TWI796957B - 一種提取肝素的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明為一種提取肝素的方法,將成本較低且來源充足的豬腸、豬肺、肉雞內臟等動物組織作為肝素原料,並與水均質,以強鹼調整均質液並利用蛋白酶將蛋白質去除,以氯化鈉提供鈉離子形成肝素鈉鹽溶液,再透過離子交換樹脂吸附及脫附肝素鈉鹽,提取出粗肝素;在粗肝素提取完畢後,以氯化鈉溶液進行溶解,並利用過錳酸鉀氧化,及硫酸鈉執行反滴定,確保過錳酸鉀完全反應,避免殘留,並接續第二次氧化與離心,取得精緻肝素;據此,本發明不僅可利用提取肝素,更透過離子交換樹脂、反滴定等方法,有效降低肝素提取的成本,及達到肝素品質的提升。
Description
本發明涉及一種提取肝素的方法,尤指為一種改良習知的酸鹼法,可利用豬腸、豬肺、以及肉雞內臟作為原料以提取肝素提取方法。
肝素是一種帶高度負電荷的硫酸化多醣,存在於生物體的肥大細胞中,特別是在心臟,肝臟和腸道組織中,雖然肝素在生物體中的功能尚不清楚,但肝素具有良好的抗凝作用,用於預防血管血栓形成,是臨床實踐中常用的抗凝劑之一,而現今一般肝素的提取來源是豬或牛,其相關的專利如下:(1)專利公告號TW176145,豬肺臟中肝素之分離與純化;(2)專利公告號TW438812B,純化肝素份其製法及醫藥組合物;(3)專利公開號CN107022039A,以豬小腸為原料製備肝素鈉的新方法;雖技術已發展成熟,但在現今使用的肝素提取製程上,經常面臨品質不佳、雜質過多,從而導致了製程步驟繁瑣耗時,且在生產醫用肝素時,仍需耗費大量成本進行萃取;據此,如何改良現今提取肝素的量產製程,使製程更加簡化,亦可有效減少雜質過濾步驟,及避免過度依賴昂貴內臟作為製造肝素的單一原料來源,此乃待解決的問題。
有鑒於上述的問題,本發明人係依據多年來的研究經驗,針對提取肝素的方法進行改進;緣此,本發明之主要目的在於改良現今肝素的提取製程,適合以相較習知充足且便宜之內臟作為肝素原料,且達到有效減少肝素雜質之提取肝素的方法。
為達上述的目的,請參閱圖1,為本發明之提取肝素的方法流程圖,本發明係包含有粗肝素提取方法S1及肝素精煉方法S2,首先經過粗肝素提取方法S1由豬腸豬肺、及肉雞內臟等動物組織中提取出粗肝素,再經由肝素精煉方法S2進一步氧化得到接近商業臨床使用、具有雜質少、純度高等特點之精緻肝素,以此作為後續生產商業臨床肝素的原料;其中,粗肝素提取方法S1中係先將動物組織均質後以蛋白酶分解,再經過離子交換樹脂提取出肝素後以氯化鈉析出得到粗肝素;而肝素精煉方法S2則是取粗肝素進一步以過錳酸鉀進行氧化,並透過硫酸納反滴定確保無氧化劑殘留後進行離心分離,得到精緻肝素。
為使 貴審查委員得以清楚了解本發明之目的、技術特徵及其實施後之功效,茲以下列說明搭配圖示進行說明,敬請參閱。
請參閱圖1,本發明之一種提取肝素的方法,可拆分為兩步驟,先由動物組織提取出粗肝素的粗肝素提取步驟S1,及由粗肝素精煉出精緻肝素的肝素精煉步驟S2;以下係先對粗肝素提取步驟S1作詳細說明,請參閱圖2,為本發明之粗肝素提取方法流程圖(一):
(1)均質步驟S11:首先,取一動物組織與一去離子水,以每1公斤動物組織搭配15~20公升之去離子水之比例進行混合並進行均質,以形成一均質液;其中,前述動物組織可為豬肺、豬腸及肉雞內臟之其中一種或其組合;較佳的,可先將豬肺、豬腸及肉雞內臟先清洗並經過絞碎,製成絞肉形式,再與去離子水進行混合均質;
(2)鹼處理步驟S12:取完成均質步驟S11的均質液,再加入重量莫爾濃度1~3N的氫氧化鈉(NaOH)溶液,將均質液溶液pH值調整至8~10之間;
(3)酶分解步驟S13:取完成鹼處理步驟S12中的均質液,加入一胰蛋白酶(trypsin,CAS number:9002-07-7)以35
oC~60
oC攪拌30-120分鐘,將均質液中動物組織的蛋白進行分解並去除;較佳的,胰蛋白酶添加量為每1公斤的均質液搭配1~2毫升的胰蛋白酶;
(4)鹽析步驟S14:取完成酶分解步驟S13的均質液,加入均質液總重量3%~5%,或5%~10%的氯化鈉(NaCl),並以40
oC~60
oC攪拌至少120分鐘將氯化鈉完全溶解,氯化鈉係與均質液中的肝素形成肝素鈉鹽(Heparin sodium),再以30~100um孔隙之一過濾材料進行過濾,得到一濾液;較佳的,以48um孔隙之濾布作為過濾材料進行過濾;
(5)離子吸附步驟S15:取鹽析步驟S14的濾液加入一離子交換樹脂在40
oC~60
oC攪拌3~5小時後,過濾濾液留下離子交換樹脂,其中,離子交換樹脂添加量為動物組織重量的5%~15%;較佳的,此離子交換樹脂可例如為杜邦公司(E. I. du Pont de Nemours and Company,DuPont)生產的Amberlite FPA98 Cl離子交換樹脂,並且添加量為動物組織重量的8%~10%;
(6)離子脫附步驟S16:將完成離子吸附步驟S15的離子交換樹脂泡入體積莫爾濃度5M的氯化鈉(NaCl),在55~60
oC下攪拌3小時後過濾去除離子交換樹脂,此時,濾液即為肝素鹽水溶液;較佳的,可在完成離子吸附步驟S15後,先加入體積莫爾濃度1~2M的氯化鈉(NaCl)溶液靜置半小時以上,去除雜質並過濾,以此減少雜質沾附於樹脂;
(7)調酸步驟S17:取完成離子脫附步驟S16的肝素鹽水溶液加入重量莫爾濃度1~3N的氯化氫(HCl)溶液,至濾液pH值呈3~5之間,並在靜置0.5~1小時後進行過濾;
(8)調鹼步驟S18:取完成調酸步驟S17的濾液加入氫氧化鈉(NaOH)至濾液pH值呈8~10之間;
(9)乾燥步驟S19:取完成調鹼步驟S18的濾液,加入濾液體積1.5~2倍的95%乙醇(EtOH)進行混合,並在混合完畢後在室溫下沉降至少12小時,取沉降的一沉澱物烘乾得到一粗肝素。
請參閱圖3,為本發明之肝素精煉方法流程圖(二),在完成粗肝素提取步驟S1後,可接續進行肝素精煉步驟S2,以下係針對粗肝素提取步驟S2作詳細說明:
(1)粗肝素溶解步驟S21:將所取得的粗肝素以其重量百分濃度2%~5%的氯化鈉 (NaCl) 溶液溶解,形成一粗肝素溶液,並以氫氧化鈉(NaOH)調整粗肝素溶液至pH值為8~10;
(2)第一次氧化步驟S22:取完成粗肝素溶解步驟S21的粗肝素溶液,加入體積莫爾濃度0.05~0.5M的過錳酸鉀(KMnO₄)溶液並持續攪拌直至粗肝素溶液恆呈紫紅色,以進行氧化;
(3)反滴定步驟S23:取完成第一次氧化步驟S22的粗肝素溶液,加入硫酸鈉(Na
2SO₄)至粗肝素溶液紫紅色消失後,加入氫氧化鈉(NaOH)並溶解,直至pH值為8~11,並進行過濾,得到一脫色濾液,此反滴定步驟係藉由硫酸鈉,將粗肝素溶液中經氧化還原反應仍未反應消耗掉的過錳酸鉀進行中和,如此可確保後續步驟產物中,不會殘留有強氧化劑過錳酸鉀,而導致了肝素品質不良的問題,此外,在進行第一次氧化步驟S22時,亦因有此反滴定步驟S23,可對過錳酸鉀在加入過量時具有相對應的確保及因應步驟,本發明可在生產時更具效率,及生產出更佳及品質穩定的肝素;
(4)第二次氧化步驟S24:取完成脫色步驟S23的脫色濾液,加入重量百分濃度為3%-5%的過氧化氫(H
2O
2)溶液,控制溫度維持在20~30
oC,並利用37%濃鹽酸(HCl)將濾液調整至pH值為5.8-6.5;第二次氧化步驟S24可進一步將第一次氧化步驟S22可能未氧化反應完全的粗肝素溶液以過氧化氫進行氧化,保證粗肝素溶液可被提取完全;
(5)離心步驟S25:取完成反滴定步驟S23的濾液,或完成第二次氧化步驟S24的濾液,並加入濾液體積0.5~2倍、濃度為95%的乙醇後混合均勻並進行離心,離心條件為8000rpm ~10000rpm、10~20分鐘,去除離心完成後之液體部份,取離心沉澱物即為精緻肝素;可選的,離心沉澱物可再經過無水乙醇及無水丙酮之其中一種或其組合沖提,並經由遠紅外線50-60
oC真空烘乾進行脫水。
本發明之一種提取肝素的方法,以下實施例一及實施例二作為示例:
實施例一:取1公斤肉雞內臟,並加入15公升去離子水,均勻攪拌10分鐘達到均質,再加入3N的氫氧化鈉15毫升使pH值達到8.5,並恆溫在溫度55
oC下攪拌30分鐘;攪拌完成後接續加入20毫升胰蛋白酶在55
oC下攪拌120分鐘;再加入850g氯化鈉維持60
oC攪拌120分鐘後以48um濾布過濾;取過濾完畢之濾液加入80克的離子交換樹脂在40
oC下攪拌3小時後過濾移除濾液,取離子交換樹脂加入200毫升的1.2M氯化鈉溶液,並於室溫下靜置半小時再進行過濾;取過濾後之樹脂再加入200毫升的5M氯化鈉溶液攪拌3小時進行肝素脫附,得到肝素鹽水溶液;將肝素鹽水溶液加入10~20毫升的3N的氯化氫溶液使溶液pH值呈3.5並靜置30分鐘;靜置完成後加入10~20毫升的3N的氫氧化鈉溶液使溶液pH值呈10,並加入400毫升的95%乙醇,在經過均勻攪拌及靜置12小時後,取沉降的沉澱物烘乾得到粗肝素。
實施例二:將所得粗肝素用2%的氯化鈉溶液完全溶解,製成粗肝素濃度大約為8%的粗肝素溶液,將上述粗肝素溶液用5M氫氧化鈉溶液調製pH值至8,升溫至70~80
oC,加入0.15~0.2M的過錳酸鉀至溶液為紫紅色,再加入硫酸鈉至紫紅色消失並進行過濾;取濾液,以氫氧化鈉將pH值調至10~11,可選的,在25-27
oC下充分攪拌後加入4%之過氧化氫,攪拌16-24小時,並以除菌過濾器進行過濾;取濾液用37%濃鹽酸調整pH值至6後,再加入總溶液0.9倍的95%乙醇進行沉澱;收集沉澱物,分別經過無水乙醇及無水丙酮進行沖提,並經由遠紅外線50-60
oC真空烘乾進行脫水,得到精緻肝素。
請參閱圖4及圖5,其中,圖4為商業臨床之肝素NMR標準圖譜,係根據文獻Control of the heparosan N-deacetylation leads to an improved bioengineered heparin(數位物件識別碼DOI : 10.1007/s00253-011-3231-5),圖5則為利用本發明方法製成之肝素NMR圖譜,經由圖4及圖5比對可知,透過本發明製成之肝素,其已相當接近商業臨床使用之肝素,具有雜質少、純度高等特點,作為肝素原料,可大大降低後端純化處理之工序及提升最終產品品質。
由上所述可知,本發明之提取肝素的方法,其據以實施後,確實可以提供一種改良現今肝素的提取製程,適合以相較習知充足且便宜之內臟作為肝素原料,且達到有效減少肝素雜質之目的。
唯,以上所述者,僅為本發明之較佳之實施例而已,並非用以限定本發明實施之範圍;任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神與範圍下所作之均等變化與修飾,皆應涵蓋於本發明之專利範圍內。
綜上所述,本發明係具有「產業利用性」、「新穎性」與「進步性」等專利要件;申請人爰依專利法之規定,向 鈞局提起發明專利之申請。
S1:粗肝素提取步驟
S11:均質步驟
S12:鹼處理步驟
S13:酶分解步驟
S14:鹽析步驟
S15:離子吸附步驟
S16:離子脫附步驟
S17:調酸步驟
S18:調鹼步驟
S19:乾燥步驟
S2:肝素精煉步驟
S21:粗肝素溶解步驟
S22:第一次氧化步驟
S23:反滴定步驟
S24:第二次氧化步驟
S25:離心步驟
圖1,為本發明之提取肝素的方法流程圖。
圖2,為本發明之粗肝素提取方法流程圖(一)。
圖3,為本發明之肝素精煉方法流程圖(二)。
圖4,為商業臨床之肝素NMR標準圖譜。
圖5,為利用本發明方法製成之肝素NMR圖譜。
S1:粗肝素提取步驟
S2:肝素精煉步驟
Claims (10)
- 一種提取肝素的方法,包含: 一均質步驟:取一動物組織與一去離子水,以每1公斤該動物組織搭配15~20公升的該去離子水之比例進行混合並均質,以形成一均質液; 一鹼處理步驟:取完成該均質步驟的該均質液,再加入重量莫爾濃度1~3N的氫氧化鈉溶液,將該均質液溶液pH值調整至8~10之間; 一酶分解步驟:取完成該鹼處理步驟中的該均質液,加入一胰蛋白酶以35 oC~60 oC攪拌均勻,使該均質液中的該動物組織進行分解; 一鹽析步驟:取完成該酶分解步驟的該均質液,加入該均質液總重量3%~5%,或5%~10%的氯化鈉,並以40 oC~60 oC攪拌至氯化鈉完全溶解,形成一肝素鈉溶液,再以一過濾材料過濾,得到一濾液; 一離子吸附步驟:取該鹽析步驟的該濾液加入一離子交換樹脂在40 oC~60 oC下攪拌,並過濾該濾液留下該離子交換樹脂,其中,該離子交換樹脂添加量為該動物組織重量的5%~15%; 一離子脫附步驟:將完成該離子吸附步驟的該離子交換樹脂泡入體積莫爾濃度5M的氯化鈉,在55 oC~60 oC下攪拌,並過濾去除該離子交換樹脂,此時,濾液為一肝素鹽水溶液; 一調酸步驟:取完成該離子脫附步驟的該肝素鹽水溶液加入重量莫爾濃度1~3N的氯化氫溶液,至該肝素鹽水溶液pH值呈3~5之間,並在靜置後進行過濾; 一調鹼步驟:取完成該調酸步驟的該肝素鹽水溶液加入氫氧化鈉至該肝素鹽水溶液pH值呈8~10之間;以及 一乾燥步驟:取完成該調鹼步驟的該肝素鹽水溶液,加入濾液體積1.5~2倍的95%乙醇進行混合,並在混合完畢後在室溫下沉降,取沉降的一沉澱物烘乾得到一粗肝素。
- 如請求項1所述之提取肝素的方法,在乾燥步驟後包含: 一粗肝素溶解步驟:將該粗肝素以其重量百分濃度2%~5%的氯化鈉溶液溶解,形成一粗肝素溶液,並以氫氧化鈉調整該粗肝素溶液至pH值為8~10; 一第一次氧化步驟:取完成該粗肝素溶解步驟的該粗肝素溶液,加入體積莫爾濃度0.05M~0.5M的一過錳酸鉀溶液並持續攪拌直至該粗肝素溶液恆呈紫紅色; 一反滴定步驟:取完成該第一次氧化步驟的該粗肝素溶液,加入一硫酸鈉至該粗肝素溶液紫紅色消失後,加入氫氧化鈉並溶解,直至pH值為8~11,再進行過濾,得到一脫色濾液;以及 一離心步驟:取完成該反滴定步驟的該脫色濾液,並加入該脫色濾液體積的0.5~2倍、濃度為95%的乙醇後混合均勻並進行離心,去除離心完成後之液體部份,取離心沉澱物即為精緻肝素。
- 如請求項2所述之提取肝素的方法,其中,在該離心步驟前更包含有一第二次氧化步驟:取該完成脫色步驟的該脫色濾液,加入重量百分濃度為3%-5%的過氧化氫溶液,維持在20~30 oC並利用37%氯化氫將該脫色濾液調整至pH值為5.8-6.5;且該離心步驟取完成該第二次氧化步驟的該脫色濾液,並加入該脫色濾液體積的1~2倍、濃度為95%的乙醇後混合均勻並進行離心。
- 如請求項2所述之提取肝素的方法,其中,在該離心步驟中包含取該離心沉澱物,經過無水乙醇及無水丙酮之其中一種或其組合進行沖提,並經由遠紅外線50-60 oC真空烘乾進行脫水,得到精緻肝素。
- 如請求項1所述之提取肝素的方法,其中,該動物組織為豬肺、豬腸及肉雞內臟之其中一種或其組合。
- 如請求項1所述之提取肝素的方法,其中,先將該動物組織經過絞碎,製成絞肉形式,再與該去離子水進行混合均質。
- 如請求項1所述之提取肝素的方法,其中,該胰蛋白酶添加量為每1公斤的完成該鹼處理步驟中的該均質液,搭配1~2毫升的該胰蛋白酶。
- 如請求項1所述之提取肝素的方法,其中,該過濾材料為48um孔隙之濾布。
- 如請求項1所述之提取肝素的方法,其中,該離子交換樹脂為杜邦公司的Amberlite FPA98 Cl樹脂,並且添加量為該動物組織重量的8%~10%。
- 如請求項1所述之提取肝素的方法,其中,在完成該離子吸附步驟後,先加入體積莫爾濃度1~2M的氯化鈉溶液靜置半小時以上,去除雜質並過濾。
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