CN113425902A - 可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水及其制备方法 - Google Patents

可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于I型胶原蛋白的用于DLP式3D打印的可见光交联生物墨水及其制备方法和应用。本发明主要利用MA改性的I型胶原蛋白（ColMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）在405nm可见光下的快速交联构建交联网络结构，同时利用辅助添加剂的特性实现高精度DLP式3D打印。生物墨水材料由如下成分制备而成：0.25%～0.3%（w/v）ColMA、0.25%～0.3%（v/v）PEGDA、5%（v/v）黄色食用色素和0.5%～1%（w/v）光引发剂，其余成分为酸性溶液和水。本发明原材料不涉及对细胞有毒的试剂，反应温和，生产周期短；适合DLP式3D打印，打印分辨率高，适合构建多孔、中空结构；以低浓度胶原蛋白达到较高机械强度，且机械强度可控；3D打印可针对个人进行定制化设计，适合临床个性化医疗应用。

Description

可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水及其制备方法
技术领域
本发明涉及3D生物打印、一种生物墨水，尤其是涉及一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水及其制备方法。
背景技术
在修复重建外科领域，过去几十年中已经开发了一系列具有生物活性和生物可吸收性的复合材料，如聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、壳聚糖、胶原蛋白和明胶等用于科研和临床工作。但它们较差的力学性能、有限的生物功能和较高的细胞毒性仍是外科应用的挑战。在这些材料中，胶原蛋白因其是人体组织如骨骼、皮肤、血管、韧带、软骨等的天然组成成分，应用范围广而受到广泛的关注和研究，在组织工程应用中被广泛用于构建基质。
I型胶原蛋白是胶原蛋白家族中的一员，在人体中占总蛋白质的三分之一，占皮肤干重的四分之三，是细胞外基质中最普遍的成分，具有良好的可生物降解性、弱抗原性和优异的生物相容性。I型胶原蛋白由三个多肽链在空间中组成三螺旋结构，每条链的组成是Gly-X-Y序列，其中X和Y代表任意氨基酸，但主要是羟脯氨酸和脯氨酸。胶原蛋白的三螺旋结构使其具有较高的机械强度和良好的生物活性。胶原蛋白三螺旋结构可以进一步通过自组装和交联形成具有更高机械强度和稳定性的纤维结构，并可以通过调节交联度来控制机械强度和降解速率，具有良好的可控性，使其应用范围可以广泛覆盖从较软的脑组织到较硬的骨组织。在材料制备方面，I型胶原蛋白可以相对容易地从动物结缔组织（牛、猪、鸡和鱼类等）中提取，来源多样，存量丰富。常用的提取方法有酸提取法、碱提取法、酶提取法或以上多种方法联合应用，提取方法成熟，适于实验室操作或大规模工业应用。先前报道胶原蛋白的热降解产物明胶的肽链上的伯胺基可被甲基丙烯酰胺（MA）取代，改性后的明胶在光引发剂的存在下可被紫外光交联。作为结构上的类似物，胶原蛋白肽链上的伯氨基理论上也可被MA取代并进行光交联。目前该技术已被证明可行，通过调节胶原浓度、光引发剂添加比例、紫外光强度和暴露时间，可以控制胶原基质的强度，从而适用于不同应用。该项技术使得利用胶原蛋白进行光交联三维（3D）打印成为可能。
3D打印，或增材制造是一种工艺，该工艺可通过专用3D打印机将生物材料按照预设的3D建模打印出来并固化。在3D建模程序的帮助下，打印机根据文件中包含的信息将待打印的3D模型切分成多层二维（2D）图案，并将这些2D图案依照层的顺序叠加打印，直到全部模型打印完成。3D打印理论上可以打印出任意几何结构，使临床上针对患者的个性化材料制造具有可行性。目前主要的3D打印技术包括挤出式、喷墨式和激光辅助式。挤出式打印依赖机械力或气动力通过喷嘴挤出生物墨水，打印分辨率显著受限于喷头直径、墨水粘度和弹性等，并且对于胶原蛋白生物墨水无法实现边打印边交联，对于较大或较高的结构容易出现坍塌形变现象。喷墨式打印机是用加热或压电的方法以一定的频率将生物墨水通过针头喷洒到平台上形成结构，其要求墨水粘度低，滴到平台上迅速固化。胶原蛋白对温度敏感，温度升高会显著改变胶原蛋白生物墨水的粘度，且造成具有生物活性的三螺旋结构降解。同时，若生物墨水混合细胞，细胞在静置时因重力会沉积在墨盒底部，易堵塞针头或细胞在打印结构中分布不均，因此亦不适合胶原蛋白生物墨水的打印。激光辅助式打印是采用激光代替喷墨式打印中的加热或压电，通过激光进行生物墨水的固化，可能会在固化过程中对生物墨水中的细胞造成较大损伤。最近，新出现的数字光处理（DLP）式打印使基于胶原蛋白的生物墨水打印得到优化。DLP式打印主要采用投影仪原理，通过将2D图像投影至液态光敏感样品池，每次固化整个层面，逐层固化成型。该方法可在低温下进行，投影采用可见光，分辨率不受喷嘴尺寸限制，较传统打印方法提高了4倍，而打印速度则较传统打印方法提高了8倍。其低温、温和和快速的特点保证了胶原蛋白三螺旋结构的稳定，但该打印方法因依靠倒置的打印平台依靠液体表面张力对生物墨水进行吸附，从而要求生物墨水粘度低、流动性高。
目前，用于DLP式3D打印的可光交联的生物墨水仍以明胶为主，主要是由于明胶提取工艺较简单；溶解度高且能在较高浓度下保持良好流动性；PH变化不会引起肽链的自组装而导致打印前交联，有利于在中性环境下与细胞混合打印；肽链结构不易受高温影响，可在打印过程中通过加热的方式保持生物墨水良好的流动性； MA改性过程中可调节PH至碱性，升温至60℃，保证取代反应在最高效率条件下进行。但基于明胶的生物墨水具有明显缺点，即机械强度低（通常报道压缩模量仅1～10kPa），无法满足多数医学应用的需求。与明胶相比，传统胶原蛋白因其保持了完整的三螺旋结构，具有明显较高的机械强度（通常报道压缩模量数十至数百kPa）。然而，胶原蛋白制备工艺较复杂，提纯需要盐析和透析等步骤，耗时长；为保存生物活性三螺旋结构需在4℃低温下进行，但低温不利于胃蛋白酶对胶原蛋白的水解；胶原蛋白原纤维对PH变化敏感，如酸性环境下提取的胶原蛋白在中性和碱性环境中会发生自组装导致交联，溶解度降低而析出；而中性和碱性环境下提取的胶原蛋白三螺旋结构均受到不同程度的破坏；胶原蛋白浓度变化对溶液流动性影响大，无法配制高浓度墨水；在MA改性过程中，由于MA取代反应在碱性、高温条件下效率最高，反之亦然，因此胶原蛋白酸性溶液和4℃低温的反应条件不利于MA取代反应；此外，已知的胶原蛋白生物墨水由于不含光抑制剂，无法控制光交联深度，在打印多孔、中空结构时常因交联区域不可控导致过度交联，从而预留空部分也被交联而堵塞，严重影响打印精度。
综上所述，现有基于明胶的生物墨水虽然制备工艺简单，可进行DPL式3D打印，但所获得的结构机械强度低，限制了它的应用范围。目前已开发的基于胶原蛋白的生物墨水制备周期长，且仅适用于挤出式3D打印，打印精度低，可用于DLP式3D打印的生物墨水尚无报道。
发明内容
针对现有生物墨水及其制备工艺存在的缺点和不足，本发明的目的之一旨在提供一种无需耗时长的盐析和透析步骤的高效、省时的可用于DLP式3D打印的I型胶原蛋白生物墨水的制备工艺，适用于实验室研究和工厂大规模生产。所得I型胶原蛋白生物墨水的特点是可进行DLP式3D打印，具有极适合该3D打印方法的低粘度和良好流动性；打印分辨率高，最高层高精度可达50μm，所得结构边缘锐利，适合构建多孔、中空结构；以低浓度（0.3% w/w）胶原蛋白达到较高机械强度(＞100kPa)，节约原料；在4℃或室温下使用405 nm波长可见光交联，反应条件较温和，保证胶原蛋白生物活性三螺旋结构的完整性。
本发明的目的之二旨在提供一种基于该墨水的DLP式3D打印技术方案，优化打印参数，用于制作可用于细胞培养的3D打印仿生支架。
本发明可3D打印的可见光交联I型胶原蛋白生物墨水材料为多元材料体系，主要可打印成分为1：1混合的MA改性I型胶原蛋白（ColMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）。其中I型胶原蛋白为天然生物高分子，主要存在于结缔组织中，特征是由两条α1肽链和一条α2肽链组成三螺旋二级结构，是生物医疗领域常用的材料，可通过MA改性后光交联构建可打印水凝胶；PEGDA是一种水溶性高分子材料，亦可在光引发剂存在的条件下被光交联固化，由于其生物惰性，对细胞无促进或抑制作用，被广泛用于构建水凝胶模拟细胞外基质（ECM）环境以进行细胞封装和培养。据报道生物墨水添加PEGDA可提高打印分辨率。本发明的辅助成分为黄色食用色素和光引发剂。黄色食用色素是常用的食品添加剂，无生物毒性，主要作为405nm紫光的光抑制剂，限制DLP式3D打印时每层结构的光交联深度和范围，防止过度交联，以获得高分辨率结构。光引发剂是光交联所必须的引发剂，在特定波长的光照条件下，光引发剂吸收光能产生自由基，使MA改性后的I型胶原蛋白溶液分子间成键形成固相凝胶。生物墨水中各成分的最终比例为0.25%～0.3%（w/v）ColMA、0.25%～0.3%（v/v）PEGDA、5%（v/v）黄色食用色素和0.5%～1%（w/v）光引发剂，其余成分为酸性溶液和水。
为实现上述目的，本发明的第一个目的采用如下技术方案（所有溶液均在使用前平衡至4℃，所有操作均在4℃下进行，除非另有说明）。
步骤（1）、取新鲜或冰冻牛肌腱用水洗净，切成1×1mm小块；将所得牛肌腱小块用75%乙醇浸泡15分钟无菌化处理；倒去乙醇，加入无菌水润洗三次以洗净残留乙醇。
作为优选，所述的水为去离子水、蒸馏水或超纯水中的一种或几种。
步骤（2）、将步骤（1）无菌牛肌腱小块加入到脱脂剂中，在摇床上过夜脱脂。
作为优选，所述的脱脂剂包括并不限于乙醇、异丙醇、丙酮、石油醚中的一种或几种；脱脂剂体积百分比为10%～100%；脱脂固液比为1：10～1：20。
步骤（3）、将步骤（2）脱脂后的肌腱加入到含有胃蛋白酶的PH2.5的酸性溶液中，以搅拌速率200rpm～800rpm机械搅拌12h～72h，酶解提取I型胶原蛋白。
作为优选，所述酸性溶液包括并不限于醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种或几种；酸性溶液固液比为1：20～1：40；胃蛋白酶与牛肌腱的质量比为1：10～1：1000。
步骤（4）、将步骤（3）消化产物以3000rpm离心15min～20min；收集含有I型胶原蛋白的粘稠上清液，弃去不溶物及未消化牛肌腱颗粒。
步骤（5）、I型胶原蛋白的初步纯化：将步骤（4）溶液滴加NaOH调节PH值至7.0，静置15min～30min，见溶液逐渐凝胶化析出；收集析出的凝胶状物，置于离心管中以3000rpm离心15min～20min；收集含有I型胶原蛋白的凝胶状沉淀，弃去上清液。
步骤（6）、将步骤（5）凝胶状物重新溶解于酸性溶液中，得到初步纯化后的含有I型胶原蛋白的溶液。
步骤（7）、I型胶原蛋白的进一步纯化：将步骤（6）溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min；分子质量低于100kDa的杂蛋白和肽链碎片被过滤至下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kDa的I型胶原蛋白溶液则被截留于上方的收集管中； 收集I型胶原蛋白溶液。
步骤（8）、将步骤（7）溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度I型胶原蛋白冻干粉。
步骤（9）、I型胶原蛋白的MA改性：将步骤（8）冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mL I型胶原蛋白溶液。
步骤（10）、将MA（平均摩尔质量700g/mol）按体积比1：100逐滴加入步骤（9）溶液中，在室温20℃～25℃条件下以500rpm磁力搅拌24h～48h。
步骤（11）、将步骤（10）溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min，过量的小分子MA及反应副产物被过滤至滤芯下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kDa的ColMA则被截留于上方的收集管中；收集ColMA溶液。
步骤（12）、将步骤（11）溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度ColMA冻干粉。
步骤（13）、将步骤（12）冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mL～0.6mg/mL ColMA溶液，用于生物墨水的配制。
步骤（14）、将ColMA溶液、PEGDA、黄色食用色素、光引发剂、酸性溶液按比例混合，300rpm磁力搅拌15分钟使混合均匀，得到生物墨水材料。
作为优选，所述黄色食用色素包括并不限于酒石酸（E102）、姜黄素（E100）中的一种或几种。
作为优选，所述光引发剂包括并不限于Irgacure 2959、苯基（2,4,6-三甲基甲酰基）磷酸锂盐（LAP）中的一种或几种。
作为优选，所述生物墨水材料的PH值为2.5～3.0。
本发明的第二个目的采用如下技术方案。
基于可3D打印的可见光交联I型胶原蛋白生物墨水材料的应用，用于制作可用于细胞培养的3D打印仿生支架，其特征在于，按以下步骤进行：在4℃或室温下，将配制好的上述生物墨水材料均匀加样到DLP式3D打印机的样品池内，选择相应CAD模型，设定打印层高精度为50μm～100μm，光照强度6.32mW/cm2，每层光照时间10s～30s，平台不加温。得到定型的凝胶样品后，将样品浸入平衡盐溶液（PBS）中静置12h，期间更换三次新鲜PBS，使黄色食用色素和酸性溶液彻底析出，最终得到无色透明、中性的凝胶样品；无菌化处理后的凝胶样品可用于细胞培养。
作为优选，根据凝胶样品的不同应用，得到定型的凝胶样品后可进行1min～5min的后固化光照，增加凝胶样品的机械强度。
本发明的有益效果是。
本发明生物墨水材料是基于I型胶原蛋白的天然高分子，生物相容性和生物降解性好，降解后无毒安全，免疫原性低，可促进细胞的黏附、增殖和分化；原材料不涉及对细胞有毒的试剂；3D打印可在4℃或室温下进行，使用405 nm波长可见光交联，不涉及对细胞有害的过程，且能保证胶原蛋白生物活性三螺旋结构的完整性；I型胶原蛋白提取工艺不涉及需耗时的盐析和透析，以选择性滤过膜离心法替代，生产周期大幅缩短，有利于大规模生产；生物墨水材料粘度低、流动性好，适合DLP式3D打印，打印分辨率高，适合构建多孔、中空结构；以低浓度胶原蛋白达到较高机械强度，节约原料；本发明生物墨水材料机械强度可控，针对人体不同组织应用特性，通过改变材料配比、光照强度和时间即可配制出一些列不同强度的凝胶样品；3D打印可针对个人进行定制化设计，适合临床个性化医疗应用。
附图说明
图1为用本发明方法提取的I型胶原蛋白、ColMA、商业I型胶原蛋白的紫外-可见光光谱。
图2为用本发明方法提取的I型胶原蛋白、ColMA、商业I型胶原蛋白、商业B型明胶的傅立叶变换红外光谱。
图3为I型胶原蛋白、ColMA、商业I型胶原蛋白、商业B型明胶的Wester-Blot凝胶电泳结果。
图4为DLP式3D打印人耳形状凝胶样品。
图5为DLP式3D打印4×4网格形状凝胶样品。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和有点更加清楚，下面通过实施例的方式作进一步的详细描述，但是不局限于下述实施例。本发明所采用牛肌腱可由市场购得，本发明所采用DLP式3D打印机为美国Cellink公司LumenX+ 3D打印机。
实施例1：
所有溶液均在使用前平衡至4℃，所有操作均在4℃下进行，除非另有说明。
1）取冰冻牛肌腱25g用去离子水洗净，切成1×1mm小块；将所得牛肌腱小块用100mL 75%乙醇浸泡15分钟无菌化处理；倒去乙醇，加入100mL无菌水润洗三次。
2）将上述无菌牛肌腱小块加入到250mL 10%异丙醇中，在摇床上过夜脱脂。
3）将上述脱脂后的肌腱加入到1000mL含有250mg胃蛋白酶的PH2.5的0.5M醋酸中，以搅拌速率400rpm机械搅拌24h。
4）将上述消化产物以3000rpm离心20min；收集含有I型胶原蛋白的粘稠上清液，弃去不溶物及未消化牛肌腱颗粒。
5）将上述溶液滴加NaOH调节PH值至7.0，静置30min；收集析出的凝胶状物，置于离心管中以3000rpm离心20min；收集含有I型胶原蛋白的凝胶状沉淀，弃去上清液。
6）将上述凝胶状物重新溶解400mL 0.5M醋酸中，得到初步纯化后的含有I型胶原蛋白的溶液。
7）将上述溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min； 收集截留在收集管中的I型胶原蛋白溶液。
8）将上述溶液冷冻干燥48h后得到高纯度I型胶原蛋白冻干粉。
9）将上述冻干粉3mg加入5mL 0.5M醋酸，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.6mg/mLI型胶原蛋白溶液。
10）将50μL的MA（平均摩尔质量700g/mol）逐滴加入上述5mL溶液中，在室温20℃～25℃条件下以500rpm磁力搅拌24h。
11）将所得上述溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min，收集被截留在收集管中的ColMA溶液。
12）省略步骤（12），将新鲜配制的ColMA溶液直接用于生物墨水的配制；预稀释30μL PEGDA至45μL去离子水中，配制40%（v/v）PEGDA溶液；将100mg LAP溶解于1mL 去离子水中，配制10%（w/v）LAP溶液。
13）、将5mL上述ColMA溶液、75μL 上述PEGDA溶液、500μL黄色食用色素、1mL 上述LAP溶液和3.425mL 0.5M醋酸混合，300rpm磁力搅拌15分钟使混合均匀，最终得到10mL生物墨水材料；各成分的最终浓度为0.3%（w/v）ColMA、0.3%（v/v）PEGDA、5%（v/v）黄色食用色素和1%（w/v）LAP；生物墨水PH值为2.7。
14）在室温下，取3mL上述生物墨水材料均匀加样到LumenX+ 3D打印机的样品池内，选择人耳形状CAD模型，设定打印层高精度为100μm，光照强度20%（6.32mW/cm2），每层光照时间20s，平台不加温，得到定型的人耳形状凝胶样品；将所得凝胶样品在405nm紫光灯下进行5min的后固化，最后经12小时PBS浸泡和3%双氧水灭菌处理2h。打印的生物支架压缩模量为约为115.3kPa；通过细胞活性检测，细胞存活率75%或更多存活。
参照图1，用0.1%（w/v）的本发明方法提取的I型胶原蛋白、ColMA、商业I型胶原蛋白进行紫外-可见光光谱扫描。可见三种样品均具有230nm胶原蛋白特征峰，且本发明方法提取的I型胶原蛋白在250nm～280nm处具有宽峰，证明其比商业I型胶原蛋白保留了更多的发色团（伯氨基），更利于MA取代反应；在MA改性后，ColMA样品在250nm～280nm处的宽峰消失，表明大部分伯氨基被MA取代。
参照图2，本发明方法提取的I型胶原蛋白、ColMA、商业I型胶原蛋白、商业B型明胶冻干粉进行傅立叶变换红外光谱扫描，结果显示本发明方法提取的I型胶原蛋白、ColMA与商业I型胶原蛋白均可观察到较强的酰胺A（3298cm-1）、B（2922cm-1）带和酰胺I（1631cm-1）、II（1542cm-1）、III（1236cm-1）带特征峰；酰胺III带是胶原具有完整三螺旋结构的特征峰，本发明方法提取的I型胶原蛋白、ColMA、商业I型胶原蛋白均有强酰胺III带特征峰，而商业B型明胶是胶原热降解的产物，三螺旋结构受到破坏，可见其酰胺III带峰强度明显降低，且酰胺A带峰增宽。
参照图3，将10μg的商业I型胶原蛋白（a）、本发明方法提取的I型胶原蛋白（b）、ColMA（c）、商业B型明胶（d）进行Wester-Blot凝胶电泳，电泳在冰浴中进行，电泳参数为浓缩胶70V 30min，分离胶100V 165min；电泳结束后凝胶进行考马斯亮蓝染色。结果显示本发明方法提取的I型胶原蛋白、ColMA与商业I型胶原蛋白条带相似，均可见α链（130kDa）、β链（α链二聚体，270kDa）和γ链（α链三聚体，400kDa）条带，未见其他小分子杂蛋白条带，表明所提取胶原蛋白为高纯度I型胶原蛋白，且在MA改性前后三螺旋结构完整性均保存良好；明胶样品未见大于100kDa以上的条带。
参照图4，使用本发明的生物墨水材料和3D打印参数，可以得到具有复杂仿生结构的人耳形状凝胶，且分辨率高，边缘锐利，透明度高。
实施例2：
所有溶液均在使用前平衡至4℃，所有操作均在4℃下进行，除非另有说。
1）取冰冻牛肌腱50g用去离子水洗净，切成1×1mm小块；将所得牛肌腱小块用200mL 75%乙醇浸泡15分钟无菌化处理；倒去乙醇，加入200mL无菌水润洗三次。
2）将上述无菌牛肌腱小块加入到500mL 75%乙醇中，在摇床上过夜脱脂。
3）将上述脱脂后的肌腱加入到2000mL含有500mg胃蛋白酶的PH2.5的0.5M醋酸中，以搅拌速率700rpm机械搅拌48h。
4）将上述消化产物以3000rpm离心20min；收集含有I型胶原蛋白的粘稠上清液，弃去不溶物及未消化牛肌腱颗粒。
5）将上述溶液滴加NaOH调节PH值至7.0，静置15min；收集析出的凝胶状物，置于离心管中以3000rpm离心20min；收集含有I型胶原蛋白的凝胶状沉淀，弃去上清液。
6）将上述凝胶状物重新溶解800mL 0.5M醋酸中，得到初步纯化后的含有I型胶原蛋白的溶液。
7）将上述溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min； 收集截留在收集管中的I型胶原蛋白溶液。
8）将上述溶液冷冻干燥48h后得到高纯度I型胶原蛋白冻干粉。
9）将上述冻干粉25mg加入50mL 0.5M醋酸，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mL I型胶原蛋白溶液。
10）将400μL的MA（平均摩尔质量700g/mol）逐滴加入上述50mL溶液中，在室温20℃～25℃条件下以500rpm磁力搅拌48h。
11）将所得上述溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min，收集被截留在收集管中的ColMA溶液。
12）将上述溶液冷冻干燥48h后得到高纯度ColMA冻干粉。
13）将上述冻干粉2.5mg加入5mL 0.5M醋酸溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mL ColMA溶液，用于生物墨水的配制；预稀释25μL PEGDA至50μL去离子水中，配制33.3%（v/v）PEGDA溶液；将50mg LAP溶解于1mL 去离子水中，配制5%（w/v）LAP溶液。
13）、将5mL上述ColMA溶液、75μL 上述PEGDA溶液、500μL黄色食用色素、1mL 上述LAP溶液和3.425mL 0.5M醋酸混合，300rpm磁力搅拌15分钟使混合均匀，最终得到10mL生物墨水材料；各成分的最终浓度为0.25%（w/v）ColMA、0.25%（v/v）PEGDA、5%（v/v）黄色食用色素和0.5%（w/v）LAP；生物墨水PH值为2.7。
14）在室温下，取1mL上述生物墨水材料均匀加样到LumenX+ 3D打印机的样品池内，选择4×4网格形状CAD模型，设定打印层高精度为100μm，光照强度20%（6.32mW/cm2），每层光照时间15s，平台不加温，得到定型的4×4网格形状凝胶样品；将所得凝胶样品经12小时PBS浸泡和3%双氧水灭菌处理2h。打印的生物支架压缩模量为约为15.4kPa；通过细胞活性检测，细胞存活率75%或更多存活。
参照图5，使用本发明的生物墨水材料和3D打印参数，可以得到4×4网格形状凝胶（a）；与MA改性纯I型胶原蛋白生物墨水对照样品（b）严重的堵孔现象相比，本发明的生物墨水分辨率高，结构清晰，无堵孔现象，透明度高。
以上所述仅为本发明较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围。凡对本发明做出其他各种相应的修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料，其特征在于为多元材料体系，主要利用MA改性的I型胶原蛋白和PEGDA在405nm可见光下的快速交联构建交联网络结构，同时利用辅助添加剂的特性实现高精度DLP式3D打印。
2.如权利要求1所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料，其特征在于多元材料体系是指由ColMA、PEGDA、黄色食用色素、光引发剂、酸性溶液和水组成的复合体系。
3.如权利要求1所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料，其特征在于所述黄色色素为包括但不限于酒石酸（E102）、姜黄素（E100）中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料，其特征在于所述酸性溶液为包括但不限于醋酸、柠檬酸、盐酸中的一种或几种；所述水为包括但不限于去离子水、蒸馏水或超纯水中的一种或几种。
5.如权利要求1所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料，其特征在于所述光引发剂包括并不限于Irgacure 2959、苯基（2,4,6-三甲基甲酰基）磷酸锂盐（LAP）中的一种或几种。
6.如权利要求1所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料，其特征在于生物墨水材料各组分的最终浓度为0.25%～0.3%（w/v）ColMA、0.25%～0.3%（v/v）PEGDA、5%（v/v）黄色食用色素和0.5%～1%（w/v）LAP，其余成分为酸性溶液和水。
7.一种如权利要求1～6所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法，其特征在于该方法具体是：
所有溶液均在使用前平衡至4℃，所有操作均在4℃下进行，除非另有说明；
步骤（1）、取新鲜或冰冻牛肌腱用水洗净，切成1×1mm小块；将所得牛肌腱小块用75%乙醇浸泡15分钟无菌化处理；倒去乙醇，加入无菌水润洗三次以洗净残留乙醇；
步骤（2）、将步骤（1）无菌牛肌腱小块加入到脱脂剂中，在摇床上过夜脱脂；
步骤（3）、将步骤（2）脱脂后的肌腱加入到含有胃蛋白酶的PH2.5的酸性溶液中，以搅拌速率200rpm～800rpm机械搅拌12h～72h，酶解提取I型胶原蛋白；
步骤（4）、将步骤（3）消化产物以3000rpm离心15min～20min；收集含有I型胶原蛋白的粘稠上清液，弃去不溶物及未消化牛肌腱颗粒；
步骤（5）、I型胶原蛋白的初步纯化：将步骤（4）溶液滴加NaOH调节PH值至7.0，静置15min～30min，见溶液逐渐凝胶化析出；收集析出的凝胶状物，置于离心管中以3000rpm离心15min～20min；收集含有I型胶原蛋白的凝胶状沉淀，弃去上清液；
步骤（6）、将步骤（5）凝胶状物重新溶解于酸性溶液中，得到初步纯化后的含有I型胶原蛋白的溶液；
步骤（7）、I型胶原蛋白的进一步纯化：将步骤（6）溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min；分子质量低于100kDa的杂蛋白和肽链碎片被过滤至下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kDa的I型胶原蛋白溶液则被截留于上方的收集管中； 收集I型胶原蛋白溶液；
步骤（8）、将步骤（7）溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度I型胶原蛋白冻干粉；
步骤（9）、I型胶原蛋白的MA改性：将步骤（8）冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mL I型胶原蛋白溶液；
步骤（10）、将MA（平均摩尔质量700g/mol）按体积比1：100逐滴加入步骤（9）溶液中，在室温20℃～25℃条件下以500rpm磁力搅拌24h～48h；
步骤（11）、将步骤（10）溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min，过量的小分子MA及反应副产物被过滤至滤芯下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kDa的ColMA则被截留于上方的收集管中；收集ColMA溶液；
步骤（12）、将步骤（11）溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度ColMA冻干粉；
步骤（13）、将步骤（12）冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mL～0.6mg/mL ColMA溶液，用于生物墨水的配制；
步骤（14）、将ColMA溶液、PEGDA、黄色食用色素、光引发剂、酸性溶液按比例混合，300rpm磁力搅拌15分钟使混合均匀，得到生物墨水材料。
8.如权利要求7所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的脱脂剂包括并不限于乙醇、异丙醇、丙酮、石油醚中的一种或几种；脱脂剂体积百分比为10%～100%；脱脂固液比为1：10～1：20。
9.如权利要求7所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法，其特征在于步骤（3）中酸性溶液固液比为1：20～1：40；胃蛋白酶与牛肌腱的质量比为1：10～1：1000。
10.如权利要求1所述的可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的应用，其特征在于用于DLP式3D打印机制作可用于细胞培养的3D仿生支架，按以下步骤进行：在4℃或室温下，将配制好的上述生物墨水材料均匀加样到DLP式3D打印机的样品池内，选择相应CAD模型，设定打印层高精度为50μm～100μm，光照强度6.32mW/cm2，每层光照时间10s～30s，平台不加温；根据凝胶样品的不同应用，得到定型的凝胶样品后还可进行1min～5min的后固化光照；最后还需将样品浸入平衡盐溶液（PBS）中洗涤并无菌化处理后用于细胞培养。
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