CN101914170A - 一种利用羊小肠生产肝素钠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从羊小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法，特别公开了一种利用羊小肠生产肝素钠的制备方法。该利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：包括如下步骤：肠粘膜的制备、酶解、吸附、洗脱、沉淀脱盐和脱水干燥即得肝素钠。因此本发明的有益效果是：收率高，肝素钠活性损失小，质量稳定，特别是采用车间废气净化处理装置，解决了肝素钠车间气味恶臭的问题；利用旧工艺生产1亿个单位的肝素钠，需要10000～12000根羊小肠粘膜，而利用本发明的制备方法生产1亿个单位的肝素钠，只需要6000～8000根羊小肠粘膜，且肝素钠效价和活性都有大幅度提高，从而使生产成本大大降低，利润可提高40％以上。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种从羊小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法，特别涉及一种利用羊小肠生产肝素钠的制备方法。
(二)背景技术
肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药，是从猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质，天然存在于肥大细胞中，具有降血脂的作用，被广泛用于治疗动、静脉血栓和肺栓塞、缺血性脑卒中、不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞等。目前，肝素钠主要是从猪、羊小肠粘膜和牛肺、腌肠衣盐水中提取。肝素钠为天然抗凝血物质，是我国主要的出口药物之一.随着研究的深入，人们发现肝素钠不但有抗凝、抗血栓形成和调节血脂的作用，还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等功能。中国是一个畜牧大国，每年羊小肠的供应量非常巨大，但由于羊小肠粘膜中肥大细胞的数量比猪小肠粘膜中的数量少很多，生产1亿个单位的肝素钠往往需要10000-12000根羊小肠粘膜，且制备出的肝素钠产率低，活性也不够稳定，实际操作过程相对严格且工序复杂，达不到工业化生产的要求，以至于对于羊小肠粘膜的利用长期不合理，而且在生产过程中会产生大量的废水污染环境。
(三)发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种收率高、肝素钠活性损失小的利用羊小肠生产肝素钠的制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：包括如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：在羊小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池；
(2)酶解：用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为1∶1.7-1.9，搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3％-5％的肠衣专用盐，测其盐度达到2％-2.5％，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温30-40分钟后，用80目尼龙布过滤，收集过滤液；
(3)吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，搅拌7-9小时，继续冷却到40℃-45℃，放出废液，收集过滤树脂；
(4)洗脱：
①：将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中，加入质量分数为4.5％-5％的盐水，温度保持在55℃-58℃，搅拌30-40分钟后将废液倒掉，加入质量分数为22％-25％的盐水，温度保持在55℃-58℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
②：重复①的步骤，将两次收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
①：将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％-85％的乙醇，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
②：重复①的步骤，将两次收集的沉淀物合并待用；
(6)脱水干燥：将上述沉淀物滤干脱水，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
步骤(2)酶解中2709碱性蛋白酶的添加量按每根羊小肠加入1克2709碱性蛋白酶的比例添加；步骤(3)吸附中树脂的添加量按每根羊小肠加入2-3克树脂的比例添加；步骤(4)洗脱中，树脂与加入的质量分数为4.5％-5％盐水的重量比为1∶1.1-1.3，树脂与加入的质量分数为22％-25％盐水的重量比为1∶1.1-1.3；步骤(5)沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇，洗脱液与乙醇的体积比为1∶1.8-2.2；步骤(6)脱水干燥中烘箱的温度为85℃-95℃，干燥时间为6-8小时。
上述步骤(3)吸附中，所加树脂为德国朗盛树脂；步骤(4)洗脱中，盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。
为了使粘膜刮制容易，常习惯将小肠浸泡24-48小时，这样能保护肠衣免受破损，但长时间浸泡会发酵产生肝素酶，分解肝素钠，此外发酵还会产生一些有害物质，使树脂中毒，因此在浸泡时间上一定要准确把握，夏季适当缩短时间，冬季可适当延长时间，在弱碱性或质量分数为4％的盐水条件下，能减缓微生物的发酵和抑制肝素酶活性，可以放于低温处作短期贮存。
乙醇沉淀时，必须在搅拌的同时逐渐加入乙醇，以避免局部乙醇浓度突然增高，而且乙醇要用预冷过的，否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏，从而降低其活性。
酶解、吸附肝素钠过程中的废液(煮锅废水)，气味恶臭，致使生产车间空气质量不好，使人难以忍受，甚至影响工作人员的身心健康，为此本发明采用车间废气净化处理装置，大大减少了空气中的恶臭气味，极大改善了工作环境。
因此本发明的有益效果是：收率高，肝素钠活性损失小，质量稳定，特别是采用车间废气净化处理装置，解决了肝素钠车间气味恶臭的问题；利用旧工艺生产1亿个单位的肝素钠，需要10000～12000根羊小肠粘膜，而利用本发明的制备方法生产1亿个单位的肝素钠，只需要6000～8000根羊小肠粘膜，且肝素钠效价和活性都有大幅度提高，从而使生产成本大大降低，利润可提高40％以上。
(四)具体实施方式
实施例1：
利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：
①取200根羊小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净，打把冷冻储存；
②将羊小肠常温自然解冻，肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；
③刮制过程中的肠头、碎肠皮应绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜120公斤；
(2)酶解：
①打开粘膜泵，将120公斤粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将216公斤水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为55r/min，搅拌均匀，再加入200克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为8.5；
②打开蒸汽阀门使温度达到58℃，加入13公斤肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.3％，保温2.5小时；
③恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到83℃，停止加温，保温35分钟；
④保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
⑤肠渣粉碎后再进行二次酶解；
(3)吸附：
①将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为55r/min，使罐中的温度自然降到59℃，保持溶液的PH值为7.5，盐度2.3％；
②将500克树脂加入吸附罐中，搅拌8小时；
③自然冷却温度到43℃，放出废液，用尼龙丝袋收集过滤树脂；
(4)洗脱：
①将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；
②将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为4.8％的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在57℃，开启搅拌机转速为35r/min，搅拌35分钟；
③随后将废液倒掉，加入质量分数为24％的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在57℃，搅拌3.5小时后，收集洗脱液；
④重复③的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
①将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为83％的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到43％，调PH值至7.5，搅匀密封沉淀24小时；
②虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
③重复上述步骤一次，将两次收集沉淀物合并待用；
(6)脱水干燥：
①将收集的沉淀物滤干脱水；
②将脱水后的沉淀物移入烘箱在90℃下用蒸汽干燥7小时，即得肝素钠。
实施例2：
利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：
①取100根羊小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净，打把冷冻储存；
②将羊小肠常温自然解冻，肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；
③刮制过程中的肠头、碎肠皮应绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜70公斤；
(2)酶解：
①打开粘膜泵，将70公斤粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将119公斤水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为50r/min，搅拌均匀，再加入100克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为8；
②打开蒸汽阀门使温度达到55℃，加入6公斤肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2％，保温2小时；
③恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到80℃，停止加温，保温40分钟；
④保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
⑤肠渣粉碎后再进行二次酶解；
(3)吸附：
①将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为50r/min，使罐中的温度自然降到58℃，保持溶液的PH值为7，盐度2％；
②将200克树脂加入吸附罐中，搅拌7小时；
③自然冷却温度到40℃，放出废液，用尼龙丝袋收集过滤树脂；
(4)洗脱：
①将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；
②将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为4.5％的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在55℃，开启搅拌机转速为30r/min，搅拌40分钟；
③随后将废液倒掉，加入质量分数为22％的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在55℃，搅拌3小时后，收集洗脱液；
④重复③的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
①将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的2.2倍，使乙醇浓度降到40％，调PH值至7，搅匀密封沉淀23小时；
②虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
③重复上述步骤一次，将两次收集沉淀物合并待用；
(6)脱水干燥：
①将收集的沉淀物滤干脱水；
②将脱水后的沉淀物移入烘箱在85℃下用蒸汽干燥8小时，即得肝素钠。
实施例3：
利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：
①取300根羊小肠灌水洗涤，除去残留粪便，清洗干净，打把冷冻储存；
②将羊小肠常温自然解冻，肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜，操作用力均匀，粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池；
③刮制过程中的肠头、碎肠皮应绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜150公斤；
(2)酶解：
①打开粘膜泵，将150公斤粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将285公斤水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为60r/min，搅拌均匀，再加入300克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中，调节PH值为9；
②打开蒸汽阀门使温度达到60℃，加入22公斤肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2.5％，保温3小时；
③恒温结束后，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到85℃，停止加温，保温30分钟；
④保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附；
⑤肠渣粉碎后再进行二次酶解；
(3)吸附：
①将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为60r/min，使罐中的温度自然降到60℃，保持溶液的PH值为8，盐度2.5％；
②将900克树脂加入吸附罐中，搅拌9小时；
③自然冷却温度到45℃，放出废液，用尼龙丝袋收集过滤树脂；
(4)洗脱：
①将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；
②将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为5％的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在58℃，开启搅拌机转速为40r/min，搅拌30分钟；
③随后将废液倒掉，加入质量分数为25％的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在58℃，搅拌4小时后，收集洗脱液；
④重复③的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
①将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为85％的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的1.8倍，使乙醇浓度降到45％，调PH值至8，搅匀密封沉淀25小时；
②虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
③重复上述步骤一次，将两次收集沉淀物合并待用；
(6)脱水干燥：
①将收集的沉淀物滤干脱水；
②将脱水后的沉淀物移入烘箱在95℃下用蒸汽干燥6小时，即得肝素钠。
上述步骤(3)吸附中，所加树脂为德国朗盛树脂；步骤(4)洗脱中，盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。
Claims (7)
1.一种利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：包括如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：在羊小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池；
(2)酶解：用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为1∶1.7-1.9，搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3％-5％的肠衣专用盐，测其盐度达到2％-2.5％，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温30-40分钟后，用80目尼龙布过滤，收集过滤液；
(3)吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，搅拌7-9小时，继续冷却到40℃-45℃，放出废液，收集过滤树脂；
(4)洗脱：
①：将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中，加入质量分数为4.5％-5％的盐水，温度保持在55℃-58℃，搅拌30-40分钟后将废液倒掉，加入质量分数为22％-25％的盐水，温度保持在55℃-58℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
②：重复①的步骤，将两次收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
①：将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％-85％的乙醇，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
②：重复①的步骤，将两次收集的沉淀物合并待用；
(6)脱水干燥：将上述沉淀物滤干脱水，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
2.根据权利要求1所述的利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤(2)酶解中2709碱性蛋白酶的添加量按每根羊小肠加入1克2709碱性蛋白酶的比例添加。
3.根据权利要求1所述的利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤(3)吸附中树脂的添加量按每根羊小肠加入2-3克树脂的比例添加。
4.根据权利要求1所述的利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤(4)洗脱中，树脂与加入的质量分数为4.5％-5％盐水的重量比为1∶1.1-1.3，树脂与加入的质量分数为22％-25％盐水的重量比为1∶1.1-1.3。
5.根据权利要求1所述的利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤(5)沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。
6.根据权利要求5所述的利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤(5)沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为1∶1.8-2.2。
7.根据权利要求1所述的利用羊小肠生产肝素钠的制备方法，其特征是：步骤(6)脱水干燥中烘箱的温度为85℃-95℃，干燥时间为6-8小时。
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