ym, dependendo da viscosidade ajustável da solução do SCS produzido conforme as invenções. As microcápsulas (de todos os tamanhos testados) obtidas exibiram uma geometria esférica quase perfeitamente ideal e um elevado nível de reprodutibilidade. A figura 2, como nas figuras 2a e 2b, mostra o comportamento do crescimento das células HEK 293 em cápsulas de SCS em diferentes períodos. Neste caso, as cápsulas foram cultivadas num meio DMEM com uma glucose de 4,5% (p/v) (Gibco, Glasgow) e 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (Gibco, Glasgow) por um período de 36 dias. Foram tiradas alíquotas em momentos diferentes. A figura 2a mostra qualitativamente, da esquerda em cima para a direita em baixo, o aumento no número de células nas microcápsulas, enquanto foram tiradas amostras nos dias 1, 2, 3, 7, 14 e 21 após encapsulamento. Uma solução aquosa de SCS (2% p/v) utilizada para o encapsulamento continha inicialmente 2 x 106 células/ml e 31 adicionalmente 1% NaCl (p/v). Outros parâmetros para o encapsulamento foram:

Concentração da solução pDADMAC: 1,1% (p/v), Diâmetro desejado da cápsula: 600 ym, Diâmetro dos bocais: 200 ym, Caudal volumétrico: 6,1 ml/min, Amplitude: 100%, Frequência: 900 Hz e Tensão da dispersão: 1100 V. A figura 2b mostra o comportamento do crescimento das células HEK293 encapsuladas nas cápsulas com um diâmetro desejado de 600 a 1200 ym sob aplicação do ensaio MTT (Roche, Mannheim) para células vivas imobilizadas. Para este efeito, as cápsulas foram cultivadas em frascos de cultura celular T75 por um período de 36 dias. Os parâmetros para o encapsulamento em cápsulas de 600 ym (- -) correspondem aos descritos na figura 2a. Foram utilizados os seguintes parâmetro no encapsulamento em cápsulas de 1200 ym (- -) : Os 2% de solução de SCS utilizados para o encapsulamento continha inicialmente 1,5 x 106 células/ml e adicionalmente 1% NaCl (p/v). Outros parâmetros para o encapsulamento foram:

Concentração da solução pDADMAC: 2,5% (p/v), Diâmetro dos bocais: 300 ym, Caudal volumétrico: 12,9 ml/min, Amplitude: 100%, Frequência: 600 Hz e Tensão da dispersão: 1200 V.

As duas curvas não podem ser directamente comparadas, mas ambas mostram um comportamento de crescimento logarítmico ideal das células 293 HEK. Isto mostra que nem o SCS complexado, nem o SCS não complexado dentro da 32 cápsula têm um efeito citotóxico ou uma influência negativa sobre as células encapsuladas. A figura 3 mostra uma vista microscópica das cápsulas SCS, que contêm células 293 HEK após a ultra-congelamento e descongelamento. As cápsulas foram cultivadas por 21 dias em meio DMEM com 4,5g/l de glucose (Gibco, Glasgow) e 10% de soro fetal de vitelo (Gibco, Glasgow) antes do ultra-congelamento. O ultra-congelamento foi executado num meio DMEM com 10% DMSO (v/v). Após um periodo de incubação de 2 horas, as cápsulas foram arrefecidas para os -80°C. O processo de descongelamento foi executado sob uma ligeira agitação a 37°C num lote de água. Para continuar a cultivação, o meio DMSO foi repetidamente substituido por um meio DMEM fresco para remover o excesso de DMSO. Através do ensaio MTT verifica-se que as células imobilizadas sobrevivem aos processos de congelamento e descongelamento, apesar da elevada densidade das células dentro da cápsula e que podem ser ainda mais cultivadas. Após o descongelamento, a estrutura macroscópica da membrana e a geometria da cápsula permanecem intactas. A figura 4 mostra o espectro 13C NMR do lote b2 do exemplo lb2. Como resultado da substituição regioselectiva do grupo de hidroxilos por um grupo de sulfatos na posição C6, o sinal muda de 60 para 67 ppm. Não se detectaram grupos de acetato ou qualquer substituição de grupos de sulfatos nas posições C2 ou C3. O valor DS determinado (DSô = 0,4) tem correspondência com o valor DS calculado a partir da determinação de enxofre. 33

As seguintes versões ou exemplos não devem ser consideradas limitativas da invenção. Ainda no contexto da descrição, dos exemplos ou das versões, tais variações, elementos e combinações foram abertamente acreditados, que (quer sejam combinados ou modificados) possuem as caracteristicas incluídas na descrição geral, nos exemplos, reivindicações ou diagramas, apesar ou mesmo se estas combinações de caracteristicas ou alterações não forem explicitamente apresentadas ou descritas numa versão, mas levam a um sujeito alterado ou novas operações no processo, nomeadamente uma nova sequência das operações do processo.

Exemplos

Exemplo 1: Produção de sulfato de celulose de sódio (SCS)

Exemplo la:

Adiciona-se 10,7 g de celulose de 93, 73% de teor seco (lintéres de algodão com um cuoxam-DP de 1230) a 333ml de dimetilformamida(DMF). A celulose dilate à temperatura ambiente durante aproximadamente 14 horas.

Inicia-se a esterificação misturada, após uma expansão com sucesso, adicionando a mistura de reacção, que é constituída por 8 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de anidridos de ácido acético (47 ml) como agente de acetilação e 0,7 mol/mol AGU de ácido clorossulfónico (2,9 ml) como agente de sulfatação, assim como, 100 ml DMF. A síntese é efectuada à temperatura de 50°C. A celulose 34 começa a dissolver-se e umas 3 horas depois está disponível uma clara solução de polimero transparente. 5 Horas depois a neutralização/precipitação é executada sob constante agitação, vertendo lentamente a solução de polimero (dentro de aprox. 15 min) num meio de neutralização/precipitação, que é constituído até 42,9 g de hidróxido de sódio (NaOH) , 8 0g de H20 e 2 0g de acetato de sódio até 1,51 com etanol preferencialmente à temperatura ambiente. Depois da solução de polimero ter sido completamente vertida no meio de neutralização/precipitação, é agitada por mais 1 hora. A seguir é filtrada e três vezes lavada, cada vez com 600 ml de solução de lavagem, constituída por 4% (p/p) de acetato de sódio em mistura de etanol-água (1:1, p/p).

Procede-se então à desacetilação, adicionando 333 ml de reagente de desacetilação (13g de NaOH, 27g de H20 enchido com 333ml de etanol). A mistura é agitada durante aprox. 1 hora e pode permanecer até aprox. 12 horas. A neutralização da mistura é originada pelo ajuste do valor pH para 8.0 com uma mistura de etanol de ácido acético (1:1, p/p). A seguir é três vezes lavada com 11 etanol. Vai secar a 40°C num vácuo. A proporção e a quantidade dos agentes de acetilaçãos e de sulfataçãos utilizados dependem da desejada substituição regioselectiva nas posições C2, C3 e Οε· Os peritos nesta material conhecem as proporções da mistura. O SCS obtido é claramente solúvel em água e tem um DS = 0,33 e uma viscosidade de 25 mPas numa solução aquosa de 1%.

Os seguintes métodos foram utilizados para a caracterização analítica do sulfato de celulose conforme a invenção: 35 A. Determinação do enxofre por análise elementar:

Após a combustão quantitativa das amostras de SCS, os elementos C, Η, N e S foram determinados em % através de análise elementar (equipamento de Cario Erba), em que o qrau de substituição dos grupos de éster de sulfato é calculado a partir do teor de enxofre (considerando o teor da mistura da preparação) em conformidade com DSsuifato = 162x%S/ (3200-102x%S) B. Análise de resíduos de metal, utilizando espectrometria óptica de emissão: A análise foi efectuada após uma transformação especial em pasta da celulose e derivados de celulose através de ICP-OES (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry; Perkin-Elmer). C. DS total, DS parcial na posição C6, detecção da eliminação completa de grupos de acetilo através de 13C NMR líquido: 0 grau parcial de substituição nas posições individuais da AGU é calculada a partir do espectro liquido de 13C NMR de soluções de sulfato de celulose de sódio em D2O, integrando as áreas de sinalização e comparando as integrais da superfície de SCS substituídos e não substituídos. 0 espectro foi medido, utilizando um espectrómetro Bruker MSL 400 a uma frequência de 100,63 36 MHz, em que se utilizou tetrametilsilano como referência para troca quimica. D. Óbvia solubilidade das soluções de sulfato de celulose aquosa:

Adicionalmente à avaliação óptica de 1% de soluções aquosas do sulfato de celulose de sódio, o valor da turvação num ângulo de 90° é medido num tipo turbidimetro

2100AN (Hach-Lange GmbH, Dusseldorf, Germany) em NTU (Nephelometric Turbidity Units). E. Viscosidade da solução: A viscosidade cinemática de 1% de soluções aquosas do sulfato de celulose de sódio é medida a 25°C num viscosimetro capilar automático Viscoboy 2 + SAE/KM2 (Lauda, Germany). As viscosidades são apresentadas em mPas depois de converter, utilizando a densidade.

Exemplo 1.bl e 1.b2

Adiciona-se lentamente 21,1 g de linteres de algodão (94,86% de teor seco, DP = 1264) a 550 ml de DMF (dimetilformamida) sob constante agitação a 80°C durante 8 horas, é arrefecido até à temperatura ambiente (RT) e agitado por mais 12 horas. Depois de expandir, iniciou-se uma esterificação misturada adicionando a mistura do reagente, que consiste em 8 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de anidrido de ácido acético (93 ml) e 0,9 mol/mol AGU de ácido clorossulfónico (7,4 ml) enchido 37 até um volume total de 200 ml com DMF. Esta mistura de reagente foi depois rapidamente adicionada à solução de celulose a 50°C, enquanto se agitava rapidamente. Como resultado da formação do sulfato de acetato de celulose, obteve-se uma solução de polimero transparente amarelada após aproximadamente 1.5 horas. 4.5 Horas depois o lote foi dividido em duas porções. Metade da solução de polimero foi retirada e adicionada ao meio de neutralização e precipitação, que consiste de 42,9 g de NaOH, 80 g de H2O e 20 g de acetato de sódio até um volume de 1,5 1 com etanol (bl) . A outra metade (b2) foi agitada por mais 3.5 horas a 50°C e depois foi adicionada ao meio de neutralização e precipitação. Uma vez concluída a precipitação, ambos os lotes foram separadamente filtrados e lavados três vezes com 600 ml de solução de lavagem (4% de acetato de sódio (p/p) em mistura de água e etanol (1:1, p/p)). A desacetilação começou com a adição de 333 ml de um reagente de desacetilação (13 g de NaOH, 27 g de H2O até um volume de 333 ml com etanol). Ambos os lotes foram agitados por 1 hora e permaneceram durante umas 12 horas à temperatura ambiente. O pH foi ajustado, utilizando uma mistura de etanol de ácido acético (1:1, p/p). Ambos os preparados de sulfato de celulose foram então lavados três vezes com 11 de etanol (em cada caso) e secos a 40 °C num vácuo. As propriedades do SCS obtido são apresentadas na tabela aa. A figura 4 mostra o espectro 13C NMR do lote b2. Como resultado da substituição regioselectiva do grupo de hidróxilos por um grupo de sulfatos na posição C6, o sinal muda de 60 para 67 ppm. Não se detectaram grupos de acetato ou qualquer substituição de grupos de sulfatos nas posições C2 ou C3. O valor DS determinado (DS6 = 0,4) tem 38 correspondência com o valor DS calculado a partir da determinação de enxofre.

Tabela aa:

Lote bl Lote b2 Tempo de reacção [h] 4,5 8 Massa [g] 12,1 10,7 Teor seco [%] 84,11 85, 31 Teor de enxofre [%] 7, 99 7,24 Grau de substituição (DS) 0,54 0,48 Regioselectividade C6 C6 Viscosidade [mm/s^] 66 14

Exemplo 1.cl e 1.c2:

Como descrito no exemplo lb, foram preparadas duas formulações SCS diferentes, utilizando diferentes químicos iniciais. No lote cl não se considerou o teor de metal dos químicos iniciais. A pesagem ou adição de químicos foi efectuada com espátulas de metal. Foi utilizado um agitador de metal no processo de precipitação. No lote c2 foram utilizados somente químicos com teor de metal extremamente baixo. Além disso, evitou-se durante a síntese qualquer contacto com equipamento que contenha metal, como é o caso dos agitadores, espátulas etc. A análise do teor de metal pesado de ambas as formulações é apresentada na tabela bb. 39

Tabela bb:

Metais pesados Cu Ni Ti Mn Zn Fe Formulação cl (em ppm) 3 2 1 0 37 12 Formulação c2 (em ppm) 1 010 0 2

Exemplo 1.dl

Segue-se o mesmo procedimento do exemplo lb, mas em vez de linteres de algodão é utilizado um pó de celulose de solo Arbocell M80 da Rettenmayer (Alemanha). 21,2 g de cuoxam (DP = 750, teor seco = 94,16%) foram convertidas com 11 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de anidrido de ácido acético e 1 mol/mol AGU de ácido clorossulfónico em 200 ml DMF. Após a desacetilação, o produto obtido foi purificado por diálise e depois liofilizado. O sulfato de celulose de sódio claramente solúvel (SCS) obtido em água possui um DS = 0,49 e 1% de solução aquosa tem uma viscosidade de 15 mPas.

Exemplo 1.d2

Os lintéres de algodão foram utilizados como no exemplo la, com excepção do facto de terem sido utilizados 11 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de anidrido de ácido acético e 1,1 mol/mol AGU de ácido clorossulfónico em 200 ml DMF. O sulfato de celulose de sódio claramente solúvel (SCS) obtido em água possui um DS = 0,57 e 1% de solução aquosa tem uma viscosidade de 120 mPas. 40

Exemplo 1.el e 1.e2

Produziu-se sulfato de celulose de sódio (SCS) como descrito no exemplo la. Adicionalmente executaram-se as operações de sintese após desacetilação, como descrito no exemplo al, mas no exemplo e2 isto foi executado numa caixa laminar para comparar o grau de contaminação. Os resultados são apresentados na tabela dd. O ensaio de esterilidade foi executado com a recomendação da "Farmacopeia Europeia 4" no meio liquido "meio tioglicolato" para microrganismos anaeróbicos e "caldo de tripticase de soja" para microrganismos aeróbicos. Foi ainda utilizado o meio liquido de baixo nutriente "1/4 de caldo de extracto de levedura de peptona de reforço". Depois de preparar o meio nutriente, verteu-se 10 ml de uma só vez para garrafas com cápsula de rosca. Estas são depois autoclavadas a 121°C. Cada garrafa foi inoculada com 1 ml de amostra e depois sujeita a um controlo de temperatura durante 14 dias a 28°C. Cada ensaio foi executado, utilizando uma formulação dupla. Como controlo de esterilização foram utilizadas duas garrafas não inoculadas de cada meio sob as mesmas condições.

As garrafas que ficaram turvas ou com sedimentos, foram consideradas como contaminadas. A amostra e2 preparada sob condições de esterilização não ficou turva nem com sedimento e foi considerada livre de bactérias. 41

Tabela dd:

Meio Caldo de tioglicolato (anaeróbico) Caldo de tripticase de so j a (aeróbica) H caldo de extracto de levedura de peptona de reforço (aeróbica) Amostra 1 1 1 1 1 1 1 1 1 el ++ — ++ ++ + + e2 — - - - - - Legenda: - Sem crescimento após incubação durante 14 dias + Crescimento após incubação durante 14 dias ++ Forte crescimento após 14 dias

Exemplo 1.f

Adicionou-se 10,7 g de lintéres de algodão (TG = 93,9 %, DP = 1351) a 230 ml de DMF e como descrito no exemplo la e foi possível expandir enquanto agitava continuamente durante 8 horas. A temperatura inicial foi ajustada para 80°C. Depois de arrefecer para a temperatura ambiente, a mistura permaneceu sem ser agitada por mais 12 horas. Após a expansão, iniciou-se a esterificação misturada com a adição da mistura de reagente. A mistura de reagentes foi produzida à parte através do arrefecimento e agitação, adicionando sucessivamente 11 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de anidridos de ácido acético (64 ml) e 1 mol/mol AGU de cloreto sulfúrico (5 ml) a 100 ml de DMF. A mistura de reagentes foi depois rapidamente adicionada celulose, enquanto se agitava continuamente. De seguida, a 42 temperatura da reacção vai para os 50°C. 6 Horas depois ocorre a neutralização e precipitação, adicionando lentamente (em mais ou menos 15 min) - continuando a agitar a solução polimérica ao meio de neutralização e precipitação, que consiste em 42,9 g de NaOH, 80 g de H2O e 20 g de acetato de sódio até um volume de 1,5 1 com etanol e, preferencialmente, à temperatura ambiente. Depois de adicionar a solução polimérica ao meio de neutralização e precipitação, toda a mistura foi agitada por mais uma hora. De seguida, a formulação foi filtrada e lavada três vezes com 600 ml, utilizando sempre uma solução de lavagem (4% p/p) de nitrato de sódio numa mistura de etanol e água (1:1, p/p) . A desacetilação começou, em cada caso, com a adição de 333 ml de reagente de desacetilação (13 g de NaOH, 27g de H2O até um volume de 333 ml com etanol) . A formulação foi agitada por 1 hora e permaneceu durante umas 12 horas à temperatura ambiente. O pH foi depois ajustado para 8.0, utilizando uma mistura de etanol de ácido acético (1:1, p/p). De seguida, a formulação foi lavada três vezes com 1 1 de etanol e seco a 40°C em vácuo. O SCS resultante tem um teor de enxofre de 6,49 %, que resulta num grau de substituição DS = 0,51. O valor DS determinado pela utilização de NMR (DStotoai = DSC6) foi 0,55. Uma solução aquosa de 1% tem uma viscosidade de 40 mPas (mm2/s).

Exemplo lg: É seguido mesmo procedimento do exemplo lf, com a excepção de ter sido utilizado 250 ml de pirrolidona-2— metilo-N (NMP) como solvente. Inicia-se a esterificação misturada depois da expansão, adicionando a mistura de 43 reacção, que é constituída por 11 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de anidridos de ácido acético (64 ml) como agente de acetilação e 0,5 mol/mol AGU de ácido clorossulfónico (2,9 ml) como agente de sulfatação e 100 ml de pirrolidona N-metilo-2 (NMP). A síntese foi efectuada à temperatura de 70°C. A precipitação, desacetilação, lavagens e secagem do produto são processos efectuados como descrito no exemplo lf. O SCS claramente solúvel em água daí resultante tem um teor de enxofre de 5,12 % (DS = 0,31). O valor DS determinado pela utilização de NMR (DStotai = DSC6) foi 0,33. Uma solução aquosa de 1% tem uma viscosidade de 12 mPas.

Exemplo lh: É seguido o mesmo procedimento do exemplo lf, com a excepção de utilizar 350 ml de acetamida dimetil-Ν,Ν (DMAc) como solvente. Inicia-se a esterificação misturada depois da expansão, adicionando a mistura de reacção, que é constituída por 11 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de anidridos de ácido acético (64 ml) como agente de acetilação e 0,9 mol/mol AGU de ácido sulfúrico (3ml, 98 % H2S04) como agente de sulfatação, assim como, 150 ml DMAc. A síntese é efectuada à temperatura de 70°C. A precipitação, desacetilação, lavagens e secagem do produto são processos efectuados como descrito no exemplo lf. O SCS claramente solúvel em água daí resultante tem um teor de enxofre de 6,93 % (DS = 0,45). Uma solução aquosa de 1% tem uma viscosidade de 5 mPas. 44

Exemplo li: É seguido o mesmo procedimento do exemplo lf, com a excepção de utilizar 350 ml de acetamida dimetil-Ν,Ν (DMAc) como solvente. Inicia-se a esterificação misturada depois da expansão, adicionando a mistura de reacção, que é constituída por 6 mol/mol unidades de anidroglucose (AGU) de cloretos de acetilo (29 ml) como agente de acetilação e 1,5 mol/mol AGU de ácido sulfúrico (4,9 ml) como agente de sulfatação, assim como, 150 ml DMAc. A síntese é efectuada à temperatura de 70°C. A precipitação, desacetilação, lavagens e secagem do produto são processos efectuados como descrito no exemplo lf. O SCS claramente solúvel em água daí resultante tem um teor de enxofre de 10,73 % (DS = 0,82) . Uma solução aquosa de 1% tem uma viscosidade de 13 mPas e um valor de turvação de 2,5 NTU.

Exemplo 1j: É seguido o mesmo procedimento do exemplo lf, com a excepção de utilizar 350 ml NMP como solvente. Inicia-se a esterificação misturada depois da expansão, adicionando a mistura de reacção, que é constituída por 6 mol/mol AGU de cloretos de acetilo (29 ml) como agente de acetilação e 1,5 mol/mol AGU SCU/complexos DMF (14 g, disponível no comércio habitual a 1:1) como agente de sulfatação, assim como, 150 ml NMP. A síntese é efectuada à temperatura de 60°C. A precipitação, desacetilação, lavagens e secagem do produto são processos efectuados como descrito no exemplo lf. O SCS claramente solúvel em água daí resultante tem um teor de enxofre de 9,83 % (DS = 0,72) . Uma solução aquosa de 1% tem 45 uma viscosidade de 12 mPas e um valor de turvação de 6, 6 NTU.

Exemplo 2: Produção de microcápsulas SCS a partir de SCS conforme a invenção

Em conformidade com os métodos conhecidos (método AirJet; método JetCutter; método de vibração) para preparar as microcápsulas (Orive et al., 2004, Trends Biotechnol. 10 22 (2): 87-92), a solução de sulfato de celulose foi adicionada gota a gota para complexação numa solução de policatiões (por ex. pDADMAC) com a ajuda de um dispositivo de encapsulamento (Inotech, Model IE-50R). A imersão de gotinhas de sulfato de celulose numa solução aquosa agitada de um policatião (pDADMAC) causa a formação de uma membrana semi-permeável na interface de fase através de uma reacção de complexação espontânea, que inclui um núcleo liquido não complexado. Com tempo de reacção progressivo, o reforço da membrana aumenta pela difusão do policatião na membrana da cápsula até a densidade da rede tridimensional formadora criar uma barreira difusora para os polielectrólitos.

Para fabricar as cápsulas, é criada uma solução aquosa homogénea de SCS com uma concentração de sulfatos de celulose de 1,5-3,5 % (p/v) . O SCS utilizado para isto tinha um grau de substituição (DS) entre 0,3 e 0,99. Esta solução SCS foi adicionada gota a gota numa solução pDADMAC de 0,8-2% (p/v) com uma velocidade do fluxo laminar de 1-15 ml/min através de um bocal de 100-300 pm. É possivel obter uma elevada velocidade de trabalho devido à baixa viscosidade estrutural com uma elevada tensão de 46 superfície, ao mesmo tempo da solução de SCS conforme a invenção. A formação e tamanho das gotas é determinado para uma pelo caudal volumétrico, pelas características físicas do fluido, pela selecção do diâmetro do bocal e, no caso do método de vibração, também pela frequência da excitação e da amplitude da frequência, que permite controlar a decomposição do jacto do líquido em gotas. Esta frequência foi definida para 600-1100 Hz para criar microcápsulas esféricas com um diâmetro aprox. de 650-700 ym. Ao aumentar a frequência, reduz o tamanho das cápsulas e vice-versa. De preferência, selecciona-se uma frequência de 650 Hz para criar cápsulas com um tamanho médio de 700 ym diâmetro com um bocal de 250 ym. Deve seleccionar uma frequência de 1100 Hz para criar cápsulas com um tamanho médio de 500 ym e uma frequência de 500 Hz para criar cápsulas com um tamanho médio de 800 ym. Pode fazer uma sintonização precisa se modular os outros parâmetros.

Além disso, o tamanho das cápsulas é também influenciado pela reacção do sulfato de celulose com o pDADMAC. Um maior tempo de reacção, elevadas concentrações e um baixo peso molecular de pDADMAC reduz o tamanho das cápsulas. Pode dizer-se que as microcápsulas simplex preparadas com SCS de acordo com a invenção, apresentam uma geometria esférica reproduzível e quase ideal e, ao mesmo tempo, uma dispersão de menor tamanho (figura 1)

Exemplo 3: Produção de cápsulas SCS com objectos biológicos O processo de produção de microcápsulas SCS inclui como operações importantes (a) a preparação da solução SCS, 47 (b) a preparação da suspensão celular SCS, (c) a conversão das cápsulas em gotas, (d) a formação complexa no banho de complexação e (e) a conclusão da reacção complexa de formação. 0 SCS de acordo com a invenção é primeiramente dissolvido em solução de sal fisiologicamente antiácida (0,8-1,0% (p/v)) numa concentração de 1,5 - 3,5 % (p/v) sob agitação à temperatura ambiente e o valor pH é ajustado para 7.2 com 0,1N NaOH ou 0,1N HC1. A solução SCS preparada é autoclavada a 121°C antes de ser misturada com as células.

Preparação de suspensões de células SCS:

Para encapsular as cápsulas SCS são utilizadas células HEK293 (ATCC CRL-2828), células Jurkat (ATCC TIB-152) ou as células HIT (ATCC CRL-1777). No entanto, em princípio pode utilizar-se um número de aderentes, assim como, células de suspensão. As culturas de células são multiplicadas exponencialmente em métodos adequados de culturas de células convencionais, como por ex. em frascos de T75 ou frascos rotativos e são obtidas após a formação de uma camada mono a uma confluência de 90%. As linhas das células utilizadas são incubadas em meio de DMEM com 4,5 g/1 de glucose (Gibco, Glasgow, GB) com 10% de soro fetal de vitelo (Gibco, Glasgow, GB). As células libertas são transferidas para um tubo Falcon de 50 ml, centrifugadas por 5 minutos a 200g e o fluido sobrenadante é deitado fora. O pellet de células é então cuidadosamente lavado com o tampão PBS e, por fim, integrado na solução SCS, homogeneamente suspenso em solução SCS, transferido para 48 uma seringa esterilizada e depois ligado sob condições esterilizadas à unidade de encapsulamento equipada com todas as ligações de tubo flexível e vasos autoclavados. 0 processo de encapsulamento começa logo a seguir.

Conversão em gotas e produção de cápsulas:

Para o encapsulamento começa-se por aumentar a velocidade até sair uma corrente líquida uniforme dos vasos capilares; de seguida, o caudal volumétrico pode ser reduzido à velocidade ideal para uma conversão em gotas. A suspensão residual de células SCS, convertidas em gotas até agora, é interceptada por um tanque de recolha articulado antes de cair num banho de têmpera, que é rodado para o lado depois da formação de um jacto uniforme do líquido (fase estável), de modo a poder concretizar-se a formação da cápsula. As microcápsulas criadas podem ser continuamente bombeadas para fora da área da reacção e deviam ser lavadas ou diluídas com solução de sal fisiologicamente antiácida, PBS (salino antiácido de fosfato) ou meio de cultura para remover o pDADMAC não complexado. Todas as operações podem ser efectuadas sob condições de esterilização.

De seguida, num local de trabalho esterilizado, o fluido sobrenadante sai do vaso colectivo através de uma pipeta depois das cápsulas terem sedimentado, e é substituído pelo meio de cultura. Logo a seguir, as células encapsuladas são cultivadas em frascos T ou em frascos rotativos a 37 °C, 5% de CCç, humidade saturada e 2 rpm. Após 4 a 8 horas, o meio é mais uma vez mudado para remover o pDADMAC residual. Enquanto prepara as cápsulas, deve 49 prestar atenção à esterilização de todos os componentes e soluções.

Determinação da vitalidade através da coloração azul tripan: A determinação da vitalidade através da coloração azul tripan serve para determinar a contagem total das células (células mortas e vivas). Azul tripan (0,8mM em PBS (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha) é um agente negativamente carregado, que pode difundir selectivamente nas células com uma membrana de células não intacta e pode conferir uma coloração azul ao seu citoplasma. Como resultado, as células mortas aparecem a azul violeta sob a luz do microscópio, enquanto as células vivas têm uma cor entre branco amarelo. A contagem das células vivas e mortas pode então ser determinada com a ajuda de uma câmara microscópica contadora Neubauer.

Determinação da vitalidade com a ajuda do ensaio MTT A determinação da vitalidade com a ajuda do ensaio MTT (MTT-Proliferation Kit, Roche, Mannheim, Alemanha) inclui apenas a contagem de células vivas ao contrário da coloração azul tripan acima mencionada.

Este método de medição é um ensaio calorimétrico, em que o sal amarelo de tetrazólio 3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difenil-tetrazólio-brometo (MTT) é absorvido passivamente nas células vias e é reduzido a cristais púrpuras formazan, insolúveis em água, pela acção de desidrogenases. A quantidade de formazan formado é 50 proporcional à contagem de células vivias num periodo de incubação constante e suficientemente longo. A determinação é fotométrica a λ=570 nm depois de um periodo de incubação de 4 horas a 37°C.

Ensaio da vitalidade MTT para células encapsuladas O ensaio MTT foi originalmente desenvolvido para determinar a contagem das células vivas das suspensões de células. Também se pode fazer um ensaio MTT qualitativo nas cápsulas intactas. Mas, para a determinação quantitativa, as células têm de estar dissolvidas para fora das cápsulas, através da incubação das cápsulas por 1 hora em 20% de solução SDS (Sigma-Aldrich, Alemanha) em banho ultra-sónico. A cápsula e fragmentos da célula ainda disponíveis são centrifugados. O ensaio MTT foi executado conforme as instruções do fornecedor (MTT-Proliferation Kit, Roche, Mannheim, Alemanha) . A concentração de MTT é medida por espectrofotometria.

Exemplo 4:

Determinação da reprodutibilidade da qualidade da cápsula, utilizando diferentes lotes de produção de SCS

Para produzir cápsulas de 600 ym, é preparada uma solução de 2% SCS (p/v) com 1% NaCl (p/v) e uma solução de 1,0% de pDADMAC (p/v) com 1% NaCl (p/v) . A solução de pDADMAC é temperada para 30 °C. Adiciona-se 20 ml de SCS gota a gota em 300 ml de uma solução agitada de 1,0% de pDADMAC. O tempo de reacção é 3 min. 51 0 diâmetro do bocal é 200 ym. O caudal volumétrico é 6,1 ml/min. A amplitude da vibração do bocal está definida para 100%, a frequência está definida para 900 Hz. A tensão de dispersão é 1100 V.

Para produzir cápsulas de 600 ym com células imobilizadas, o método descrito no exemplo 3 é adaptado. Adicionalmente, as células de crescimento confluente para 90% são tripsinizadas num frasco de T75, absorvidas em meio de NM (meio de DMEM com 4.5 g/1 de glucose + 10% FCS (Gibco, Glasgow, GB)) e pelletizadas a 200g por 5 min. O pellet é novamente suspenso em PBS e determina-se a concentração da célula. Uma alíquota da suspensão de células é pelletizada para obter uma concentração de células de 2x106 células/ml SCS. O pellet lavado é novamente suspenso na solução SCS e é enchido numa injecção. Logo a seguir ocorre a conversão da suspensão de células em gotas.

Determinação do tamanho da cápsula:

Os tamanhos das cápsulas são determinados microscopicamente numa câmara de contagem Neubauer (microscópio de luz M 200 e software "Zeiss Imaging Vers. 4" (Cari Zeiss Jena, Jena, Alemanha) 4x ampliado.

Medição da estabilidade de microcápsulas:

Para determinar as propriedades mecânicas das microcápsulas SCS utilizou-se um dispositivo de medição da deslocação da força (LUMiTexture, Lerche GmbH, Berlim, Alemanha). 52

Um selo aplica carga ao objecto de ensaio com uma velocidade programável, enquanto uma escala electrónica mede a força resultante. A partir da curva de deslocação da força podem determinar-se os parâmetros da pressão de ruptura e a tensão máxima que aparece na membrana simplex. As medições da estabilidade são utilizadas para cápsulas sem células imobilizadas, como também, para estudar a estabilidade a longo prazo de cápsulas com células imobilizadas.

Tabela 2

Lote de produção 1 2 3 4 Média da tensão máxima [N/m] 1,36 1,43 1,35 1,38 Lote de produção 1 2 3 4 Desvio padrão [N/m] 0,27 0,29 0,22 0,20 Número de amostras 20 20 20 20 A medição de cápsulas com os mesmos parâmetros de encapsulamento, mas preparadas com 4 lotes diferentes de produção mostra que as estabilidades das cápsulas obtidas são absolutamente comparáveis. As estabilidades medias variam em aprox. 6%. A dispersão entre os lotes individuais é menor do que o desvio padrão das respectivas faixas de medição. Este resultado ilustra que a reacção de formação complexa, através da qual é executada a formação da membrana simplex, pode ser muito bem controlada devido à síntese SCS reproduzível e à gestão do processo seleccionado. A estabilidade constantemente elevada da cápsula permite estimar a utilidade das cápsulas produzidas 53 para fins especiais com elevadas cargas mecânicas, minimizando assim o risco de danos mecânicos das cápsulas. As cápsulas são convenientemente estáveis para a cultivação em vasos de cultura de repouso e de agitação, assim como, para injecções intravenosas e para implantação no tecido humano e animal.

Exemplo 5

Efeito das células encapsuladas na estabilidade da cápsula: A cápsula foi preparada como descrito no exemplo 3. A estabilidade foi medida de acordo com o processo mencionado no exemplo 4. As cápsulas foram inicialmente carregadas com 300 células/cápsulas. 14 Dias depois procedeu-se à medição.

Tabela 3

Amostra Sem células Com células Média da tensão máxima [N/m] 1,43 1,45 Desvio padrão [N/m] 0,29 0,26 Número de amostras 20 20

Se as células suspensas ficam à superfície da gotinha, pode acontecer elas ficarem permanentemente fixas na membrana durante a reacção de complexação entre SCS e pDADMAC. As estabilidades das cápsulas medidas ilustram que as células suspensas em SCS não influenciam negativamente a da membrana da cápsula. Este é um pré-requisito básico para 54 a imobilização de sólidos não solúveis, como tecidos, células humanas e animais, microrganismos, micro-particulas, nano-particulss, enzimas imobilizadas, catalisadores e substâncias cristalinas não solúveis em água.

Exemplo 6

Estabilidade a longo prazo das cápsulas SCS com células imobilizadas:

As cápsulas são preparadas e cultivadas de acordo com o método descrito no exemplo 3. As medições da estabilidade são efectuadas como descrito no exemplo 4. Inicialmente são encapsuladas 300 células/cápsulas e são cultivadas por 60 dias em meio de DMEM com 4,5 g/1 de glucose + 10% de soro fetal de vitelo (Gibco, Glasgow, GB) a 37°C e 5% de CO2 em garrafas rotativas a 2 rpm.

Tabela 4

Amostra Pouco depois da preparação Após 60 dias de cultura Média da tensão máxima [N/m] 1,35 1,11 Desvio padrão [N/m] 0,22 0,20 Número de amostras 20 20

As medições da tensão máxima dentro da membrana da cápsula, que ocorre mesmo antes da destruição das cápsulas, 55 mostra que a estabilidade da cápsula desde em 18% ao longo de uma cultivação com duração de 60 dias, mas continua a ser suficientemente elevada para preservar a integridade das cápsulas. A membrana simplex formada é resistente à tensão osmótica, química e física, que ocorre durante a cultivação das células imobilizadas no meio de cultara das células. Isto permite a utilização em concentrações elevadas de sal, mudando os valores de pH e sob permanente tensão mecânica.

Exemplo 7 A produção e reprodutibilidade de microcápsulas SCS com um diâmetro especifico

Para preparar cápsulas com um diâmetro de referência de 250 ym, é preparada uma solução de 1,5% SCS (ρ/v) com 1% de NaCl (p/v) e uma solução de 0, 85% de pDADMAC (p/v) preparada com 1% de NaCl (p/v). A solução de pDADMAC é temperada para 30 °C. Adiciona-se 10 ml de SCS gota a gota em 300 ml de uma solução agitada de 0,85% de pDADMAC. A proporção da concentração pDADMAC para com SCS é 17 (g/g). O tempo de reacção é 2 min. O mecanismo de transmissão da injecção é equipado com 10 ml de injecções plásticas. O diâmetro do bocal é 100 ym. O caudal volumétrico é 1,5 ml/min. A amplitude da vibração do bocal é 100%, a frequência está definida para 2000 Hz. A tensão de dispersão é 1300 V. Os resultados são apresentados na figura IA.

Para preparar cápsulas com um diâmetro de referência de 520 ym, é preparada uma solução de 1,8% SCS (p/v) com 1% 56 de NaCl (p/v) e uma solução de 1,0% de pDADMAC (p/v) preparada com 1% de NaCl (p/v) . A solução de pDADMAC é temperada para 30 °C. Adiciona-se 20 ml de SCS gota a gota

em 300 ml de uma solução agitada de 1,0% de pDADMAC. A proporção da concentração de pDADMAC para com SCS é 11,1 (g/g). O tempo de reacção é 3 min. O mecanismo de transmissão da injecção é equipado com injecções plásticas. O diâmetro do bocal é 200 ym. O caudal volumétrico é 6,1 ml/min. A amplitude da vibração do bocal é 100%, a frequência está definida para 1100 Hz. A tensão de dispersão é 1100 V. Os resultados são apresentados na figura 1B.

Para preparar cápsulas com um diâmetro de referência de 700 ym, é preparada uma solução de 2,8% SCS (p/v) com 1% de NaCl (p/v) e uma solução de 1,5% de pDADMAC (p/v) preparada com 1% de NaCl (p/v) . A solução de pDADMAC é temperada para 30 °C. Adiciona-se 15 ml de SCS gota a gota

em 8,5 ml de uma solução agitada de 1,5% de pDADMAC. A proporção da concentração de pDADMAC para com SCS é 10,7 (g/g). O tempo de reacção é 3 min. O mecanismo de transmissão da injecção é equipado com injecções plásticas. O diâmetro do bocal é 250 ym. O caudal volumétrico é 8,5 ml/min. A amplitude da vibração do bocal é 100%, a frequência está definida para 700 Hz. A tensão de dispersão é 1100 V. Os resultados são apresentados na figura 1C.

Para preparar cápsulas com um diâmetro de referência de 1200 ym, é preparada uma solução de 2% SCS (p/v) com 1% de NaCl (p/v) e uma solução de 2,5% de pDADMAC (p/v) preparada com 1% de NaCl (p/v) . A solução de pDADMAC é temperada para 30° C. Adiciona-se 30 ml de SCS gota a gota 57 em 300 ml de uma solução agitada de 2,5% de pDADMAC. A proporção da concentração de pDADMAC para com SCS é 10,7 (g/g). O tempo de reacção é 5 min. O mecanismo de transmissão da injecção é equipado com injecções plásticas. O diâmetro do bocal é 300 ym. O caudal volumétrico é 12,9 ml/min. A amplitude da vibração do bocal é 100%, a frequência está definida para 600 Hz. A tensão de dispersão é 1200 V. Os resultados são apresentados na figura 1D.

Os tamanhos das cápsulas são determinados microscopicamente numa câmara de contagem Neubauer (microscópio de luz M 200 e software "Zeiss Imaging Vers. 4" (Cari Zeiss Jena, Jena, Alemanha) 4x ampliado.

Determinação da reprodutibilidade do tamanho da cápsula, utilizando diferentes lotes de produção de SCS

Para comparar a reprodutibilidade de diferentes lotes de produção de SCS, são preparadas cápsulas com um diâmetro de referência de 710 ym, utilizando uma solução de 1,7% de SCS (p/v) com 1% de NaCl (p/v) e uma solução de 1,5% d pDADMAC (p/v) com 1% de NaCl (p/v). A solução de pDADMAC é temperada para 30 °C. Adiciona-se 15 ml de SCS gota a gota com 8,1 ml a uma solução agitada de 300ml de 1,5% de pDADMAC. A proporção da concentração de pDADMAC para com SCS é 10,7 (g/g). O tempo de reacção é 3 min. O mecanismo de transmissão da injecção é equipado com seringas plásticas. O diâmetro do bocal é 250 ym. O caudal volumétrico é 8,1 ml/min. A amplitude da vibração do bocal é 100%, a frequência está definida para 750 Hz. A tensão de 58 58 dispersão é 1350 tabela 5. Os tamanhos microscopicamente (microscópio de luz 4" (Cari Zeiss Jena, V. Os resultados das cápsulas numa câmara de M 200 e software Jena, Alemanha) 4

Tabela 5 são apresentados na são determinados contagem Neubauer "Zeiss Imaging Vers. c ampliado.

Lote de produção 1 2 3 4 5 Diâmetro médio [pm] 667 725 714 720 717 Lote de produção 1 2 3 4 5 Desvio padrão [pm] 16 29 26 25 18 Desvio padrão [%] 2,3 4,0 3, 6 3,5 2,5 Diâmetro médio de todos os lotes [pm] 709 Desvio padrão médio de todos os lotes 24pm (3,3%)

Outras especificações de produção correspondem ao método descrito no exemplo 2.

Os exemplos apresentados na figura 1 ilustram que as microcápsulas SCS mono-dispersas podem ser produzidas com diferentes diâmetros, o que abre um largo espectro de possibilidades de utilização das cápsulas. O desvio padrão do diâmetro do diâmetro da cápsula é baixo com 4% na média. A variação de lote para lote é baixa a 3,3% para cápsulas com diâmetro de 710 pm, o que permite obter uma elevada reprodutibilidade ao utilizar SCS produzido com o processo da invenção em suspenso. Isto deve-se ao facto do jacto 59 liquido que sai do bocal possuir uma velocidade de fluxo constante, o que é possível apenas com soluções de polímero muito homogéneas. Isto é extremamente relevante na preparação das cápsulas com um menor diâmetro porque as pequenas mudanças na velocidade do fluxo causam grandes variações no tamanho da cápsula. Mesmo com um diâmetro médio baixo de 265 ym, obtém-se um desvio padrão de 4% com o SCS da invenção em suspenso (figura la) , apesar das mudanças mínimas do volume causadas por soluções não homogéneas de SCS poderem ter um efeito negativo dramático na distribuição do tamanho. Com cápsulas de 520 ym, pode obter-se um desvio padrão de 2% (figura lb) . A mono-dispersão das cápsulas produzidas permite uma dosagem muito precisa do material imobilizado porque se pode calcular com exactidão a superfície das cápsulas. As células imobilizadas crescem uniformemente em partículas mono-dispersas. No caso de vasos de cultivação agitados, as cápsulas mono-dispersas garantem uma dispersão uniforme e, consequentemente, uma excelente condição de crescimento para todas as células cultivadas. A aplicação de microcápsulas utilizando uma cânula só é possível para cápsulas com baixa dispersão do tamanho porque minimizam o risco de bloqueio. Os diâmetros mais elevados de bocais permitem a imobilização de pequenos tecidos isolados com um mínimo risco de bloqueio. As cápsulas mono-dispersas podem também ser preparadas com estes (figura 1C) . O tamanho mínimo das cápsulas possível de ser produzido está limitado apenas pelo método escolhido para criar gotas e não pela solução de SCS utilizada. 60

Exemplo 8

Investigações sobre a Influência das cápsulas de SCS sobre o comportamento de crescimento das células 0 comportamento de crescimento das células 293 HEK foi acompanhado numa experiência durante um certo período de tempo. Para a produção de cápsulas SCS, foram tripsinizadas células divididas de um frasco de T75 a 90% de confluência, recolhidas no meio de DMEM e centrifugadas com 200g por 5 min. A massa foi resuspendida em PBS e determinou-se a concentração da célula. Uma alíquota da suspensão de células foi novamente pelletizada para ajustar uma concentração de células de 2x106 células/ml SCS. O pellet lavado foi resuspendido na solução de SCS e enchido para dentro de uma seringa. Logo a seguir ocorreu a conversão da suspensão de células em gotas.

Para produzir cápsulas de 600 pm, foi preparada uma solução de 2% SCS (p/v) com 1% NaCl (p/v) e uma solução de 1,1% de pDADMAC (p/v) com 1% NaCl (p/v) . A solução de pDADMAC foi mantida a uma temperatura moderada de 30° C. Verteu-se 20 ml de solução de SCS em 300 ml de solução agitada de 1,1% de pDADMAC. O tempo de reacção foi de 3 min. O diâmetro do bocal era 200 pm. A velocidade do fluxo foi ajustada para 6,1 ml/min. A amplitude da oscilação do bocal chegava aos 100% e a frequência foi ajustada para 900 Hz. A tensão de dispersão era 1100 V.

Para produzir cápsulas de 1200 pm, é preparada uma solução de 2% SCS (p/v) com 1% NaCl (p/v) e uma solução de 61 2,5% de pDADMAC (p/v) com 1% NaCl (p/v) . A solução de pDADMAC foi aquecido para os 30° C.

Verteu-se 30 ml de solução de SCS em 300 ml de uma solução agitada de 2,5% de pDADMAC. A reacção demorou 5 min. O diâmetro do bocal tinha 300 ym. A velocidade do fluxo era 12,9 ml/min. A amplitude da oscilação do bocal era de 100% e a frequência foi ajustada para 600 Hz. A tensão de dispersão era 1200 V. A figura 2a mostra em cima da esquerda para a direita a qualidade do aumento da contagem das células nas microcápsulas, tendo sido feitas amostras do ensaio nos dias 1, 2, 3, 7, 14 e 21 após o encapsulamento. A figura 2a nas fotografias microscópicas mostra claramente um crescimento positivo das células imobilizadas 293 HEK 293 em cápsulas SCS. As células foram imobilizadas como células individuais e não aglomeradas, fixadas no inicio à superfície interior da membrana da cápsula e finalmente enchem a cápsula. As células ficam depois em densas aglomerações de células tipo tecido dentro do lúmen da cápsula. A figura 2b ilustra a curva de crescimento de células imobilizadas 293 HEK em cápsulas com 600 ym, e/ou 1200 ym. Os gráficos clarificam o aumento em células 293 HEK envolvidas durante um período de 36 dias. As cápsulas foram cultivadas para isto em frascos T175 com 30 ml de meio de NM. Foi determinada a contagem de células vivas por ml de solução de SCS com o ensaio MTT (MTT-Proliferation Kit, Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A figura 2b mostra ainda uma fase de crescimento logarítmico, que ao longo de uma fase de transição 62 expandida apresenta uma velocidade de crescimento reduzida baseada primeiramente no encapsulamento, que é transformada numa fase final estacionária. Mesmo utilizando uma cultivação estática, obtiveram-se densidades de célula muito elevadas de 5, 61 x 107 células por ml de SCS com cápsulas com um diâmetro de 600 ym e 3,1 x 107 células por ml de SCS com cápsulas com um diâmetro de 1200 ym. A mais elevada densidade da célula em cápsulas mais pequenas é proporcional à maior superfície de troca específica, que limita a transferência de material vago de gases e nutrientes (tabela 6).

Tabela 6

Resfera A esfera/ V esfera Densidade da célula [mm] [mm2/ mm3 ] [células / ml SCS] 0,3 10,0 5,60E+07 0, 6 5, 0 3,10E+07

Os tempos de duplicação medidos (tD) na fase prematura de crescimento logarítmico são, como tD 600ym=73 horas e tD 1200ym=86 horas, comparativamente elevados, uma vez que nesta altura a difusão ainda não é factor limitador para o crescimento das células.

Exemplo 9

Estabilidade das cápsulas SCS após congelamento e descongelamento 63

Para efeitos de ensaios, as células divididas de um frasco de T75 a 90% de confluência foram resuspendidas em meio de DMEM e centrifugadas com 200g por 5 min. O pellet foi resuspendido em PBS e determinou-se a concentração da célula. Uma aliquota da suspensão de células foi pelletizada para ajustar uma concentração de células de 2x106 células/ml SCS. O pellet lavado foi resuspendido na solução de SCS e enchido para dentro de uma seringa. O processo de encapsulamento iniciou-se logo a seguir. Para produzir cápsulas de 600 ym, foi preparada uma solução de 2% SCS (p/v) com 1% NaCl (p/v) e uma solução de 1,1% de pDADMAC (p/v) com 1% NaCl (p/v). A solução de pDADMAC foi mantida a uma temperatura de 30° C. Verteu-se 20 ml de solução de SCS em 300 ml de uma solução agitada de 1,1% de pDADMAC. A reacção demorou 3 min. O diâmetro do bocal era 200 ym. A velocidade do fluxo foi ajustada para 6,1 ml/min. A amplitude da oscilação do bocal chegava aos 100% e a frequência foi ajustada para 900 Hz. A tensão de dispersão era 1100 V.

As cápsulas foram cultivadas por 21 dias antes de congelar em frascos T175 com 30ml de meio de DMEM com 4,5 g/1 de glucose + 10% FCS. O congelamento ocorreu no meio de DMEM com 4,5 g/1 de glucose + 10% FCS, ao qual se adicionou 10% de DMSO (v/v) . Após um periodo de incubação de 2 horas, as cápsulas foram arrefecidas para -80° C com uma velocidade constante de arrefecimento. As cápsulas foram guardadas a -80° C para uso futuro. A imagem microscópica (figura 3) mostra cápsulas com células imobilizadas, que foram descongeladas e, mais tarde 64 cultivas em meio de DMEM por 24 horas, após mancheamento activo com o ensaio MTT (MTT-Proliferation Kit, Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Após descongelamento, a estrutura macroscópica da membrana das cápsulas permanece completamente intacta. As cápsulas mantiveram as células imobilizadas estáveis mesmo depois deste procedimento. Como também se pode ver se utilizar o ensaio MTT, as células imobilizadas sobrevivem ao processo de congelamento e descongelamento e podem ser facilmente cultivadas de novo, apesar da densidade extremamente elevada da célula no interior da cápsula. A membrana da cápsula parece ser globalmente opaca. Isto permite fornecer cápsulas com elevada concentração de células humanas, utilizando métodos de produção industriais. Também se pode disponibilizar o armazenamento como aliquotas e uma crio-preservação a custos razoáveis. 65

DOCUMENTOS APRESENTADOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista dos documentos apresentados pelo requerente foi exclusivamente recolhida para informação do leitor e não faz parte do documento europeu da patente. Apesar de ter sido elaborada com o máximo cuidado, o IEP não assume, porém, qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos da patente apresentados na descrição

us 2539451 A us 2969355 A DD 295858 A5 DE 4019116 AI DE 4021049 DE 4435180 DE 4435082 US 2683143 A US 2969356 A US 3086007 A US 3075963 A US 4005251 A

DD 218734 A4 DE 3306259 C2 DE 4021050 AI EP 0892852 A DD 298643 A5 DD 299313 A5 DE 19837673 AI DE 19838535 AI WO 2000010 694 DD 298790 A5 DE 4435180 Cl EP 1062032 BI

Documentação não relativa à patente citada na descrição • LUKANOFF, B. ; DAUTZENBERG, H. Das Papier, 1994, vol. 6, 287-298 66 • BOHLMANN et al. Chemie Ingenieur Technik, 2002, vol. 74, 359-363 • Das Papier, 1996, 712-720 • CHAUVELON, G. et al. Carbohydrate Research, 2003, vol. 338, 743-750 • WAGENKNECHT, W. et al. Cellulosics: materiais for selective separations and other technologies, 1993, 205-211 • WAGENKNECHT, W. Das Papier, 1996, vol. 12, 712-720 • PHILIPP et al. Das Papier, 1995, vol. 2, 58-64 • RICHAU, K. et al. J Membr. Sei, 1996, vol. 113, 31-41 • Cellulose Chem. Technol., 1991, vol. 25, 343-354 • Das Papier, 1996, vol. 12, 712-720 • LORD RAYLEIGH. Proc. London Math. Soc., vol. 10 (4), 4-13 • RENKEN A. ; HUNKELER D. Microencapsulation: A Review of Polymers and Technologies with a Focus on Bioartificial Organs, Polimery, 1998, vol. 43 (9), 530-537 • ORIVE et al. Trends Biotechnol., 2004, vol. 22 (2), 87-92

Lisboa, 02/04/2009

Claims (23)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de sulfato de celulose(CS) substituido regioselectivamente, caracterizado pela combinação dos seguintes passos: a) expansão de celulose nativa num solvente polar aprótico; b) adição de reagente de sulfatação e um reagente de acetilação, para a esterificação e distribuição simultânea de grupos de acetato e grupos de sulfato ao longo e entre as cadeias de polímero; c) logo seguido de uma completa neutralização com uma base, preferencialmente hidróxido de sódio, em que o sulfato, sem clivar o grupo de acetilo, é transferido para um sal de sódio do sulfato de acetato de celulose, sendo que a neutralização imediatamente a seguir também evita a clivagem dos grupos de acetato e, consequentemente, a degradação das cadeias de celulose; e d) subsequente precipitação, desacetilação, lavagem e secagem do SCS, em que este é caracterizado por uma viscosidade da solução superior a 10 mPas numa concentração de 1% em água.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da operação de neutralização ser concretizada ao mesmo tempo que a precipitação.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto da gama de viscosidades da solução 2 do SCS produzido ser ajustável entre 10 e 500 mPas, particularmente entre 15 e 400 mPas, mais particularmente entre 20 e 300 mPas, e ainda mais particularmente entre 15 e 100 mPas, em especial entre 20 e 50 mPas, com base numa solução de 1% em água.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 3 caracterizado pelo facto da celulose nativa ser expandida num solvente polar seleccionado de entre o grupo de N,N-dimetilacetamida (DMAc), N-metilpirrolidona (NMP), dimetilssulfóxido (DMSO) e N,N-dimetilformamida (DMF).

5. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores de 1 a 4 caracterizado pelo facto da celulose expandida ser sulfatada com reagente de sulfatação, o qual é seleccionado de entre o grupo que consiste em ácido sulfúrico, ácido amidosulfúrico, trióxido de enxofre, cloreto de sulfurilo e ácido clorossulfónico.

6. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores de 1 a 5 caracterizado pelo facto da celulose expandida ser acetilada com cloreto de acetilo ou anidrido acético.

7. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores de 1 a 6 caracterizado pelo facto da expansão ser concretizada a temperaturas que vão desde a temperatura ambiente até 150°C, particularmente 20° a 100°C ou ainda mais particularmente de 40° a 80°C. 3

8. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores de 1 a 7 caracterizado pelo facto da acetilação e a sulfatação serem executadas a temperaturas que vão desde a temperatura ambiente até 110°C, particularmente de 20° a 80°C, mais particularmente de 30° a 70°C ou ainda mais particularmente de 40° a 65°C.

9. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores de 1 a 8 caracterizado pelo facto de todos os materiais iniciais serem essencialmente isentos de qualquer metal pesado como Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn ou Cu, sendo o teor de ferro do SCS produzido £20ppm, e, consequentemente, sendo o teor total em metais pesados excluindo ferro do SCS produzido £l0ppm.

10. Sulfato de celulose de sódio (SCS) que pode ser obtido pelo método de acordo com uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo facto da gama de viscosidades da solução do SCS produzido ser ajustável entre 10 e 500 mPas, particularmente entre 15 e 400 mPas, também particularmente entre 20 e 300 mPas, mais particularmente entre 15 e 100 mPas, e ainda mais particularmente entre 20 e 50 mPas, com base numa solução de 1% em água.

11. Sulfato de celulose de sódio (SCS) de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo facto do SCS produzido ser isento de metais pesados como Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn ou Cu, sendo o teor de ferro do SCS produzido £20ppm e o teor total de metais pesados do SCS produzido excluindo ferro ^lOpprn. 4

12. Método para a produção de microcápsulas caracterizado pelos seguintes passos: a) preparação de solução aquosa 0,5 a 10% de SCS de acordo com as reivindicações 10 ou 11/ b) preparação de suspensão de SCS para um processo de encapsulamento através da adição dos materiais a encapsular à solução aquosa de SCS e, opcionalmente, a adição de um ou mais substratos, aditivo portador, solução, conservante, sal, glicerina ou DMSO; c) gotejamento da suspensão de b) num banho de complexação ; e d) complexação das cápsulas no banho que contém um polimero catiónico em solução aquosa.

13. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelo facto de os materiais encapsulados serem de origem biológica, particularmente as células naturais ou modificadas de seres humanos ou animais, bactérias naturais ou modificadas, vírus nativos ou modificados, leveduras naturais ou modificadas, proteínas isoladas ou misturas de proteínas, anticorpos ou fragmentos de anticorpos, e/ou moléculas de ácido nucleico.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13 caracterizado pelo facto do gotejamento ser realizado através do procedimento de vibração utilizando-se uma frequência de 100 a 4000 Hz.

15. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores de 12 a 14 caracterizado pelo facto da 5 complexação ser executada num banho, em que um catião polimérico é seleccionado do grupo de dodecilamina, etilenodiamina, piperazina, azul de metileno, arginina, trietiltetramina, poli(hidrocloreto de alilamina), espermina, poli (cloreto de dialildimetilamónio) (pDADMAC), poli (cloreto de vinilbenziltrimetilamónio) e uma mistura dos mesmos.

16. Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado pelo facto de a complexação ser executada num banho com poli (cloreto de dimetilalilamónio) (pDADMAC) com um peso molecular médio entre 10.000 e 500.000, preferencialmente entre 10.000 e 50.000.

17. Utilização de SCS de acordo com as reivindicações 10 ou 11 para o micro-encapsulamento de materiais biológicos.

18. Utilização de SCS de acordo com as reivindicações 10 ou 11 no método de acordo com as reivindicações de 12 a 16.

19. Microcápsulas de SCS de acordo com as reivindicações de 10 ou 11.

20. Microcápsulas de SCS produzidas através do método de acordo com qualquer das reivindicações de 12 a 16.

21. Microcápsulas ds SCS de acordo com as reivindicações 19 ou 20 caracterizadas pelo facto de possuírem uma distribuição homogénea de tamanhos com um 6 diâmetro médio de 0,1-50 ym, 1-100 pm, 50-250 ym, 50-500 ym, 100-250 ym, 100-500 ym, 250-500 ym, 250-700 ym, 200-1500 ym, 500-1000 ym, 600-800 ym, 700-1500 ym, 1000-2500 ym, 1500-3000 ym, 2500-4000 ym ou 3000-5000 ym.

22. Utilização das microcápsulas de SCS de acordo com qualquer das reivindicações de 19 a 21 como medicamentos.

23. Utilização das microcápsulas de SCS de acordo com qualquer das reivindicações de 19 a 21 para a produção de um medicamento para implantação e/ou injecção. Lisboa, 2/04/2009