CN113717251B - 一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽及其制备方法，以鱼鳞为原料，通过前处理及木瓜蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到高活性的抗冻多肽，经过检测分析，该抗冻肽的分子量在1107.54~1554.72Da，所含的三种主要多肽氨基酸序列分别是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG。本发明充分利用鱼鳞废弃物资源，变废为宝，制备一种低成本、高活性的天然抗冻多肽，克服了常见抗冻剂及抗冻蛋白的不足与弊端，来源广、安全性好、成本低廉、热稳定性好等特点有利于其工作业化推广应用，具有较好的应用前景。本发明为制备新型抗冻多肽及探索其在食品、医学等方面的应用提供技术支持和理论基础。

Description

一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽及其制备方法。
背景技术
草鱼在我国渔业发展中占有重要地位，《中国渔业统计年鉴》统计结果显示，2018年我国淡水鱼养殖产量达2959.84万吨，其中草鱼产量最大，达到550.43万吨，在保障人民生活水平、解决渔民、农民就业、保护生态环境等方面发挥不可替代的作用。近年来，各种草鱼加工产品如调理食品、休闲食品、鱼糜制品等连年攀升。但是，草鱼加工量提高的同时也造成大量鱼鳞等副产物的产生，据不完全统计，每年草鱼鱼鳞的产量在10万吨左右，这些副产物产量大、易腐烂变臭、处理困难，从而造成严重的资源浪费和环境污染。
食品在低温存储和运输的过程中由于温度的波动变化导致冰晶生长、冻融、重结晶的现象，严重破坏细胞和组织机构，导致产品品质下降。如何抑制冰晶生长及重结晶，是保证低温冷链上食品品质不受其影响的关键。
抗冻蛋白是一种可以减少液体冰晶形成，改良冰晶结构/降低冰晶重结晶的物质，但是抗冻蛋白的提取率低，不能够大量制备，因此也造成其提取成本高，价格高昂的特点，除此之外抗冻蛋白的热稳定性差等问题也限制了它的利用。抗冻多肽是具有与抗冻蛋白相同优质性质的分子，但抗冻多肽却不存在抗冻蛋白的一些缺点，它不仅具有非常广泛的原材料来源，而且相对于抗冻蛋白，它的制备成本更低并且还拥有很好的热稳定性质。同时抗冻多肽的生产过程相对更加简单快捷，只用对原材料进行酶解，并且得到的抗冻多肽比制备抗冻蛋白的产量更大，更有利于企业扩大规模进行量产。其良好的性质使得抗冻多肽在冷冻食品添加剂领域中有重要的研究价值和很好的使用前景。
抗冻多肽的研究者们近些年来发现从富含胶原蛋白的哺乳动物皮类、鱼类等原料中通过酶解的方式得到具有热滞活性、修饰冰晶形态和抑制重结晶作用的胶原抗冻多肽。现在研究比较多的胶原抗冻肽种类有：猪皮明胶抗冻多肽、鱼皮明胶抗冻多肽、鲨鱼皮抗冻多肽。且其均是采用酶解的方式，并通过利用凝胶过滤色谱或强阳离子交换色谱等手段进行分离、纯化以得到其所要研究的抗冻多肽。近年来，猪瘟、口蹄疫等疾病的爆发，哺乳类动物来源的抗冻蛋白、抗冻多肽存在安全性隐患。
数据表明，鱼鳞中含有60%左右的胶原蛋白，但是作为下脚料，通常作为废弃物处理，污染环境又浪费资源，基于此，以鱼鳞为原料，研发明胶、胶原蛋白、抗冻剂等产品是鱼鳞高值化综合利用的主要趋势。至今为止尚未有文献系统的研究从鱼鳞中提取抗冻多肽的方法及其抗冻性能。所以本研究用草鱼加工副产物鱼鳞作为原料提取出具有抗冻活性的胶原抗冻多肽，不仅增加了抗冻肽的来源，降低成本，而且充分利用资源。
这种新型的抗冻多肽活性高、来源广、安全性好、成本低，既能解决冷冻食品、医药用品等冷链食品存储和运输过程中的品质破坏问题，又能充分运用废弃原料，解决鱼类下脚料对环境的污染问题，具有非常大的现实意义和应用价值。
制备抗冻多肽类似的发明专利有：
1.发明名称：一种利用碱性蛋白酶酶解鱼皮胶原蛋白制备的抗冻多肽（公开号：CN103467572A）
2. 发明名称：一种利用木瓜蛋白酶酶解猪皮胶原蛋白制备的抗冻多肽（公开号：CN 101921317B）
3. 发明名称：利用碱性蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白制备抗冻多肽（公开号：CN101921328B）
4. 发明名称：一种利用猪皮胶原蛋白制备的抗冻多肽（公开号：CN 101921316B）
5. 发明名称：利用木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白制备抗冻多肽（公开号：CN101921311B）
上述五篇发明专利在制备抗冻多肽的方法上存在以下几点技术问题：
1. 哺乳动物皮类来源存在的弊端：近年来，猪瘟、口蹄疫等疾病的爆发，用哺乳类动物作为原料制备的抗冻多肽的安全性存在隐患。
2.文献报道鱼皮胶原蛋白制备的抗冻多肽的抗冻活性热滞活性0.63℃，抗冻活性不够高。
3. 文献报道的提取方法程序多、效率低、耗时长，本发明所采取的方法制备工艺更省时、环节更少。
4.鱼鳞作为废弃物，相较于其他原料，成本更低。
发明内容
本发明为了解决现有技术中的不足之处，提供一种制备活性高、安全性好、效率高、成本低、来源广、且为食源性的草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽，该抗冻多的分子量在1107.54～1554.72Da，所含的三种主要多肽氨基酸序列分别是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG。
一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用草鱼鱼鳞为原料，先对草鱼鱼鳞进行处理；
（2）对处理后的草鱼鱼鳞进行酶解；
（3）分离纯化酶解液；
（4）冷冻干燥后得到所述的抗冻多肽；
（5）对抗冻多肽的抗冻活性进行测定，确定最佳酶解条件；
（6）测定抗冻多肽的氨基酸序列。
步骤（1）的具体操作过程为：将草鱼鱼鳞清洗、晒干后进行粉碎，并进行45°C超声清洗50分钟；之后将洗净的鱼鳞过滤干净，使用1mol/L的柠檬酸溶液震荡浸泡24h，最后将鱼鳞过滤清洗至中性后备用。
步骤（2）的具体操作过程为：酶购自Sigma 生物试剂公司；采用单因素实验，对四个酶解因素进行考察，四个酶解因素分别为酶解温度：45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，加酶量：2500 U/g、3000 U/g、3500 U/g、4000 U/g和4500U/g，料液比：1：10、1：15、1：20，酶解pH：3、4、5、6和7；
称取3g在步骤（1）中处理后的草鱼鱼鳞溶解于60m1蒸馏水中，按照不同的酶与底物草鱼鱼鳞的比例加入相应量的酶，在一定的温度下水解一定的时间，反应结束后，沸水浴10min灭酶，收集酶水解的溶液；在4℃、8000r/min条件下用冷冻离心机离心15min，取其上清液。
步骤（3）对上清液的酶解产物分离纯化的具体操作过程为：酶解产物首先选用凝胶色谱进行分离，第一次分离采用的洗脱液为pH7.0的PBS缓冲溶液，流速为0.8mL /min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，再用阳离子交换色谱进行分离，第二次分离采用的采用洗脱液为NaCl浓度为0-0.5M的0.01mol/L pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，流速为0.5mL /min，收集具有最佳抗冻活性的峰，接着再用C18反相HPLC进一步分离，最后收集具有最佳抗冻活性的组分。
步骤（5）具体过程为：
1）对酵母微生物低温保护效果测定
取1g活性干酵母放入离心管中，与10倍蒸馏水混合（平行+空白），在10℃下震荡20min，然后将抗冻多肽以两个水平0%（空白的酵母悬浮液）和0.5%酵母悬浮液分别加入到离心管中震荡，制成酵母悬浮液，分别冻藏3d酵母悬浮液，对酵母菌落进行培养，计算出酵母的存活率；
细胞存活率=100%×（培养出细胞的数量/细胞总数）
2）热滞活性THA的测定
将冻干后的多肽样品配制成20mg/mL的水溶液；取5μL的多肽溶液密封于坩埚内，置于DSC炉体中测定抗冻多肽的THA；初始温度为20℃，以5℃/min的速率降温至-20℃，保持2 min，再以相同的速率升温至20℃，保持2 min，根据熔融曲线计算多肽溶液的熔融焓Hm和熔点Tm，然后，以5℃/min速率降温至-20℃，保持2 min，再以1 ℃/min的速率缓慢升温至样品呈部分熔融状态，这一温度称为保留温度Th，在Th下保持2 min，最后以相同的速率降温至-20℃；重复上述过程，选取不同的Th，分别按照公式(1)和(2)计算THA和冰晶含量Φ；
THA=Th-To （1）
φ（%）=（1-(-∆Hr)/∆Hm）×100 （2）
式中，THA指热滞活性，℃；Th指保留温度，℃；T0指起始结晶温度，℃ ；Φ指冰晶含量，%；∆Hr指结晶焓，J/g；∆Hm指熔融焓J/g。
步骤（6）的具体操作过程为：用LC-MS/MS 进行检测步骤（5）分离出的具有较强抗冻活性的组分的其氨基酸序列。
步骤（5）通过对抗冻多肽的抗冻活性进行测定，确定最佳酶解条件；得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是：酶采用碱性蛋白酶，酶解温度40-60℃、酶解时间为3-5h、酶-底物草鱼鱼鳞配比为1：10-1：20（w/w）、酶解pH为4-6。
最大抗冻活性的酶解液的酶解条件优选为：酶采用木瓜蛋白酶，底物草鱼鱼鳞浓度5%、pH6、酶解时间3h、酶解温度60°C、加酶量4000U/g。
采用上述技术方案，步骤（2）优化后得到最佳酶解条件，其酶解物的热滞活性为2.66℃；步骤（3）对上清液的酶解产物用凝胶色谱进行分离，分离出抗冻活性最高的组分F3，其热滞活性为2.7℃，接着用阳离子交换色谱分离F3，得到最佳抗冻活性的峰S2，其热滞活性为4.55℃，接着再用C18反相HPLC进一步分离S2，最后收集具有最佳抗冻活性的组分P7，其热滞活性为5.09℃；步骤（5）测定收集到的组分P7的酵母微生物低温保护效果，添加了0.5%（w/w）P7组分冻藏24h后酵母的存活率提高到84.4%，与对照相比，可见经过纯化后的抗冻多肽对酵母在冻藏条件下具有很强的保护作用；步骤（6）测定抗冻肽多的分子量在1107.54~1554.72Da，所含的三种主要多肽氨基酸序列分别是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG。
综上所述，本发明与现有技术相比具有以下优点：
1.本发明从鱼鳞中提取抗冻多肽，为抗冻多肽制备提供低成本新原料，解决现有抗冻蛋白、抗冻多肽成本高的问题。
2.本发明分离纯化的高活性草鱼鱼鳞抗冻多肽，弥补了草鱼鱼鳞源的抗冻多肽研究的空白。
3.文献报道，植物抗冻蛋白的THA通常为0.06～0.35℃，鱼类抗冻蛋白的THA为0.2～0.6℃，鱼皮抗冻多肽的THA是0.63 ℃。本发明制备的草鱼鱼鳞胶原抗冻多肽的热滞活性达到了5.09℃，高于同类来源的抗冻多肽，显著提高酵母微生物在相同低温条件下的存活率。其纯度高、活性强、安全性好，可作为食品、医学、生物、化工、冷链物流等多个领域的安全添加剂。
4．本发明制备方法操作简单，适合工业化生产。提取率高、原来来源广、成本低廉，极大的降低了生产成本，具有良好的市场前景。
5.该抗冻肽多的分子量在1107.54~1554.72Da，所含的三种主要多肽氨基酸序列分别是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG。
附图说明
图1是本发明中凝胶色谱分离图；
图2是本发明中凝胶过滤色谱分离后不同组分的热滞活性图；
图3是本发明中离子交换色谱图；
图4是本发明中离子交换色谱分离后不同组分的热滞活性图；
图5是本发明中离子交换色谱图；
图6是本发明中C18液相色谱分离后不同组分的热滞活性图；
图7是本发明中P7组分酵母微生物低温保护效果。
具体实施方式
本发明的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽，该抗冻多的分子量在1107.54～1554.72Da，所含的三种主要多肽氨基酸序列分别是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG。
一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用草鱼鱼鳞为原料，先对草鱼鱼鳞进行处理；
（2）对处理后的草鱼鱼鳞进行酶解；
（3）分离纯化酶解液；
（4）冷冻干燥后得到所述的抗冻多肽；
（5）对抗冻多肽的抗冻活性进行测定，确定最佳酶解条件；
（6）测定抗冻多肽的氨基酸序列。
步骤（1）的具体操作过程为：将草鱼鱼鳞清洗、晒干后进行粉碎，并进行45°C超声清洗50分钟；之后将洗净的鱼鳞过滤干净，使用1mol/L的柠檬酸溶液震荡浸泡24h，最后将鱼鳞过滤清洗至中性后备用。
步骤（2）的具体操作过程为：酶购自Sigma 生物试剂公司；采用单因素实验，对四个酶解因素进行考察，四个酶解因素分别为酶解温度：45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，加酶量：2500 U/g、3000 U/g、3500 U/g、4000 U/g和4500U/g，料液比：1：10、1：15、1：20，酶解pH：3、4、5、6和7；
称取3g在步骤（1）中处理后的草鱼鱼鳞溶解于60m1蒸馏水中，按照不同的酶与底物草鱼鱼鳞的比例加入相应量的酶，在一定的温度下水解一定的时间，反应结束后，沸水浴10min灭酶，收集酶水解的溶液；在4℃、8000r/min条件下用冷冻离心机离心15min，取其上清液。
步骤（3）对上清液的酶解产物分离纯化的具体操作过程为：酶解产物首先选用凝胶色谱进行分离，第一次分离采用的洗脱液为pH7.0的PBS缓冲溶液，流速为0.8mL /min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，再用阳离子交换色谱进行分离，第二次分离采用的采用洗脱液为NaCl浓度为0-0.5M的0.01mol/L pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，流速为0.5mL /min，收集具有最佳抗冻活性的峰，接着再用C18反相HPLC进一步分离，最后收集具有最佳抗冻活性的组分。
步骤（5）具体过程为：如图1，图2和图3所示，
1）对酵母微生物低温保护效果测定
取1g活性干酵母放入离心管中，与10倍蒸馏水混合（平行+空白），在10℃下震荡20min，然后将抗冻多肽以两个水平0%（空白的酵母悬浮液）和0.5%酵母悬浮液分别加入到离心管中震荡，制成酵母悬浮液，分别冻藏3d酵母悬浮液，对酵母菌落进行培养，计算出酵母的存活率；
细胞存活率=100%×（培养出细胞的数量/细胞总数）
2）热滞活性THA的测定
将冻干后的多肽样品配制成20mg/mL的水溶液；取5μL的多肽溶液密封于坩埚内，置于DSC炉体中测定抗冻多肽的THA；初始温度为20℃，以5℃/min的速率降温至-20℃，保持2 min，再以相同的速率升温至20℃，保持2 min，根据熔融曲线计算多肽溶液的熔融焓Hm和熔点Tm，然后，以5℃/min速率降温至-20℃，保持2 min，再以1 ℃/min的速率缓慢升温至样品呈部分熔融状态，这一温度称为保留温度Th，在Th下保持2 min，最后以相同的速率降温至-20℃；重复上述过程，选取不同的Th，分别按照公式(1)和(2)计算THA和冰晶含量Φ；
THA=Th-To （1）
φ（%）=（1-(-∆Hr)/∆Hm）×100 （2）
式中，THA指热滞活性，℃；Th指保留温度，℃；T0指起始结晶温度，℃ ；Φ指冰晶含量，%；∆Hr指结晶焓，J/g；∆Hm指熔融焓J/g。
步骤（6）的具体操作过程为：用LC-MS/MS 进行检测步骤（5）分离出的具有较强抗冻活性的组分的其氨基酸序列。
步骤（5）通过对抗冻多肽的抗冻活性进行测定，确定最佳酶解条件；得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是：酶采用碱性蛋白酶，酶解温度40-60℃、酶解时间为3-5h、酶-底物草鱼鱼鳞配比为1：10-1：20（w/w）、酶解pH为4-6。
最大抗冻活性的酶解液的酶解条件优选为：酶采用木瓜蛋白酶，底物草鱼鱼鳞浓度5%、pH6、酶解时间3h、酶解温度60°C、加酶量4000U/g。
图1是对酶解产物用凝胶色谱进行分离，分离出四个组分F1-F4；
图2是DSC测定F1-F4组分的THA，F3组分的THA为2.7℃；
图3是对F3组分阳离子交换色谱分离，分离出三个组分S1-S3;
图4是DSC测定S1-FS组分的THA，S2组分的THA为4.55℃；
图5是对S2组分用C18反相HPLC进一步分离，分离出8个组分P1-P8;
图6是DSC测定P1-P8组分的THA，P7组分的THA为5.09℃；
图7是P7组分酵母微生物低温保护效果，添加了0.5%（w/w）P7组分冻藏24h后酵母的存活率提高到84.4%。
本实施例并非对本发明的形状、材料、结构等作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (4)

1.一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽，其特征在于：该抗冻多肽的分子量在1107.54～1554.72Da，所含的三种主要多肽氨基酸序列分别是VGPAGPSGPSGPQ、RGSPGERGESGPAGPSG、VGPAGPSGPSGPQG；
所述抗冻多肽的制备方法为：将草鱼鱼鳞清洗、晒干后进行粉碎，并进行 45℃超声清洗 50 分钟；之后将洗净的鱼鳞过滤干净，使用 1mol/L 的柠檬酸溶液震荡浸泡 24h，最后将鱼鳞过滤清洗至中性后备用；按照酶采用木瓜蛋白酶，底物草鱼鱼鳞浓度 5%、pH6、酶解时间 3h、酶解温度 60℃、加酶量 4000U/g 进行水解，反应结束后，沸水浴 10min 灭酶，收集酶水解的溶液；在 4℃、8000r/min 条件下用冷冻离心机离心 15min，取其上清液；对上清液的酶解产物分离纯化的具体操作过程为：酶解产物首先选用凝胶色谱进行分离，第一次分离采用的洗脱液为 pH7.0 的 PBS 缓冲溶液，流速为 0.8mL/min，洗脱峰在 225nm 下进行测量，收集具有最佳抗冻活性的峰；再用阳离子交换色谱进行分离，第二次分离采用的采用洗脱液为 NaCl 浓度为 0-0.5M 的 0.01mol/L pH5.0 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，流速为0.5mL/min，收集具有最佳抗冻活性的峰；接着再用 C18 反相 HPLC 进一步分离，最后收集具有最佳抗冻活性的组分。
2.根据权利要求1所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）采用草鱼鱼鳞为原料，先对草鱼鱼鳞进行处理；
（2）对处理后的草鱼鱼鳞进行酶解；
（3）分离纯化酶解液；
（4）冷冻干燥后得到所述的抗冻多肽；
（5）对抗冻多肽的抗冻活性进行测定；
（6）测定抗冻多肽的氨基酸序列；
步骤（1）-（4）的具体制备过程为：将草鱼鱼鳞清洗、晒干后进行粉碎，并进行 45℃超声清洗 50 分钟；之后将洗净的鱼鳞过滤干净，使用 1mol/L 的柠檬酸溶液震荡浸泡 24h，最后将鱼鳞过滤清洗至中性后备用；按照酶采用木瓜蛋白酶，底物草鱼鱼鳞浓度 5%、pH6、酶解时间 3h、酶解温度 60℃、加酶量 4000U/g 进行水解，反应结束后，沸水浴 10min 灭酶，收集酶水解的溶液；在 4℃、8000r/min 条件下用冷冻离心机离心 15min，取其上清液；对上清液的酶解产物分离纯化的具体操作过程为：酶解产物首先选用凝胶色谱进行分离，第一次分离采用的洗脱液为 pH7.0 的 PBS 缓冲溶液，流速为 0.8mL/min，洗脱峰在 225nm下进行测量，收集具有最佳抗冻活性的峰；再用阳离子交换色谱进行分离，第二次分离采用的采用洗脱液为 NaCl 浓度为 0-0.5M 的 0.01mol/L pH5.0 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，流速为0.5mL/min，收集具有最佳抗冻活性的峰；接着再用 C18 反相 HPLC 进一步分离，最后收集具有最佳抗冻活性的组分。
3. 根据权利要求2所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法，其特征在于：步骤（5）具体过程为：
1）对酵母微生物低温保护效果测定
取1g活性干酵母放入离心管中，与10倍蒸馏水混合，在10℃下震荡20min，然后将抗冻多肽以两个水平0%和0.5%酵母悬浮液分别加入到离心管中震荡，制成酵母悬浮液，分别冻藏3d酵母悬浮液，对酵母菌落进行培养，计算出酵母的存活率；
细胞存活率=100%×（培养出细胞的数量/细胞总数）
2）热滞活性THA的测定
将冻干后的多肽样品配制成20mg/mL的水溶液；取5μL的多肽溶液密封于坩埚内，置于DSC炉体中测定抗冻多肽的THA；初始温度为20℃，以5℃/min的速率降温至-20℃，保持2min，再以相同的速率升温至20℃，保持2 min，根据熔融曲线计算多肽溶液的熔融焓Hm 和熔点Tm，然后，以5℃/min速率降温至-20℃，保持2 min，再以1 ℃/min的速率缓慢升温至样品呈部分熔融状态，这一温度称为保留温度Th，在Th下保持2 min，最后以相同的速率降温至-20℃；重复上述过程，选取不同的Th，分别按照公式(1)和(2)计算THA和冰晶含量Φ；
THA=Th-To （1）
φ（%）=（1-(-∆Hr)/∆Hm）×100 （2）
式中，THA指热滞活性，℃；Th指保留温度，℃；T0指起始结晶温度，℃ ；Φ指冰晶含量，%；∆Hr指结晶焓，J/g；∆Hm指熔融焓J/g。
4. 根据权利要求3所述的一种草鱼鱼鳞高活性抗冻多肽的制备方法，其特征在于：步骤（6）的具体操作过程为：用LC-MS/MS 进行检测步骤（5）分离出的具有较强抗冻活性的组分的其氨基酸序列。
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