CN115418383A - 一种酵母发酵产物提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母发酵产物提取物及其制备方法和应用，利用特定酵母菌所分泌蛋白酶，经控制发酵条件将培养基中大分子蛋白质成分分解为小分子活性肽，经分离提纯获得小分子抗氧化活性肽，无需蛋白酶提纯后再酶解大分子蛋白质等过程，工艺简单，成本低廉。

Description

一种酵母发酵产物提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种酵母发酵产物提取物及其制备方法和应用。
【背景技术】
酵母是一种天然酶，在食品工业已有多年应用历史，例如面包生产、啤酒发酵、红酒发酵、营养供给。近年来，生化产物，如酵母及其代谢物替代化学合成制剂作为化妆品主要成分成为热潮。其实早在8000年前，中世纪的人们就知道利用酵母菌的活性物质进行酿酒，古巴比伦人使用啤酒和酵母来帮助伤口愈合，希腊妇女也常用酿酒发酵产生的泡沫来擦洗脸部和身体，以此来保持皮肤的健康美丽。随着生物发酵技术的发展和人们对护肤品的天然、绿色、健康、安全、高效的更高追求，生物发酵护肤品，以更安全、更天然、使用感更好、功效性更强的特点，逐渐受到全球化妆品科研专家和消费者的关注。
酵母提取物(yeast extract)又称酵母抽提物、酵母发酵产物，是指以酵母为主要原料，在酵母自身的酶或外加酶的作用下，酶解自溶并且再经分离提取后得到的产品。酵母提取物是经过酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解，得到富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分。小分子氨基酸活性更强，皮肤渗透性更好，容易被皮肤吸收，使老化的表皮恢复弹性，修复皮肤屏障功能。核酸及核苷酸可以促进新陈代谢、提高蛋白质合成速度，增强免疫机能、增强SOD活性，提高皮肤抗自由基能力。维生素和矿物质，为皮肤提供充足营养。
酵母提取物常用的提取方法包括利用内源酶自溶法、外源酶处理法、化学处理法等技术将酵母细胞的蛋白质降解成氨基酸和多肽、核酸降解成核苷酸，并把它们和其它有效成分，如B族维生素、微量元素(例如硒、锌、铁、铜等)、谷胱甘肽一起从酵母细胞中抽提出来所制得的水溶性营养物质的浓缩物。酵母提取物中含有丰富的小分子肽、游离氨基酸、维生素、核酸、核苷酸等活性成分，其中氨基酸含量30％以上，总蛋白50％以上，核苷酸10％以上，主要应用于食品、调味品、化妆品等领域。目前，酵母提取物主要有三种应用形式，第一种为酵母发酵产物滤液，例如SK-II公司从覆膜孢酵母属的特殊酵母在发酵后去除酵母菌体提炼的液体产物pitera，具有滋润及保湿功能；第二种为酵母溶胞产物提取物，是通过破壁手段使酵母菌破碎后将营养物质提炼所得的产物，例如雅诗兰黛公司的小棕瓶系列中含酵母溶胞产物提取物；第三种为酵母滤液和酵母提取物都存在的营养液，此类提取物产品很好地利用了发酵物滤液和菌体中所含的营养物质，能够降低酵母提取物的获取成本，避免有用物质的浪费。
但酵母提取物也存在一些问题，因为酵母发酵的气味不良，无添加产品中气味难以掩盖，菌落总数超标等问题，特别是菌落总数超标的问题，现有技术中，一般酵母发酵产物提取物的含量一般都会低于5％，过高的含量在开封后不仅会滋生细菌，而且因为酵母发酵产物提取物中蛋白质含量高，会凝析出，导致化妆品中有沉淀，以及发黄等问题，还存在产品杂质较多，刺激性较大，需要繁琐的调配工艺、美白和修复能力较低等问题。
【发明内容】
针对现有技术中的酵母发酵产物提取物中蛋白质含量高，会凝析出，导致化妆品中有沉淀，以及发黄等问题，本发明提供了一种酵母发酵产物提取物及其制备方法和应用，利用特定酵母菌所分泌蛋白酶，经控制发酵条件将培养基中大分子蛋白质成分分解为小分子活性肽，经分离提纯获得小分子抗氧化活性肽，无需蛋白酶提纯后再酶解大分子蛋白质等过程，工艺简单，成本低廉。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种酵母发酵产物提取物的制备方法，包括如下步骤：
S1：将桂林兴安猫儿山葡萄采用酵母菌种进行发酵：
葡萄样品经捣碎后带皮进行自然发酵，在发酵过程中定期取样，以不同浓度梯度涂布于赖氨酸培养基，28℃培养48h，划线分离；重复多次直至得到单菌落后，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，28℃培养48h后，16％甘油保存于-80℃冰箱；所述的赖氨酸培养基：赖氨酸0.56％(w/w)、葡萄糖1.0％(w/w)、KH2PO40.1％(w/w)、MgSO40.05％(w/w)、琼脂2.0％(w/w)，121℃灭菌20min；所述的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：葡萄糖2.0％(w/w)、酵母提取物2.0％(w/w)、蛋白胨2.0％(w/w)、pH 7.0，121℃灭菌20min；
取菌悬液0.1mL进行10倍系列稀释至10-1-10-6，分别取各个稀释梯度1mL涂布于酪蛋白分离筛选培养基，28℃培养48h后，取用柠檬酸调pH值至6.0的NaOH溶液，喷于平板上，选择其中显示透明圈直径较大的菌株，备用；所述的酪蛋白分离筛选培养基：干酪素0.5％(w/w)、牛肉膏0.3％(w/w)、蛋白胨1.0％(w/w)、NaCl 1.0％(w/w)、琼脂1.5％，pH 7.0，121℃灭菌20min；
初筛菌株接种于发酵培养基I中，在37℃下于200r/min的摇床上培养48h后，分别取1mL菌液于离心管中，离心后，收集上清液进行酶活测定，将酶活力大的菌株筛选出来，备用；所述的发酵培养基I：干酪素0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 1.0％，牛肉膏0.3％，pH 7.0，121℃灭菌20min；
所述的酵母菌种选自葡萄汁有孢汉逊酵母、鲁考弗美奇酵母、奇异酵母、维多利亚维希尼克氏酵母中的一种或多种，混合时为任意比例；
S2：诱变选育：
将筛选出的菌株发酵液在离心机中5000r/min离心8min，弃去上清液，用无菌水重新悬浮；吸取2mL放置于4℃冰箱中作为对照；剩余的菌液，吸取5mL加入无菌平板中，平板置于紫外灯已照射30min的磁力搅拌器上，等距离放置距灯30cm处，照射20min，得诱变菌株1；诱变菌种1放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，照射10s，而后室温静置10s后再照射10s，温度降至室温后，在37℃培养60h，得到最终诱变菌株，诱变菌株接种于发酵培养基I，进行扩大培养，备用；
S3：4个发酵特殊配方培养基的制备：
生物素浓缩液的制备：称取0.2g生物素溶于100ml水中，0.22μm滤膜除菌过滤，2-8℃保存，待用；
蛋白质溶液：(1)蛋白粉加水溶解后得到1.5％(w/w)，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；或(2)取高蛋白含量植物原料粉末，加氯化钠溶液混匀后反复冻融处理2-3次，再经超声、高速均质处理，离心得到蛋白质含量1.5％(w/w)的溶液，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
酵母提取物溶液：酵母提取物加水溶解后得到酵母提取物含量18％(w/w)的溶液，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
葡萄糖溶液：葡萄糖加水溶解后得到葡萄糖含量12％(w/w)的溶液，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
S4：发酵液分离提取：
S4.1：发酵种子液制备：
S4.1.1：一级种子液：在种子培养基中按0.1-5％(v/v)的比例接入菌种，放入恒温摇床，30℃、250rpm，培养10-18h后，取样镜检；无杂菌，并为典型的酵母菌形态，吸光度A600为0.8-2.0，则为合格的一级种子液；
S4.1.2：二级种子液：在种子培养基中按5-15％(v/v)的比例接入一级种子液，放入恒温摇床中，30℃、250rpm，培养10-18h后，取样镜检，无杂菌，并都为典型的酵母菌形态，吸光度A600为0.8-3.0，则为合格的二级种子液；
S4.2：发酵培养：
S4.2.1：接种：发酵培养基Ⅱ按10％(v/v)的比例接入二级种子液；
S4.2.2：培养；
S4.2.3诱导：当发酵液A600值≥3时，在15分钟内，将发酵液温度升高至42±0.5℃，开始诱导；
S4.2.4补料控制：发酵培养过程中，当溶解氧由最高逐渐减到最低时，并且由最低突然升高至初始值时，开始按1:1的量补加蛋白质溶液和酵母提取物溶液，同时调节搅拌速度和空气流量，使溶解氧维持在50％，在诱导过程中，当发酵液溶氧升高至30％时，开始按1:1的比例流加酵母提取物溶液和葡萄糖溶液，当溶氧降低到10％时，停止流加，如此反复操作，直到结束，使溶解氧浓度维持在10-50％之间；
S4.2.5放罐和离心收集上清液：在诱导4-6h后，停止诱导，将发酵液放入无菌离心瓶中，平衡后离心，离心条件设定为：转速4000rpm、离心时间30分钟、温度4℃；离心完毕，收集上清液至烧杯中密封，放在2-8℃保存；若不在当日提取，将所得上清液放在-20℃下保存；菌体用无菌水按1:2重悬，再次离心，收集上清液混合，将菌体收集后，倒入发酵罐中，加水按1:5重悬，用蒸汽在121℃、灭菌30分钟后作废弃物处理；
S4.3提取；
S4.4中间体质量控制：
S4.4.1一级种子液质量控制参数：培养时间：10-18h；接种量：0.1-5％(v/v)；吸收值A600：0.6-2.0；镜检：无杂菌，并都为典型的酵母菌形态；
S4.4.2二级种子液质量控制参数：培养时间：10-18h；接种量：5-15％(v/v)；吸收值A600：0.8-3.0；镜检：无杂菌，并都为典型的酵母菌形态；
S4.4.3发酵培养阶段质量控制参数：培养时间：8-20h；接种量：10％(v/v)；吸收值A600：≥3；
诱导培养阶段质量控制参数：诱导时间：4-6h；诱导结束吸收值A600：≥6；
S4.4.4目的物质量控制参数：蛋白含量：用Lowry法测定，目的物收集液(酵母发酵产物提取物)中蛋白含量≥20mg/L。
本发明中：
步骤S4.1中所述的种子培养基，是将蛋白胨1％(w/w)、酵母提取物0.5％(w/w)、氯化钠0.5％(w/w)加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却后每千毫升加入生物素浓缩液0.2ml得到。
步骤S4.2.1中所述的发酵培养基Ⅱ，是将蛋白胨1.5％(w/w)、酵母提取物1％(w/w)、氯化铵0.1％(w/w)、氯化钠0.5％(w/w)、磷酸氢二钠1.2％(w/w)、磷酸二氢钾0.3％(w/w)、葡萄糖0.4％(w/w)加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却后每千毫升加入生物素浓缩液0.2ml得到。
步骤S4.2.2中所述的培养，包括如下步骤：
S4.2.2.1培养阶段发酵参数设定：接种完毕，设定发酵培养参数，初始搅拌转速(AGIT)设定为150rpm，根据溶氧(DO)变化逐渐增大至600rpm；初始空气流量设定为1200L/h，根据溶氧(DO)变化逐渐增大；培养温度设定为30℃，设为自动控制；pH值设定为7.2，设为自动控制；通过调节排气阀，将罐压控制在0.04±0.01Mpa；通过调节搅拌转速和空气流量，将溶解氧浓度(DO)维持在50％以上；
参数 设定值
培养温度 30℃
pH 7.2
溶解氧(DO) 100％
搅拌转速(rpm) 150
罐压(Mpa) 0.04±0.01
空气流量(L/h) 1200；
S4.2.2.2发酵开始时，由于菌体细胞生长缓慢，溶解氧浓度(DO)变化不大，当菌体细胞适应了生长环境后生长速度加快，此时溶解氧浓度(DO)也缓慢下降，通过提高搅拌转速和增加空气流量来提高溶解氧浓度(DO)；当溶解氧浓度(DO)在接近初始溶氧不再下降时，表明此时基础培养基中的酵母提取物和葡萄糖已经消耗完毕，补加酵母提取物溶液(18％)和葡萄糖溶液(12％)；此时开始按1:1的量流加葡萄糖和酵母提取物溶液补料以后，溶解氧浓度(DO)迅速下降；当溶氧降低到50％时，停止流加，当溶解氧浓度(DO)迅速上升时，开始流加，如此反复，直到培养结束；
S4.2.2.3当吸收值A600≥3的时，转入诱导阶段，培养时间8-20h；培养过程中每小时取样检测A600、镜检。
步骤S4.2.3所述的诱导，诱导阶段发酵参数按如下设定：
参数 设定值
诱导温度 42±0.5℃
pH 7.2±0.2
溶解氧(DO) 10-50
诱导时间(h) 4-6
搅拌转速(rpm) 450-600
罐压(Mpa) 0.04±0.01
空气流量(L/h) 800-2000。
步骤S4.3所述的提取，包括如下步骤：
凝胶过滤层析：填料名称：Sephadexl G-50；层析柱规格：Φ5×100cm；
层析系统的连接：按洗脱液→蠕动泵→已填装好的层析柱→紫外检测器、记录仪→接收瓶的顺序，将层析系统连接好；
清洗：将层析柱入液口接入无菌注射用水中，打开夹在出液口末端硅胶管上的止血钳，出液口接入废液瓶中，开启蠕动泵，调节流速为10-30ml/min，洗脱3个以上的柱体积后，关闭蠕动泵；
平衡：将层析柱入液口接入0.01mol/L PBS溶液，pH值7.0，出液口接入废液瓶中，开启蠕动泵，调节流速至10-30ml/min，待基线平稳后，洗脱3-4柱体积，关闭蠕动泵；
上样：将层析柱入液口插入发酵上清收集液中，开启蠕动泵，以10-30ml/min的流速将发酵上清收集液泵入层析柱内，当收集液剩余少许时，关闭蠕动泵，停止上样，避免将气泡泵入层析柱内；
洗脱：上样完毕，将层析柱入液口接入0.01mol/L PBS溶液，pH值7.0中，以10-30ml/min的流速进行洗脱；
目的物的收集：洗脱过程中注意观察紫外检测仪吸收值变化，当洗脱到一定程度，吸收值会迅速增大，提示准备收集；当记录笔往上升至距离基线0.5cm处时，进行目的物的接收，当记录笔往下降至与接样点相同高度处时，停止接收；接收完毕，将收集液过滤除菌，即为酵母发酵产物提取物，冷藏保存。
本发明还涉及一种酵母发酵产物提取物，采用上述一种酵母发酵产物提取物的制备方法得到，酵母发酵产物提取物中蛋白含量≥20mg/L(用Lowry法测定)。
本发明还涉及上述一种酵母发酵产物提取物在护肤化妆品中的应用，具体是在制备抗氧化活性化妆品、上调I型胶原合成化妆品、下调基质金属蛋白酶合成化妆品，抗光老化化妆品中的应用。
和现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明所述的一种酵母发酵产物提取物，含有丰富的小分子抗氧化活性肽，具有显著的抗皮肤衰老活性，是一种理想的抗衰老护肤品功效原料。
2、本发明所述的一种酵母发酵产物提取物的制备方法，利用特定酵母菌所分泌蛋白酶，经控制发酵条件将培养基中大分子蛋白质成分分解为小分子活性肽，经分离提纯获得小分子抗氧化活性肽，无需蛋白酶提纯后再酶解大分子蛋白质等过程，工艺简单，成本低廉。
【附图说明】
图1是本发明实验例抗氧化活性的实验的细胞内ROS的含量图；
图2是本发明实验例上调I型胶原合成、下调基质金属蛋白酶合成的实验的Collagen I和MMP-1的含量图；
图3是本发明实验例抗光老化实验的HFF-1细胞的存活率图。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例：
一种酵母发酵产物提取物的制备方法，包括如下步骤：
S1：将桂林兴安猫儿山葡萄采用酵母菌种进行发酵：
葡萄样品经捣碎后带皮进行自然发酵，在发酵过程中定期取样，以不同浓度梯度涂布于赖氨酸培养基(赖氨酸0.56％，葡萄糖1.0％，KH2PO40.1％，MgSO40.05％，琼脂2.0％，121℃灭菌20min)，28℃培养48h，划线分离；重复多次直至得到单菌落后，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(葡萄糖2.0％，酵母提取物2.0％，蛋白胨2.0％，pH 7.0，121℃灭菌20min)，28℃培养48h后，16％甘油保存于-80℃冰箱；
取菌悬液0.1mL进行10倍系列稀释至10-1-10-6，分别取各个稀释梯度1mL涂布于酪蛋白分离筛选培养基(干酪素0.5％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 1.0％，琼脂1.5％，pH 7.0，121℃灭菌20min)，28℃培养48h后，取用柠檬酸调pH值至6.0的NaOH溶液，喷于平板上，选择其中显示透明圈直径较大的菌株，备用；初筛菌株接种于发酵培养基(干酪素0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 1.0％，牛肉膏0.3％，pH 7.0，121℃灭菌20min)中，在37℃下于200r/min的摇床上培养48h后，分别取1mL菌液于离心管中，离心后，收集上清液进行酶活测定，将酶活力大的菌株筛选出来，备用；
所述的酵母菌种选自、葡萄汁有孢汉逊酵母、鲁考弗美奇酵母、奇异酵母、维多利亚维希尼克氏酵母中的一种或多种，混合时为任意比例；
S2：诱变选育：
将筛选出的菌株发酵液在离心机中5000r/min离心8min，弃去上清液，用无菌水重新悬浮；吸取2mL放置于4℃冰箱中作为对照；剩余的菌液，吸取5mL加入无菌平板中，平板置于紫外灯已照射30min的磁力搅拌器上，等距离放置距灯30cm处，照射20min，得诱变菌株1；诱变菌种1放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，照射10s，而后室温静置10s后再照射10s，温度降至室温后，在37℃培养60h，得到最终诱变菌株，诱变菌株接种于发酵培养基，进行扩大培养，备用；
S3：发酵特殊配方培养基的制备：
生物素浓缩液：称取0.2g生物素溶于100ml水中，0.22μm滤膜除菌过滤，2-8℃保存，待用；
蛋白质溶液：(1)取螺旋藻粉30g，加0.9％氯化钠溶液1200ml混匀，置-20℃冰柜中冷冻12小试，取出置37℃水浴解冻，反复冻融3次；(2)超声处理5分钟(每超声6s，间隔9s)；(3)高速均质处理5分钟；(4)3000rpm离心10分钟，取上清液，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
酵母提取物溶液：酵母提取物18％，加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
葡萄糖溶液：葡萄糖12％，加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
S4：发酵液分离提取：
S4.1：发酵种子液制备：
S4.1.1：一级种子液：在种子培养基中按0.1-5％(v/v)的比例接入菌种，放入恒温摇床，30℃、250rpm，培养10-18h后，取样镜检；无杂菌，并为典型的酵母菌形态，吸光度A600为0.8-2.0，则为合格的一级种子液；
所述的种子培养基，是将蛋白胨1％(w/w)、酵母提取物0.5％(w/w)、氯化钠0.5％(w/w)加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却后每千毫升加入生物素浓缩液0.2ml得到；
S4.1.2：二级种子液：在种子培养基中按5-15％(v/v)的比例接入一级种子液，放入恒温摇床中，30℃、250rpm，培养10-18h后，取样镜检，无杂菌，并都为典型的酵母菌形态，吸光度A600为0.8-3.0，则为合格的二级种子液；
S4.2：发酵培养：
S4.2.1：接种：发酵培养基按10％(v/v)的比例接入二级种子液；
所述的发酵培养基，是将蛋白胨1.5％(w/w)、酵母提取物1％(w/w)、氯化铵0.1％(w/w)、氯化钠0.5％(w/w)、磷酸氢二钠1.2％(w/w)、磷酸二氢钾0.3％(w/w)、葡萄糖0.4％(w/w)加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却后每千毫升加入生物素浓缩液0.2ml得到；
S4.2.2：培养，包括如下步骤：
S4.2.2.1培养阶段发酵参数设定：接种完毕，设定发酵培养参数，初始搅拌转速(AGIT)设定为150rpm，根据溶氧(DO)变化逐渐增大至600rpm；初始空气流量设定为1200L/h，根据溶氧(DO)变化逐渐增大；培养温度设定为30℃，设为自动控制；pH值设定为7.2，设为自动控制；通过调节排气阀，将罐压控制在0.04±0.01Mpa；通过调节搅拌转速和空气流量，将溶解氧浓度(DO)维持在50％以上；
参数 设定值
培养温度 30℃
pH 7.2
溶解氧(DO) 100％
搅拌转速(rpm) 150
罐压(Mpa) 0.04±0.01
空气流量(L/h) 1200；
S4.2.2.2发酵开始时，由于菌体细胞生长缓慢，溶解氧浓度(DO)变化不大，当菌体细胞适应了生长环境后生长速度加快，此时溶解氧浓度(DO)也缓慢下降，通过提高搅拌转速和增加空气流量来提高溶解氧浓度(DO)；当溶解氧浓度(DO)在接近初始溶氧不再下降时，表明此时基础培养基中的酵母提取物和葡萄糖已经消耗完毕，补加酵母提取物溶液(18％)和葡萄糖溶液(12％)；此时开始按1:1的量流加葡萄糖和酵母提取物溶液补料以后，溶解氧浓度(DO)迅速下降；当溶氧降低到50％时，停止流加，当溶解氧浓度(DO)迅速上升时，开始流加，如此反复，直到培养结束；
S4.2.2.3当吸收值A600≥3的时，转入诱导阶段，培养时间8-20h；培养过程中每小时取样检测A600、镜检；
S4.2.3诱导：当发酵液A600值≥3时，在15分钟内，将发酵液温度升高至42±0.5℃，开始诱导；所述的诱导，诱导阶段发酵参数按如下设定：
参数 设定值
诱导温度 42±0.5℃
pH 7.2±0.2
溶解氧(DO) 10-50
诱导时间(h) 4-6
搅拌转速(rpm) 450-600
罐压(Mpa) 0.04±0.01
空气流量(L/h) 800-2000；
S4.2.4补料控制：发酵培养过程中，当溶解氧由最高逐渐减到最低时，并且由最低突然升高至初始值时，开始按1:1的量补加蛋白质溶液和酵母提取物溶液，同时调节搅拌速度和空气流量，使溶解氧维持在50％，在诱导过程中，当发酵液溶氧升高至30％时，开始按1:1的比例流加酵母提取物溶液和葡萄糖溶液，当溶氧降低到10％时，停止流加，如此反复操作，直到结束，使溶解氧浓度维持在10-50％之间；
S4.2.5放罐和离心收集上清液：在诱导4-6h后，停止诱导，将发酵液放入无菌离心瓶中，平衡后离心，离心条件设定为：转速4000rpm、离心时间30分钟、温度4℃；离心完毕，收集上清液至烧杯中密封，放在2-8℃保存；若不在当日提取，将所得上清液放在-20℃下保存；菌体用无菌水按1:2重悬，再次离心，收集上清液混合，将菌体收集后，倒入发酵罐中，加水按1:5重悬，用蒸汽在121℃、灭菌30分钟后作废弃物处理；
S4.3提取，包括如下步骤：
凝胶过滤层析：填料名称：Sephadexl G-50；层析柱规格：Φ5×100cm；
层析系统的连接：按洗脱液→蠕动泵→已填装好的层析柱→紫外检测器、记录仪→接收瓶的顺序，将层析系统连接好；
清洗：将层析柱入液口接入无菌注射用水中，打开夹在出液口末端硅胶管上的止血钳，出液口接入废液瓶中，开启蠕动泵，调节流速为10-30ml/min，洗脱3个以上的柱体积后，关闭蠕动泵；
平衡：将层析柱入液口接入0.01mol/L PBS溶液，pH值7.0，出液口接入废液瓶中，开启蠕动泵，调节流速至10-30ml/min，待基线平稳后，洗脱3-4柱体积，关闭蠕动泵；
上样：将层析柱入液口插入发酵上清收集液中，开启蠕动泵，以10-30ml/min的流速将发酵上清收集液泵入层析柱内，当收集液剩余少许时，关闭蠕动泵，停止上样，避免将气泡泵入层析柱内；
洗脱：上样完毕，将层析柱入液口接入0.01mol/L PBS溶液，pH值7.0中，以10-30ml/min的流速进行洗脱；
目的物的收集：洗脱过程中注意观察紫外检测仪吸收值变化，当洗脱到一定程度，吸收值会迅速增大，提示准备收集；当记录笔往上升至距离基线0.5cm处时，进行目的物的接收，当记录笔往下降至与接样点相同高度处时，停止接收；接收完毕，将收集液过滤除菌，即为酵母发酵产物提取物，冷藏保存；
S4.4中间体质量控制：
S4.4.1一级种子液质量控制参数：培养时间：10-18h；接种量：0.1-5％(v/v)；吸收值A600：0.6-2.0；镜检：无杂菌，并都为典型的酵母菌形态；
S4.4.2二级种子液质量控制参数：培养时间：10-18h；接种量：5-15％(v/v)；吸收值A600：0.8-3.0；镜检：无杂菌，并都为典型的酵母菌形态；
S4.4.3发酵培养阶段质量控制参数：培养时间：8-20h；接种量：10％(v/v)；吸收值A600：≥3；
诱导培养阶段质量控制参数：诱导时间：4-6h；诱导结束吸收值A600：≥6；
S4.4.4目的物质量控制参数：蛋白含量：用Lowry法测定，目的物收集液(酵母发酵产物提取物)中蛋白含量20.8mg/L。
实验例：
1、抗氧化活性的实验：
1.1主要材料与试剂
实施例得到的酵母发酵产物提取物；Collagen I抗体、MMP-1抗体和β-acin抗体购自Bio-world公司；MTT试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；DMEM培养基购自Gibco公司；活性氧检测试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司；Western blotting系统购自美国伯乐公司；光学读数分析天平购自北京赛多利斯天平有限公司；流式细胞仪购自BeckmanCoulter公司；低温高速离心机购自eppendorf公司；酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；UVA辐照仪SS-01购自上海希格玛高技术有限公司；
1.2细胞培养
人皮肤成纤维细胞(HFF-1细胞)购自美国典型培养物保藏中心。HFF-1细胞在含有10％胎牛血清、1％丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中于37℃和5％C02下培养，然后取对数生长期细胞进行后续实验；
1.3细胞内ROS水平检测
将HFF-1细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁融合至80％后，用无血清培养基、不同浓度(5，10，20μg/mL)的酵母发酵产物提取物于37℃，5％C02下培养24h，然后使用UVA辐照仪SS-01放于细胞板上方，辐照剂量为10.8J/cm2；建模结束后，除去PBS，加入无血清培养基继续培养4h，按照活性氧检测试剂盒的说明书，向每孔中加入5μmol/L探针，于37℃条件下孵育30min，期间每隔5min轻轻混匀一下，使探针与细胞充分作用，随后用预冷的PBS冲洗2次，每次5min，以除去未进入细胞内的探针，收集细胞，采用流式细胞仪对探针含量进行检测(激发光488nm，发射光525nm)。
1.4结果
如附图1所示，在没有UVA照射的情况下细胞内ROS表达含量为1343.75，而在剂量为10.8J/cm2的UVA照射下会显著升高细胞内ROS的表达含量(p<0.01)，其ROS含量为2294.25。与此同时，在酵母发酵产物提取物的作用下能够显著降低细胞内ROS的表达含量，其随着浓度的升高依次降低ROS含量至1906.75、1716.25和1296，其中浓度为20μg/ml的酵母发酵产物提取物降低作用最强(p<0.01)，可以恢复ROS至正常水平。
以上说明本发明所述酵母发酵产物提取物可以降低皮肤成纤维细胞中ROS的表达含量从而抗皮肤的衰老。
2、上调I型胶原合成、下调基质金属蛋白酶合成的实验：
2.1主要材料与试剂
实施例得到的酵母发酵产物提取物；Collagen I抗体、MMP-1抗体和β-acin抗体购自Bio-world公司；MTT试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；DMEM培养基购自Gibco公司；活性氧检测试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司；Western blotting系统购自美国伯乐公司；光学读数分析天平购自北京赛多利斯天平有限公司；流式细胞仪购自BeckmanCoulter公司；低温高速离心机购自eppendorf公司；酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；UVA辐照仪SS-01购自上海希格玛高技术有限公司；
2.2细胞培养
人皮肤成纤维细胞(HFF-1细胞)购自美国典型培养物保藏中心；HFF-1细胞在含有10％胎牛血清、1％丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中于37℃和5％C02下培养，然后取对数生长期细胞进行后续实验；
2.3 Western blotting检测CollagenⅠ和MMP-1的蛋白表达
将HFF-1细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁融合至80％时，用无血清培养基、不同浓度的酵母发酵产物提取物(5，10，20μg/mL)于37℃，5％C02下培养24h，使用UVA辐照仪SS-01放于细胞板上方，辐照剂量为10.8J/cm2；建模结束后，除去PBS，加入无血清培养基继续培养4h，收集细胞，并使用裂解缓冲液(RPA裂解缓冲液补充有1％苯甲磺酰氟)裂解细胞，然后将裂解好的细胞在4℃下以12，000rpm离心10min，收集上清液；根据目的蛋白的分子量，取等量的蛋白样品用10％电泳胶分离并转移至硝酸纤维素膜上，然后将膜放置在含有5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1.5h；封闭后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜；第二天，使用TBST缓冲液冲洗3次后，膜与二抗于室温下孵育2h，蛋白条带图像由全自动化学发光图像分析系统捕获，并通过Quantity One软件量化蛋白质条带的强度；
2.4结果
如附图2所示，正常情况下Collagen I和MMP-1的蛋白水平分别为1.11和0.97，在剂量为10.8J/cm2的UVA照射后，Collagen I表达含量显著降低至0.80(p<005)、MMP-1的表达显著升高至1.44(p<0.01)，而酵母发酵产物提取物可以逆转Collagen I表达下调和MMP-1表达上调的作用，其随着浓度的升高，依次显著升高CollagenⅠ表达水平至1.05、1.04和1.07，降低MMP-1表达水平至1.09、0.82和0.80，且浓度为20μg/mL时，即可将Collagen-Ⅰ和MMP-1表达含量恢复与正常水平相一致(p<0.01)。
以上结果说明本发明所述酵母发酵产物提取物通过上调CollagenⅠ和下调MMP-1的蛋白表达抗皮肤衰老。
3、抗光老化实验
2.1主要材料与试剂
实施例得到的酵母发酵产物提取物；Collagen I抗体、MMP-1抗体和β-acin抗体购自Bio-world公司；MTT试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；DMEM培养基购自Gibco公司；活性氧检测试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司；Western blotting系统购自美国伯乐公司；光学读数分析天平购自北京赛多利斯天平有限公司；流式细胞仪购自BeckmanCoulter公司；低温高速离心机购自eppendorf公司；酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；UVA辐照仪SS-01购自上海希格玛高技术有限公司；
2.2细胞培养
人皮肤成纤维细胞(HFF-1细胞)购自美国典型培养物保藏中心；HFF-1细胞在含有10％胎牛血清、1％丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中于37℃和5％C02下培养，然后取对数生长期细胞进行后续实验；
2.3细胞存活率检测
将HFF-1细胞(5×103/well)铺于96孔板，待融合度达到80％后，用无血清培养基、不同浓度(5，10，20μg/mL)的酵母发酵产物提取物于37℃，5％CO2下培养24h，然后将培养基吸去，PBS温和清洗细胞两次后，每孔中加入200μL的PBS将单层细胞覆盖。随后使用UVA辐照仪SS-01放于细胞板上方，辐照剂量为10.8J/cm2，然后除去PBS，加入无血清培养基继续培养4h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，使用酶标仪检测细胞的存活率。
2.4结果
如附图3所示，与空白对照组相比，在剂量为10.8J/cm2的UVA照射下可以导致HFF-1细胞的存活率显著降低(p<0.01)，其存活率为对照组的78.84％；而酵母发酵产物提取物作用下能够显著提高UVA诱导的细胞衰老模型中细胞的存活率，其中随着浓度的升高，依次为对照组的92.26％、97.18％和99.92％，其中浓度为20μg/mL的酵母发酵产物提取物提高细胞存活率的能力最强(p<001)，几乎可以阻止UVA诱导细胞的死亡。
说明本发明所述酵母发酵产物提取物具有抑制UVA诱导的皮肤成纤维细胞死亡的作用。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，做出若干改进和变化，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种酵母发酵产物提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：将桂林兴安猫儿山葡萄采用酵母菌种进行发酵：
葡萄样品经捣碎后带皮进行自然发酵，在发酵过程中定期取样，以不同浓度梯度涂布于赖氨酸培养基，28℃培养48h，划线分离；重复多次直至得到单菌落后，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，28℃培养48h后，16％甘油保存于-80℃冰箱；所述的赖氨酸培养基：赖氨酸0.56％w/w、葡萄糖1.0％w/w、KH2PO40.1％w/w、MgSO40.05％w/w、琼脂2.0％w/w，121℃灭菌20min；所述的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：葡萄糖2.0％w/w、酵母提取物2.0％w/w、蛋白胨2.0％w/w、pH 7.0，121℃灭菌20min；
取菌悬液0.1mL进行10倍系列稀释至10-1-10-6，分别取各个稀释梯度1mL涂布于酪蛋白分离筛选培养基，28℃培养48h后，取用柠檬酸调pH值至6.0的NaOH溶液，喷于平板上，选择其中显示透明圈直径较大的菌株，备用；所述的酪蛋白分离筛选培养基：干酪素0.5％w/w、牛肉膏0.3％w/w、蛋白胨1.0％w/w、NaCl 1.0％w/w、琼脂1.5％，pH 7.0，121℃灭菌20min；
初筛菌株接种于发酵培养基I中，在37℃下于200r/min的摇床上培养48h后，分别取1mL菌液于离心管中，离心后，收集上清液进行酶活测定，将酶活力大的菌株筛选出来，备用；所述的发酵培养基I：干酪素0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 1.0％，牛肉膏0.3％，pH 7.0，121℃灭菌20min；
所述的酵母菌种选自葡萄汁有孢汉逊酵母、鲁考弗美奇酵母、奇异酵母、维多利亚维希尼克氏酵母中的一种或多种，混合时为任意比例；
S2：诱变选育：
将筛选出的菌株发酵液在离心机中5000r/min离心8min，弃去上清液，用无菌水重新悬浮；吸取2mL放置于4℃冰箱中作为对照；剩余的菌液，吸取5mL加入无菌平板中，平板置于紫外灯已照射30min的磁力搅拌器上，等距离放置距灯30cm处，照射20min，得诱变菌株1；诱变菌种1放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，照射10s，而后室温静置10s后再照射10s，温度降至室温后，在37℃培养60h，得到最终诱变菌株，诱变菌株接种于发酵培养基I，进行扩大培养，备用；
S3：4个发酵特殊配方培养基的制备：
生物素浓缩液的制备：称取0.2g生物素溶于100ml水中，0.22μm滤膜除菌过滤，2-8℃保存，待用；
蛋白质溶液：(1)蛋白粉加水溶解后得到1.5％w/w，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；或(2)取高蛋白含量植物原料粉末，加氯化钠溶液混匀后反复冻融处理2-3次，再经超声、高速均质处理，离心得到蛋白质含量1.5％w/w的溶液，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
酵母提取物溶液：酵母提取物加水溶解后得到酵母提取物含量18％w/w的溶液，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
葡萄糖溶液：葡萄糖加水溶解后得到葡萄糖含量12％w/w的溶液，蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却待用；
S4：发酵液分离提取：
S4.1：发酵种子液制备：
S4.1.1：一级种子液：在种子培养基中按0.1-5％v/v的比例接入菌种，放入恒温摇床，30℃、250rpm，培养10-18h后，取样镜检；无杂菌，并为典型的酵母菌形态，吸光度A600为0.8-2.0，则为合格的一级种子液；
S4.1.2：二级种子液：在种子培养基中按5-15％v/v的比例接入一级种子液，放入恒温摇床中，30℃、250rpm，培养10-18h后，取样镜检，无杂菌，并都为典型的酵母菌形态，吸光度A600为0.8-3.0，则为合格的二级种子液；
S4.2：发酵培养：
S4.2.1：接种：发酵培养基Ⅱ按10％v/v的比例接入二级种子液；
S4.2.2：培养；
S4.2.3诱导：当发酵液A600值≥3时，在15分钟内，将发酵液温度升高至42±0.5℃，开始诱导；
S4.2.4补料控制：发酵培养过程中，当溶解氧由最高逐渐减到最低时，并且由最低突然升高至初始值时，开始按1:1的量补加蛋白质溶液和酵母提取物溶液，同时调节搅拌速度和空气流量，使溶解氧维持在50％，在诱导过程中，当发酵液溶氧升高至30％时，开始按1:1的比例流加酵母提取物溶液和葡萄糖溶液，当溶氧降低到10％时，停止流加，如此反复操作，直到结束，使溶解氧浓度维持在10-50％之间；
S4.2.5放罐和离心收集上清液：在诱导4-6h后，停止诱导，将发酵液放入无菌离心瓶中，平衡后离心，离心条件设定为：转速4000rpm、离心时间30分钟、温度4℃；离心完毕，收集上清液至烧杯中密封，放在2-8℃保存；若不在当日提取，将所得上清液放在-20℃下保存；菌体用无菌水按1:2重悬，再次离心，收集上清液混合，将菌体收集后，倒入发酵罐中，加水按1:5重悬，用蒸汽在121℃、灭菌30分钟后作废弃物处理；
S4.3提取；
S4.4中间体质量控制：
S4.4.1一级种子液质量控制参数：培养时间：10-18h；接种量：0.1-5％v/v；吸收值A600：0.6-2.0；镜检：无杂菌，并都为典型的酵母菌形态；
S4.4.2二级种子液质量控制参数：培养时间：10-18h；接种量：5-15％v/v；吸收值A600：0.8-3.0；镜检：无杂菌，并都为典型的酵母菌形态；
S4.4.3发酵培养阶段质量控制参数：培养时间：8-20h；接种量：10％v/v；吸收值A600：≥3；
诱导培养阶段质量控制参数：诱导时间：4-6h；诱导结束吸收值A600：≥6；
S4.4.4目的物质量控制参数：蛋白含量：用Lowry法测定，目的物收集液即酵母发酵产物提取物中蛋白含量≥20mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种酵母发酵产物提取物的制备方法，其特征在于：步骤S4.1中所述的种子培养基，是将蛋白胨1％w/w、酵母提取物0.5％w/w、氯化钠0.5％w/w加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却后每千毫升加入生物素浓缩液0.2ml得到。
3.根据权利要求1所述的一种酵母发酵产物提取物的制备方法，其特征在于：步骤S4.2.1中所述的发酵培养基Ⅱ，是将蛋白胨1.5％w/w、酵母提取物1％w/w、氯化铵0.1％w/w、氯化钠0.5％w/w、磷酸氢二钠1.2％w/w、磷酸二氢钾0.3％w/w、葡萄糖0.4％w/w加水溶解后蒸汽灭菌115℃30分钟，冷却后每千毫升加入生物素浓缩液0.2ml得到。
4.根据权利要求1所述的一种酵母发酵产物提取物的制备方法，其特征在于：步骤S4.2.2中所述的培养，包括如下步骤：
S4.2.2.1培养阶段发酵参数设定：接种完毕，设定发酵培养参数，初始搅拌转速设定为150rpm，根据溶氧变化逐渐增大至600rpm；初始空气流量设定为1200L/h，根据溶氧变化逐渐增大；培养温度设定为30℃，设为自动控制；pH值设定为7.2，设为自动控制；通过调节排气阀，将罐压控制在0.04±0.01Mpa；通过调节搅拌转速和空气流量，将溶解氧浓度维持在50％以上；
Figure FDA0003885968750000031
Figure FDA0003885968750000041
S4.2.2.2发酵开始时，由于菌体细胞生长缓慢，溶解氧浓度变化不大，当菌体细胞适应了生长环境后生长速度加快，此时溶解氧浓度也缓慢下降，通过提高搅拌转速和增加空气流量来提高溶解氧浓度；当溶解氧浓度在接近初始溶氧不再下降时，表明此时基础培养基中的酵母提取物和葡萄糖已经消耗完毕，补加酵母提取物溶液和葡萄糖溶液；此时开始按1:1的量流加葡萄糖和酵母提取物溶液补料以后，溶解氧浓度迅速下降；当溶氧降低到50％时，停止流加，当溶解氧浓度迅速上升时，开始流加，如此反复，直到培养结束；
S4.2.2.3当吸收值A600≥3的时，转入诱导阶段，培养时间8-20h；培养过程中每小时取样检测A600、镜检。
步骤S4.2.3所述的诱导，诱导阶段发酵参数按如下设定：
Figure FDA0003885968750000042
5.根据权利要求1所述的一种酵母发酵产物提取物的制备方法，其特征在于：步骤S4.3所述的提取，包括如下步骤：
凝胶过滤层析：填料名称：Sephadexl G-50；层析柱规格：Φ5×100cm；
层析系统的连接：按洗脱液→蠕动泵→已填装好的层析柱→紫外检测器、记录仪→接收瓶的顺序，将层析系统连接好；
清洗：将层析柱入液口接入无菌注射用水中，打开夹在出液口末端硅胶管上的止血钳，出液口接入废液瓶中，开启蠕动泵，调节流速为10-30ml/min，洗脱3个以上的柱体积后，关闭蠕动泵；
平衡：将层析柱入液口接入0.01mol/L PBS溶液，pH值7.0，出液口接入废液瓶中，开启蠕动泵，调节流速至10-30ml/min，待基线平稳后，洗脱3-4柱体积，关闭蠕动泵；
上样：将层析柱入液口插入发酵上清收集液中，开启蠕动泵，以10-30ml/min的流速将发酵上清收集液泵入层析柱内，当收集液剩余少许时，关闭蠕动泵，停止上样，避免将气泡泵入层析柱内；
洗脱：上样完毕，将层析柱入液口接入0.01mol/L PBS溶液，pH值7.0中，以10-30ml/min的流速进行洗脱；
目的物的收集：洗脱过程中注意观察紫外检测仪吸收值变化，当洗脱到一定程度，吸收值会迅速增大，提示准备收集；当记录笔往上升至距离基线0.5cm处时，进行目的物的接收，当记录笔往下降至与接样点相同高度处时，停止接收；接收完毕，将收集液过滤除菌，即为酵母发酵产物提取物，冷藏保存。
6.一种酵母发酵产物提取物，其特征在于：采用权利要求1-5任一项所述的一种酵母发酵产物提取物的制备方法得到。
7.权利要求6所述的一种酵母发酵产物提取物在护肤化妆品中的应用，其特征在于：在制备抗氧化活性化妆品、上调I型胶原合成化妆品、下调基质金属蛋白酶合成化妆品，抗光老化化妆品中的应用。
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