JP2013245198A - コラーゲンの抽出方法、及びコラーゲンの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、製造工程を省略することのできるコラーゲンの製造方法を提供すること、及び塩の混入の少ないコラーゲン又はゼラチンを提供することである。
【解決手段】本発明の前記課題は、（１）炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程を含むことを特徴とするコラーゲン抽出方法、又は（１）炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、（２）前記原料に含まれるコラーゲン及び／又は浸漬工程（１）によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、及び（３）前記溶液から不溶物を除去する工程を含むコラーゲン製造方法によって解決することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、炭酸水を用いたコラーゲンの抽出法、及びコラーゲンの製造方法に関する。本発明によれば、コラーゲンの製造工程・コストを大幅に短縮・削減することができる。

コラーゲンは、Ｉ型からＸＸVIII型までの多くの種類があるが、ほとんどのコラーゲンは３重らせん構造を有している。例えば、Ｉ型コラーゲンは分子量約１０万のポリペプチド鎖（α鎖）が３本集まり、長さ３００ｎｍ、直径１．５ｎｍの１本の硬い棒のような３重らせん構造を形成しており、Ｃ末端とＮ末端をもつトロポコラーゲンとも呼ばれる。生体内では、５本のトロポコラーゲンが、少しずつずれながら整列（トロポコラーゲンの長さの１／４）してマイクロフィブリルを形成し、更にマイクロフィブリルが集合して、直径が数十〜百数十ｎｍのコラーゲン細線維を形成している。そして、このコラーゲン細線維が、更に集積して、骨基質又は軟骨基質中の結合組織を形成している。

前記コラーゲンは、ウシ皮、ウシ骨、ウシ軟骨、ブタ皮、ブタ骨、ブタ軟骨、鶏の軟骨や鶏冠などの家畜の組織、又は魚の皮、骨、鱗、軟骨若しくは臓器などから抽出され、生体材料の原料や化粧品の原料として利用されている。コラーゲンには酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、アテロ化コラーゲン、サクシニル化コラーゲン又はフタル化コラーゲンなどがある。生体の組織から酸可溶化コラーゲンを製造する場合、酸性溶液を用いる抽出方法が用いられている（特許文献１〜７）。例えば、特許文献１には、ウナギの頭部から酸性溶液、特に酢酸、を用いて酵素処理を施し、塩析等の処理をすることが開示されている。特許文献２には、チョウザメの皮を塩酸溶液に膨潤させ、ペプシン処理を行う魚皮由来アテロ化コラーゲンの製造方法が開示されている。特許文献３には、テラピアの皮をクエン酸溶液で膨潤させ、ペプシン処理を行い、アテロ化コラーゲンを得ることが開示されている。特許文献４は、魚鱗を塩酸溶液に膨潤させ、破砕後、ペプシン処理によりアテロ化コラーゲンを抽出する方法が開示されている。また、特許文献５には、動物の軟骨に存在するＩＩ型アテロ化コラーゲンを、ペプシンを含む塩酸溶液によって抽出することが開示されている。特許文献６には、海洋生物の皮膚を有機酸によって抽出し、そして得られた粗コラーゲンをタンパク質分解酵素でアテロ化して、精製コラーゲンを得ることが開示されている。特許文献７は、粗コラーゲンに過酸化水素及び酢酸を添加して、酸可溶化コラーゲンを抽出する方法が開示されている。
このように、酸可溶化コラーゲン又はアテロ化コラーゲンの製造においては、酸性溶液による抽出は、必須の工程であり、酸性溶液の酸源として、塩酸、クエン酸、又は酢酸などが用いられていた。前記の抽出方法によって抽出された酸可溶化コラーゲン又はアテロ化コラーゲンを含む抽出液は、他の型のコラーゲンと分離するために塩析を行い、そして塩を除去（脱塩）するために透析を行う必要があった。

特開２０１２−７７０３４号公報 特開２００９−５７３２７号公報 特開２００６−２８１３８号公報 特開２００３−３２７５９９号公報 特許第３１５５７６４号公報 特許第３５３２８１７号公報 特開２００７−３１４４５８号公報

一般に哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、無脊椎動物の組織・臓器からコラーゲンを製造する場合、特許文献１〜７にも記載されているように、以下のような工程で行う。
（１）コラーゲンを含む生体組織から、アルカリやエタノールを用いて夾雑物や脂質などを除去する。
（２）前記生体組織を、酸性溶液（無機酸である塩酸・リン酸など、又は有機酸である酢酸・クエン酸・乳酸など）により膨潤させたり、又は生体組織からリン酸カルシウムを除去したりする。あるいは、この工程でエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を用いることもある。
（３）酸性溶液にタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン、パパイン、又はプロクターゼなど）を溶解し、前記のコラーゲンを含む原料を浸漬してコラーゲンを抽出させる。
（４）塩化ナトリウムにより塩濃度を上昇させコラーゲンを塩析するか、又は水酸化ナトリウムなどを加えてｐＨを７．０以上に調整してコラーゲンの析出や酵素の失活を行う。
（５）遠心分離などにより析出したコラーゲンを回収する。
（６）回収したコラーゲンから塩を除くため、透析膜での処理や遠心分離を用いた洗浄や膜分画を用いて脱塩を行う。
このような、従来のコラーゲンの製造方法では、塩析（４）、回収（５）や脱塩（６）の工程に時間やコストがかかるため、その工程の短縮化が求められている。

また、コラーゲンが変性することによって得られるゼラチンは、電子デバイスにおける導電性ペーストの分散剤として用いられている。電子デバイスに用いられるゼラチンは、塩を含まないものが好ましいが、前記のように従来のコラーゲンの製造方法は、塩析を行うため、得られたゼラチンに塩が残存する可能性があった。

従って、本発明の目的は、製造工程を省略することのできるコラーゲンの製造方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、塩の混入の少ないコラーゲン又はゼラチンを提供することである。

本発明者は、簡便なコラーゲン製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、炭酸水を用いてコラーゲンを抽出することにより、塩析を行わずにコラーゲンを製造できることを見出した。すなわち、コラーゲンの抽出方法又はコラーゲンの製造方法において、炭酸水を用いることによって、コラーゲンの製造方法の工程を簡略化できることを見出した。更に、二酸化炭素を精製水に流し、圧力下でコラーゲンを抽出することにより、効率よくコラーゲンを抽出できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。

従って、本発明は、
［１］（１）炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、を含むことを特徴とする、コラーゲン抽出方法、
［２］（２）前記原料に含まれるコラーゲン及び／又は浸漬工程（１）によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、を含む、［１］に記載のコラーゲン抽出方法、
［３］炭酸水がｐＨ５以下である、［１］又は［２］に記載のコラーゲン抽出方法、
［４］前記浸漬工程（１）及び／又は接触工程（２）を加圧下で行う、［１］〜［３］のいずれかに記載のコラーゲン抽出方法、
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のコラーゲン抽出方法によって得られる、酸及び／又は塩を含まないコラーゲン抽出液、
［６］（１）炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、（２）前記原料に含まれるコラーゲン及び／又は浸漬工程（１）によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、及び（３）前記溶液から不溶物を除去する工程、を含む、コラーゲン製造方法、
［７］前記浸漬工程（１）及びタンパク質分解酵素接触工程（２）を同時に行う、［６］に記載のコラーゲン製造方法、
［８］（４）前記不溶物を除去した炭酸水（酸性溶液）から二酸化酸素を除去する工程、を更に含む［６］又は［７］に記載のコラーゲン製造方法、
［９］前記浸漬工程（１）の前に、コラーゲンを含む原料を前処理する工程を含む、［６］〜［８］のいずれかに記載のコラーゲン製造方法、
［１０］炭酸水がｐＨ５以下である、［６］〜［９］のいずれかに記載のコラーゲン製造方法、又は
［１１］前記浸漬工程（１）及び／又は接触工程（２）を加圧下で行う、［６］〜［１０］のいずれかに記載のコラーゲン製造方法、
に関する。

本発明のコラーゲン製造方法によれば、塩析及び塩を除去する透析といった工程を省略することができるため、製造方法を簡略化することができ、製造工程の大幅な短縮やコストの削減をすることができる。本発明のコラーゲン抽出方法によれば、塩を含まない純度の高いコラーゲン又はゼラチンを得ることができる。特に、本発明の製造方法によって得られたゼラチンは、塩を含まないため電子デバイスにおける導電性ペーストの分散剤として好適に用いることができる。

加圧下においてコラーゲンを抽出又は製造するための圧力容器を模式的に示した図である。

［１］コラーゲンの抽出方法
本発明のコラーゲンの抽出方法は、（１）炭酸水にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程を含むことを特徴とする。また、本発明のコラーゲンの抽出方法は、更に（２）前記原料に含まれるコラーゲン及び／又は浸漬工程（１）によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程を含んでもよい。

《浸漬工程（１）》
本発明のコラーゲンの抽出方法における浸漬工程（１）は、炭酸水にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程であり、従来コラーゲンの抽出に用いていた塩酸溶液、又は酢酸溶液などに代えて、炭酸水を使用するものである。この浸漬工程（１）により、酸性溶液への浸漬によって抽出される酸可溶化コラーゲンやペプチドを、原料から抽出することができる。酸可溶性化コラーゲンは、酸性溶液への浸漬のみで抽出されるコラーゲンであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端にテロペプチドを有するコラーゲンである。

炭酸水は、ｐＨ７未満の酸性であれば、特に限定されるものではないが、効率的にコラーゲンを抽出するためには、ｐＨ６以下が好ましく、ｐＨ５以下がより好ましく、ｐＨ４以下が更に好ましく、ｐＨ４未満が最も好ましい。ｐＨの下限は限定されるものではないが、ｐＨ１以上が好ましく、ｐＨ２以上がより好ましい。炭酸水への浸漬時間も、特に限定されるものではないが、１〜７２時間程度で行うことができ、３〜４８時間が好ましい。

（温度）
浸漬温度は、非変性コラーゲンが抽出される限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば０℃〜４０℃で行うことができ、好ましくは４〜３５℃であり、更に好ましくは１０〜３０℃である。一方、変性コラーゲン（いわゆる、ゼラチン）でもよい場合は、変性温度以上で抽出してもよく、例えば４０℃〜１００℃で抽出することができる。
コラーゲンの抽出効率を上げるために、原料を炭酸水に浸漬させ、攪拌することが好ましい。炭酸水の攪拌は、スターラーや振とうなどを用い、例えば５ｒｐｍ〜６０ｒｐｍ程度で行うことができる。

（圧力）
浸漬工程（１）は、常圧で行ってもよいが、加圧下で行うこともできる。加圧下で浸漬を行うことによって、抽出効率を向上させることができる。従って、浸漬工程（１）における圧力は、限定されるものではないが、１〜１０×１０^５Ｐａで行うことができ、好ましくは１〜５×１０^５Ｐａであり、より好ましくは１〜３×１０^５Ｐａである。

《タンパク質分解酵素接触工程（２）》
本発明のコラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素接触工程（２）は、原料に含まれるコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させ、コラーゲンのＮ末端及びＣ末端に存在するテロペプチドを切断する工程である。生体内においては、コラーゲンはテロペプチドの部分で架橋されている。コラーゲン同士を架橋しているテロペプチドを切断することにより、低抗原化したアテロ化コラーゲンを得ることができる。
本発明のコラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素接触工程（２）は、用いる溶液を除けば、従来のコラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素による抽出に従って、行うことができる。酵素処理に用いることのできる酵素としては、特に制限はないが、例えば、ペプシン、パパイン、プロテアーゼＭ、又はプロクターゼを挙げることができる。これらの酵素の使用量は、特に制限されないが、コラーゲンを含む原料の乾燥重量に対して１〜１５重量％とすることが好ましい。

（温度）
タンパク質分解酵素接触工程（２）の温度は、酵素が作用する限りにおいて限定されるものではないが、例えば温度０〜４０℃で行うことができ、好ましくは４〜３５℃であり、更に好ましくは１０〜３０℃である。一方、変性コラーゲン（いわゆる、ゼラチン）でもよい場合は、変性温度以上で抽出してもよく、例えば４０℃〜１００℃で抽出することができる。
コラーゲンの抽出効率を上げるために、原料を炭酸水に浸漬し、攪拌することが好ましい。炭酸水の攪拌は、スターラーや振とうなどを用い、例えば５ｒｐｍ〜６０ｒｐｍ程度で行うことができる。
接触時間も特に限定されるものではないが、例えば１〜７２時間かけて行うことができるが、好ましくは３〜４８時間であり、より好ましくは１２〜２４時間である。

（圧力）
タンパク質分解酵素接触工程（２）は、常圧で行ってもよいが、加圧下で行うこともできる。加圧下で浸漬を行うことによって、抽出効率を上昇させることができる。従って、浸漬工程（１）における圧力は、限定されるものではないが、１〜１０×１０^５Ｐａで行うことができ、好ましくは１〜５×１０^５Ｐａであり、より好ましくは１〜３×１０^５Ｐａである。

前記浸漬工程（１）とタンパク質分解酵素接触工程（２）とは、別の工程として行うことも可能であるが、同時に行うこともできる。
別の工程として行う場合、例えば炭酸水への原料の浸漬による浸漬工程（１）を行い、その後炭酸水にタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン、パパイン、プロテアーゼＭ又はプロクターゼ）を添加してタンパク質分解酵素接触工程（２）を行ってもよい。また、炭酸水への原料の浸漬により浸漬工程（１）を行い、二酸化炭素を除去した後に、溶液にタンパク質分解酵素を添加してタンパク質分解酵素接触工程（２）を行ってもよい。
浸漬工程（１）とタンパク質分解酵素接触工程（２）を同時に行う場合、炭酸水にタンパク質分解酵素を添加し、原料を炭酸水に浸漬すると同時にタンパク質分解酵素を原料に接触させる。

（炭酸水）
本発明の抽出方法に用いる炭酸水は、溶媒に二酸化炭素を溶解することによって製造することができる。

（溶媒）
炭酸水に用いる溶媒は、二酸化炭素を溶解させることにより酸性になり、且つコラーゲンが抽出できるものであれば、特に限定されるものではないが、水又は水性溶媒が好ましい。水性溶媒としては、水と有機溶媒とを混合した溶媒を挙げることができる。水性溶媒に用いる有機溶媒としては、水と混和し、且つコラーゲンを溶解することができる限り、限定されるものではないが、好ましくは低級アルコールであり、例えば炭素数１〜４の低級アルコール（すなわち、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、又はｔｅｒｔ−ブチルアルコール）を用いることができる。このような低級アルコールは、製造にかかるコストが、低廉であり、殺菌しながらの抽出を可能とする。

（二酸化炭素）
炭酸水に含まれる二酸化炭素（ＣＯ_２）は、比較的水に溶解しやすく、水に溶解したＣＯ_２の一部は、以下のように、水分子の付加により炭酸となる。
炭酸水の二酸化炭素の濃度は、コラーゲン酸性溶液がｐＨ７未満である限り、限定されるものではない。例えば、１．０１３×１０^５Ｐａにおいて、二酸化炭素の水への溶解度は、温度が低いほど高く、０℃で１．７１ｃｍ^３／ｃｍ^３、２０℃で０．８８ｃｍ^３／ｃｍ^３、４０℃で０．５３ｃｍ^３／ｃｍ^３、６０℃で０．３６ｃｍ^３／ｃｍ^３である。
用いる二酸化炭素の形態は、気体、液体、又は固体のいずれでもよいが、気体又は固体が好ましい。気体を用いる場合、溶媒（例えば、水）にバブリングして二酸化炭素を溶解してもよい。固体を用いる場合、ドライアイスを溶媒（例えば、水）に投入して、二酸化炭素を溶解してもよい。
炭酸水のｐＨは、前記のようにｐＨ７未満の酸性であれば、特に限定されるものはないが、好ましくはｐＨ６以下であり、最も好ましくはｐＨ５以下である。ｐＨ２〜ｐＨ５において、コラーゲンの溶解性が高いからである。

（コラーゲンを含む原料）
本発明のコラーゲンの抽出方法に用いるコラーゲンを含む原料としては、コラーゲンを含む生体組織・臓器を挙げることができ、具体的には、皮膚、骨、皮、筋肉、軟骨、鱗、又は浮袋等を挙げることができる。また、コラーゲンを含む原料として、コラーゲンを産生する細胞、又は遺伝子組み換え操作により製造される人工コラーゲンを産生する宿主細胞を用いることもできる。

（コラーゲン）
原料に含まれるコラーゲンは、特に限定されるものではないが、例えばＩ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸII型コラーゲン、ＸIII型コラーゲン、ＸIV型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸVI型コラーゲン、ＸVII型コラーゲン、ＸVIII型コラーゲン、ＸIX型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸII型コラーゲン、ＸＸIII型コラーゲン、ＸＸIV型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸVI型コラーゲン、ＸＸVII型コラーゲン、ＸＸVIII型コラーゲン又はこれらの２つ以上の組み合わせを挙げることができる。
前記のコラーゲンのうち、例えばＩ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、及びＶ型コラーゲンは線維型コラーゲンであり、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、及びVIII型コラーゲンは非線維型コラーゲンである。更に、これらのコラーゲンのうち、コラーゲン成形体又は化粧品等の原料として汎用されているのは、Ｉ型コラーゲン又はII型コラーゲンである。これらのコラーゲンが含まれている原料は比較的大量に入手することが可能であり、本発明の抽出方法に用いる原料として適している。

コラーゲンを含む原料を取得する動物種も、特に限定されるものではなく、例えば、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又はサル）、鳥類（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、又はダチョウ）、爬虫類（例えば、ワニ）、両生類（例えば、カエル）、魚類（例えば、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、又はサケ）、又は無脊椎動物（例えば、クラゲ）を挙げることができる。またコラーゲンを得る部位も限定されるものではなく、例えば、皮膚、骨、皮、筋肉、軟骨、鱗、又は浮袋等を挙げることができる。

以下に、人獣共通感染症がほとんどなく、生体材料又は化粧品の材料として好ましい魚類由来コラーゲンについて説明する。魚類由来コラーゲンの由来としては、例えば、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、チョウザメ、ライギョ、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケなどを挙げることができるが、変性温度の観点から、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましい。このような魚類として、具体的には、オレオクロミス属の魚類を挙げる事ができ、特にはテラピアが好ましい。オレオクロミス属の魚類からは、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得でき、例えば中国、東南アジアや南アフリカで食用として養殖されているナイルテラピア（Oreochromis niloticus）は入手が容易であり、大量のコラーゲンを取得することができる。更に、中国で食用又はキャビアの生産のために養殖されているチョウザメは各種臓器が入手可能であり、大量のコラーゲンを取得することができる。

魚類由来コラーゲンを取得する魚の部位も、限定されるものではない。例えば、鱗、皮、骨、軟骨、ひれ、及び臓器（例えば、浮き袋）等を挙げることができるが、鱗が好ましい。鱗は、魚臭の原因となる脂質が少ないからである。また、魚類の鱗由来のＩ型コラーゲンは、他のコラーゲンと比較して線維化しやすく、線維形成速度が著しく速い。

例えば、Ｉ型コラーゲンは、分子量約１０万のポリペプチド鎖が３本集まって「３重らせん構造（トロポコラーゲン）」を作っており、分子量は約３０万である。長さ３００ｎｍで、直径１．５ｎｍの１本の硬い棒のような形態をしている。魚類のＩ型コラーゲンやＩＩ型コラーゲンが特異な「３重らせん構造（トロポコラーゲン）」を作るのは、ポリペプチド鎖のアミノ酸の配列が関与している。ポリペプチド鎖は３個のアミノ酸が並んだユニット「Ｇ−Ｘ−Ｙ」のつながりからできている。Ｇはグリシンを表し、Ｘはプロリン、そしてＹはヒドロキシプロリンであることが多い。ヒドロキシプロリンは、通常のタンパク質に含まれておらず、コラーゲンに特有のアミノ酸であるが、ヒドロキシプロリンの水酸基と水和水との水素結合によって３重らせん構造が安定すると考えられている。コラーゲンは、アミノ基及びカルボキシル基を有する両性高分子であり、酸性溶液中でプラスに帯電し、アルカリ溶液中でマイナスに帯電する性質があり、更に中性付近では見掛け上、中性の電荷となる。３重らせん構造（トロポコラーゲン）のコラーゲン分子は、塩濃度、塩の種類や温度に強く依存するが、中性付近でコラーゲン細線維を形成する。
本発明のコラーゲン酸性溶液では、二酸化炭素により酸性に維持され、更に塩酸、酢酸、クエン酸、又はフマル酸を含まずに、コラーゲン溶液とすることができるため、線維化が起きにくい、安定なコラーゲン酸性溶液とすることができる。

コラーゲンは、温度が上昇すると３本のポリペプチドからなる「３重らせん構造」が解けて、３本のポリペプチドがばらばらになり、ゼラチンとなる。コラーゲンからゼラチンへの変化を変性と呼び、一度変性が起きると、再び温度を低下させても「３重らせん構造」に戻すことは困難である。コラーゲンの変性温度は、通常そのコラーゲンが由来する生物の棲息温度より、若干高い程度であり、従って、水中に生息している魚類の鱗のコラーゲンの変性温度は、それほど高くない。

本発明に用いることのできる魚類由来コラーゲンは、その変性温度によって、限定されるものではないが、変性温度の高い魚類由来コラーゲンが好ましく、具体的には２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましく、２８℃以上が更に好ましく、３０℃以上が最も好ましい。

（前処理）
前記コラーゲンを含む原料は、そのまま本発明の抽出方法に用いることも可能であるが、抽出効率を上げるために、前処理を行うことが好ましい。前処理としては、洗浄、脱灰処理、脱脂処理、粉砕処理、又はそれらの任意の組み合わせを挙げることができ、その順番も目的に応じて、適宜変更することができる。

洗浄は、水、塩化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は塩酸溶液などを用いて行うことができる。例えば、原料に付着した夾雑物は、水洗することにより除去することができる。また、原料の表面に付着した夾雑タンパク質は、例えば、１〜１５重量％、好ましくは５〜１０重量％の塩化ナトリウム水溶液で１０〜４８時間、好ましくは２４〜４８時間洗浄することにより除去することができる。更に、コラーゲンを含む原料を、水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、水温を１０℃に保って２４時間攪拌することによって、洗浄してもよい。

粉砕処理としては、高速ホモジナイザーによる粉砕や凍結乾燥粉砕などが適用できる。粉砕処理により、コラーゲンの抽出効率を向上させ、高収率を実現することができる。また、粉砕処理は、前記脱灰処理又は脱脂処理の前に行うことができるが、脱灰処理や脱脂処理のあとで、粉砕処理を行うことも可能である。具体的には、コラーゲンを含む原料として魚鱗を用いる場合、高速ホモジナイザーを５０００〜２００００ｒｐｍ、１０〜６０分間の条件下で運転する方法、及び、凍結粉砕する方法を挙げることができる。

脱灰処理としては、例えば、塩酸、エチレンジアミン４酢酸水溶液、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム水溶液、及びエチレンジアミン４酢酸４ナトリウム水溶液等による処理を挙げることができる。脱灰処理の方法も、特に制限されるものではなく、例えば、コラーゲンを含む原料を前記処理液中で２４〜４８時間攪拌するなど、通常の方法により行えばよい。脱灰処理によって、原料に含まれるリンやカルシウムなどの無機物質を除去することができる。

脱脂処理としては、脱脂作用を有する界面活性剤や有機溶剤などを含む処理液に抽出原料を浸漬し、処理液に溶け出した油脂分を取り除く。具体的には、エタノールやアセトン等の有機溶剤処理液、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ処理液、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤処理液を用いて行うことができる。処理時間は、適宜選択することができるが、通常、３〜７２時間でよい。また、処理温度は、４〜２５℃の範囲で行うとよい。

［２］コラーゲンの製造方法
本発明のコラーゲンの製造方法は、（１）二酸化炭素を含む炭酸水にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程（以下、浸漬工程（１）と称する）、（２）前記原料に含まれるコラーゲン及び／又は浸漬工程（１）によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程（以下、タンパク質分解酵素接触工程（２）と称する）、（３）前記溶液から不溶物を除去する工程（以下、不溶物除去工程（３）と称する）を含む。本発明のコラーゲンの製造方法は、（４）前記不溶物を除去した酸性溶液から二酸化酸素を除去する工程を含んでもよく、更に、浸漬工程（１）の前に、コラーゲンを含む原料を前処理する工程を含んでもよい。
本発明のコラーゲンの製造方法には、前記抽出方法に記載の炭酸水を用いることができる。また本発明のコラーゲンの製造方法には、本発明のコラーゲンの抽出方法を使用することができる。

前記コラーゲンの抽出方法と同様に、浸漬工程（１）とタンパク質分解酵素接触工程（２）とは、別の工程として行うことも可能であるが、同時に行うこともできる。浸漬工程（１）とタンパク質分解酵素接触工程（２）を同時に行う場合は、その後に不溶物除去工程（３）を行う。
浸漬工程（１）とタンパク質分解酵素接触工程（２）とを別の工程として行う場合は、浸漬工程（１）、タンパク質分解酵素接触工程（２）及び不溶物除去工程（３）をその順番で行ってもよく、浸漬工程（１）、不溶物除去工程（３）、及びタンパク質分解酵素接触工程（２）の順番で行ってもよい。

《浸漬工程（１）》
本発明のコラーゲンの製造方法における浸漬工程（１）は、前記コラーゲンの抽出方法における浸漬工程（１）に従って行うことができる。

《タンパク質分解酵素接触工程（２）》
本発明のコラーゲンの製造方法におけるタンパク質分解酵素接触工程（２）は、前記コラーゲンの抽出方法におけるタンパク質分解酵素接触工程（２）に従って行うことができる。

前記の浸漬工程（１）と、タンパク質分解酵素接触工程（２）とを同時に行う場合は、炭酸水にペプシン、パパイン、プロテアーゼＭ又はプロクターゼを添加することにより、コラーゲンを抽出する。浸漬工程（１）及びタンパク質分解酵素接触工程（２）とを組み合わせることにより、効率的に原料中のコラーゲンを抽出することができる。

（不溶物除去工程（３））
前記浸漬工程（１）及びタンパク質分解酵素接触工程（２）の終了した原料（又は浸漬工程（１）の終了した原料）のうち、溶解しなかった画分を不溶物除去工程（３）によって、除去する。具体的には、遠心分離又はろ過などによって、不溶物を除去し、酸可溶化コラーゲン、又はアテロ化コラーゲンの溶解液を得ることができる。

（二酸化炭素除去工程（４））
得られたコラーゲンの溶解液は、二酸化炭素除去工程（４）において、超音波処理、又は真空脱気により、溶解している二酸化炭素を除去することができる。二酸化炭素を除去したコラーゲン溶液は、そのまま、用いることもできるが、例えば凍結乾燥を行い保存することもできる。凍結乾燥の方法は、特に限定されるわけではなく、通常公知の方法に従い、行うことができる。

なお、前記不溶物除去工程（３）において得られた酸可溶化コラーゲン水溶液から、通常のコラーゲンの製造方法における回収方法により、コラーゲンを回収してもよい。すなわち、塩化ナトリウム等を加えて塩濃度を上昇させること、又は水酸化ナトリウム等を加えてｐＨを中性付近に調整することにより、コラーゲンを線維化することができる。そして、例えば線維化したコラーゲンを遠心分離法等により分離回収することも可能である。

（前処理工程）
本発明のコラーゲンの製造方法における前処理工程は、前記コラーゲンの抽出方法における「前処理」に従って、行うことができる。前処理工程を行うことにより、コラーゲンを含む原料からのコラーゲンの抽出効率を上昇させることができる。

本発明のコラーゲンの製造方法の１つの態様を、テラピアの鱗を例として、具体的に説明する。
テラピアの鱗を水で十分洗浄し、更に１０％塩化ナトリウム溶液で十分洗浄する。鰭などの夾雑物を除去した後、室温にて乾燥する。得られたテラピア鱗をｐＨ３の塩酸溶液に分散し、１Ｍの塩酸溶液を添加しながらｐＨを３に保った状態で、２５℃、２時間穏やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分を溶解する。テラピア鱗をザルにあげて、十分水洗する（脱灰鱗）。

蒸留水に二酸化炭素をバブリングし、ｐＨ５以下に調整した酸性溶液を得る。この酸性溶液に、ペプシン（和光純薬 １：１００００）を添加する。この溶液に脱灰したテラピア鱗とペプシンを投入し、攪拌羽根を用いて２５℃、２４時間、穏やかに攪拌して、鱗からコラーゲンを溶解する。これをザルにあげて、鱗残渣と分離した後、更に遠心分離により上澄を回収して微細な鱗残渣と分離した。

得られたコラーゲン溶液は限外濾過膜により、分子量１００ｋＤａ以下の分子を分離することでペプシンの分画を行う。更に、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過する。コラーゲン溶液を、超音波照射し、更に真空脱気により、溶解している二酸化炭素を除去する。これにより、コラーゲン抽出液を得る。また、得られたコラーゲン溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥コラーゲンを得ることもできる。

［３］コラーゲン抽出液
前記コラーゲンの抽出方法よって得ることのできる抽出液は、酸及び／又は塩を含まないものである。得られるコラーゲン抽出液は、中和又は脱塩の必要がないため、そのままさまざまな用途（例えば、化粧用コラーゲン溶液、美容形成用コラーゲン溶液、又は細胞培養溶液など）に用いることができる。なお、本発明のコラーゲン抽出液が、酵素等を含んでいる場合は、前記の限界濾過等により酵素を除去することが望ましい。また、本発明のコラーゲン抽出液を製品に使用する場合は、０．４５μｍのメンブレンフィルターで滅菌処理を行ったものを使用することが好ましい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１》
本実施例では、テラピアの鱗を用いて、室温（２５℃）及び大気圧の１．０１３×１０^５Ｐａでコラーゲンの抽出（製造）を行った。
テラピアの鱗を水で十分洗浄し、更に１０％塩化ナトリウム溶液で十分洗浄し、鰭などの夾雑物を除去した後、室温にて乾燥した。含水率は１８．５％であった。

このテラピア鱗１ｋｇをｐＨ２の塩酸溶液９ｋｇに分散し、１Ｍの塩酸溶液を添加しながらｐＨを２に保った状態で、２５℃、２時間穏やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分を溶かしだした（脱灰）。これをザルにあげて、十分水洗した後、総重量が４ｋｇとなるようにｐＨ３．８の炭酸水を添加した。これに、ペプシン（和光純薬 １：１００００）２４ｇを添加し、攪拌羽根を用いて２５℃、２４時間、穏やかに攪拌して、鱗からコラーゲンを溶かし出した。これをザルにあげて、鱗残渣と分離した後、更に遠心分離（１００００Ｇ，６０ｍｉｎ）により上澄を回収して微細な鱗残渣と分離した。これに、更にペプシンを０．５ｇ添加し、２５℃、２４時間保持した。

得られた溶液（２．４ｋｇ）を限外濾過膜（１００ｋＤａ）によりペプシンを除去した後、更に０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過して凍結乾燥した。

《実施例２》
本実施例では、加圧下でのコラーゲンの抽出及び製造を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたコラーゲンを確認した。
図１に示す圧力容器を用いて、２０ｍＬの精製水を加え、二酸化炭素を３×１０^５Ｐａに調整して室温で振とうさせた。これに実施例１で作製した脱灰鱗を室温で乾燥させ、２ｇを加えた。更にペプシンを３０ｍｇ加えて、２４時間振とうさせた。遠心分離により鱗の残渣と上澄み溶液を分離した。上澄み溶液を用いて、限外濾過膜（１００ｋＤａ）により遠心分離により分画を行った。分画の洗浄には、二酸化炭素をバブリングさせた水溶液を用いた。

分画した上澄み溶液を凍結乾燥させ、得られた白色の析出物をｐＨ３．８の炭酸水に溶解させ、サンプルバッファー（２ｍＬの０．５Ｍトリス塩酸塩バッファー（ｐＨ６．８）、４ｍＬの１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＬのグリセロール、０．８ｍＬの精製水、数滴の１％ブロモフェノールブルー、１．２ｍＬの２−メルカプトエタノール）を１：１の容積比で混合後、沸騰浴中で３分間変性させた。室温に戻し、遠心分離により、上澄みを分離した。電気泳動は、グラジェントゲルを用いて１枚当たり１００Ｖの定電圧により３時間電気泳動を行った。０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ（４５％メタノール／１０％酢酸）に一晩浸漬させ染色した。更に５％メタノール／７％酢酸溶液を調整し、これに染色したゲルを２日間浸漬させ、脱色した。作製したゲルを超純水に入れて保存した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、分子量１００ｋＤａ付近のバンドと３４ｋＤａ付近の弱いバンドがそれぞれ観測された。１００ｋＤａ付近のバンドは、コラーゲンが変性したα鎖（分子量１００ｋＤａ）のものと考えられ、コラーゲンの抽出が確認できた。また、３４ｋＤａ付近のバンドは、限外濾過により分離が不十分であったペプシンに由来するものと考えられる。

本発明のコラーゲンの製造方法によれば、様々なコラーゲンを含む組織から、簡便に、且つ効率的にコラーゲンを製造することができる。また本発明のコラーゲンの抽出方法又は製造方法により得られたコラーゲン又はゼラチンは、化粧品、医薬部外品、化学試薬、細胞培養基材、再生医療用（例えば、骨、軟骨、又は皮膚）の足場材料、移植材料、又は電子デバイスにおける導電性ペーストの分散剤として用いることができる。

Claims (11)

1. （１）炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、
   を含むことを特徴とする、コラーゲン抽出方法。
2. （２）前記原料に含まれるコラーゲン及び／又は浸漬工程（１）によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、
   を含む、請求項１に記載のコラーゲン抽出方法。
3. 炭酸水がｐＨ５以下である、請求項１又は２に記載のコラーゲン抽出方法。
4. 前記浸漬工程（１）及び／又は接触工程（２）を加圧下で行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲン抽出方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のコラーゲン抽出方法によって得られる、酸及び／又は塩を含まないコラーゲン抽出液。
6. （１）炭酸水中にコラーゲンを含む原料を浸漬する工程、
   （２）前記原料に含まれるコラーゲン及び／又は浸漬工程（１）によって抽出されたコラーゲンにタンパク質分解酵素を接触させる工程、及び
   （３）前記溶液から不溶物を除去する工程、
   を含む、コラーゲン製造方法。
7. 前記浸漬工程（１）及びタンパク質分解酵素接触工程（２）を同時に行う、請求項６に記載のコラーゲン製造方法。
8. （４）前記不溶物を除去した炭酸水（酸性溶液）から二酸化酸素を除去する工程、を更に含む請求項６又は７に記載のコラーゲン製造方法。
9. 前記浸漬工程（１）の前に、コラーゲンを含む原料を前処理する工程を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のコラーゲン製造方法。
10. 炭酸水がｐＨ５以下である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のコラーゲン製造方法。
11. 前記浸漬工程（１）及び／又は接触工程（２）を加圧下で行う、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のコラーゲン製造方法。