CN117363679A - 一种河豚鱼精巢蛋白肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种河豚精巢肽，是将河豚的精巢匀浆后加入脱脂浸提液进行脱脂，脱脂后的蛋白溶解后加入蛋白酶进行酶解制备的，其一种具体的肽段的氨基酸序列为GHPGTDL和AVGKEVA。本发明所提供的河豚精巢肽可用于制备抗疲劳或抗氧化的制品。本发明制得的河豚精巢肽可以增加肝糖原的储备量，减少血乳酸和血清尿素氮的产生量，具有抗疲劳和抗氧化功效。
Description
技术领域
本发明属于功能性多肽制备技术领域，具体涉及一种河豚鱼精巢蛋白肽及其应用。
背景技术
疲劳是现代社会一种常见的亚健康状态，长期处于疲劳状态，会使机体发生内分泌紊乱，抵抗力和免疫力逐渐下降，引起早衰，甚至会引发一些潜在的慢性疾病急性发作，出现器质性病变。因此，如何缓解疲劳，改善人体亚健康状态受到人们越来越多的重视，研究开发具有抗疲劳功能的食品或营养品具有很好的市场前景。
研究发现牡蛎肉提取物可以提高小鼠的抗疲劳能力和耐缺氧能力，增强小鼠的免疫力；青石斑鱼肉多肽能降低小鼠血清尿素氮的含量，提高小鼠肝糖原含量，具有较好的抗疲劳作用。而鲑鱼蛋白能显著延长小鼠力竭游泳时间，降低血清尿素氮含量，具有明显的抗疲劳作用。
河鲀是一种高蛋白、低脂肪的鱼类，其精巢具有养精固气、滋阴补阳的功效，在日本民间有用河鲀精巢泡酒饮用的风俗。但已有的研究更多的是开发河豚为对象的食品，对河豚的深加工报道很少。
发明内容
本发明提供了一种河豚精巢肽，及其在制备抗疲劳的功能性食品中的应用。
本发明首先提供了一种河豚鱼精巢蛋白肽，是将河豚的精巢匀浆后加入脱脂浸提液进行脱脂，脱脂后的蛋白溶解后加入蛋白酶进行酶解制备的，
所述的脱脂浸提液，其一种脱脂浸提液是体积比为1:1:4的乙醚-异丙醇-蒸馏水溶液；
所述的酶解，是使用木瓜蛋白酶，在pH值为7.0，温度55℃的条件下进行酶解；
在pH值为7.0，温度55℃的溶液环境中，添加3％木瓜蛋白酶、酶解时间为8h所制备的小分子蛋白肽的效果最佳。
所述的河豚精巢肽，其一种具体的肽段的氨基酸序列为GHPGTDL(SEQ ID NO:1)和AVGKEVA(SEQ ID NO:2)。
本发明所提供的河豚精巢肽可用于制备抗疲劳或抗氧化的制品。
本发明制得的河豚精巢肽可以增加肝糖原的储备量，减少血乳酸和血清尿素氮的产生量，具有抗疲劳和抗氧化功效。
附图说明
图1为单因素对鱼精巢蛋白水解度的影响图，
图2为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠负重游泳时间的影响图，
图3为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清乳酸含量的影响图，
图4为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清尿素氮的影响图，
图5为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠肝糖原含量的影响图。
图6为河豚鱼精巢蛋白肽的中具有最好抗疲劳效果的组分的RP-HPLC分离洗脱图。
具体实施方式
本发明提取了河豚精巢蛋白肽，并通过小鼠实验测定小鼠的负重游泳时间和血清尿素氮、血清乳酸、肝糖原含量的变化，并研究其抗疲劳功效。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：制备河豚鱼精巢蛋白肽
1.1河豚精巢蛋白肽的提取
将河豚精巢置于高速组织捣碎机中捣碎，用体积比为1∶1∶4的乙醚-异丙醇-蒸馏水脱脂浸提液在恒温摇床中脱脂3h，重复脱脂1次，离心弃上清液。
沉淀加水匀浆，加入蛋白酶进行酶解。酶解结束后用沸水浴灭酶10min，冷却后5000r/min低温离心15min，取上清液冷冻干燥。
1.2最佳提取条件的筛选
选用木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶对河豚精巢鱼白进行酶解，并对所筛选的蛋白酶的酶解实验的加酶量、液料比、酶解时间、pH值、酶解温度值等条件进行单因素实验。
(a)选酶：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，对应调至木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶最适pH值，分别加入24000U/g加酶量的木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶。30℃恒温提取2h。每组3个平行。
(b)加酶量：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，分别加入1.5％，2％，3％，4％，6％，8％的木瓜蛋白酶。30℃恒温提取2h。每组3个平行。
(c)液料比：原料分别按液料比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，加入3％的木瓜蛋白酶。30℃恒温酶解2h。每组3个平行。
(d)酶解时间：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，加入3％的木瓜蛋白酶。30℃恒温提取，提取时间分别为2，4，6，8，10h。每组3个平行。
(e)pH值：原料按液料比20加入蒸馏水，调pH分别为4、5、6、7、8，加入3％的木瓜蛋白酶。35℃恒温酶解2h。每组3个平行。
(f)酶解温度：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，加入3％的木瓜蛋白酶。在30、40、50、55、60、70℃下分别恒温酶解2h。每组3个平行。
由图1-A可看出，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶均能够使河豚精巢蛋白中的蛋白肽键断裂，其中木瓜蛋白酶的水解程度最佳，可以获得更多小分子质量鱼精巢蛋白肽，远优于胃蛋白酶。可能是河豚精巢蛋白中主要成分为精氨酸、赖氨酸和组氨酸，而木瓜蛋白酶相对另外2种酶与这3种氨基酸具有较好的结合能力。采用木瓜蛋白酶试验加酶量、液料比、酶解时间、pH值、酶解温度等工艺条件对水解度的影响如图1-B～图1-F所示。
木瓜蛋白酶添加量对蛋白的水解度影响显著，在未达到3％添加量时，底物充足，少量添加酶都可以迅速提高水解进程，但达到3％后底物的酶解达到饱和，酶的继续增多只会引起水解度在一定范围内上下波动，此外基于经济考虑，酶添加量3％最合适。图1-C证实酶解的液料比具有峰形规律，河豚精巢蛋白溶液过浓过稀都不利于酶解反应的进行。过浓使得溶液黏性大，阻碍了酶与底物的传质过程；过稀又使得酶与底物结合的效率降低，因此在液料比30∶1时，水解度达到峰值，条件最佳。图1-D证实，酶解时间适当延长可使酶解更充分，但达到8h后，由于蛋白水解达到饱和平衡，继续酶解作用不大，因此最佳酶解时间为8h。酶解过程溶液的pH值和温度同样对酶解过程有影响，且均是在较低区域产生较大影响，pH值和温度由低增大，水解程度呈现先快速提高后轻微下降的趋势。pH值和温度主要对木瓜蛋白酶的活性产生影响。
因此，在pH值为7.0，温度55℃的溶液环境中，添加3％木瓜蛋白酶、酶解时间为8h所制备的河豚鱼精巢蛋白肽的效果最佳。
实施例2：河豚鱼精巢蛋白肽的抗疲劳效果
取30只小鼠，体质量为(20±2)g，将小鼠随机分为6组，包括河豚鱼精巢蛋白肽饲喂低、中、高剂量组[50、100、200mg/(kg·d)]、精巢蛋白原样组[100mg/(kg·d)]、阳性对照组[香菇多糖50mg/(kg·d)]和空白对照组(生理盐水)，每组5只小鼠，雌雄各半；分组后25℃适应环境饲养7d，光暗12h∶12h交替；每天灌胃1次，灌胃剂量见分组。灌胃前小鼠称重记录，连续28d。此期间，小鼠自由摄食及饮水。
1、河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠体质量的影响
由表1可以看出，空白组、河豚鱼精巢蛋白肽高、中、低剂量剂量组、原样组和阳性组小鼠的体质量随着时间的延长逐渐增长。灌胃饲养相同时间时，空白组、河豚鱼精巢蛋白肽低、中、高剂量组、原样组和阳性组，各组组间小鼠体质量的差异不显著(P>0.05)，说明河豚鱼精巢蛋白肽饲喂对小鼠的体质量没有显著影响(P>0.05)。
表1：河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠体质量的影响表
2、负重游泳实验
末次给药30min后，将各组小鼠取出，尾部绑定该只小鼠体质量5％的自制负重物；在游泳箱中放入适量水，水深约40cm，水温保持(25±1)℃；将要进行实验的小鼠充分打湿毛发，防止毛发间的空气对实验产生影响；将小鼠放入游泳箱游泳。每只水箱一次放入5只小鼠。如有小鼠趴在游泳箱边缘部位休息，则用玻璃棒驱离，使其保持运动状态，记录小鼠从游泳开始至力竭的时间(以小鼠身体完全没入水中且持续10s后为判断标准)，为小鼠力竭游泳时间。
灌胃河豚鱼精巢蛋白肽饲养28d后，各组小鼠的负重游泳时间如图2所示。高剂量组小鼠负重游泳时间为45.35min，是空白对照组小鼠负重游泳时间的2.24倍，极显著地延长了小鼠的负重游泳时间(P<0.01)，提示灌胃高剂量精巢肽使小鼠体力明显增加；中、低剂量组和原样组小鼠负重游泳时间分别是空白组的1.41、1.09倍和1.23倍，在一定程度上延长了小鼠负重游泳时间，与空白组无显著差异(P>0.05)。实验结果说明河豚鱼精巢蛋白肽能够延长小鼠负重游泳的时间，且呈现剂量效应。
3、河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清乳酸含量的影响
末次给药30min后，将各组小鼠取出，尾静脉采血20μL；在游泳箱中保持25℃水温，不负重游泳10min，尾静脉取血20μL；小鼠休息20min后，再次尾静脉取血20μL；利用全血乳酸检测试剂盒说明书分别检测3次血中乳酸的含量，计算全血乳酸曲线下面积。公式为：全血乳酸曲线下面积＝5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值)。
如图3所示，喂养28d后，各组小鼠无负重游泳1h后，高、中剂量组和阳性对照组的血乳酸含量分别比空白组减少了20.0％、12.4％和19.6％，具有显著差异(P＜0.05)，低剂量组和原样组的血乳酸含量与空白组的血乳酸含量相近。说明河豚鱼精巢蛋白肽可以有效地清除或延缓小鼠体内乳酸堆积，随着剂量的增加，对血乳酸的清除作用逐渐明显，呈现一定的量效关系。
4、河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清尿素氮含量的影响
末次给药30min后，将小鼠毛发充分打湿，置于游泳箱中不负重游泳90min，取出，擦拭掉水，让小鼠休息60min；小鼠摘取眼球取血，常温放置2h后，1575g离心10min分离血清；解剖小鼠，分离得到小鼠肝脏，生理盐水漂洗后，吸干水分，精确称量100mg，利用尿素氮和肝糖原试剂盒说明书测定血清尿素氮和肝糖原的含量。
各组小鼠喂养28d后，血清尿素氮变化情况如图4所示。高、中、低剂量组、阳性组和原样组分别比空白组降低了37.30％、22.0％、13.7％、25.4％和10.1％，高剂量组血清尿素氮含量与空白组比具有极显著差异(P＜0.01)，低剂量组和原样组则差异不明显。结果表明河豚鱼精巢蛋白肽在一定剂量范围内，不同剂量组给药，能够减轻血清中尿素氮的含量，且随着剂量增加，作用越显著，提示河豚鱼精巢蛋白肽可以提高肾脏清除尿素氮的能力。
如图5所示，饲喂28天后，高、中、低剂量组肝糖原储备量明显增加，且呈现剂量效应。说明河豚鱼精巢蛋白肽被吸收进入体内有助于肌糖原的积累，增加肝糖原的储备量，减少血乳酸和血清尿素氮的产生量，证实河豚鱼精巢蛋白肽具有增加机体糖原储备，增强机体对运动负荷耐受能力的功效。
5、急性毒理实验
每组实验雌雄小鼠各10只，级别为ICR级别，分开饲养。适应一周后，小鼠禁食6h，但饮水不受限制。之后将河豚鱼精巢蛋白肽按剂量15g/kg给小鼠灌胃。小鼠灌胃完成后，观察其状态，一共观察14d，并解剖小鼠，观察小鼠内脏。
以15g/kg剂量给小鼠灌胃河豚鱼精巢蛋白肽，并持续观察14d，结果表明小鼠无死亡现象，体质量变化正常。小鼠的摄食、毛色、大小便、精神状态等行为活动均未发现异常。小鼠眼、鼻腔、口腔未发现分泌异常物质。观察后将小鼠进行解剖，肉眼观察内脏器官未见异常。该结果表明河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠无毒。
实施例3：河豚精巢肽的序列鉴定
对实施例1所制备的河豚精巢肽进行RP-HPLC分离纯化，得到的五个不同分子量的洗脱组分(图6)，按照实施例2的方法对不同组分的抗疲劳活性进行检测，其中F3组分具有最好的抗疲劳活性。
通过LC-MS/MS对组分F3进行多肽序列分析，选择置信区间>96％的肽序列，鉴定出高活性肽段2条，其序列分别为GHPGTDL和AVGKEVA。
对序列为GHPGTDL和AVGKEVA的多肽进行合成，经过造模实验摸索，选择以0.4mmol/LH2O2为PC12细胞氧化损伤的造模浓度。功效评价实验结果表明，预孵育多肽GHDPTL、AHVKGAY的PC12细胞的存活率相比于实施例1中制备的多肽的模型组有显著提高，且细胞内ROS水平有明显降低，这就验证了两条多肽对H2O2诱导的细胞氧化损伤有很好的保护作用。
本发明所提供的河豚精巢肽GHPGTDL和AVGKEVA能清除体内自由基，可以提高体内超氧化物歧化酶的活性，进而提高机体的抗氧化能力，使机体更好地维持氧化与抗氧化系统的平衡；能增加机体糖原储备，增强机体对运动负荷耐受能力的功效；能够延长小鼠的负重游泳时间，减少血清尿素氮含量，提高乳酸脱氢酶水平和肝糖原含量，具有抗疲劳和抗氧化功效。为河豚精巢蛋白肽抗疲劳产品的研发提供了新思路。
Claims (10)
1.一种河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的河豚鱼精巢蛋白肽是将河豚的精巢匀浆后加入脱脂浸提液进行脱脂，脱脂后的蛋白溶解后加入蛋白酶进行酶解制备的。
2.如权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的脱脂浸提液是体积比为1:1:4的乙醚-异丙醇-蒸馏水溶液。
3.如权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶。
4.如权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的酶解，是使用木瓜蛋白酶，在pH值为7.0，温度55℃的条件下进行酶解。
5.如权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的酶解，是在pH值为7.0，温度55℃的溶液环境中，添加3％木瓜蛋白酶、酶解时间为8h。
6.如权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其一种肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
7.如权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的河豚鱼精巢蛋白肽，其一种肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
8.权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽在制备抗疲劳制品中的应用。
9.权利要求6或7所述的河豚鱼精巢蛋白肽在制备抗氧化的制品中的应用。
10.一种抗疲劳、抗氧化的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1、权利要求6或7所述的河豚鱼精巢蛋白肽。
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