CN101717804B - 医用级ⅲ型胶原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医用级III型胶原的制备方法，其特点是将新鲜新生犊牛皮作为原料进行前处理，然后用限制胃蛋白酶降解法和盐析法提取I和III型胶原混合物；再用浓度为1.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris、pH＝7.5的缓冲液溶解2-5次，以溶解掉大部分的I型胶原；用浓度为2-6mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.5的缓冲液，于温度45-95℃水浴中加热30-60分钟，使胶原变性，降低温度和盐酸胍浓度，III型胶原于2-6小时复性，高速离心后获得III型胶原。
Description
技术领域
本发明涉及一种医用级III型胶原的制备方法，属于生物医用材料的制备领域。
背景技术
III型胶原(Type III Collagen，CIII)是一种典型的间质胶原，主要存在于皮肤、血管、心脏、肺、肝脏及肾脏等的组织中。以细纤维形式存在的III型胶原赋予组织较强的可扩张能力，对保持皮肤、血管、肝脏等组织器官的弹性，维持其正常的生理功能起着重要的作用。近年来的研究表明，III型胶原在Ehlers-Danlos综合症IV(EDS IV)和动脉瘤的病理研究中起着重要的作用(Kroes HY，Pals G and van Essen AJ.Ehlers-Danlos syndrome type IV：unusual congenital anomalies in a mother and son with a COL3A1 mutation and a normalcollagen III protein profile.Clin Genet.2003：63：224-227和Brega KE，Seltzer WK，Munro L，Breeze RE.Genotypic variations of type III collagen in patients with cerebral aneurysms.SurgNeurol.1996：46：253-7)。同时，III型胶原还用于抗血清的制备和免疫组织化化学的研究(S.Gay，L. Balleisen，K.Remberger，P.P.Fietzek，B.C.Adelmann and K.Kühn.Immunohistochemical Evidence for the Presence of Collagen Type III in Human Arterial Walls，Arterial Thrombi，and in Leukocytes，Incubated with Collagen in Vitro.Klin.Wschr，1975，53：899-902)。并且，国内外均有关于III型胶原蛋白促进胃粘膜上皮细胞再生及胃粘膜损伤组织修复的报道(王韦.III型胶原对利血平诱发大鼠溃疡的治疗作用.第二军医大学学报，1993，14：472和Rattner DW，Rnteen IM，Silen W.A rapid method for culturing guinea piggastric mucous cell monolayers.In Vitro，1985；21：453)等等。III型胶原作为一种伴生胶原，通常与I型胶原共存(如在真皮中，III型胶原约占皮胶原总量的10％-15％；在许多腱组织中，III型胶原的含量较少，大约占5％，而在膝关节的韧带中，III胶原的含量稍多，大约占9％-10％。)，在组织工程支架、药品、病理学等领域有广泛应用，因此建立一套操作简便、成本低、产品纯度高的医用级III型胶原制备方法有着十分重要的意义。
由于III型胶原是伴随着I型胶原出现的，从真皮或粗制I型胶原(未分离出III型胶原的I型胶原)中分离出高纯度的III型胶原一直是人们努力的方向。现在国内外常用的分离纯化III型胶原的方法是盐析法和柱层析法。盐析法是虽然操作简单、成本低，但纯化程度也较低。DEAE-纤维素柱离子交换层析法能除去III型胶原中的非胶原蛋白和前胶原，但对于I型胶原和III型胶原的分离作用不大。高效液相离子交换柱层析法、CM-纤维素柱层析法和琼脂糖分子筛凝胶过滤柱层析法随纯化程度高，但产量低、操作复杂，因此受到的限制因素更多。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种医用级III型胶原的制备方法，其特点是该方法制备III型胶原耗时短、纯度高、理化性稳定、生物活性好满足生物医用材料、病理学研究和药品等领域的要求。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。
III型胶原的制备方法包括以下步骤：
1、新生犊牛皮的前处理
将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切，取200-300份切细的皮加入醇∶卤代烷＝0.5-1.5体积比的混合溶液2000-5000份，浸泡脱脂，每隔5-15小时更换一次上述溶液，15-45小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液2000-5000份浸泡，5-15小时更换一次，10-30小时倒掉浓度溶液；用浓度为20％的乙醇水溶液2000-5000份清洗一次；再用0.1-0.2mol/L EDTA溶液，pH＝10.5～11.5，于温度4-6℃浸泡6-12小时，然后，用超纯水2000-5000份洗涤3次；再用浓度为10-30％的NaCl水溶液2000-5000份浸泡，4-6小时更换一次，8-12小时倒掉溶液，用超纯水2000-5000份清洗2次，再将牛皮置入超纯水2000-5000份中浸泡过夜，将水倒掉。
2、胃蛋白酶酶解
在上述固体物质中，加入浓度为0.4-0.6mol/L的醋酸水溶液2000-5000份，然后加入湿牛皮∶胃蛋白酶＝2000-5000质量比的胃蛋白酶0.1-0.3份，置于温度4℃冰箱中放置5-7天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。
3、盐析
在上述清液中加入固体NaCl至浓度为15-25％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐，或者将上述清液用浓度0.01-0.02mol/L的Na2HPO4溶液2000-5000份充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度0.1-0.5mol/L的醋酸水溶液2000-5000份透析，溶解，再用去离子水透析，脱盐；
将脱盐后的物质悬浮于浓度为1.5mol/LNaCl、0.05mol/L Tris，pH＝7.5的缓冲液2000-5000份中，搅拌10-24小时，离心取固体物质，去上清液，将固体物质按上述方法重复纯化2-5次。
4、变性-复性
将上述固体物质放入浓度2-6mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.5的缓冲液500-1000份的中，溶解，在温度45-90℃水浴中加热30-60分钟，室温下，离心取上清液，用2000-5000份的室温超纯水透析2-6小时，换水1-2次，高速离心分离，取固体物质，离心机转速为12000-20000r/min，时间为45-60min，温度为4-6℃，获得医用级III型胶原，产率达到0.30-0.50％(干皮)。
按上述方法制备得到的III型胶原。
III型胶原用于组织工程支架、病理研究和药品领域。
性能测试：
III型胶原采用苦味酸天狼腥红染色的方法测试，如图1所示，结果表明III型胶原为疏松的细纤维。
III型胶原采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法测试，如图2所示，结果表明III型胶原的纯度达90％。
本发明具有如下的优点：
1、采用新生犊牛皮作为原材料，来源丰富，价格低廉，降低了生产成本。
2、制备方法科学先进、过程简易、产品回收率高。
4、严格控制制备条件，产品纯度高达90％，产率达0.30-0.50％，低抗原性。
附图说明
图1为III型胶原苦味酸天狼腥红染色图片
图2为III型胶原与I型胶原SDS-PAGE对比图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1医用级III型胶原的制备方法
1、新生犊牛皮的前处理
将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切，取200g切细的皮加入醇∶卤代烷＝0.5体积比的混合溶液2000ml，浸泡脱脂，每隔5小时更换一次上述溶液，15小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液2000ml浸泡，5小时更换一次，10小时倒掉浓度；用浓度为20％的乙醇水溶液2000ml清洗一次；再用0.1mol/L EDTA溶液，pH＝10.5～11.5，于温度4℃浸泡6小时，然后，用超纯水2000ml洗涤3次；再用浓度为10％的NaCl水溶液2000ml浸泡，4小时更换一次，8小时倒掉溶液，用超纯水2000ml清洗2次，再将牛皮置入2000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉。
2、胃蛋白酶酶解
在上述固体物质中，加入浓度为0.4mol/L的醋酸水溶液2000ml，然后加入湿牛皮∶胃蛋白酶＝2000质量比的胃蛋白酶0.1g，置于温度4℃冰箱中放置5天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。
3、盐析
在上述清液加入固体NaCl至浓度为15％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐，或者将上述清液用浓度为0.01mol/L的Na2HPO4溶液2000ml充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度为0.1mol/L的醋酸水溶液2000ml透析，溶解，再用去离子水透析，脱盐。
将脱盐后的物质悬浮于浓度为1.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris，pH＝7.5的缓冲液2000ml中，搅拌10小时，离心取固体物质，去上清液，将固体物质按上述方法重复纯化2次；
4、变性-复性
将上述固体物质放入浓度2mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.5的缓冲液500ml中，溶解，在温度45℃水浴中加热30分钟。室温下，离心取上清液，用2000ml室温超纯水透析2小时，换水1次。高速离心分离，取固体物质，离心机转速为12000r/min，时间为45min，温度为4℃，获得III型胶原，产率为0.30％。
实施例2医用级III型胶原的制备方法
1、新生犊牛皮的前处理
将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切。取300g切细的皮加入醇∶卤代烷＝1.5体积比的混合溶液5000ml，浸泡脱脂，每隔15小时更换一次上述溶液，45小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液5000ml浸泡，15小时更换一次，30小时倒掉浓度；用浓度为20％的乙醇水溶液5000ml清洗一次；再用0.2mol/L EDTA溶液，pH＝10.5～11.5，于温度6℃浸泡12小时，然后，用超纯水5000ml洗涤3次；再用浓度为30％的NaCl水溶液5000ml浸泡，6小时更换一次，12小时倒掉溶液，用超纯水5000ml清洗2次，再将牛皮置入5000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉。
2、胃蛋白酶酶解
在上述固体物质中，加入浓度为0.6mol/L的醋酸水溶液5000ml，然后加入湿牛皮∶胃蛋白酶＝5000质量比的胃蛋白酶0.3g，置于温度4℃冰箱中放置7天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。
3、盐析
在上述清液加入固体NaCl至浓度为25％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐。或者将上述清液用浓度为0.02mol/L的Na2HPOX溶液5000ml充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度为0.5mol/L的醋酸水溶液5000ml透析，溶解，再用去离子水透析，脱盐。
将脱盐后的物质悬浮于浓度为1.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris，pH＝7.5的缓冲液5000ml中，搅拌24小时，离心取固体物质，去上清液，将固体物质按上述方法重复纯化5次；
4、变性-复性
将上述固体物质放入浓度6mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.5的缓冲液1000ml中，溶解，在温度90℃水浴中加热60分钟。室温下，离心取上清液，用5000ml室温超纯水透析6小时，换水2次。高速离心分离，取固体物质，离心机转速为20000r/min，时间为60min，温度为6℃，获得III型胶原，产率为0.50％。
实施例3III型胶原的制备方法
1、新生犊牛皮的前处理
将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切。取250g切细的皮加入醇∶卤代烷＝1体积比的混合溶液3000ml，浸泡脱脂，每隔10小时更换一次上述溶液，30小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液3000ml浸泡，10小时更换一次，20小时倒掉浓度；用浓度为20％的乙醇水溶液3000ml清洗一次；再用0.15mol/L EDTA溶液，pH＝10.5～11.5，于温度4℃浸泡9小时，然后，用超纯水3000ml洗涤3次；再用浓度为20％的NaCl水溶液3000ml浸泡，5小时更换一次，10小时倒掉溶液，用超纯水3000ml清洗2次，再将牛皮置入3000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉。
2、胃蛋白酶酶解
在上述固体物质中，加入浓度为0.5mol/L的醋酸水溶液3000ml，然后加入湿午皮∶胃蛋白酶＝3000质量比的胃蛋白酶0.2g，置于温度4℃冰箱中放置6天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。
3、盐析
在上述清液中加入固体NaCl至浓度为18％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐。或者将上述清液用浓度为0.015mol/L的Na2HPO4溶液3000ml充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度为0.25mol/L的醋酸水溶液3000ml透析，溶解，再对去离子水透析，脱盐。
将脱盐后的物质悬浮于浓度为1.5mol/LNaCl、0.05mol/L Tris，pH＝7.5的缓冲液3000ml中，搅拌16小时，离心取固体物质，去上清液，将固体物质按上述方法重复纯化3次；
4、变性-复性：
将上述固体物质放入浓度为4mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH 7.5的缓冲液750ml中，溶解，在温度60℃水浴中加热45分钟。室温下，离心取上清液，用3000ml室温超纯水透析3小时，换水1次。高速离心分离，取固体物质，离心机转速为15000r/min，时间为50min，温度为5℃，获得III型胶原，产率为0.40％。
实施例4III型胶原的制备方法
1、新生犊牛皮的前处理
将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切。取280g切细的皮加入醇∶卤代烷＝1.2体积比的混合溶液4000ml，浸泡脱脂，每隔12小时更换一次上述溶液，36小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液4000ml浸泡，12小时更换一次，24小时倒掉浓度；用浓度为20％的乙醇水溶液4000ml清洗一次；再用0.18mol/L EDTA溶液，pH＝10.5～11.5，于温度4℃浸泡10小时，然后，用超纯水2000ml洗涤3次；再用浓度为25％的NaCl水溶液4000ml浸泡，5.5小时更换一次，11小时倒掉溶液，用超纯水4000ml清洗2次，再将牛皮置入4000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉。
2、胃蛋白酶酶解
在上述固体物质中，加入0.55mol/L的醋酸水溶液4000ml，然后加入湿牛皮∶胃蛋白酶＝4000质量比的胃蛋白酶0.25g，置于温度4℃冰箱中放置6天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。
3、盐析
在上述清液加入固体NaCl至浓度为22％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐。或者将上述清液用浓度为0.018mol/L的Na2HPO4溶液4000ml充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度为0.4mol/L的醋酸水溶液4000ml透析，溶解，再用去离子水透析，脱盐。
将脱盐后的物质悬浮于浓度为1.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris，pH＝7.5的缓冲液4000ml中，搅拌20小时，离心取固体物质，去上清液，将固体物质按上述方法重复纯化4次；
4、变性-复性
将上述固体物质放入浓度为5mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.5的缓冲液850ml中，溶解，在温度80℃水浴中加热50分钟。室温下，离心取上清液，用4000ml室温超纯水透析3.5小时，换水2次。高速离心分离，取固体物质，离心机转速为18000r/min，时间为55min，温度为4℃，获得III型胶原，产率为0.36％。
实施例5III型胶原的制备方法
1、新生犊牛皮的前处理
将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切。取220g切细的皮加入醇∶卤代烷＝0.8体积比的混合溶液2000ml，浸泡脱脂，每隔8小时更换一次上述溶液，24小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液2000ml浸泡，8小时更换一次，16小时倒掉浓度；用浓度为20％的乙醇水溶液2000ml清洗一次；再用0.13mol/L EDTA溶液，pH＝10.5～11.5，于温度4℃浸泡8小时，然后，用超纯水2000ml洗涤3次；再用浓度为15％的NaCl水溶液4000ml浸泡，4小时更换一次，8小时倒掉溶液，用超纯水4000ml清洗2次，再将牛皮置入4000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉。
2、胃蛋白酶酶解：
在上述固体物质中，加入浓度为0.45mol/L的醋酸水溶液3000ml，然后加入湿牛皮∶胃蛋白酶＝2500质量比的胃蛋白酶0.15g，置于温度4℃冰箱中放置5天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。
3、盐析
在上述清液加入固体NaCl至浓度为25％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐。或者将上述清液用浓度为0.013mol/L的Na2HPO4溶液3000ml充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度为0.2mol/L的醋酸水溶液3000ml透析，溶解，再对去离子水透析，脱盐。
将脱盐后的物质悬浮于浓度为1.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris，pH＝7.5的缓冲液3000ml中，搅拌12小时，离心取固体物质，去上清液，将固体物质按上述方法重复纯化3次；
4、变性-复性：
将上述固体物质放入浓度为3mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.5的缓冲液700ml中，溶解，在温度50℃水浴中加热40分钟。室温下，离心取上清液，用3000ml室温超纯水透析3.5小时，换水1次。高速离心分离，取固体物质，离心机转速为15000r/min，时间为50min，温度为6℃，获得III型胶原，产率为0.44％。
Claims (1)
1.一种医用级III型胶原的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)、新生犊牛皮的前处理
将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切，取300g切细的皮加入醇∶卤代烷＝1.5体积比的混合溶液5000ml，浸泡脱脂，每隔15小时更换一次上述溶液，45小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液5000ml浸泡，15小时更换一次，30小时倒掉溶液；用浓度为20％的乙醇水溶液5000ml清洗一次；再用0.2mol/L EDTA溶液，pH＝10.5～11.5，于温度6℃浸泡12小时，然后，用超纯水5000ml洗涤3次；再用浓度为30％的NaCl水溶液5000ml浸泡，6小时更换一次，12小时倒掉溶液，用超纯水5000ml清洗2次，再将牛皮置入5000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉；
(2)、胃蛋白酶酶解
在上述固体物质中，加入浓度为0.6mol/L的醋酸水溶液5000ml，然后加入胃蛋白酶0.3g，置于温度4℃冰箱中放置7天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液至pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液至pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣；
(3)、盐析
在上述清液中加入固体NaCl至浓度为25％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐，或者将上述清液用浓度为0.02mol/L的Na2HPO4溶液5000ml充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度为0.5mol/L的醋酸水溶液5000ml透析，溶解，再用去离子水透析，脱盐；
将脱盐后的物质悬浮于浓度为1.5mol/L NaCl、0.05mol/L Tris，pH＝7.5的缓冲液5000ml中，搅拌24小时，离心取固体物质，去上清液，将固体物质按上述方法重复纯化5次；
(4)、变性-复性
将上述固体物质放入浓度6mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.5的缓冲液1000ml中，溶解，在温度90℃水浴中加热60分钟，室温下，离心取上清液，用5000ml室温超纯水透析6小时，换水2次，高速离心分离，取固体物质，离心机转速为20000r/min，时间为60min，温度为6℃，获得III型胶原，产率为0.50％。
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