CN101307348A - 从淡水鱼鱼鳞中制备未变性胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业天然产物提取领域,具体涉及从淡水鱼鳞中制备未变性胶原蛋白的方法,具体步骤为:1)将洗净的鱼鳞加入蒸馏水,用电动搅拌器间歇搅拌3-5分钟,蒸馏水洗至表面无色素和脂肪等附着;自然风干或低温干燥后粉碎至40-50目;2)将1)的材料按1∶10-1∶20加入为8-10%柠檬酸、苹果酸溶液,冰水浴微波处理2min,10-20℃脱钙8-24h,过滤,滤液置10℃以下静置5-10h,得柠檬酸钙沉淀;3)向经步骤2)处理后所得的脱钙鱼鳞中按1∶5至1∶20比例加入1%的苹果酸或柠檬酸溶液(含蛋白酶)于0-20℃搅提取2-4次,每次12-48h,离心,取上清,加NaCl至终浓度为0.7-0.90mol/L,盐析过夜,离心,沉淀用0.50mol/L乙酸溶解,重复盐析和溶解操作1次,将沉淀透析,冷冻干燥得本发明的产品。
Description
技术领域
本发明属于农业天然产物的化学的提取领域,具体涉及一种从鱼鳞中制备未变性胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原(Collagen)蛋白是一种重要的功能性蛋白质,它与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合等密切相关。由于胶原蛋白的特殊功能,其提取物已被广泛应用于医药、食品、日用化工、生物合成等工业领域,如医用胶囊、外科手术材料、食用明胶、照相明胶、化妆品等。目前生产的胶原蛋白制品的原料主要来源是从猪、牛等陆生哺乳动物的皮、骨和肌腱,因近年来随着全球生态环境恶化导致许多疯牛病、口蹄疫等流行病的发生,使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大。欧美、日本等国家相继出台了不少法规,限制从牛等哺乳动物皮骨中提取物用于食品医药等对人体直接影响的产品中。因此,从水生动物鱼体废弃物中提取安全、卫生、无害的胶原蛋白已成为当前国内外业内人士研发的一个热门课题。
分析显示,胶原蛋白含量占鱼体总蛋白的25-30%,主要分布于鱼鳞和鱼皮中,且鱼鳞、鱼皮中的粗胶原蛋白就约占80%,而一般水产加工中都将鱼鳞、鱼皮作为废弃物扔掉的,尤其是鱼鳞。因此,充分而合理地利用废弃物鱼鳞提取胶原蛋白不仅可推动水产加工业的发展,而且能化废为宝、减少环境污染,更好地造福于人类。我国是世界上最大的淡水鱼养殖国,据不完全统计,每年废弃鱼鳞约达5万吨,鱼鳞资源相当丰富,目前国内已有多家鱼鳞收购公司,将鱼鳞晒干作为一种资源出口。国外如日本也十分看好中国鱼鳞资源,并将在中国筹建生产基地共同开发鱼鳞胶原蛋白产品。
目前国内外公开发表的有关利用鱼体废弃物资源提取胶原蛋白的研究文献不少,以鱼皮为原料制取胶原蛋白较多,一般可采用酸碱处理法和酶解法。而鱼鳞胶原蛋白提取工艺通常采取以下工艺流程:鱼鳞→清洗凉干→酸碱脱盐处理→熬胶→过滤→浓缩→凝固→切片→干燥→粉碎制成品。上海水产研究所文献报道了制取鱼鳞胶原蛋白新工艺,其采用鱼鳞→清洗→脱脂→脱灰→热熔法→酶解→脱色→精滤→浓缩→灭菌→干燥→胶原蛋白粉末的制作工艺。专利号为CN1628540的文献涉及其以鱼鳞为原料,经清洗处理(去鱼鳞表面粘稠物及杂质)、干燥去腥、酸碱法脱灰脱脂,后进行高压催化蒸解,提炼液体状鱼鳞胶原蛋白产品。专利CN1582771涉及一种用鱼皮生产胶原蛋白工艺:将鱼皮洗净浸入稀碱水(NaOH或NaHCO3)中去除其杂蛋白,用醋酸水溶液溶解胶原蛋白后加食品酶和风味酶水解,使胶原蛋白形成小分子,经除苦、脱色、浓缩、干燥,即制成胶原蛋白肽。专利CN1560270还利用废弃物鱼皮胶原蛋白,以复合酶分步定向水解法生产降血压活性肽。其将鱼皮胶原蛋白放入磷酸缓冲溶液中,加入菠萝蛋白酶进行酶解,灭酶后用碱调pH至7.0-8.0,再加入Alcalase碱性蛋白酶酶解、灭酶、冷却至常温,冻干后制得其降血压活性肽。专利CN1382806通过碱溶液处理深海鱼皮,再利用限制性酶解法处理鱼皮,净化酶解上清液即得可降解生物相容性的鱼皮胶原蛋白。日本专利JP2001200000公开了从海洋生物鲑鱼鱼皮中提取胶原蛋白的制备方法,先对鱼皮进行脱脂脱灰酸法处理,然后进行蛋白酶酶解、过滤、脱色、精滤、浓缩、灭菌干燥制得胶原蛋白粉。美国专利US2002164681提及从鱼皮、猪或牛皮中,采用蛋白酶酶解法提取制备胶原质,其中蛋白酶可选用木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等,经脱脂脱磷、酸处理后可得到生物相容性好的鱼皮胶原蛋白。欧洲专利EP682873公开了从海洋动物鱼体废弃物中采用胃蛋白酶、胰蛋白酶等酶解处理方法制得鱼体胶原蛋白。
上述专利或专利申请多以鱼皮为研究对象,与本发明的主题有很大的差别,且传统鱼类胶原蛋白提取大都采用氢氧化钠和盐酸或氯化钠和盐酸浸泡等前处理去杂脱钙,丰富的钙质未能得到有效利用,提取过程中有大量腐蚀性物质(氢氧化钠、盐酸等)介入,而且很多工艺还采用高温高压或酶解处理,所得产物均为水解或变性的胶原肽,不属于未变性胶原蛋白的范畴。Nagai等的文献报道了一种从海水鱼鱼鳞中提取天然胶原蛋白的方法,但提取过程中也是采用氢氧化钠浸泡等去杂,Tris-HCl及EDTA脱钙,生产过程中三废污染严重,前处理工艺就需7天,提取周期长,难以实现工业化;虽然专利CN1597741涉及一种未变性天然鱼胶原制备法,以鱼皮为原料,用醚或与水混合的非离子表面活性剂溶液中浸泡5-24h,过滤后用EDTA溶液搅拌处理24-48h。在过滤后沉渣中加入蛋白酶,用pH=2-4酸调节与搅拌,在离心过滤得到的胶原溶液中加入NaCl盐析,经膜透析反复处理得到高纯度的未变性天然鱼胶原蛋白液。此专利的主体与本发明明显不同,同时其具体提取方法与本发明也有很大差别。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,研制一种从淡水鱼副产物中特别是从淡水鱼鳞中提取天然胶原蛋白的方法。本发明不仅工艺简便、实用,提取周期大大缩短,提取率高,能耗低,生产成本较低,整个提取过程都没有毒害或腐蚀性物质的涉入,对环境无污染,且所提胶原蛋白为未变性胶原蛋白,可大大提高水产品加工副产物的附加值,产生明显的经济效益和社会效益。
本发明所述的制备方法包括以鱼鳞的预处理、脱钙、胶原蛋白的提取、分离等处理过程。具体为:
一种从淡水鱼鳞中提取未变性胶原蛋白的方法,其步骤包括鱼鳞预处理、脱钙、胶原蛋白提取和分离,其特征在于以下步骤:
(1)鱼鳞的预处理:将洗净的鱼鳞按重量/体积比为1∶10至1∶15加入洁净自来水,采用电动搅拌器于20℃以下间歇搅拌,搅拌速度为1500-3500r/min,搅拌时间为1-10分钟(优选地,步骤(1)中搅拌机的速度为2500r/min,处理时间为3-5分钟),用蒸馏水将所述的鱼鳞洗至表面无色素和脂肪附着,自然风干或置于<50℃温度下干燥,将所述的鱼鳞粉碎至40-50目,得到预处理鱼鳞;
(2)脱钙处理:将步骤(1)得到的预处理鱼鳞按重量/体积比为1∶10-1∶20,加入浓度为4-12%的柠檬酸或苹果酸溶液,冰水浴中用微波处理1-5min,所述的微波功率为100-500W,然后于4-25℃下脱钙处理6-30h,过滤分离得到脱钙鱼鳞和滤液,将所得的滤液置10℃以下静置5-10h,得到柠檬酸钙沉淀,(优选地,步骤(2)所述的微波功率为200-300W,处理2min,所述的柠檬酸、苹果酸溶液的浓度为8-10%,处理温度为10-20℃);
(3)提取分离:向步骤(2)所得的脱钙鱼鳞按重量/体积比为1∶5至1∶20加入质量浓度为1%的含质量分数为0.1-2%胃蛋白酶或0.5-1%碱性蛋白酶的苹果酸或柠檬酸溶液,于0-20℃下提取2-4次,其中,采用胃蛋白酶时的提取温度为4-25℃,采用碱性蛋白酶时提取温度为0-10℃(优选地,采用胃蛋白酶时温度控制在10-20℃,采用碱性蛋白酶时提取温度控制在0-4℃)。上述胃蛋白酶或碱性蛋白酶提取时间均为12-48h,提取完毕后用纱布过滤,将得到的滤液置20℃以下5000-50000g离心10-20min,取上清液,加NaCl至其终浓度为0.7-0.90mol/L,盐析过夜,5000-50000g离心10-30min,取沉淀,将所得的沉淀用0.50mol/L乙酸溶解,重复盐析1次,再将得到的沉淀用蒸馏水透析1-3d,每天更换蒸馏水2-3次,将透析液冷冻干燥,即得未变性的鱼鳞胶原蛋白。
本发明较好的解决了现有技术存在的两大缺陷;一是现有技术在提取过程中使用大量的毒害或腐蚀性物质如氢氧化钠或盐酸等进行前处理去杂脱钙,不仅腐蚀设备,污染环境,所得钙液无法被回收利用,本发明先采用机械搅拌处理去除鱼鳞表面的脂肪、色素等杂质,然后采用微波短时处理结合食用酸脱钙巧妙地解决了这一技术缺陷。二是本发明大大简化和缩短了鱼鳞胶原蛋白提取前处理工艺,缩短了胶原蛋白的提取周期,提高了提取效率,且提取所得产物均为未变性胶原蛋白。
本发明的积极效果是:
1)与现有技术相比,本发明整个提取过程均所用可食性试剂,没有毒害或腐蚀性物质的涉入,这不仅可使设备免于被腐蚀,也使得所提胶原蛋白具有更高的安全性。
2)本发明鱼鳞胶原蛋白得率较高:据测定,从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白的得率可达到26.4-38.9%。
3)本发明提取的胶原蛋白为天然I型胶原蛋白,其纯度达83.2%-93.9%。
4)本发明在提取胶原蛋白的同时钙也能被回收利用。
5)本发明的制备方法使鱼鳞胶原蛋白的提取周期从传统的10-15天缩短至5-6天,且对环境无污染。
以下结合实例,对本发明作进一步的详细描述,但并不说明本发明仅限于此范围。
附图说明
图1是鱼鳞胶原蛋白酸溶液的热变性曲线
图2是鱼鳞胶原蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图
1.高分子量标准蛋白质;2.小牛腱I型胶原蛋白;3.草鱼鱼鳞胶原蛋白图3是鱼鳞胶原蛋白傅立叶红外光谱图
1.鱼鳞鱼鳞胶原蛋白;2.小牛腱I型胶原蛋白
具体实施方式
实施例1
将洗净的的新鲜草鱼(市售)鱼鳞按1∶10(W/V)的比例加入洁净的自来水,采用电动搅拌器(仪器型号:JJ-200W,江苏省金坛市环宇科学仪器厂)于20℃以下间歇搅拌3分钟(2500转/分),用洁净的自来水将鱼鳞洗至表面无色素和脂肪等附着。自然风干或40-50℃干燥后粉碎至50目。称取100g经预处理原料按1∶10(W/V)的比例加入浓度为10%柠檬酸水溶液,冰水浴中微波(500W)处理1min(保持体系温度低于20℃),然后于10脱钙24h,过滤分离得脱钙鱼鳞片和滤液,将所得的滤液置4℃静置10h,得到柠檬酸钙沉淀;向所得的脱钙鱼鳞片中按1∶10(W/V)比例加入质量浓度为1%柠檬酸溶液(溶液内含1%胃蛋白酶或0.5-1%碱性蛋白酶,以质量分数计)于10℃提取2次,每次24h,提取完毕经纱布过滤,滤液在4℃以12000g离心10-20min,倾出上清液,加NaCl至其最终浓度为0.90mol/L,盐析过夜,20000g离心10-30min,沉淀用0.50mol/L乙酸溶解,重复盐析和溶解操作1次,将得到沉淀移入透析袋,用蒸馏水透析1-3d,每天更换蒸馏水2-3次。透析液冷冻干燥(德国Marin Christ公司,ALPHA 1-4LD真空冷冻干燥机)后得到12.4g未变性鱼鳞胶原蛋白天然鱼鳞胶原蛋白,其纯度为93.4%。
实施例2
将洗净的新鲜鲫鱼(市售产品)鱼鳞按1∶15(W/V)的比例加入洁净自来水,20℃以下采用电动搅拌器(仪器型号:JJ-200W,江苏环宇科学仪器厂)间歇搅拌5分钟(1500转/分),蒸馏水洗至表面无色素和脂肪等附着。自然风干或50℃干燥后粉碎至40目。称取100g经预处理原料按1∶15(W/V)的比例加入浓度为8%苹果酸水溶液,冰水浴中微波(380W)处理2min(保持体系温度低于20℃),然后于15℃脱钙20h,过滤分离得脱钙鱼鳞片和滤液,将所得的滤液置10℃以下静置8h,得到柠檬酸钙沉淀;向所得的脱钙鱼鳞片中按1∶10(W/V)比例加入质量浓度为1%苹果酸溶液(含1%胃蛋白酶,以质量分数计)于15℃提取3次,每次12h,提取完毕经纱布过滤,滤液在20℃以下以12000g离心10-20min,倾出上清液,加NaCl至其最终浓度为0.90mol/L,盐析过夜,20000g离心10-30min,沉淀用0.50mol/L乙酸溶解,重复盐析和溶解操作1次,将得到沉淀移入透析袋,用蒸馏水透析1-3d,每天更换蒸馏水2-3次。透析液冷冻干燥(德国Marin Christ公司,ALPHA 1-4LD真空冷冻干燥机)后得到10.9g未变性鱼鳞胶原蛋白天然鱼鳞胶原蛋白,其纯度为83.6%。
实施例3
将洗净的草鱼(市售产品)鱼鳞按1∶12(W/V)的比例加入洁净自来水,20℃以下采用电动搅拌器(仪器型号:JJ-200W,江苏省金坛市环宇科学仪器厂)间歇搅拌2分钟(3500转/分),蒸馏水洗至表面无色素和脂肪等附着。自然风干或50℃干燥后粉碎至40目。称取100g经预处理原料按1∶10(W/V)的比例加入浓度为10%柠檬酸水溶液,冰水浴中微波(100W)处理5min(保持体系温度低于20℃),然后于10℃脱钙24h,过滤分离得脱钙鱼鳞片和滤液,将所得的滤液置4℃静置10h,得到柠檬酸钙沉淀;向所得的脱钙鱼鳞片中按1∶10(W/V)比例加入质量浓度为1%柠檬酸溶液(该溶液内含1%碱性蛋白酶,以质量分数计)于0-4℃提取2次,每次24h,提取完毕经纱布过滤,滤液在4℃以12000g离心10-20min,倾出上清液,加NaCl至其最终浓度为0.90mol/L,盐析过夜,20000g离心10-30min,沉淀用0.50mol/L乙酸溶解,重复盐析和溶解操作1次,将得到沉淀移入透析袋,用蒸馏水透析1-3d,每天更换蒸馏水2-3次。透析液冷冻干燥(德国Marin Christ公司,ALPHA 1-4LD真空冷冻干燥机)后得到13.7g未变性鱼鳞胶原蛋白天然鱼鳞胶原蛋白,其纯度为91.8%。
Claims (4)
1、从淡水鱼鳞中提取未变性胶原蛋白的方法,其步骤包括鱼鳞预处理、脱钙、胶原蛋白提取和分离,其特征在于以下步骤:
(1)鱼鳞的预处理:将洗净的鱼鳞按重量/体积比为1∶10至1∶15加入洁净的自来水,采用电动搅拌器于20℃以下间歇搅拌,搅拌速度为1500-3500r/min,搅拌时间为1-10分钟,用蒸馏水将所述的鱼鳞洗至表面无色素和脂肪附着,自然风干或置于<50℃温度下干燥,将所述的鱼鳞粉碎至40-50目,得到预处理鱼鳞;
(2)脱钙处理:将步骤(1)得到的预处理鱼鳞按重量/体积比为1∶10-1∶20,加入浓度为4-12%的柠檬酸或苹果酸溶液,冰水浴中用微波处理1-5min,所述的微波功率为100-500W,然后于4-25℃下脱钙处理6-30h,过滤分离得到脱钙鱼鳞和滤液,将所得的滤液置10℃以下静置5-10h,得到柠檬酸钙沉淀;
(3)提取分离:向步骤(2)所得的脱钙鱼鳞按重量/体积比为1∶5至1∶20加入质量浓度为1%的含质量分数为0.1-2%胃蛋白酶或0.5-1%碱性蛋白酶的苹果酸或柠檬酸溶液,于0-20℃下提取2-4次,其中,采用胃蛋白酶时的提取温度为4-25℃,采用碱性蛋白酶时提取温度为0-10℃,每次处理12-48h,提取完毕后用纱布过滤,将得到的滤液置20℃以下5000-50000g离心10-20min,取上清液,加NaCl至其终浓度为0.7-0.90mol/L,盐析过夜,5000-50000g离心10-30min,取沉淀,将所得的沉淀用0.50mol/L乙酸溶解,重复盐析1次,再将得到的沉淀用蒸馏水透析1-3d,每天更换蒸馏水2-3次,将透析液冷冻干燥,即得未变性的鱼鳞胶原蛋白。
2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中搅拌机的速度为2500r/min,处理时间为3-5分钟。
3、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的微波功率为200-300W,处理2min,所述的柠檬酸、苹果酸溶液的浓度为8-10%,处理温度为10-20℃。
4、根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的蛋白酶是胃蛋白酶或碱性蛋白酶,采用胃蛋白酶时温度为10-20℃,采用碱性蛋白酶时提取温度为0-4℃。
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