TWI664189B - 低內毒素膠原蛋白的製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭露一種低內毒素膠原蛋白的製備方法。所述製備方法包含以下步驟:提供動物皮膚;去除動物皮膚之殘餘脂肪組織及肌肉組織;以鹼性溶液膨脹動物皮膚;刨除動物皮膚的上下表面;以含有水解酶之溶液水解動物皮膚;以鹽類溶液析出低內毒素膠原蛋白;以及以醇類溶液清洗低內毒素膠原蛋白。
Description
本發明係有關於一種膠原蛋白的製備方法,特別係有關於一種低內毒素膠原蛋白的製備方法。
內毒素為格蘭陰氏菌細胞壁表面的一種成分,其被稱為脂多糖(lipopolysaccharide),只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞後才會被釋放出來。脂多糖分子由特異性多糖、核心多糖和脂質A三部分構成。脂質A是內毒素的主要毒性組分。不同的革蘭氏陰性細菌的脂質A結構基本相似。因此,凡是由革蘭氏陰性菌引起的感染,雖菌種不一,各菌的內毒素性效應大致相同。其主要會在人體內引起發熱、白細胞增多、微循環障礙、休克等臨床症狀。
在醫療級膠原蛋白的產業中,內毒素的含量即決定了膠原蛋白的品質及應用層次,也即決定了醫療級膠原蛋白是否可做為植入醫療器械的使用範圍。
一般而言,在膠原蛋白材料上的內毒素,主要來自於動物組織上殘留的微生物、吸附於動物皮膚組織表面的內毒素、以及製程中微生物污染所產生的內毒素等。內毒素在與蛋白質或其他成份吸附後,其脫附的條件相當不容易。傳統上常用乾熱滅菌法(dry heat sterilization)來去除耐熱性材料的內毒
素,其主要是將要去除內毒素的物品曝露於250℃的環境2小時,來進行內毒素的去除;但遇高溫會產生熱分解反應之熱穩定性不佳的材料,無法以上述之方法來進行內毒素的去除。因此,如膠原蛋白等生物高分子常用透析法來移除膠原蛋白溶液內的內毒素。透析法的最大困難在於透析的過程中,膠原蛋白溶液的黏度不能過高,因此在透析前,必需要將被透析溶液進行高倍率的稀釋,而在完成透析後再做濃縮程序,以提高溶液的濃度。此透析程序不但非常耗時、耗能又耗料,也大大降低了低內毒素膠原蛋白的產能,因而使得生產的成本倍數的增加。
有鑑於上述習知技藝之問題,本發明之目的就是在提供一種利用物理與化學手段來生產低內毒素膠原蛋白的方法。
根據本發明之一目的,提出一種低內毒素膠原蛋白的製備方法,其包含以下步驟:提供一動物皮膚、將動物皮膚之殘餘脂肪組織及肌肉組織去除、以鹼性溶液或緩衝溶液膨脹動物皮膚、刨除動物皮膚的上下表面、以含有水解酶之溶液水解動物皮膚、以鹽類溶液析出低內毒素膠原蛋白、以及以醇類溶液清洗低內毒素膠原蛋白。
較佳者,刨除動物皮膚的步驟係刨除動物皮膚的上下表面約0.2mm至約0.5mm。
較佳者,水解酶可選自於胃蛋白酶(pepsin)、膠原蛋白水解酶(collagenase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胜肽酶(peptidase)、蛋
白酶A(proteinase A)、蛋白酶K(proteinase K)、胰蛋白酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbial proteases)、木瓜蛋白酵素(papain)及其任意組合。
較佳者,鹽類溶液可選自於鹼金屬磷酸鹽溶液、鹼金屬鹵化物溶液及其任意組合。
較佳者,醇類溶液可包含乙醇、異丙醇或其組合。
較佳者,在去除步驟、水解步驟、鹽析步驟及醇洗步驟中使用微生物生長抑制溶液。
較佳者,微生物生長抑制溶液可選自於醇類溶液、酸性溶液、鹼性溶液、高滲透壓溶液及其任意組合。
較佳者,刨除動物皮膚之步驟係在常溫下進行。
較佳者,膨脹動物皮膚之步驟係將該動物皮膚膨脹至1.2倍至2.1倍之範圍內。
較佳者,鹼液或緩衝溶液的pH值在11~13.5的範圍內。
承上所述,依本發明之低內毒素膠原蛋白的製備方法,可具有一或多個下述優點:
(1)本發明之製備方法不需經高溫加熱,可在不破壞膠原蛋白高分子下製備低內毒素膠原蛋白。
(2)本發明之製備方法不需經過透析程序即可製備低內毒素膠原蛋白,因此可以縮短製程時間並節省原料及能源消耗,以降低生產成本,增加生產效率。
S101~S113‧‧‧步驟
第1圖係為根據本發明實施例之低內毒素膠原蛋白的製備方法之流程圖。
請參閱第1圖,其係為根據本發明實施例之低內毒素膠原蛋白的製備方法之流程圖。如第1圖所示,本發明之低內毒素膠原蛋白的製備方法包含以下步驟:提供動物皮膚(步驟S101);去除殘餘脂肪組織及肌肉組織(步驟S103);膨脹動物皮膚(步驟S105);刨除部分動物皮膚(步驟S107);水解動物皮膚(步驟S109);鹽析(步驟S111);以及醇洗(步驟S113)。
於步驟S101中,所提供之動物皮膚可利用相關領域之通常知識者所習知之技術,取自於其外皮系統包括皮膚及皮膚衍生物之脊椎動物,其包含但不限於牛、豬、馬、羊、雞、鴨、火雞、鹅、鯨魚或者鯊魚等畜類或魚類。
在一實施例中,所提供之動物皮膚可為其表皮組織已利用人工或機械之方式移除之皮下組織。
於步驟S103中,在移除動物皮膚之表皮組織後,可以機械(例如去肉機)或人工之方式去除皮下組織上殘餘之脂肪組織及肌肉組織。於去除殘餘脂肪組織及肌肉組織的過程期間,可使用微生物生長抑制溶液,以將皮下組織保持在無內毒素及微生物的狀態。其中微生物生長抑制溶液可選自相關領域之通常知識者所習知之各種微生物生長抑制溶液,包含但不限於:醇類溶液、酸性溶液、鹼性溶液、高滲透壓溶液及其任意組合。
於步驟S105中,利用鹼性溶液將動物皮膚膨脹至原本的1.2倍至1.5倍之範圍內。此步驟可同時藉由鹼性溶液再次洗去膠原蛋白以外之其他
雜質。所述之鹼性溶液的pH值在11~13.5的範圍內。當pH值在11以下時,無法在此步驟中同時有效地洗去膠原蛋白以外之其他雜質,且無法有效地膨脹動物皮膚。當pH值在13.5以上時,則可能會使蛋白質降解,從而使產率下降。鹼性溶液之實例可包含但不限於碳酸鈉、氫氧化鈣、氫氧化鈉、氫氧化鎂及其任意組合。較佳者,鹼性溶液可為氫氧化鈣。於一實施例中,用來膨脹動物皮膚的鹼性溶液係以與動物皮膚等重的水及以動物皮膚的重量為基礎14wt%至16wt%的氫氧化鈣所組成。
於另一實施例中,可使用pH值在11~13.5的範圍內的緩衝液代替鹼性溶液。與使用鹼性溶液的實施例不同之處在於,緩衝溶液的pH值穩定,且於膨脹動物皮膚的過程中不會進一步產生沉澱,不須進行習知的脫灰步驟,從而可進一步簡化製造過程並減少製造成本。於一實施例中,緩衝液包含磷酸。
於步驟S107中,利用片皮機、刨皮機或任何可移除大約0.2mm~0.5mm的動物皮膚的設備,在常溫下刨除膨脹之動物皮膚的一部分。為了徹底清除殘留於組織表面的微生物及吸附於動物皮膚組織表面的內毒素,需刨除動物皮膚暴露於外界環境之部分,例如,動物皮膚之上下表面,且刨除大約0.2mm~0.5mm,若刨除小於約0.2mm,則可能無法徹底清除殘留於組織表面的微生物及吸附於動物皮膚組織表面的內毒素。考量微生物及內毒素之清除效果及收產成本,較佳為刨除約0.2mm至約0.5mm。
於步驟S109中,將已去除殘餘脂肪組織及肌肉組織及刨除表皮上下表面之動物皮膚以水解酶水解(digestion)處理,藉此製造無端肽膠原蛋白(atelopeptide collagen)。水解酶包含但不限於,胃蛋白酶(pepsin)、膠原蛋白水解
酶(collagenase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胜肽酶(peptidase)、蛋白酶A(proteinase A)、蛋白酶K(proteinase K)、胰蛋白酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbial proteases)、木瓜蛋白酵素(papain)及其任意組合。水解反應的條件視所使用的水解酶而定。例如,當使用胃蛋白酶時,水解反應可在pH值約1.0至約4.0、酶濃度在約0.5g/L至約5.5.0g/L、反應溫度在0℃至20℃之條件下攪拌12~72小時進行。
於步驟S111中,將鹽類溶液加入步驟S109所得之產物中,以進行鹽析,獲得低內毒素膠原蛋白,並以鹽類溶液對所得之低內毒素膠原蛋白進行清洗,以除去未反應完全之蛋白水解酶、不想要之多醣體、多酞及步驟S109所用之溶液的殘留。其中,所用之鹽類溶液可選自於鹼金屬磷酸鹽溶液、鹼金屬鹵化物溶液及其任意組合。
於步驟S113中,以醇類溶液對所得之低內毒素膠原蛋白進行清洗並真空冷凍,以獲得高純度、高產量且低內毒素之膠原蛋白。所用之醇類可選自於乙醇、異丙醇及其任意組合。
下文中,藉由以下提供之實例,進一步詳細說明本發明。
實例1
將已移除表皮組織之4000~6000g的牛皮膚去除動物皮膚上殘餘之脂肪組織及肌肉組織後的組織後,以重量百分率約為13%的氫氧化鈣溶液(水與氫氧化鈣為100:14至約100:16的範圍內)膨脹為原本的1.2倍,接著在室溫下以MOSCONI公司,型號為3000mm的片皮機,自該皮膚之上下表面刨除0.5mm的厚度。
將自上述步驟獲得之皮膚置於1000至3000ml的10%~20%異丙醇溶液中,以絞肉機絞碎成小塊。加入12~20g的胃蛋白酶,接著加入480~720ml的冰乙酸將溶液之PH值調整為1.5~3.5後,在1℃至12℃下攪拌24~48小時以獲得一混合物。
將向上述混合物加入3600~5700ml的氯化钠溶液進行鹽析,經過12~72小時靜置後收集沈澱物,分別以3200~4800ml的異丙醇清洗所得沈澱物。清洗過之沈澱物於-15~-5℃下真空冷凍24~48小時後,乾燥獲得800~1600g的膠原蛋白1。
實例2
除了差異是將皮膚膨脹為原本的2.1倍及自皮膚之上下表面刨除0.2mm的厚度以外,其他係以與實例1相同之製備方法獲得800~1600g的膠原蛋白2。
實例3
除了差異是將皮膚膨脹為原本的2.1倍以外,其他係以與實例1相同之製備方法獲得800~1600g的膠原蛋白3。
實例4
除了差異是自皮膚之上下表面刨除0.2mm的厚度以外,其他係以與實例1相同之製備方法獲得800~1600g的膠原蛋白4。
比較例1
除了差異是使用未移除脂肪組織及肌肉組織之4000~6000g的牛皮膚以外,其他係以與實例1相同之製備方法獲得650~780g的膠原蛋白5。
比較例2
除了差異是不刨除皮膚之上下表面以外,以與實例1相同之製備方法獲得202~443g的膠原蛋白6。
比較例3
除了差異是不膨脹皮膚以外,其他係以與實例1相同之製備方法獲得512~810g的膠原蛋白7。
測試實例1至4以及比較例1至3所得之膠原蛋白之內毒素濃度,其結果示於以下表1。
由以上表1可以看出,相較於比較例1及2,實例1~4具有較低之內毒素濃度,且相較於比較例1~3,實例1~4具有較高之產率。因此可證實如同本發明之實施例般移除表皮組織後,於鹼性溶液中進行動物皮膚的表面進一
步地刨除,可有效降低膠原蛋白濃度並維持膠原蛋白產率。本發明利用鹼性溶液膨脹動物皮膚後刨除動物皮膚表面,於此情況下,由於鹼性溶液為微生物生長抑制溶液的一種,因此可以在刨除過程之外進一步以鹼性溶液降低動物皮膚表面上之內毒素,並抑止期間內毒素的生成。而膨脹動物皮膚此一步驟可以在維持低內毒素的同時,提高膠原蛋白的產率,以避免不必要的成本耗損。
綜上所述,本發明不需經高溫加熱及透析程序即可製備低內毒素膠原蛋白,因此,可在不破壞膠原蛋白高分子、縮短製程時間、節省原料及能源消耗、降低生產成本及增加生產效率的情況下製備低內毒素膠原蛋白。
雖然本發明已參考例示性實施例具體地示出及描述,但本發明所屬技術領域之通常知識者將理解,可對本發明之實施例做出形式及細節之各種改變而不背離本發明下列申請專利範圍及其等效範圍所定義之精神及範疇。
Claims (8)
- 一種低內毒素膠原蛋白的製備方法,其包含以下步驟:提供一動物皮膚;去除該動物皮膚之殘餘脂肪組織及肌肉組織;以一鹼液或一緩衝溶液膨脹該動物皮膚;刨除該動物皮膚的上下表面後,將該動物皮膚絞碎成複數個皮膚小塊;以含有一水解酶之溶液水解該複數個皮膚小塊;以一鹽類溶液鹽析出一低內毒素膠原蛋白;以及以一醇類溶液清洗該低內毒素膠原蛋白,其中膨脹該動物皮膚之步驟係將該動物皮膚膨脹至1.2倍至2.1倍之範圍內,且刨除該動物皮膚的步驟係刨除該動物皮膚的上下表面0.2mm至0.5mm。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法,其中該水解酶係選自於胃蛋白酶、膠原蛋白水解酶、胰凝乳蛋白酶、胜肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、微生物蛋白酶、木瓜蛋白酵素及其任意組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法,其中該鹽類溶液係選自於鹼金屬磷酸鹽溶液、鹼金屬鹵化物溶液及其任意組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法,其中該醇類溶液包含乙醇、異丙醇及其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法,其中在該去除步驟、該水解步驟、該鹽析步驟及該醇洗步驟中,使用一微生物生長抑制溶液。
- 如申請專利範圍第5項所述之製備方法,其中該微生物生長抑制溶液係選自於醇類溶液、酸性溶液、鹼性溶液、高滲透壓溶液及其任意組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法,其中刨除該動物皮膚之步驟係在常溫下進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法,其中該鹼液或該緩衝溶液的pH值在11~13.5的範圍內。
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