CN109384841A - 一种完整肽链牛胶原蛋白的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种完整肽链牛胶原蛋白的生产方法。其特征是将牛跟腱预处理之后均在低温条件下进行操作：首先用非胶原蛋白去除液处理，后用胶原蛋白溶解液进行溶解，并进行充分匀浆后补加胶原蛋白溶解液继续溶解胶原蛋白，再添加胶原蛋白酶解液进行酶解，离心后收集上清液，之后加入胶原蛋白析出液使胶原蛋白析出，离心后收集沉淀，重复上述胶原蛋白溶解液溶解胶原蛋白‑离心收集上清液‑胶原蛋白析出液析出胶原蛋白‑离心收集沉淀‑胶原蛋白溶解液溶解‑离心收集上清液的处理步骤，最后将上清液进行透析，即得完整肽链牛胶原蛋白，冷冻干燥后保存。可作为医用生物材料应用于组织工程载体支架、手术缝合线、护创敷料等的制备。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料，具体涉及一种完整肽链牛胶原蛋白的生产方法。
背景技术
胶原蛋白作为一种天然的生物大分子物质，因其具有良好的生物相容性、可降解性以及创伤修复、止血、抗辐射、抗衰老等生物活性，已广泛应用于食品、生物医药和化妆品等领域。目前，胶原蛋白提取主要来源于动物的骨骼，但动物骨骼中含有大量无机物，因此利用动物骨骼提取胶原蛋白工艺繁琐、得率较低，尤其是通过高温联合酶处理法获得的胶原蛋白，其肽链将出现不同程度降解，即得到的胶原蛋白不具备完整的肽链；而已有技术利用碱提取法容易引起胶原蛋白的变性，严重水解时甚至会导致胶原蛋白发生消旋而产生有毒物质。此外，已有商业化的基因重组胶原蛋白价格十分昂贵，售价在每克约10万人民币，且这种重组胶原蛋白的肽链也同样出现不同程度的降解，只能用于包被细胞生长的介质，从而促进细胞的贴附，而这些不完整肽链的胶原蛋白是无法满足胶原蛋白在医用生物材料、尤其是在组织工程载体支架制备中实际应用的需要的，更不能进行规模化的生产。因此，必须尽快建立完善的完整肽链胶原蛋白的生产工艺，并实现规模化的生产，以高质低价满足医用生物材料的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种完整肽链胶原蛋白的生产方法，以克服现有技术的不足，并实现规模化的生产。
鉴于已有技术的胶原蛋白为了追求低廉的价格，其提取原料主要来源于动物的骨骼，但是又存在方法不当，提取步骤繁琐，提取质量和效率低、以及应用范围小等诸多弊端。如已有技术在提取胶原蛋白的过程中，往往使用热源处理，如热水抽提、喷雾干燥等，难以保证所提取的胶原蛋白为完整肽链的结构，因此不能保证提取的胶原蛋白保持最佳生物活性。
本发明为了克服传统工艺在提取过程中对胶原蛋白结构及其活性破坏的弊端，建立完善的完整肽链牛胶原蛋白的生产方法，实现规模化的生产，采用以胶原蛋白尤为丰富的新鲜牛跟腱为原材料，并以工艺全程4℃低温条件下进行，其中利用醋酸溶解、酶解等手段制出完整肽链牛胶原蛋白。
本发明制成的完整肽链牛胶原蛋白的分子量与天然胶原蛋白分子一致，纯度达到98%以上，冻干后呈白色、海绵状。
本发明的生产方法：先将牛跟腱清洗切碎进行牛跟腱的预处理，之后均在4℃条件下进行操作：首先去除碎块中的非胶原蛋白、再用胶原蛋白溶解液溶解碎块中的胶原蛋白、析出胶原蛋白、再溶解胶原蛋白，再析出胶原蛋白，之后透析，最后冷冻干燥后保存。
本发明的完整肽链牛胶原蛋白的具体制作步骤，其特征是
1、首先将新鲜牛跟腱去除筋膜、脂肪、血管，再清洗干净并沥干水后切成碎块；以下操作均在4℃条件下进行：
2、用30倍体积（V/W）的非胶原蛋白去除液浸泡并不断搅拌24~48 h，期间每8~12 h更换一次溶液，之后弃去上清液，用蒸馏水洗涤至pH为中性，用2层纱布沥去水分；
3、然后加入10倍体积（V/W）的胶原蛋白溶解液，浸泡搅拌12~24 h后，将搅拌混合液放入匀浆器中充分匀浆；
4、之后补加20倍体积（V/W）的胶原蛋白溶解液，搅拌24~48 h；之后按照牛跟腱:胃蛋白酶（W/W）=30~50:1的比例加入胶原蛋白酶解液，继续搅拌溶解8~12 h后，于10000~12000 g，离心10~30 min，收取上清液；
5、再在上清液中加入2倍体积的蒸馏水稀释，之后逐滴滴加胶原蛋白析出液并调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，10000~12000 g，离心10~30 min，弃去上清液、收集沉淀物；
6、重复上述步骤3-5以进一步纯化胶原蛋白；其中省掉步骤4中的匀浆工艺；
7、再将重复步骤5离心得到的沉淀物，用100~200 mL胶原蛋白溶解液溶解过夜，于10000~12000 g，离心10~30 min，收取上清液；
8、最后将上清液装入透析袋，以0.1~0.2 mol/L醋酸溶液为外液透析24~48 h，再以蒸馏水为外液透析24~48 h，至中性，即为完整肽链胶原蛋白，最后冷冻干燥保存。
本发明所用非胶原蛋白去除液是含有0.5~2 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris-HCl（pH7.4）。
上述胶原蛋白溶解液是0.3~0.6 mol/L醋酸溶液。
上述胶原蛋白酶解液是含有1~2 mg/mL胃蛋白酶的胶原蛋白溶解液，其中的胃蛋白酶的酶活为3000~3500 NF U/mg。
上述胶原蛋白析出液是10~20%（W/V）NaOH溶液。
本发明生产工艺流程简单，成本低，适于规模化生产，制成的完整肽链胶原蛋白的分子量与天然胶原蛋白分子一致，胶原蛋白纯度达到98%以上，因此可广泛应用于组织工程载体支架、可降解缝合线和护创敷料等的制备，从而满足医用生物材料批量生产的需要。
由于仅使用了低浓度的胃蛋白酶，并且酶解作用时间短，又在生产牛胶原蛋白的过程中始终在低温（4℃）的环境中进行操作，而未使用任何热源处理（如热水抽提、喷雾干燥等），因此生产的牛胶原蛋白能够保留原有的天然完整肽链结构，保证了其最佳的生物活性。又根据完整肽链胶原蛋白不溶于中性溶液的特性，本发明在胶原蛋白析出体系中仅仅引入NaOH溶液，通过改变体系的pH方法对胶原蛋白进行析出处理，其操作简便且其中不掺入其它的化学成分。因此，在医用生物材料，尤其是在组织工程载体支架、手术缝合线和护创敷料等方面的应用中具有无可比拟的优势。
本发明所制备的完整肽链牛胶原蛋白，通过交联的方法得到的载体支架，可应用于组织工程角膜的体外构建，该载体支架光学透明度高、对人角膜细胞的生物相容性理想，因此有望成为天然角膜载体支架的替代物而用于角膜病盲的临床移植和治疗。
具体实施方式
本发明涉及的各种溶液的配制方法：
1、上述非胶原蛋白去除液的配制方法：取蒸馏水900 mL，加入29.25~117 g NaCl和6.057g Tris-HCl，完全溶解后，调pH至7.4后用蒸馏水定容至1000 mL，4℃备用；
2、上述胶原蛋白溶解液的配制方法：取18~36 mL冰醋酸，加入蒸馏水定容至1000 mL，完全混匀后，4℃备用；
3、上述胶原蛋白酶解液的配制方法：取90 mL胶原蛋白溶解液，加入0.1~0.2g胃蛋白酶粉末，完全溶解后，再用胶原蛋白溶解液定容至100 mL，4℃备用；
4、上述胶原蛋白析出液的配制方法：取蒸馏水90 mL，加入10~20 g NaOH，完全溶解后，再用蒸馏水定容至100 mL，4℃备用。
本发明的具体实施步骤：
1、牛跟腱的预处理：机械剥离新鲜牛跟腱的筋膜、脂肪、血管，再使用蒸馏水将其清洗干净并沥干水后切成小块；
2、非胶原蛋白的去除：4℃条件下，用30倍体积（V/W）的非胶原蛋白去除液浸泡并不断搅拌24~48 h，每8~12 h更换一次溶液，再弃去上清液，用蒸馏水洗涤至pH为中性，沥干；
3、胶原蛋白的溶解：4℃条件下，10倍体积（V/W）的胶原蛋白溶解液，搅拌12~24 h后，再将上述混合液放入匀浆器中充分匀浆，之后补加20倍体积（V/W）的胶原蛋白溶解液，搅拌24~48 h；
4、胶原蛋白的酶解：按照牛跟腱:胃蛋白酶（W/W）=30~50:1的比例加入胶原蛋白酶解液，4℃条件下继续搅拌溶解8~12h后，于10000~12000 g，离心10~30 min，收取上清液；
5、胶原蛋白的析出：4℃条件下，上清液中加入2倍体积的蒸馏水稀释，之后逐滴滴加胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，10000~12000 g，离心10~30 min，弃上清液；
6、胶原蛋白的再溶解：4℃条件下，将上述离心得到的沉淀用30倍体积（V/W）的胶原蛋白溶解液溶解12~24 h，于10000~12000 g，离心10~30 min，收取上清液，除去不溶性杂质；
7、胶原蛋白的再析出：4℃条件下，将上述上清液再次用胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，10000~12000 g，离心10~30 min，弃上清液；
8、胶原蛋白的再溶解：4℃条件下，再将上述离心得到的沉淀，用100~200 mL胶原蛋白溶解液溶解过夜，于10000~12000 g，离心10~30 min，收取上清液；
9、胶原蛋白的透析和冻干：4℃条件下，将上清液装入透析袋，以0.1~0.2 mol/L醋酸溶液为外液透析24~48 h，再以蒸馏水为外液透析24~48 h，至中性，即为完整肽链牛胶原蛋白，冷冻干燥后保存。
实施例1
首先将新鲜牛跟腱去除筋膜、脂肪、血管，再清洗干净并沥干水后切成小块；
取蒸馏水900 mL，加入29.25 g NaCl和6.057 g Tris-HCl，完全溶解后，调pH至7.4后用蒸馏水定容至1000 mL，配制成非胶原蛋白去除液；取0.3 g冻干的牛跟腱，用900 mL非胶原蛋白去除液浸泡并不断搅拌48 h，每12 h更换一次溶液，再弃去上清液，用蒸馏水洗涤至pH为中性，沥干；
然后取蒸馏水4800 mL，加入90 mL冰醋酸，再用蒸馏水定容至5000 mL，配制成胶原蛋白溶解液；加入300 mL胶原蛋白溶解液，搅拌24 h；
再将上述混合液放入匀浆器中充分匀浆，之后补加600 mL胶原蛋白溶解液，搅拌48 h；
之后取100 mL胶原蛋白溶解液，加入0.1 g胃蛋白酶粉末，完全溶解后配制成胶原蛋白酶解液，然后取6 mL胶原蛋白酶解液加入到上述胶原蛋白溶解液中，继续搅拌溶解12 h后，于12000 g，离心10 min，收取上清液；
再在上清液中加入60 mL蒸馏水稀释，之后取NaOH 10 g，再用蒸馏水定容至100 mL，配制成胶原蛋白析出液，然后逐滴滴加胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，于12000 g，离心10 min，弃上清液；
然后将上述离心得到的沉淀用900 mL胶原蛋白溶解液溶解24 h，于12000 g，离心10min，收取上清液，除去不溶性杂质；
将上述上清液再次用胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，于12000 g，离心10 min，弃上清液；
再将上述离心得到的沉淀进行溶解，即用200 mL胶原蛋白溶解液溶解过夜，于12000g，离心10 min，收取上清液；
最后将上清液装入透析袋，以0.1 mol/L醋酸溶液为外液透析48 h，再以蒸馏水为外液透析24 h，至中性，即为完整肽链胶原蛋白，冷冻干燥后保存。
实施例2
首先将新鲜牛跟腱去除筋膜、脂肪、血管，再清洗干净并沥干水后切成小块；
取蒸馏水900 mL，加入58.5 g NaCl和6.057 g Tris-HCl，完全溶解后，调pH至7.4后用蒸馏水定容至1000 mL，配制成非胶原蛋白去除液；取0.3 g冻干的牛跟腱，用900 mL非胶原蛋白去除液浸泡并不断搅拌36h，每9 h更换一次溶液，再弃去上清液，用蒸馏水洗涤至pH为中性，沥干；
然后取蒸馏水4800 mL，加入120 mL冰醋酸，再用蒸馏水定容至5000 mL，配制成胶原蛋白溶解液；加入300 mL胶原蛋白溶解液，搅拌18 h；
再将上述混合液放入匀浆器中充分匀浆，之后补加600 mL胶原蛋白溶解液，搅拌36h；
之后取100 mL胶原蛋白溶解液，加入0.15 g胃蛋白酶粉末，完全溶解后配制成胶原蛋白酶解液，然后取15 mL胶原蛋白酶解液加入到上述胶原蛋白溶解液中，继续搅拌溶解10 h后，于11000 g，离心20 min，收取上清液；
再在上清液中加入60 mL蒸馏水稀释，之后取NaOH 15 g，再用蒸馏水定容至100 mL，配制成胶原蛋白析出液，然后逐滴滴加胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，于11000 g，离心20 min，弃上清液；
然后将上述离心得到的沉淀用900 mL胶原蛋白溶解液溶解18 h，于11000 g，离心20min，收取上清液，除去不溶性杂质；
将上述上清液再次用胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，于11000 g，离心20 min，弃上清液；
再将上述离心得到的沉淀进行溶解，即用150 mL胶原蛋白溶解液溶解过夜，于11000g，离心20 min，收取上清液；
最后将上清液装入透析袋，以0.15 mol/L醋酸溶液为外液透析36 h，再以蒸馏水为外液透析36 h，至中性，即为完整肽链胶原蛋白，冷冻干燥后保存。
实施例3
首先将新鲜牛跟腱去除筋膜、脂肪、血管，再清洗干净并沥干水后切成小块；
取蒸馏水900 mL，加入117 g NaCl和6.057 g Tris-HCl，完全溶解后，调pH至7.4后用蒸馏水定容至1000 mL，配制成非胶原蛋白去除液；取0.3 g冻干的牛跟腱，用900 mL非胶原蛋白去除液浸泡并不断搅拌24 h，每8 h更换一次溶液，再弃去上清液，用蒸馏水洗涤至pH为中性，沥干；
然后取蒸馏水4800 mL，加入180 mL冰醋酸，再用蒸馏水定容至5000 mL，配制成胶原蛋白溶解液；加入300 mL胶原蛋白溶解液，搅拌12 h；
再将上述混合液放入匀浆器中充分匀浆，之后补加600 mL胶原蛋白溶解液，搅拌24 h；
之后取100 mL胶原蛋白溶解液，加入0.2 g胃蛋白酶粉末，完全溶解后配制成胶原蛋白酶解液，然后取20 mL胶原蛋白酶解液加入到上述胶原蛋白溶解液中，继续搅拌溶解8 h后，于10000 g，离心30 min，收取上清液；
再在上清液中加入60 mL蒸馏水稀释，之后取NaOH 20 g，再用蒸馏水定容至100 mL，配制成胶原蛋白析出液，然后逐滴滴加胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，于10000 g，离心30 min，弃上清液；
然后将上述离心得到的沉淀用900 mL胶原蛋白溶解液溶解12 h，于10000 g，离心30min，收取上清液，除去不溶性杂质；
将上述上清液再次用胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原蛋白析出，静置过夜，于10000 g，离心30 min，弃上清液；
再将上述离心得到的沉淀进行溶解，即用100 mL胶原蛋白溶解液溶解过夜，于10000g，离心30 min，收取上清液；
最后将上清液装入透析袋，以0.2 mol/L醋酸溶液为外液透析24 h，再以蒸馏水为外液透析48 h，至中性，即为完整肽链胶原蛋白，冷冻干燥后保存。
显然，本发明能够满足对大量具有生物活性且肽链完整的胶原蛋白的需求。
Claims (9)
1.一种牛胶原蛋白，其特征是该牛胶原蛋白具有完整肽链，且分子量与天然胶原蛋白分子一致，纯度达到98%以上，冻干后呈白色、海绵状。
2.完整肽链牛胶原蛋白生产的方法：牛跟腱的预处理，之后均在4℃条件下进行操作：首先去除碎块中的非胶原蛋白、再用胶原蛋白溶解液溶解碎块中的胶原蛋白、析出胶原蛋白、再溶解胶原蛋白，再析出胶原蛋白，之后透析，最后冷冻干燥后保存。
3.一种完整肽链牛胶原蛋白的具体制备步骤，其特征是
1）首先将新鲜牛跟腱洗净后切成碎块，在低温条件下进行提取，用非胶原蛋白去除液处理牛跟腱碎块，再用蒸馏水洗涤至pH为中性；
2）然后用胶原蛋白溶解液溶解上述处理的牛跟腱碎块，并进行充分匀浆后补加胶原蛋白溶解液继续溶解胶原蛋白，再添加胶原蛋白酶解液进行适当酶解，离心后收集上清液，之后加入胶原蛋白析出液使胶原蛋白析出，离心后收集沉淀物；
4）重复步骤2），省掉其中的匀浆工艺；
5）用胶原蛋白溶解液溶解收集沉淀物，最后将上清液进行透析，即得完整肽链结构的胶原蛋白，冷冻干燥后保存。
4.如权利要求3所述的完整肽链牛胶原蛋白的生产方法，其特征是上述非胶原蛋白去除液是：含有0.5~2 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris-HCl溶液，pH为7.4。
5.如权利要求3所述的完整肽链牛胶原蛋白的生产方法，其特征是上述胶原蛋白溶解液是0.3~0.6 mol/L醋酸溶液。
6.如权利要求3所述的完整肽链牛胶原蛋白的生产方法，上述胶原蛋白酶解液是含有1~2 mg/mL胃蛋白酶的胶原蛋白溶解液，其中胃蛋白酶酶活为3000~3500 NF U/mg。
7.如权利要求3所述的完整肽链牛胶原蛋白的生产方法，其特征是上述胶原蛋白析出液是10~20%（W/V）NaOH溶液。
8.如权利要求3所述的完整肽链牛胶原蛋白的生产方法，其特征是上述加入胶原蛋白析出液使胶原蛋白析出的方法：逐滴滴加胶原蛋白析出液调pH至7.3，边滴加边搅拌使胶原析出，静置过夜。
9.权利要求1的牛胶原蛋白作为医用生物材料应用于组织工程载体支架、手术缝合线和护创敷料的制备。
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| CN201811316666.2A CN109384841A (zh) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | 一种完整肽链牛胶原蛋白的生产方法 |
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| CN (1) | CN109384841A (zh) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113425902A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-09-24 | 陈基施展 | 可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水及其制备方法 |
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- 2018-11-07 CN CN201811316666.2A patent/CN109384841A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 叶真铭: "胶原蛋白止血海绵的研制", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113425902A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-09-24 | 陈基施展 | 可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水及其制备方法 |
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