JP2013245198A - コラーゲンの抽出方法、及びコラーゲンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の前記課題は、(1)炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程を含むことを特徴とするコラーゲン抽出方法、又は(1)炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、(2)前記原料に含まれるコラーゲン及び/又は浸漬工程(1)によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、及び(3)前記溶液から不溶物を除去する工程を含むコラーゲン製造方法によって解決することができる。
【選択図】なし
Description
このように、酸可溶化コラーゲン又はアテロ化コラーゲンの製造においては、酸性溶液による抽出は、必須の工程であり、酸性溶液の酸源として、塩酸、クエン酸、又は酢酸などが用いられていた。前記の抽出方法によって抽出された酸可溶化コラーゲン又はアテロ化コラーゲンを含む抽出液は、他の型のコラーゲンと分離するために塩析を行い、そして塩を除去(脱塩)するために透析を行う必要があった。
(1)コラーゲンを含む生体組織から、アルカリやエタノールを用いて夾雑物や脂質などを除去する。
(2)前記生体組織を、酸性溶液(無機酸である塩酸・リン酸など、又は有機酸である酢酸・クエン酸・乳酸など)により膨潤させたり、又は生体組織からリン酸カルシウムを除去したりする。あるいは、この工程でエチレンジアミン4酢酸(EDTA)を用いることもある。
(3)酸性溶液にタンパク質分解酵素(例えば、ペプシン、パパイン、又はプロクターゼなど)を溶解し、前記のコラーゲンを含む原料を浸漬してコラーゲンを抽出させる。
(4)塩化ナトリウムにより塩濃度を上昇させコラーゲンを塩析するか、又は水酸化ナトリウムなどを加えてpHを7.0以上に調整してコラーゲンの析出や酵素の失活を行う。
(5)遠心分離などにより析出したコラーゲンを回収する。
(6)回収したコラーゲンから塩を除くため、透析膜での処理や遠心分離を用いた洗浄や膜分画を用いて脱塩を行う。
このような、従来のコラーゲンの製造方法では、塩析(4)、回収(5)や脱塩(6)の工程に時間やコストがかかるため、その工程の短縮化が求められている。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
[1](1)炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、を含むことを特徴とする、コラーゲン抽出方法、
[2](2)前記原料に含まれるコラーゲン及び/又は浸漬工程(1)によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、を含む、[1]に記載のコラーゲン抽出方法、
[3]炭酸水がpH5以下である、[1]又は[2]に記載のコラーゲン抽出方法、
[4]前記浸漬工程(1)及び/又は接触工程(2)を加圧下で行う、[1]〜[3]のいずれかに記載のコラーゲン抽出方法、
[5][1]〜[4]のいずれかに記載のコラーゲン抽出方法によって得られる、酸及び/又は塩を含まないコラーゲン抽出液、
[6](1)炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、(2)前記原料に含まれるコラーゲン及び/又は浸漬工程(1)によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、及び(3)前記溶液から不溶物を除去する工程、を含む、コラーゲン製造方法、
[7]前記浸漬工程(1)及びタンパク質分解酵素接触工程(2)を同時に行う、[6]に記載のコラーゲン製造方法、
[8](4)前記不溶物を除去した炭酸水(酸性溶液)から二酸化酸素を除去する工程、を更に含む[6]又は[7]に記載のコラーゲン製造方法、
[9]前記浸漬工程(1)の前に、コラーゲンを含む原料を前処理する工程を含む、[6]〜[8]のいずれかに記載のコラーゲン製造方法、
[10]炭酸水がpH5以下である、[6]〜[9]のいずれかに記載のコラーゲン製造方法、又は
[11]前記浸漬工程(1)及び/又は接触工程(2)を加圧下で行う、[6]〜[10]のいずれかに記載のコラーゲン製造方法、
に関する。
本発明のコラーゲンの抽出方法は、(1)炭酸水にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程を含むことを特徴とする。また、本発明のコラーゲンの抽出方法は、更に(2)前記原料に含まれるコラーゲン及び/又は浸漬工程(1)によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程を含んでもよい。
本発明のコラーゲンの抽出方法における浸漬工程(1)は、炭酸水にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程であり、従来コラーゲンの抽出に用いていた塩酸溶液、又は酢酸溶液などに代えて、炭酸水を使用するものである。この浸漬工程(1)により、酸性溶液への浸漬によって抽出される酸可溶化コラーゲンやペプチドを、原料から抽出することができる。酸可溶性化コラーゲンは、酸性溶液への浸漬のみで抽出されるコラーゲンであり、N末端及び/又はC末端にテロペプチドを有するコラーゲンである。
浸漬温度は、非変性コラーゲンが抽出される限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば0℃〜40℃で行うことができ、好ましくは4〜35℃であり、更に好ましくは10〜30℃である。一方、変性コラーゲン(いわゆる、ゼラチン)でもよい場合は、変性温度以上で抽出してもよく、例えば40℃〜100℃で抽出することができる。
コラーゲンの抽出効率を上げるために、原料を炭酸水に浸漬させ、攪拌することが好ましい。炭酸水の攪拌は、スターラーや振とうなどを用い、例えば5rpm〜60rpm程度で行うことができる。
浸漬工程(1)は、常圧で行ってもよいが、加圧下で行うこともできる。加圧下で浸漬を行うことによって、抽出効率を向上させることができる。従って、浸漬工程(1)における圧力は、限定されるものではないが、1〜10×105Paで行うことができ、好ましくは1〜5×105Paであり、より好ましくは1〜3×105Paである。
本発明のコラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素接触工程(2)は、原料に含まれるコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させ、コラーゲンのN末端及びC末端に存在するテロペプチドを切断する工程である。生体内においては、コラーゲンはテロペプチドの部分で架橋されている。コラーゲン同士を架橋しているテロペプチドを切断することにより、低抗原化したアテロ化コラーゲンを得ることができる。
本発明のコラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素接触工程(2)は、用いる溶液を除けば、従来のコラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素による抽出に従って、行うことができる。酵素処理に用いることのできる酵素としては、特に制限はないが、例えば、ペプシン、パパイン、プロテアーゼM、又はプロクターゼを挙げることができる。これらの酵素の使用量は、特に制限されないが、コラーゲンを含む原料の乾燥重量に対して1〜15重量%とすることが好ましい。
タンパク質分解酵素接触工程(2)の温度は、酵素が作用する限りにおいて限定されるものではないが、例えば温度0〜40℃で行うことができ、好ましくは4〜35℃であり、更に好ましくは10〜30℃である。一方、変性コラーゲン(いわゆる、ゼラチン)でもよい場合は、変性温度以上で抽出してもよく、例えば40℃〜100℃で抽出することができる。
コラーゲンの抽出効率を上げるために、原料を炭酸水に浸漬し、攪拌することが好ましい。炭酸水の攪拌は、スターラーや振とうなどを用い、例えば5rpm〜60rpm程度で行うことができる。
接触時間も特に限定されるものではないが、例えば1〜72時間かけて行うことができるが、好ましくは3〜48時間であり、より好ましくは12〜24時間である。
タンパク質分解酵素接触工程(2)は、常圧で行ってもよいが、加圧下で行うこともできる。加圧下で浸漬を行うことによって、抽出効率を上昇させることができる。従って、浸漬工程(1)における圧力は、限定されるものではないが、1〜10×105Paで行うことができ、好ましくは1〜5×105Paであり、より好ましくは1〜3×105Paである。
別の工程として行う場合、例えば炭酸水への原料の浸漬による浸漬工程(1)を行い、その後炭酸水にタンパク質分解酵素(例えば、ペプシン、パパイン、プロテアーゼM又はプロクターゼ)を添加してタンパク質分解酵素接触工程(2)を行ってもよい。また、炭酸水への原料の浸漬により浸漬工程(1)を行い、二酸化炭素を除去した後に、溶液にタンパク質分解酵素を添加してタンパク質分解酵素接触工程(2)を行ってもよい。
浸漬工程(1)とタンパク質分解酵素接触工程(2)を同時に行う場合、炭酸水にタンパク質分解酵素を添加し、原料を炭酸水に浸漬すると同時にタンパク質分解酵素を原料に接触させる。
本発明の抽出方法に用いる炭酸水は、溶媒に二酸化炭素を溶解することによって製造することができる。
炭酸水に用いる溶媒は、二酸化炭素を溶解させることにより酸性になり、且つコラーゲンが抽出できるものであれば、特に限定されるものではないが、水又は水性溶媒が好ましい。水性溶媒としては、水と有機溶媒とを混合した溶媒を挙げることができる。水性溶媒に用いる有機溶媒としては、水と混和し、且つコラーゲンを溶解することができる限り、限定されるものではないが、好ましくは低級アルコールであり、例えば炭素数1〜4の低級アルコール(すなわち、メタノール、エタノール、n−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、sec−ブチルアルコール、又はtert−ブチルアルコール)を用いることができる。このような低級アルコールは、製造にかかるコストが、低廉であり、殺菌しながらの抽出を可能とする。
炭酸水に含まれる二酸化炭素(CO2)は、比較的水に溶解しやすく、水に溶解したCO2の一部は、以下のように、水分子の付加により炭酸となる。
用いる二酸化炭素の形態は、気体、液体、又は固体のいずれでもよいが、気体又は固体が好ましい。気体を用いる場合、溶媒(例えば、水)にバブリングして二酸化炭素を溶解してもよい。固体を用いる場合、ドライアイスを溶媒(例えば、水)に投入して、二酸化炭素を溶解してもよい。
炭酸水のpHは、前記のようにpH7未満の酸性であれば、特に限定されるものはないが、好ましくはpH6以下であり、最も好ましくはpH5以下である。pH2〜pH5において、コラーゲンの溶解性が高いからである。
本発明のコラーゲンの抽出方法に用いるコラーゲンを含む原料としては、コラーゲンを含む生体組織・臓器を挙げることができ、具体的には、皮膚、骨、皮、筋肉、軟骨、鱗、又は浮袋等を挙げることができる。また、コラーゲンを含む原料として、コラーゲンを産生する細胞、又は遺伝子組み換え操作により製造される人工コラーゲンを産生する宿主細胞を用いることもできる。
原料に含まれるコラーゲンは、特に限定されるものではないが、例えばI型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン又はこれらの2つ以上の組み合わせを挙げることができる。
前記のコラーゲンのうち、例えばI型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、及びV型コラーゲンは線維型コラーゲンであり、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、及びVIII型コラーゲンは非線維型コラーゲンである。更に、これらのコラーゲンのうち、コラーゲン成形体又は化粧品等の原料として汎用されているのは、I型コラーゲン又はII型コラーゲンである。これらのコラーゲンが含まれている原料は比較的大量に入手することが可能であり、本発明の抽出方法に用いる原料として適している。
本発明のコラーゲン酸性溶液では、二酸化炭素により酸性に維持され、更に塩酸、酢酸、クエン酸、又はフマル酸を含まずに、コラーゲン溶液とすることができるため、線維化が起きにくい、安定なコラーゲン酸性溶液とすることができる。
前記コラーゲンを含む原料は、そのまま本発明の抽出方法に用いることも可能であるが、抽出効率を上げるために、前処理を行うことが好ましい。前処理としては、洗浄、脱灰処理、脱脂処理、粉砕処理、又はそれらの任意の組み合わせを挙げることができ、その順番も目的に応じて、適宜変更することができる。
本発明のコラーゲンの製造方法は、(1)二酸化炭素を含む炭酸水にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程(以下、浸漬工程(1)と称する)、(2)前記原料に含まれるコラーゲン及び/又は浸漬工程(1)によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程(以下、タンパク質分解酵素接触工程(2)と称する)、(3)前記溶液から不溶物を除去する工程(以下、不溶物除去工程(3)と称する)を含む。本発明のコラーゲンの製造方法は、(4)前記不溶物を除去した酸性溶液から二酸化酸素を除去する工程を含んでもよく、更に、浸漬工程(1)の前に、コラーゲンを含む原料を前処理する工程を含んでもよい。
本発明のコラーゲンの製造方法には、前記抽出方法に記載の炭酸水を用いることができる。また本発明のコラーゲンの製造方法には、本発明のコラーゲンの抽出方法を使用することができる。
浸漬工程(1)とタンパク質分解酵素接触工程(2)とを別の工程として行う場合は、浸漬工程(1)、タンパク質分解酵素接触工程(2)及び不溶物除去工程(3)をその順番で行ってもよく、浸漬工程(1)、不溶物除去工程(3)、及びタンパク質分解酵素接触工程(2)の順番で行ってもよい。
本発明のコラーゲンの製造方法における浸漬工程(1)は、前記コラーゲンの抽出方法における浸漬工程(1)に従って行うことができる。
本発明のコラーゲンの製造方法におけるタンパク質分解酵素接触工程(2)は、前記コラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素接触工程(2)に従って行うことができる。
前記浸漬工程(1)及びタンパク質分解酵素接触工程(2)の終了した原料(又は浸漬工程(1)の終了した原料)のうち、溶解しなかった画分を不溶物除去工程(3)によって、除去する。具体的には、遠心分離又はろ過などによって、不溶物を除去し、酸可溶化コラーゲン、又はアテロ化コラーゲンの溶解液を得ることができる。
得られたコラーゲンの溶解液は、二酸化炭素除去工程(4)において、超音波処理、又は真空脱気により、溶解している二酸化炭素を除去することができる。二酸化炭素を除去したコラーゲン溶液は、そのまま、用いることもできるが、例えば凍結乾燥を行い保存することもできる。凍結乾燥の方法は、特に限定されるわけではなく、通常公知の方法に従い、行うことができる。
本発明のコラーゲンの製造方法における前処理工程は、前記コラーゲンの抽出方法における「前処理」に従って、行うことができる。前処理工程を行うことにより、コラーゲンを含む原料からのコラーゲンの抽出効率を上昇させることができる。
テラピアの鱗を水で十分洗浄し、更に10%塩化ナトリウム溶液で十分洗浄する。鰭などの夾雑物を除去した後、室温にて乾燥する。得られたテラピア鱗をpH3の塩酸溶液に分散し、1Mの塩酸溶液を添加しながらpHを3に保った状態で、25℃、2時間穏やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分を溶解する。テラピア鱗をザルにあげて、十分水洗する(脱灰鱗)。
前記コラーゲンの抽出方法よって得ることのできる抽出液は、酸及び/又は塩を含まないものである。得られるコラーゲン抽出液は、中和又は脱塩の必要がないため、そのままさまざまな用途(例えば、化粧用コラーゲン溶液、美容形成用コラーゲン溶液、又は細胞培養溶液など)に用いることができる。なお、本発明のコラーゲン抽出液が、酵素等を含んでいる場合は、前記の限界濾過等により酵素を除去することが望ましい。また、本発明のコラーゲン抽出液を製品に使用する場合は、0.45μmのメンブレンフィルターで滅菌処理を行ったものを使用することが好ましい。
本実施例では、テラピアの鱗を用いて、室温(25℃)及び大気圧の1.013×105Paでコラーゲンの抽出(製造)を行った。
テラピアの鱗を水で十分洗浄し、更に10%塩化ナトリウム溶液で十分洗浄し、鰭などの夾雑物を除去した後、室温にて乾燥した。含水率は18.5%であった。
本実施例では、加圧下でのコラーゲンの抽出及び製造を行い、SDS−PAGEにより得られたコラーゲンを確認した。
図1に示す圧力容器を用いて、20mLの精製水を加え、二酸化炭素を3×105Paに調整して室温で振とうさせた。これに実施例1で作製した脱灰鱗を室温で乾燥させ、2gを加えた。更にペプシンを30mg加えて、24時間振とうさせた。遠心分離により鱗の残渣と上澄み溶液を分離した。上澄み溶液を用いて、限外濾過膜(100kDa)により遠心分離により分画を行った。分画の洗浄には、二酸化炭素をバブリングさせた水溶液を用いた。
Claims (11)
- (1)炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、
を含むことを特徴とする、コラーゲン抽出方法。 - (2)前記原料に含まれるコラーゲン及び/又は浸漬工程(1)によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、
を含む、請求項1に記載のコラーゲン抽出方法。 - 炭酸水がpH5以下である、請求項1又は2に記載のコラーゲン抽出方法。
- 前記浸漬工程(1)及び/又は接触工程(2)を加圧下で行う、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコラーゲン抽出方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のコラーゲン抽出方法によって得られる、酸及び/又は塩を含まないコラーゲン抽出液。
- (1)炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、
(2)前記原料に含まれるコラーゲン及び/又は浸漬工程(1)によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、及び
(3)前記溶液から不溶物を除去する工程、
を含む、コラーゲン製造方法。 - 前記浸漬工程(1)及びタンパク質分解酵素接触工程(2)を同時に行う、請求項6に記載のコラーゲン製造方法。
- (4)前記不溶物を除去した炭酸水(酸性溶液)から二酸化酸素を除去する工程、を更に含む請求項6又は7に記載のコラーゲン製造方法。
- 前記浸漬工程(1)の前に、コラーゲンを含む原料を前処理する工程を含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載のコラーゲン製造方法。
- 炭酸水がpH5以下である、請求項6〜9のいずれか一項に記載のコラーゲン製造方法。
- 前記浸漬工程(1)及び/又は接触工程(2)を加圧下で行う、請求項6〜10のいずれか一項に記載のコラーゲン製造方法。
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