CN113416728A - 一种可食用鱼精dna的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可食用鱼精DNA的提取方法，该方法包括：使用缓冲溶液清洗鱼精原料；将经过处理后的鱼精原料投入缓冲溶液中匀浆、离心，得到接近肤色的沉淀；用浓盐溶液溶解获得的沉淀物形成溶液；用碱性溶液调节溶液pH至9~11，然后离心得到上清液；用酸性溶液将上清液pH调至6.0~7.0，获得含DNA的上清液；用浓度为50~100%乙醇沉淀得到鱼精DNA沉淀；用无菌去离子水溶解鱼精DNA沉淀，并进行纯化，即可。本发明提供的鱼精DNA提取方法规避了其他方法中有毒有害试剂的使用，获得的鱼精DNA安全可食用，纯度高，且有较高回收率，能够规模化提取生产，更适合用于动物及临床研究，丰富了鱼精DNA的应用范围。

Description

一种可食用鱼精DNA的提取方法
技术领域
本发明涉及食品、海洋生物与医药相结合的技术领域，具体涉及提取可食用鱼精DNA的方法。
背景技术
在我国人口老龄化趋势的日益严重，以及有限医疗资源难以满足日益增加的医疗需求的背景下，加强病前干预以及家庭护理迫在眉睫，精准医疗、精准营养也提上日程。而核酸类物质是构成遗传信息的物质基础，是精准医疗、精准营养的重要研究内容。据报道，膳食核酸的生理功能主要有：促进生长发育；调节肝功能；抗氧化；缓解体力疲劳；辅助改善记忆，其在化妆品、食品、保健品等方面都有着广泛的应用。
膳食核酸中RNA在大多数食物中的含量占比大，而DNA一般在富含精子的物质中含量比较丰富，例如鱼精和花粉。现有的DNA产品以鱼精DNA和小牛胸腺DNA为主，在加工中被当作废料的鱼精巢中含有丰富的DNA，且鱼精DNA已被证实具有保养皮肤、治疗贫血等功能，所以从鱼精巢中有效提取DNA的方法非常重要。
但是对现有鱼精DNA的提取方法进行研究发现，提取过程多涉及有毒有害试剂的使用，阻碍了其在食品、保健品、化妆品等领域中的应用。王建（从海鱼鱼白中提取核酸，无锡轻工大学学报(食品与生物技术)，2003年第2期71-74页）、唐孝礼（鱼精DNA的快速无污染提取工艺，广州化工，1996年第24卷第4期）、刘润芝（从鲤鱼精巢中提取脱氧核糖核酸(DNA)的研究，湖南师范大学自然科学学报，1988年第11卷第3期）等人所述鱼精DNA提取率为6-25%，但实验中均使用了十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性。专利CN110760509A利用不同截留分子量的滤膜，同时获得了河豚鱼精DNA和鱼精蛋白，但其未对所得DNA进行纯度及回收率分析。
综上所述，现有方法大多使用酚仿或SDS等变性剂，不符合绿色加工、节能减排的趋势，如何能尽量避免有毒有害试剂的使用，获得条带完整、纯度高、可食用的鱼精DNA，还需要新的更加健康的提取方法。
发明内容
本发明的目的是一种可食用鱼精DNA的提取方法，以弥补现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种可食用鱼精DNA的提取方法，该方法包括以下步骤：
（1）使用缓冲溶液清洗鱼精原料；
（2）将经过（1）处理后的鱼精原料投入缓冲溶液中匀浆、离心，得到接近肤色的沉淀；
（3）用浓盐溶液溶解（2）中获得的沉淀物形成溶液；
（4）用碱性溶液调节（3）中溶液pH至9-11，然后离心得到上清液；
（5）用酸性溶液将（4）中上清液pH调至6-7，获得含DNA的上清液；
（6）用浓度为50-100%乙醇沉淀得到鱼精DNA沉淀；
（7）用无菌去离子水溶解（6）中的鱼精DNA沉淀，并进行纯化，即可。
进一步的，所述鱼类可以选择为生活中较易获取的海鱼-明太鱼。
进一步的，所述步骤（1）中所用的缓冲溶液为SSC溶液，具体为0.05-1 M氯化钠和0.01-0.1 M柠檬酸钠（14: 5, c/c）混合液。
进一步的，所述步骤（2）具体过程为：加入2倍原料重量预冷后的SSC溶液，匀浆1.5min；4℃，4000 rpm离心15 min，弃上清液；将沉淀转移至2倍原料重量预冷后的SSC溶液，匀浆1 min；4℃，4000 rpm离心15 min，弃上清液，重复操作2次；该离心的具体操作也是经过多次实验验证的，能够得到较好的离心效果。
进一步的，所述步骤（3）中的浓盐溶液具体选择为10-20wt%氯化钠溶液；具体操作为加10倍原料重量的10-20wt%氯化钠溶液，搅拌，使鱼精脱氧核糖核蛋白（DNP）充分溶解，4℃静置48 h。
进一步的，所述步骤（4）中碱性溶液为碳酸钠、碳酸氢钠或两者的混合物所配制的；具体为：加入碱性溶液，根据氨基酸组成调整DNP溶液，一般调整范围为pH 9-11；以明太鱼鱼精提取为例，调节DNP溶液pH=9.7；4℃，10000 rpm离心10 min，弃沉淀；加入碱溶液，调节DNP溶液pH=10.8；4℃，10000 rpm离心10 min，弃沉淀。
进一步的，所述步骤（5）中酸性溶液为盐酸、醋酸、柠檬酸中的一种或几种混合，调节DNP溶液pH=6.5；4℃，10000 rpm离心10 min，弃沉淀。
所述步骤（6）具体操作包括：加入2倍体积预冷的50-100%乙醇，4℃，10000 rpm离心10 min，弃上清液，重复上述操作2次；用预冷的50-100%洗涤沉淀2次，空干乙醇。
进一步的，所述步骤（7）中经过截留分子量为5000的超滤膜进行纯化。
本发明的优点和有益效果：
本发明使用氯化钠、可食用碱性溶液、盐酸等溶液代替苯酚、氯仿、十二烷基硫酸钠（SDS）等获得鱼精DNA，提供了一种安全的可食用鱼精DNA的提取方法。
本发明提供的鱼精DNA提取方法规避了其他方法中苯酚、氯仿、SDS等试剂的使用，获得的鱼精DNA安全可食用，纯度高，且有较高回收率，能够规模化提取生产，更适合用于动物及临床研究，丰富了鱼精DNA的应用范围，尤其是适用于海鱼-明太鱼鱼精的提取。
附图说明
图1是实施例中提取可食用明太鱼精DNA方法的流程示意图。
图2是实施例中所采用的明太鱼精氨基酸成分及含量分析的结果图。
图3是实施例中提取方法获得的DNA不同波长下吸光度的变化曲线。
图4是实施例中提取方法获得的DNA琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明实施例中揭露的数值是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值而不限于本发明实施例中公开的具体数值。
实施例1：
本实施例采用对鱼精进行氨基酸分析来确定碱溶液调节溶液pH，氨基酸分析参考GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》所述方法包括：
（1）将鱼精解冻，匀浆1 min，重复操作3次。
（2）取适量鱼精匀浆测定明太鱼精中的蛋白质浓度，具体方法包括：
取1 mL鱼精匀浆，加入3 mL PBS缓冲液稀释，标记为“M4”。
取200 μL“M4”中的匀浆，加入200 μL PBS缓冲液稀释，重复操作，将明太鱼精匀浆稀释至4倍、8倍、16倍、32倍和64倍，分别标记为“M4”、“M8”、“M16”、“M32”、“M64”。
在96孔板的样品孔中加入20 μL不同稀释倍数的鱼精匀浆，再加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min。
测定A562，计算出鱼精蛋白质浓度，确定需要称取鱼精匀浆的质量为0.3501 g。
（3）向安瓿瓶中加入0.3501 g鱼精匀浆，加入15 mL 6 M HCl（含5% 巯基乙醇），充氮气，酒精灯熔化封管。
（4）将安瓿瓶放入110℃电热鼓风恒温箱水解22 h，取出冷却，将水解液用0.02 MHCl定容至50 mL。
（5）吸取1 mL水解液于安瓿瓶中，置于60℃水浴中，用压缩空气机吹干。
（6）加入3-5滴超纯水，吹干排酸，重复操作3次。
（7）用2 mL 0.02 M HCl复溶，再经过0.22 μm水系滤膜过滤至液相瓶作为待测液，最后采用日立L-8900 全自动氨基酸分析仪进行分析。
鱼精氨基酸分析结果如图2和表1所示，结果显示鱼精蛋白中碱性氨基酸占比大，其中赖氨酸和精氨酸占比分别为11.32%和10.76%，精氨酸等电点为pH 10.8，赖氨酸等电点为pH 9.7，大致范围pH 9-11，根据“等电点处蛋白质或氨基酸溶解度最小”这一性质，最终得出pH由此得出用碱溶液去除鱼精蛋白时pH的调节范围为pH 9-pH 11。
表1明太鱼精氨基酸成分及含量分析
Figure 29415DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
本实施例旨在选取合适的离心条件。
由于离心速度和时间应试沉淀的情况而定，如果离心速度过低，则沉淀会漂浮在溶液中无法去除，如果离心速度过高，则可能会造成鱼精DNA的降解，影响后续实验的进行。本实施例所涉及的离心速度为4000-10000 rpm，时间为10-15 min。获取DNP溶液的离心条件为4℃，4000 rpm离心15 min；在调节DNP溶液pH值去除鱼精蛋白步骤中离心条件为4℃，10000 rpm离心10 min；超滤纯化步骤的离心条件为4℃，7000 rpm离心20 min，在这个条件下，得到的DNA条带完整、纯度高。
实施例3
该实施例确定去除过量碱性溶液的pH范围。
根据图2显示的结果，鱼精蛋白中谷氨酸含量高，故将DNP溶液的pH调节到3.2左右，在中和过量碱溶液的同时去除鱼精蛋白，但去除蛋白质的效果不显著，且在pH 3.2条件下，DNA存在降解的可能，故将DNP溶液的pH调回到加入碱溶液前的pH即可，范围为pH 6.0-pH 7.0，确保过量的碱液被中和。
实施例4：
本实施例以明太鱼精巢组织为原料，按照图1提取可食用明太鱼精DNA方法的示意图进行提取，所述方法包括：
（1）用SSC溶液（0.14 M 氯化钠和0.05 M柠檬酸钠混合液）洗净明太鱼精巢组织，滤纸吸干，称重；投入捣碎机中。
（2）向（1）中所得的明太鱼精巢组织中加入2倍原料重量预冷后的SSC溶液，匀浆1.5 min；4℃，4000 rpm离心15 min，弃上清液；将沉淀转移至2倍原料重量预冷后的SSC溶液，匀浆1 min；4℃，4000 rpm离心15 min，弃上清液，重复操作2次，得到接近肤色的沉淀。
（3）向（2）中所述沉淀加10倍原料重量的10%氯化钠溶液，搅拌，使（2）中所述沉淀充分溶解，4℃静置48 h。
（4）向（3）中获得的溶液加入饱和碳酸钠溶液，调节DNP溶液pH=9.7，4℃，10000rpm离心10 min，弃沉淀；加入饱和碳酸钠溶液，调节DNP溶液pH=10.8；4℃，10000 rpm离心10 min，弃沉淀，取上清液。
（5）所述步骤（5）上清液中加入盐酸，调节DNP溶液pH=6.5；4℃，10000 rpm离心10min，弃沉淀，取上清液。步骤（4）和（5）涉及到的pH是根据所用的明太鱼白氨基酸组成和含量确定，图2是本发明所采用的明太鱼精氨基酸成分及含量分析的图表。
（6）将（5）中得到的上清液加入2倍体积预冷的75%乙醇中，4℃，10000 rpm离心10min，弃上清液，重复上述操作2次；用预冷的无水乙醇洗涤沉淀2次，空干乙醇，用无菌去离子水溶解DNA，得到DNA溶液。
（7）将（6）中的溶液转移至截留分子量为5000的超滤管，7000 rpm离心20 min，对DNA进行纯化。
本发明实施例所提取的DNA含量及纯度的评价方法如下：
（1）回收率分析
本发明实施例所提取的DNA回收率可达到1-5%，具体操作及计算方法如下：
本发明中DNA回收率指提取得到的鱼精DNA干重占鱼精干重的百分率。鱼精干重的计算方法利用测定鱼精水分含量测得,参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》，本发明中的鱼精适宜采用直接干燥法中的二步干燥法测定其水分含量，具体方法如下：
称取2-5 g洁净的鱼精（精确至0.0001 g），记为“m1”，自然风干15-20 h，再将风干后的样品粉碎、混匀。
取洁净玻璃制的扁形称量瓶，置于101-105℃干燥箱中烘干1 h，盖好取出放入干燥器内冷却0.5 h，称重。
重复上述干燥操作至前后两次质量差≤2 mg，最后一次称量值记为“m5”。
称量风干后的鱼精，记为“m2”，放入干燥好的称量瓶中，确保样品厚度≤5 mm，称量，记为“m3”。
加盖置于101-105℃干燥箱内，瓶盖斜支于瓶边，干燥2-4 h，盖好取出放入干燥器内冷却0.5 h，称重。
加盖置于101-105℃干燥箱内，瓶盖斜支于瓶边，干燥1 h，盖好取出放入干燥器内冷却0.5 h，称重。
重复上述干燥操作至前后两次质量差≤2 mg，最后一次称量值记为“m4”。
水分含量的计算公式：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
经上述计算，本发明方法鱼精DNA的回收率为1-5%，现有技术中精巢中提取脱氧核糖核酸(DNA)的研究，DNA提取率在8-10%左右，但在提取过程中添加了十二烷基硫酸钠（SDS），对所得鱼精DNA存在污染的可能，这点也正是本申请要解决的技术问题；本实施例中的鱼精DNA回收率与专利CN106031709B和徐志鹏等（规模化制备小牛胸腺DNA的工艺研究，药物生物技术，2013年第20卷第5期435-438页）所述的鱼精DNA-Na和小牛胸腺DNA收率接近，而后者两种方法所制得的鱼精是非可食用的，即，本发明可用于后续的规模化制备以及鱼精DNA的活性研究。
（2）纯度分析
取2μL步骤（6）获得的DNA溶液置于Nano-100检测得到图3按本发明实施例提取方法获得的DNA不同波长下吸光度的变化曲线，计算了所得DNA的纯度，计算公式如下：
纯度 = A260/A280
如图3所示，提取得到的明太鱼精DNAA260/A280为1.80，可以确认其纯度高，证明该实施例能够获得蛋白质污染程度低的高纯度DNA。
取7.5μL步骤（6）获得的DNA溶液与1.5μL 6×上样缓冲液混合均匀，取6μL上样，用1%琼脂糖凝胶进行电泳1 h，电压为120 V，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示，1点样孔为本实施例提取得到的鱼精DNA，条带完整，分子大小在10kb-15kb之间，可满足后续活性分析的要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。

Claims (10)

1.一种可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）使用缓冲溶液清洗鱼精原料；
（2）将经过（1）处理后的鱼精原料投入缓冲溶液中匀浆、离心，得到接近肤色的沉淀；
（3）用浓盐溶液溶解（2）中获得的沉淀物形成溶液；
（4）用碱性溶液调节（3）中溶液pH至9-11，然后离心得到上清液；
（5）用酸性溶液将（4）中上清液pH调至6-7，获得含DNA的上清液；
（6）用浓度为50~100%乙醇沉淀得到鱼精DNA沉淀；
（7）用无菌去离子水溶解（6）中的鱼精DNA沉淀，并进行纯化，即可。
2.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中所用的缓冲溶液为SSC溶液，具体为0.05-1 M氯化钠和0.01-0.1 M柠檬酸钠浓度比例为14: 5的混合液。
3.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（2）具体过程为：加入2倍原料重量预冷后的SSC溶液，匀浆1.5 min；4℃，4000 rpm离心15 min，弃上清液；将沉淀转移至2倍原料重量预冷后的SSC溶液，匀浆1 min；4℃，4000 rpm离心15 min，弃上清液，重复操作2次。
4.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中的浓盐溶液具体选择为10-20wt%氯化钠溶液；具体操作为加10倍原料重量的10-20wt%氯化钠溶液，搅拌，使鱼精脱氧核糖核蛋白充分溶解，4℃静置48 h。
5.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中碱性溶液为碳酸钠、碳酸氢钠或两者的混合物所配制的；具体为：加入碱性溶液，根据氨基酸组成调整DNP溶液，一般调整范围为pH9-11。
6.如权利要求5所述的可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，调节DNP溶液pH为9.7；4℃，10000 rpm离心10 min，弃沉淀；加入碱溶液，调节DNP溶液pH为10.8；4℃，10000 rpm离心10 min，弃沉淀。
7.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（5）中酸性溶液为盐酸、醋酸、柠檬酸中的一种或几种混合，调节DNP溶液pH为6.5；4℃，10000 rpm离心10min，弃沉淀。
8.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（6）具体操作包括：加入2倍体积预冷的50-100%乙醇，4℃，10000 rpm离心10 min，弃上清液，重复上述操作2次；用预冷的50-100%洗涤沉淀2次，空干乙醇。
9.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，所述步骤（7）中经过截留分子量为5000的超滤膜进行纯化。
10.如权利要求1所述的可食用鱼精DNA的提取方法，所述鱼类选择为海鱼，具体为明太鱼。
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